CH627151A5

CH627151A5 -

Info

Publication number: CH627151A5
Application number: CH578677A
Authority: CH
Inventors: Anand Swaroop Dutta; Barrington John Albert Furr; Michael Brian Giles
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1977-05-09
Publication date: 1981-12-31
Also published as: IL52014A; GB1524747A; SE437993B; FI771480A7; FI64139B; PL197889A1; CS199673B2; ES458691A1; NL970002I1; DD136738A5; NO149586B; NZ183931A; AU508025B2; IE44426B1; DK207977A; IL52014A0; ZA772433B; NO822984L; YU117277A; PL108860B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, die Luliberinagonisteigenschaften besitzen. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF (luteinising hormone releasing factor) (J. Biol. Chem., 1975, 250, 3215).

Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Morley, Clinical Endocrinology, 1976, 5, Ergänzung, S. 291s-298s), dass der Einbau von a-Azaaminosäuren an der 6- oder 10-Stellung von Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) aus der Hypophyse weniger kräftig sind als das Ausgangsmolekül. Es wurde nunmehr gefunden, dass der Einbau von Azaglycerin an der 10-Stellung in Verbindung mit dem Einbau verschiedener D-a-Aminosäuren an der 6-Stellung in Luliberin oder der Einbau von Aza-glyzin oder Azalanin an der 6-Stellung in Verbindung mit dem Ersatz des endständigen Glycinamids durch ein Äthylaminoradikal in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luliberin.

Gemäss der Erfindung werden also Polypeptide der For-mel:

'-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I

worin A für D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bul), D-Phe, D-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht, oder A für Azgly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine direkte Bindung steht und F für ein Äthylaminoradikal steht, sowie die pharmazeutisch und Veterinär zulässigen Säureadditionssalze davon hergestellt.

In der obigen Formel I und in der gesamten Beschreibung werden die Aminosäurereste durch ihre Standardabkürzungen (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317—331) bezeichnet. Ein a-Aza-aminosäurerest ist ein solcher, in welchem das ö-CH einer Aminosäure durch Stickstoff ersetzt worden ist. Die Abkürzung für eine a-Aza-aminosäure leitet sich von der entsprechenden Aminosäure durch Hinzufügung der Vorsilbe «Az» ab. Somit steht Azgly für Azaglycin und Azala für Azalanin.

Wenn die Konfiguration der betreffenden Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt diese Aminosäure (ausser der a-Aza-aminosäuren, die in der Nachbarschaft der Carboxy-gruppe kein asymmetrisches Zentrum enthalten) die natürliche L-Konfiguration.

Speielle Gruppen von erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen innerhalb der Erfindung sind die folgenden:

Verbindungen, worin A für D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu'), D-Phe, D-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

Verbindungen, worin A für Azgly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine direkte Bindung steht und F für ein Äthylaminoradikal steht.

Verbindungen, worin A für D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu'), D-Phe, D-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen umfasst diejenigen, worin A für D-Tyr(Me), D-Ser(Bu') oder D-Phe steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

Die drei bevorzugten erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen die folgenden Strukturen:

ßlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2

^GIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr(Me)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2

ßlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2

Spezielle pharmazeutisch oder Veterinär zulässige erfindungsgemäss erhältliche Säureadditionssalze sind beispielsweise Hydrochloride, Phosphate, Citrate oder Acetate.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man

^Glu-OH, f-Glu-His-OH, ^Glu-His-Trp-OH,

'-Glu-His-Trp-Ser-OH, ^-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH,

ßlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH,

ßlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OH,

I-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH oder

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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60

65

3

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oder ein geeignetes aktiviertes Derivat davon mit H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F, H-Arg-Pro-E-F,

H-Pro-E-F bzw. H-Azgly-NH2

oder einem geeigneten aktivierten Derivat davon in einer Standardpeptidkupplungsreaktion umsetzt und das erhaltene Produkt, wenn es in der unprotonierten Form vorliegt, mit einer Säure, die ein pharmazeutisch oder Veterinär zulässiges Anion liefert, umsetzt, falls man ein Salz herzustellen wünscht.

Beim vorliegenden Verfahren kann irgendeine der Stan-dardpeptidkupplungsreaktion verwendet werden, die beispielsweise in einem Standardhandbuch der Peptidchemie beschrieben sind, wie z.B. Bodansky und Ondetti, «Peptide Syn-thesis», Interscience, New York, 1966, Kapitel V, und in den Bänden 1 bis 8 der periodischen Spezialistenberichte der Chemical Society «Amino-acids, Peptides and Proteins».

Beim vorliegenden Verfahren ist eine spezielle Kupplungsreaktion eine Azidkupplung, eine Aktivesterkupplung oder eine Kupplung, bei der ein N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenztriazol eine Rolle spielen. Eine bevorzugte Kupplungsreaktion ist eine Azidkupplung, und zwar insbesondere eine derartige Kupplung, bei der sich die His-Trp- oder Ser-Tyr-Peptidbindung bildet.

Die Ausgangsmaterialien für die Verwendung beim erfin-dungsgemässen Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpep-tidschutzreaktionen und Standardpeptidschutzgruppenabspal-tungsreaktionen hergestellt werden, wie sie Fachleuten auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind und wie sie beispielsweise in den Beispielen 1 bis 10 angegeben sind.

Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen Luliberinagonisteigenschaften, d.h. dass sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vom Hypothalamus sekretiertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) veranlasst. Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämlich FSH, in den Ovarien eine Förderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel I sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich kräftiger als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren. Es eignet sich insbesondere für die Züchtung von grossen Haustieren während eines Anöstrusses und bei jeder künstlich beeinflussten Züchtung zur genauen Bestimmung der Ovulation. Es eignet sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeits-zuständen bei Mann und Frau.

Der Luliberinagonisteffekt der Verbindungen der Formel I kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelte Antikörperradioimmunoassay) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstrischen oder diöstrischen Mutterschaften abzugeben.

Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Ratten wird wie folgt ausgeführt:

Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Alters mit 100 ug Testo-steronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständischen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatori-sche Follikeln in den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulie-

renden Anstiegs an LH und FSH, der durch die Anwesenheit von Eiern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann.

Alle in dieser Beschreibung genannten beispielhaften Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulation bei Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen ausserdem keine giftigen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfin-dungsgemässen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4, 6 und 7 beschrieben sind, annähernd lOOmal so aktiv als Luliberin. Sie zeigen ausserdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie in der lOOfachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen können in Form von pharmazeutischen oder Veterinären Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil eine Verbindung der Formel I gemeinsam mit einem pharmazeutisch oder Veterinär zulässigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthalten, verwendet werden.

Die Zusammensetzungen können die verschiedensten Formen aufweisen, beispielsweise eine für orale oder buccale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Tabletten, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen; eine für nasale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Schnupfmittel, Nasenspray oder Nasentropfen; eine für vaginale oder rektale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Suppositorien; oder für eine parenterale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. sterile injizierbare Lösungen oder Suspensionen.

Im allgemeinen werden die obigen Zusammensetzungen in üblicher Weise unter Verwendung herkömmlicher Exzipien-zien hergestellt. Zusammensetzungen für orale Verabreichung können jedoch eine Beschichtung aufweisen, um den aktiven Polypeptidbestandteil von den Wirkungen von Enzymen im Magen zu schützen.

Die Zusammensetzungen können ausserdem zusätzlich zu einem erfindungsgemässen Polypeptid ein oder mehrere bekannte Wirkstoffe enthalten, die aus Prostaglandinderivaten ausgewählt sind, wie z.B. Prostaglandin-F^, Cloprostinol oder Fluprostinol, oder einen anderen Wirkstoff, wie z.B. Clomi-phen oder Tamoxifen.

Bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, die sich für orale Verabreichung in Einheitsdosierungsform eignen, wie z.B. eine Tablette, eine Kapsel, ein Trank oder ein Bolus, wobei dieselben 2,5 bis 500 mg und vorzugsweise 10 bis 100 mg eines Polypeptids in jeder Einheitsdosierungsform aufweisen, oder solche, die sich für parenterale Verabreichung eignen, welche 5 /tg bis 1 mg eines Polypeptids je ml und vorzugsweise 10 bis 100 ug eines Polypeptids je ml Lösung enthalten.

Eine parenterale Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Lösung an isotonischer Kochsalzlösung oder isotonischer Dextrose, nötigenfalls auf einen pH von 5 bis 9 gepuffert. Alternativ kann die parenterale Zusammensetzung so aufgebaut sein, dass sie den Wirkstoff langsam abgibt, in welchem Falle die Menge des Polypeptids je Einheitsdosierungsform im allgemeinen grösser ist, als sie erforderlich ist, wenn eine herkömmliche injizierbare Form verwendet wird. Eine bevorzugte parenterale Formulierung mit langsamer Wirkstoffabgabe enthält 100 jug bis 1 mg Polypeptid je Einheitsdosierung.

Die Zusammensetzungen werden im allgemeinen so verabreicht, dass die tägliche Dosis 50 jug bis 20 mg/kg beträgt. Eine tägliche parenterale Dosis, beispielsweise durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion oder Infusion, beträgt 0,2 bis 100 «g/kg. Bei Menschen entsprechen diese Dosen einer gesamten täglichen Dosis von 3,5 mg bis 1,4 g bei oraler Verabreichung und einer gesamten täglichen Dosis von 14 «g bis 7 mg bei parenteraler Verabreichung. Wenn die Verabreichung über die Schleimmembranen erfolgt, dann liegt die Do-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

627 151

sis zwischen den oben angegebenen Bereichen für orale und parenterale Verabfolgung.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

In den Beispielen bezieht sich Rf auf die aufsteigende Dünnschichtchromatografie (t.l.c.) auf Silicagelplatten (Kieselgel G). Die in dieser Chromatografie verwendeten Lösungsmittelsysteme waren Butan- 1-ol/Essigsäure/Wasser (4:1:5 V/V) (RfA), Butan-1-ol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (15:3:12:10 V/V) (RtB), Butan-2-ol/3 % G/V wässriges Ammoniumhydroxyd (3:1 V/V) (RfC), Acetonitril/Wasser (3:1 V/V) (RfD), Aceton/Chloroform (1:1 V/V) (RfE), Chloroform/Äthanol (1:4 V/V) (RtF), Cyclohexan/Äthylacetat (1:1 V/V) (RfG), Cyclohexan/Äthylacetat/Methanol (1:1:1 V/V) (RfH), Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) (RfK), Chloroform/Methanol (19:1 V/V) (RfP) und Chloroform/Methanol (9:1 V/V) (RfQ). In allen diesen Fällen wurden die Platten unter UV-Licht geprüft und mit Fluorescamin, Ninhydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagenzien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann bedeuten die angegebenen RrWerte, dass ein einziger Fleck durch diese Verfahren bestimmt wurde.

Säurehydrolysate aller in dieser Beschreibung beschriebenen Produkte wurden dadurch hergestellt, dass das Peptid oder geschützte Peptid mit 6 n Salzsäure, die 1 %(G/V)Phenol enthielt, in einem verschlossenen evakuierten Rohr 16 st auf 100 °C erhitzt wurde. Die Aminosäurezusammensetzung eines jeden Hydrolysats wurde mit einem LoCarte-Aminosäure-Analysator bestimmt. Die Zusammensetzung entsprach in jedem Fall der Erwartung. Der Ausdruck «in üblicher Weise aufgearbeitet», der in den Beispielen verwendet wird, besagt, dass nach der Umsetzung jeder feste Rückstand durch Filtration entfernt wurde, das Filtrat unter 40 °C zur Trockne eingedampft wurde, der Rückstand in Äthylacetat mit einer 20%igen Zitronensäurelösung, Wasser, gesättigter Natriumhy-drogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wurde und das Äthylacetat im Vakuum eingedampft wurde, wobei die Verbindung zurückblieb.

Beispiele 1 bis 8 Synthese von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-

L-tyrosyl-A-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-E-F Allgemeines Verfahren (m). (Schemata 1 und 2)

Zu einer auf 0 °C gekühlten und gerührten Suspension von 0,2 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidinhydrazid in 0,9 ml Dime-

thylformamid und 0,7 ml Dimethylsulfoxyd wurden 0,8 mMol 5,7n Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben. Nach einem 5min dauernden heftigen Rühren wurde eine klare Lösung erhalten. Die Lösung wurde auf —20 °C abgekühlt, 0,22 mMol t-Butyl-5 nitrit wurde zugegeben, und das Rühren wurde 25 min fortgesetzt. Die Temperatur wurde dann auf —30 °C abgesenkt und die Lösung wurde durch Zusatz von 0,8 mMol Triäthylamin neutralisiert. Ein auf—20 °C vorgekühltes Gemisch von 0,1 mMol io L-Tiyptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-E-F-dihydrochlorid (erhalten durch Hydrogenolyse des N-Benzyloxycarbonylderi-vats in 80%igem (V/V) wässrigem Methanol mit einem Gehalt an zwei Äquivalenten Chlorwasserstoff über einem 5 %igen 15 (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator während 16 st) und aus 0,1 mMol Triäthylamin in 1 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 24 st bei 4 °C gerührt. Dimethylformamid wurde im Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde auf Sephadex LH-20 chro-2o matografiert, wobei Dimethylformamid als Eluiermittel verwendet wurde. Das Peptid-hydrochlorid wurde weiter durch Verteilungschromatografie auf Sephatex G-25 gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5:1:5:1 V/V) verwendet wurde.

25

Synthese von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid Allgemeines Verfahren (n) (Schemata 3, 4 und 5) 30 0,2 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-se-rin-hydrazid wurden in 4 ml Dimethylformamid aufgelöst und so in das Azid überführt, wie es beim Verfahren (m) beschrieben ist. Dieses wurde, wie es beim Verfahren (m) beschrieben ist, mit 0,15 mMol 35 L-Tyrosyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid-hydrochlorid (hergestellt durch katalytische Reduktion von N-Benzyloxy-carbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-

(N<"-Nitro)-L-arginyl-L-propyl-azaglycin-amid in 80%igem (V/V) wässrigem Methanol während 20 st über 40 einem 5 %igen (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator) gekuppelt und das fertige Produkt wurde wie oben beschrieben als Hydrochlorid gereinigt.

Die Verbindungen der Formel I, die durch eines dieser 45.beiden allgemeinen Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 8 in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Tabelle

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F

Beispiel Nr.

A

B

E

F

Verfahren

Ausbeute

%

Papierelektrophorese RF (relativ zu Luliberin) pH 2,1 pH 6,5

RfA

1

Azgly

Leu

__

-NHC2Hs m

25

0,98

1,03

0,28

2

Azala

Leu

—

-NHQjHS

m

42

0,97

1,0

0,30

3

D-Ala

Leu

Azgly nh2

m

32

0,97

1,0

0,30

4

D-Phe

Leu

Azgly nh2

n

40

1,0

0,71

0,27

5

D-Trp

Leu

Azgly nh2

n

15

0,53

0,37

6

D-Tyr(Me)

Leu

Azgly nh2

n

15

0,92

0,87

0,25

7

D-Ser(Bu')

Leu

Azgly nh2

n

31

0,94

0,96

0,25

8

D-Tyr (Me)

MeLeu

Azgly nh2

n

26

0,87

0,90

0,34

Die Ausgangsmaterialien für die Verwendung in den obi- genden Schemata 1 und 2 [Verfahren (m)] und in den Sche-gen Verfahren können so erhalten werden, wie es in den fol- mata 3, 4 und 5 [Verfahren (n)] beschrieben ist.

5

Bei diesen Schemata wurden die folgenden Konzentrationen verwendet:

OCp = 2,4,5-Trichlorphenylester Bzl = Benzyl

Z = Benzyloxycarbonyl s

Boc = t-Butoxycarbonyl DMF = Dimethylformamid

Die eingekreisten Zahlen beziehen sich auf die betreffende Stufe.

627 151

6

Schema 2

7

Schema 3

627 151

0\ bJ

Q

lu

His

Trp

©

A = D-Tyr(Me), D-Ser(Bu')

Ser

Tyr ' A

Z-

Leu

Z-Z

/

-NHHHg Z.

NJ H-

Z-

Bzl

œp h P'-1 (Ça

1/

Dzl

©

Bzl

OH H.

_OMe

Arg

OMe OMe OMe

NHNIl,

N7 H.

j

NO,

/

N0o

V-L

H

/

Pro

Azgly

C/3 o

O-

§ 00

P

4^

NH,

.NH,

NH„

NH,

lu

His

Trp

Ser

Tyr D-Tyr(Me) MeLeu Z-

Arg

Pro

Z Z

nhnh2 z-

NJ H

Z-

rB?.l

OCp H-Bzl

Bzl

Z.

Bzl

-OH II

68)

©

■ OMe OMe

OMe OMe

NHNH.

N3 H

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Z

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H

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NH,

- NH

NH,

On si M VI

627 151

10

Stufe (T^

19,94 g (80 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin und 8,8 ml (80 mMol) N-Methylmorpholin wurden in 200 ml trok-kenem Tetrahydrofuran aufgelöst und die Lösung wurde auf —20 °C abgekühlt. 7,15 ml (76 mMol) Äthylchloroformiat wurden tropfenweise zugegeben, und nach einem 2 Minuten dauernden Rühren wurden 20 ml (300 mMol) einer auf —20 °C vorgekühlten 70%igen wässrigen Lösung von Äthylamin zugegeben, worauf das Rühren 18 st bei 4 °C fortgesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und der Rückstand wurde aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 60-80 °C) kristallisiert. Ausbeute 12,97 g (58,7%), Fp 107-108 °C, [a]D25-5—43,88° (c, 1 in Methanol), R,D 0,69, RfE 0,53, RfF 0,67, RfH 0,62, R,P 0,57, RfQ 0,66.

Stufe ©

Katalytische Reduktion über 5% Pd/C in wässrigem Äthanol mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 5 st bei Raumtemperatur.

Stufe (3)

Eine Lösung von 13,5 g (42,3 mMol) N"-t-Butoxycarbo-nyl-NM-nitro-L-arginin, 7,15 g (47 mMol) L-Prolin-äthyl-amid-hydrochlorid, 11,5 g (85 mMol) 1-Hydroxybenztriazol und 6,58 ml (47 mMol) Triäthylamin in DMF wurde auf 0 °C abgekühlt, und 9,13 g (44,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 °C gerührt und zur Entfernung von festem Material filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft wurde. Der Rückstand wurde zwischen Äthylacetat und Wasser durch eine Gegenstromverteilung (4 Übergänge) verteilt. Die wässrigen Phasen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde zwischen N-Butanol und 5 %iger (V/V) wässriger Essigsäure durch Gegenstromverteilung (12 Übergänge) verteilt. Das durch Eindampfen der vereinigten N-Butanolphasen erhaltene rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform und 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, und eine wässrige Lösung des Rückstandes wurde durch eine Anionenaustauschharzkolonne (AG 1-X2) hindurchgeführt, um dieses Na-t-Butoxycarbonyl-Nm-nitro-arginin zu entfernen. Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen und die vereinigten wässrigen Phasen und Waschflüssigkeiten wurden gefriergetrocknet, wobei das Aza-peptidderivat erhalten wurde. Ausbeute 16,67 g (89%), Fp 109—111 °C (Zersetzung), [a]D25—39,0° (c, 1 in Methanol), RfA 0,62, RfB 0,74, RfC 0,59, RfD 0,70, RfE 0,20, RfF 0,60, RfH 0,61, RfK 0,85, RfQ 0,13.

Stufe (?)

Das N-t-Butoxycarbonylderivat wurde in Äthylacetat aufgelöst und mit 3n HCl in Äthylacetatlösung (4 Äquivalente) während 1 st bei Raumtemperatur behandelt.

Stufe © (R=H)

Eine Lösimg von 2,90 g (22 mMol) t-Butoxycarbonylhy-drazid und 11,71 g (20 mMol) des 2,4,5-Trichlorophenylesters von N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin in 40 ml Dimethylformamid wurde über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Aufarbeitung in der üblichen Weise und anschliessende Umkristallisation des Rückstandes aus Äther/Petroläther (Kp 60 bis 80 °C) ergab das geschützte Hydrazid als weisses Pulver, 3,46 g (67%), Fp 126 bis 127 °C, [a]D2S-13,2° (c, 1 in Methanol), RfD 0,82, RfE 0,65, RfF 0,63, RfH 0,70.

Stufe 0 (R=H)

5,19 g (10 mMol) l-(N-Benzyioxycarbonyl-0-benzyl-L-ty-rosyl)-2-t-butoxycarbonyl-hydrazid wurden in 50 ml Äthylacetat aufgelöst und mit 8 ml (40 mMol) 5n Salzsäure in Äthyla-s cetat 1 st bei Raumtemperatur behandelt. Das Äthylacetat wurde im Vakuum entfernt, und das Hydrochlorid wurde mit Äther filtriert und getrocknet.

Stufe © (R=H)

10 Das obige Hydrochlorid wurde in 75 ml Tetrahydrofuran aufgenommen, und 1,15 g (8 mMol) Triäthylamin wurden zugegeben, worauf sich der Zusatz von 1,36 g (8 mMol) n-Car-bonyl-L-leucinmethylester anschloss. Nach 16 st bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch in der üblichen Weise 15 aufgearbeitet, worauf der Rückstand aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 60-80 °C) umkristallisiert wurde. Dabei wurde das Azatripeptidderivat erhalten, 4,57 g. (77,7%), Fp 156-157 °C, [cclu24—10,3° (c, 1 in Methanol), RfD 0,81, R,E 0,45, RfP 0,26, RfQ 0,47.

5 ml (100 mMol) Hydrazinhydrat wurden zu einer Lösung von 2,95 g (5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyro-sylazaglycyl-L-leucin-methylester in 50 ml Methanol zugege-25 ben. Nach 2 st bei Raumtemperatur wurde das Hydrazid mit Wasser ausgefällt und aus Methanol/Äther umkristallisiert. Ausbeute 2,74 g (92,8%), Fp 169-170 °C, [a]D24-9,05° (c, 1 in Dimethylformamid) RfA 0,76, RfB 0,75, RfC 0,73, RfD 0,63, RfF 0,60, RfH 0,55.

30

Stufen © und (LO) (R=H)

1,18 g (2,0 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyro-syl-azaglycyl-L-leucin-hydrazid wurden in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und nach Abkühlen der Lösung auf —20 °C 35 wurden 1,46 ml (8 mMol) einer 5,49m Lösung von Chlôrwas-serstoff in Dioxan und schliesslich 0,25 ml (2,2 mMol) t-Bu-tylnitrit zugegeben. Nach 5 min wurde die Lösung auf —30 °C abgekühlt, worauf ein vorgekühltes Gemisch von 0,836 g (2,2 mMol) N°J-Nitro-L-arginyl-L-prolin-äthylamid~hydrochlorid 40 und 1,43 ml (10,2 mMol) Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Std. bei -10 °C und dann 48 st bei 4 °C gerührt. Es wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet. Das Pentapeptidderivat wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von 45 Chloroform und 3%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt, Ausbeute 0,695 g. (38,5 %), RfA 0,71, R,B 0,72, RfC 0,84.

Stufe 0 (R=H)

50 Katalytische Reduktion mit 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in 80%iger (V/V) wässriger Essigsäure mit einem Gehalt an 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

55 Stufe (l2)

Zu einer heftig gerührten und auf -20 °C abgekühlten Lösung und 33,84 g (100 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-trypto-phan und 11,0 ml (100 mMol) N-Methylmorpholin in 200 ml Tetrahydrofuran wurden 9,0 ml (95 mMol) Äthylchlorofor-60 miat zugegeben. Nach 2 min wurde eine auf —20 °C vorgekühlte Lösung von 17,10 g (11 mMol) L-Serinmethylester-hy-drochlorid und 12,1 ml (110 mMol) N-Methylmorpholin in 150 ml Dimethylformamid zugegeben und das Rühren wurde 30 min bei —20 °C und 3 st bei Raumtemperatur fortgesetzt. 65 Die übliche Aufarbeitung ergab ein Öl. Zwei Kristallisationen aus Äthylacetat/Petroläther, Kp 60-80 °C, gaben das Di-peptidderivat, Ausbeute 30,53 g (69,5%), Fp 140,5—141 °C, [a[]D24—22,13 ° (c, 1,4 in Dimethylformamid).

11

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Stufe (0)

30,53 g (69,5 mMol) des vorstehenden Esters wurden in 11 Methanol aufgelöst und 15 ml einer 62%igen (G/V) Lösung von Hydrazinhydrat wurden zugesetzt. Nach 16 st wurde das Hydrazid gesammelt, mit Methanol und Äther gewaschen und aus heissem Äthanol kristallisiert, Ausbeute 23,18 g (75,8%), Fp 178-179 °C, [et]D24—25,27° (c, 1 in Dimethylformamid) RfD 0,65, RfE 0,20, R,F 0,43, RfH 0,50.

Stufen (0) und (ß)

0,77 ml (4,64 mMol) 6,Ö2n Chlorwasserstoff in Dioxan wurden zu einer auf —20 °C abgekühlten und gerührten Lösung von 0,502 g (1,16 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-serinhydrazid in 5 ml Dimethylformamid zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,14 ml (1,22 mMol) t-Butylnitrit anschloss. Nach 30 min wurde die Lösung auf —30 °C abgekühlt und durch Zusatz von 0,65 ml (4,65 mMol) Triäthylamin neutralisiert. Ein auf —20 °C vorgekühltes Gemisch von 0,547 g (0,77 mMol) L-Tyrosylazaglycyl-L-leucyl-L-argmyl-L-prolin-äthylamid-dihydrochlorid und 0,108 ml (0,77 mMol) Triäthylamin in 5 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Rühren wurde 1 st bei —20 °C und 48 st bei 4 °C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnen-chromatografie unter Verwendung von Chloroform, 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform und einem Gemisch von Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluierlösungsmittel gereinigt, Ausbeute 0,424 g (52,9%), [a]D2S-16,84° (c, 1,5 in Methanol), RfA 0,61, RfC 0,36, RfD 0,67, RfK 0,90.

Stufe @ (R=Me)

Wie Stufe © , Ausbeute 66%, Fp 102-104 °C, [ß]D24—15,5° (c, 1 in Methanol), R,D 0,76, R,E 0,68, RfF 0,76, RfH 0,74.

Stufe (22) (R=Me)

Wie Stufe © , Ausbeute 43%, [a]D25—25,9° (c, 1 in Methanol), R,A 0,72, RfB 0,76, RfC 0,85.

Wie Stufe (ó)

Stufe © (R=Me)

Stufe 0 (R=Me)

Wie Stufe (7) , Ausbeute 93%, Fp 145—146 °C, [a]D25+8,7° (c, 1,2 in Methanol), R,A 0,88, RfB 0,88, RfC 0,83, RfD 0,80, RfE 0,59, R,F 0,78, RfH 0,73.

Stufe ©

12 ml (12 mMol) In Natriumhydroxyd wurden zu einer gerührten Lösung von 2,41 g (4 mMol)

N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-azalanyl-L-leucin-methylester in 36 ml Methanol bei Raumtemperatur zugegeben, und das Rühren wurde 3 st fortgesetzt. Das Methanol wurde im Vakuum entfernt und 40 ml einer wässrigen Lösung, die unter Verwendung des Rückstandes hergestellt worden war, wurde mit Zitronensäure auf pH 3 angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Nach dem Waschen des Äthylacetatextraktes mit Wasser und Trocknen (Na2S04) wurde das Lösungsmittel eingedampft, worauf der Rückstand in 200 ml eines Gemisches aus Dimethylformamid und Wasser (3:2 V/V) auf 100 ml einer Kolonne eines AG 1 x-2-Harzes aufgegeben wurde. Die Kolonne wurde mit 50 ml des obigen Lösungsmittels gewaschen und das Tripeptid wurde mit 0,2m Essigsäure in Dimethylform-amid/Wasser (3:2 V/V) eluiert. Die Tripeptid enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde mit Äther trituriert und gesammelt, Ausbeute 1,22 g (51,7%), Fp 195 °C (Zersetzung), [«]d24—25,4° (c, 1 in Dimethylformamid).

Wie Stufe © .

Stufe (23) (R=Me)

Stufe @ (R=Me)

Wie Stufe (l5) , ausser dass das Endprodukt auch durch 10 Gelfiltration auf Sephadex LH-20 in Dimethylformamid nach Silicagelkolonnenchromatografie gereinigt wurde, Ausbeute 63%, [ö1d25-24,76°, (c, 0,8 in Methanol), R£A 0,58, RfC 0,42, R,D 0,65, R(K 0,95.

15 Stufe ©

Zu 24,9 g (100 mMol) einer gerührten und auf 0 °C abgekühlten Suspension von N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin, 11,2 g (100 mMol) Semicarbazidhydrochlorid und 14,5 ml (100 mMol) Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid wurden 20 20,6 g (100 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Rühren wurde 16 st bei 4 °C fortgesetzt. Dicyclohexyl-harnstoff wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde auf ein kleines Volumen eingedampft. 200 ml Wasser wurden zugegeben und die Lösung wurde mit 3mal 50 ml Äthylacetat 25 extrahiert. Das Produkt fiel aus der wässrigen Lösung in ungefähr 1 st aus. Umkristallisation aus wässrigem Methanol ergab das Dipeptidamid, Ausbeute 16,5 g (53,9%), Fp 189—190 °C, [cc]D24-43,6° (c, 1,4 in Dimethylformamid), RfD 0,54, RfF 0,52, RfH 0,38, RfK 0,78.

30

Stufe ©

Katalytische Reduktion über 5 %igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in 80%igem (V/V) wässrigem Dimethylformamid während 6 st bei Raumtemperatur in Gegen-35 wart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe ©

2,83 ml (29,5 mMol) Äthylchloroformiat wurden zu einer Lösung von 8,24 g (31 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin 40 und 4,55 ml (32,5 mMol) Triäthylamin in 100 ml Tetrahydrofuran bei —10 bis -15 °C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 min bei dieser Temperatur gerührt und wurde dann in eine heftig gerührte Lösung von 5,79 g (31 mMol) Nm-Ni-tro-L-arginin in 15,5 ml (31 mMol) 2n Natriumhydroxyd und 45 50 ml Dimethylformamid bei -10 °C eingeschüttet. Das Rühren wurde 30 min bei—10 °C und dann 1 st bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zwischen 50 ml Äthylacetat und 50 ml Wasser verteilt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt 50 und mit zwei weiteren Portionen Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 25 ml Wasser gewaschen und verworfen. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit gesättigter Zitronensäurelösung angesäuert und mit dreimal 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylace-55 tatextrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über Na2S04 getrocknet und zur Trockne eingedampft. Umkristallisation des Rückstandes aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 60-80 °C) ergab das Dipeptid, Ausbeute 8,98 g, (62%), Fp 150—165 °C (Zersetzung).

60

Stufe ©

Eine Lösung von 9,2 g (20 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl)-N'"-nitro)-L-arginin, 4,2 g (20 mMol) L-Prolylaza-glycinamidhydrochlorid, 5,4 g (40 mMol) 1-Hydroxybenzo-65 triazol und 3 ml (20 mMol) Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid wurde auf 0 °C abgekühlt und 8,2 g (40 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dicy-

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12

clohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Umkristallisation des Rückstandes aus Methanol/Äther ergab das Tetrapeptidderi-vat, Ausbeute 12,2 g (98,3%), Fp 88 bis 90 °C, [a]D24-30,2° (c, 1,6 in Dimethylformamid), RfD 0,57, RfF 0,40, RfH 0,26, RfK 0,63.

Stufe @

Hydrierung über 5 %igem (G/G) Palladium-auf-Holzkoh-le-Katalysator in wässrigem Äthanol während 16 st in Gegenwart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe 0

6,484 g (11,0 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-ty-rosin-2,4,5-trichlorophenylester und 1,396 g (10 mMol) D-Alanin-methylesterhydrochlorid wurden in 50 ml Dimethylformamid aufgelöst und 1,4 ml (10,0 mMol) Triäthylamin wurden zur Lösung zugegeben, die über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und der Rückstand wurde aus heissem Äthylacetat kristallisiert, Ausbeute 3,782 g (77,2%), des geschützten Dipeptidmethylesters, Fp 163 °C, [a]D24'8-12,84° (c, 1,1 in Dimethylformamid).

Stufe @

3,435 g (7,0 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-ty-rosyl-D-alanin-methylester wurden in 400 ml warmem Methanol aufgelöst und die Lösung wurde mit 10 ml (120 mMol) 62%igem (G/V) Hydrazinhydrat behandelt und das Gemisch wurde über Nacht bei 25 °C stehengelassen. Das Hydrazid wurde abfiltriert, mit Methanol und Äther gewaschen und zweimal aus siedendem Methanol kristallisiert, Ausbeute 3,068 g (89,2%), Fp 217 °C, [a]D24-20,44° (c, 1,1 in Dimethylformamid) RfA 0,73, RfB 0,75, RfC 0,67, RfD 0,70, R£E 0,50, RfF 0,54, RfH 0,67, RfK 0,85, RfQ 0,25.

Stufen (55) und ^3)

Zu einer auf —20 °C abgekühlten und gerührten Lösung von 1,18 g (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-ty-rosyl-D-alanin-hydrazid wurden 1,6 ml (9,6 mMol) einer 6,02m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,29 ml (2,52 mMol) t-Butylnitrit anschloss. Nach 15 min wurde eine auf -20 °C vorgekühlte Lösung von 1,03 g (2,0 mMol)

L-Leucyl-L-arginyl-L-prolylazaglycinamid-dihydrochlorid und 1,62 ml (11,6 mMol) Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Rühren wurde 24 st bei 4 °C fortgesetzt. Triäthylaminhydrochlorid wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Silicagelkolonne aufgegeben und die Kolonne wurde mit 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform, 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform und einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft und das Peptid wurde nochmal auf einer Silicagelkolonne unter Verwendung von Acetoni-tril/Wasser (3:1 V/V) als Eluiermittel chromatografiert. Ausbeute 890 mg (46,4%), [a]D2S-45,7° (c, 1,1 in Methanol), RfA 0,54, RfB 0,69, RfC 0,41.

Stufe @

Wie Stufe (ÏÏ) .

Stufe @

Wie Stufe 15 , Ausbeute 43%, [a]D2s-41,4° (c, 1,3 in Methanol), RfA 0,80, RfC 0,47, RfD 0,65, RfK 0,95.

Stufe (38)

Wie Stufe (3) , Ausbeute 69%, Fp 135 °C, RfA 0,49, RfB 0,65, RfC 0,46, RfD 0,64, R,F 0,35, RtH 0,19, RfK 0,86.

5 Stufe (3^)

Wie Stufe ®-

Stufe (4CÎ) (A=D-Phe)

Eine Lösung von 7,41 g (24,8 mMol) N-Benzyloxycarbo-10 nyl-D-phenylalanin und 3,62 g (25 mMol) L-Leucinmethyl-ester in 100 ml Äthylacetat wurde auf 0 °C abgekühlt und 5,15 g (25 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 °C gerührt. Die übliche Aufarbeitung und anschliessende Umkristallisation des 15 Rückstandes aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 60-80 °C) ergab das Dipeptid, Ausbeute 9,1 g (86%), Fp 123 bis 124°C, [a]D26-18,7° (c, 2,1 in Methanol), RfD 0,76, RfE 0,65, RtF 0,74, RfH 0,73.

20 Stufe @ (A=D-Phe)

Katalytische Reduktion über einem 5 %igem (G/G) Palla-dium-auf-Holzkohle-Katalysator in Äthanol mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 5 st.

*

25 Stufe @ (A=D-Phe)

Zu einer gerührten Lösung von 4,89 g (8,36 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorphenyle-ster und 2,5 g (7,6 mMol) D-Phenylalanyl-L-Ieucin-methyle-ster-hydrochlorid in Dimethylformamid wurden 1,1 ml (7,6 30 mMol) Triäthylamin zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Triäthylaminhydrochlorid wurde abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Umkristallisation des Rückstandes aus wässrigem Methanol ergab das Tripeptidderivat, Ausbeute 3,6 g (69,7 %), 3S Fp 183-184 °C, RfD 0,82, RtE 0,69, RfH 0,78, RfP 0,71, RfQ 0,82.

Stufe @ (A=D-Phe)

Eine Lösung von 3,42 g (5,04 mMol) des vorstehenden 40 Methylesters und 60 mMol Hydrazinhydrat in 30 ml Dimethylformamid wurde bei Raumtemperatur 4 st lang gerührt und auf ein kleines Volumen konzentriert, worauf das Hydrazid durch Zusatz von 500 ml Wasser ausgefällt wurde. Es wurde gesammelt, mit Wasser, Methanol/Äther (1:4 V/V) und Äther 45 gewaschen und getrocknet, Ausbeute 2,94 g, (85,9%), Fp 179-180 °C, RfA 0,81, RfB 0,79, RfC 0,88, RfD 0,69, RfE 0,49, RfF 0,65, RfH 0,67, RfP 0,25, RfQ 0,57.

50 Stufen und ^5) (A=D-Phe)

1,83 ml (11 mMol) einer 6,Ö2m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan wurden zu einer Lösung von 1,85 g (2,75 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-phenyla-lanyl-L-leucin-hydrazid in 5 ml Dimethylformamid bei —20 °C 55 zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,33 ml (2,89 mMol) t-Butylnitrit anschloss. Nach 2 min wurde eine auf -20 °C vorgekühlte Lösung von 1,89 ml (13,5 mMol) Triäthylamin und 1,02 g (2,5 mMol) N'"-Nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycin-amid-hydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid zugegeben, 60 worauf das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4 °C gerührt wurde. Die übliche Aufarbeitung ergab das Hexapeptidderivat, das weiter durch Silicagelkolonnenchromatografie (120 g Sili-cagel) unter Verwendung von 5 %igem (V/V) Methanol in Chloroform, 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform und ei-65 nem Gemisch von Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluierlösungsmittel gereinigt wurde, Ausbeute 0,74 g, (29,3%), Fp 137-139 °C, RfA 0,68, R,B 0,72, R,C 0,58, RfD 0,62, RfH 0,39, RfK 0,95.

13

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Stufen ^6) , und ^8)

10 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidin-hydrazid wurden in das Azid überführt, wie es beim Verfahren (a) beschrieben ist, und dann mit 11 mMol L-Tryptophyl-L-serin-methylester (hergestellt durch Hydrierung des N-Benzyloxycarbonylderi-vats über einem 5 %igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Ka-talysator in Dimethylformamid) während 30 min bei -10 °C und 24 st bei 4 °C gekuppelt. Triäthylaminhydrochlorid wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Das rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnen-chromatografie unter Verwendung von 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform, 20%igem (V/V) Methanol in Chloroform und einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluiermittel gereinigt, Ausbeute 70%, Fp 142-145 °C, (Zersetzung), RfA 0,39, RfB 0,72, RfC 0,45, RfD 0,48, RfK 0,61. _

Stufe @

5,4 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-se-rin-methylester wurden in 70 ml Dimethylformamid aufgelöst und mit 100 mMol Hydrazinhydrat 4 st behandelt. Dimethylformamid wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Äthanol trituriert, gesammelt, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet (88,2%), Fp 184 bis 189 °C, RfA 0,18, RfB 0,55, R,C 0,39, RfD 0,27, R,K 0,58.

Stufe 0 (A=D-Trp)

4,87 g (23,6 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu einer Lösung von 7,27 g (21,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-D-tryptophan, 3,12 g (21,5 mMol) Leucinmethylester und 5,8 g (43 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol in 50 ml Dimethylformamid bei 0 °C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und in der üblichen Weise aufgearbeitet. Umkristallisation aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 60-80 °C) ergab 9,55 g des Dipeptidderivats, welches bei Dünnschichtchromatografie Spuren von Verunreinigungen zeigte. Es wurde durch Silicagelkolonnenchromatogra-fie (300 g Silicagel) unter Verwendung von Chloroform und 5 %igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Ausbeute 9,18 g (91,7%), Fp 151-153 °C, RfA 0,84, RfB 0,80, RfC 0,86, RfD 0,78, RfE 0,61, RfF 0,68, R{H 0,73, RfP 0,55, RfQ 0,73.

Stufe @ (A=D-Trp)

Katalytische Reduktion in 80%igem (V/V) wässrigem Dimethylformamid über 5 %igem (G/G) Palladium-auf-Holzkoh-le-Katalysator während 5 st.

Stufe 0 (A=D-Trp)

Eine Lösung von 11,69 g (20 mMol) N-Benzyloxycarbo-nyl-0-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorphenylester und 6,26 g (19 mMol) D-Tryptophyl-L-leucin-methylester in 100 ml Dimethylformamid wurde 60 st bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und der Rückstand wurde aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 60-80 °C) kristallisiert. Dabei wurde das Tripeptidderivat erhalten, Ausbeute 8,52 g, (62,5%), Fp 165-166 °C, RfA 0,78, RfB 0,73, RfC 0,84, RfD 0,80, R,E 0,62, R,F 0,70, RfH 0,76, RfP 0,58, RfQ 0,68.

Stufe 0 (A=D-Trp)

Eine Lösung von 7,26 g (10,1 mMol) N-Benzyloxycarbo-nyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucin-methylester in einem Gemisch aus 200 ml Methanoi und 50 ml Dimethylformamid wurde mit 100 mMol Hydrazinhydrat bei Raumtemperatur behandelt. Nach 24 st wurde die Lösung auf ungefähr 30 ml konzentriert, worauf 500 ml Wasser zugegeben wurden. Das Tripeptidhydrazid wurde gesammelt, mit Wasser, Methanol/Äther (1:4 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet,

Ausbeute 6,86 g (94,6%), Fp 200-202 °C, RtA 0,90, R{B 0,95, RfC 0,90, RfD 0,74, RfQ 0,59.

Stufen @ und 0 (A=D-Trp)

Eine gerührte und auf -20 °C abgekühlte Lösung von 1,97 g (2,75 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyro-syl-D-tryptophyl-L-leucin-hydrazid in 10 ml Dimethylformamid wurde mit 1,83 ml (11 mMol) einer 6,02m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan und dann mit 0,33 ml (2,89 mMol) t-Butylnitrit behandelt. Nach 2 min wurde eine auf —20 °C vorgekühlte Lösung von 1,02 g (2,5 mMol) N"'-Nitro-L-argi-nyl-L-prolyl-azaglycerin-amid-hydrochlorid und 1,89 ml (13,5 mMol) Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 °C gerührt. Es wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet, und der Rückstand (1,27 g) wurde auf eine Silicagelkolonne (230 g Silicagel) aufgegeben. Die Kolonne wurde mit Chloroform und 5 %igem (V/V) Methanol in Chloroform eluiert, Ausbeute 0,911 (34,4%), Fp 139-140 °C (Zersetzung), RfA 0,67, RfB 0,72, RfC 0,58, RfD 0,62, RfH 0,34, RfK 0,95.

Stufe 0 (A=D-Tyr(Me))

Eine Lösung von 3,17 g (9,64 mMol) Z-D-Tyr(Me)-OH, 1,92 g (10,6 mMol) H-Leu-OMe.HCl, 2,6 g (19,2 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 1,6 ml (11 mMol) Triäthylamin in 30 ml Dimethylformamid wurde auf 0 °C abgekühlt und 2,29 g (11,1 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 °C gerührt und in der üblichen Weise aufgearbeitet. Umkristallisation aus heissem Cyclohexan ergab das geschützte Dipeptidderivat. Ausbeute 1,41 g (95,2%), RfD 0,83, RfE 0,69, RfP 0,72, RfQ 0,76.

Stufe 0 (A=D-Tyr(Me))

Katalytische Reduktion über 5 %igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in Methanol/Dimethylforma-mid/Wasser (8:1:1) mit einem Gehalt an 1,2 Äquivalenten Chlorwasserstoff während 3 st.

Stufe 0 (A=D-Tyr(Me))

Eine Lösung von 8,2 mMol Z-Tyr(Bzl)-OCp, 8,2 mMol HD-Tyr(Me)-LeuOMe.HCl und 8,2 mMol Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Gemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet. Das Produkt wurde mit Äther filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 81,2%, Fp 191-192 °C, RfD 0,85, RfE 0,73, RfF 0,72, RfQ 0,78.

Stufe 0 (A=D-Tyr(Me))

12,9 mMol Hydrazinhydrat wurden zu einer Lösung von 4,59 g (6,4 mMol) Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe in 25 ml Dimethylformamid und 50 ml Methanol zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Methanol wurde im Vakuum entfernt und das Produkt wurde mit Wasser ausgefällt, gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Fp 212-213 °C, RfE 0,49, RfF 0,66, RfH 0,69, R(Q 0,70.

Stufen (60) und (0 (A=D-Tyr(Me))

3,54 g (5,0 mMol) des Hydrazids aus Stufe 0) wurden in 10 ml DMF aufgelöst und die gerührte Lösung wurde auf —20 °C abgekühlt. 3,38 ml (20 mMol) 5,92m HCl in Dioxan wurden zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,6 ml (5,25 mMol) t-Butylnitrit anschloss. Nach 2 min wurde eine vorgekühlte Lösung von 2,04 g (5 mMol) H-Arg(N02)-Pro-Az-gly-NH2.HCl und 3,55 ml (25 mMol) Triäthylamin in 10 ml DMF zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei 4 °C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen

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Weise aufgearbeitet und das rohe Produkt wurde durch Silica-gelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform, 5%igem (VA') Methanol in Chloroform und 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Ausbeute 3,72 g (70,9%), RfA 0,64, RfB 0,72, RfC 0,55, RfD 0,66, RfF 0,40, RfH 0,52.

Stufe 0 (A=D-Ser(Bu'))

Wie Stufe (0) . Das Produkt wurde aus wässrigem Methanol kristallisiert. Ausbeute 90,4%, Fp 107-108 °C, RfD 0,80, RfE 0,68, RfF 0,73, RfH 0,72, R,P 0,72, R,Q 0,74.

Stufe 0 (A=D-Ser(Bu'))

Katalytische Reduktion über 5 %igem (G/G) Palladiumauf-Holzkohle-Katalysator in DMF/Wasser (8:2) während 5 st.

Stufe @ (A=D-Ser(Bu1))

Eine Lösung von 19,17 g (32,7 mMol) Z-Tyr(Bzl)-OCp und 32,7 mMol H-Ser(Bu')-Leu-OMe in 100 ml Dimethylformamid wurde 72 st bei Raumtemperatur stehengelassen. Übliche Aufarbeitung ergab einen Feststoff, der gesammelt, mit Äther gewaschen und getrocknet wurde. Ausbeute 17,6 g (79,4%) Fp 135-137 °C, RfD 0,80, RfH 0,77, RfQ 0,81.

Stufe (0) (A=D-Ser(Bu1))

Wie Stufe (59) . Umkristallisation aus wässrigem Methanol, Ausbeute 5(^2%, Fp 134—136 °C, RfD 0,66, RfH 0,64, RfQ 0,64.

Stufen (0) und (§7) (A=D-Ser(But)) Wie Stufen (60) und . Das Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform und 5 %igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Ausbeute 38,5%, Fp 142—145 °C, RfA 0,64, RfB 0,71, RfC 0,55, RfD 0,65, RfF 0,46, R,H 0,43, RfQ 0,16.

Stufe @ (A=D-Tyr(Me))

5,13 g (24,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu einer auf 0 °C abgekühlten und gerührten Lösung von 22,6 mMol Z-D-Tyr-(Me)-OH, 5,98 g (24,9 mMol) 1-Hydroxy-benzotriazol in 50 ml DMF zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei 4 °C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und das Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform als Lösungsmittel gereinigt. Ausbeute 55,2%, Öl, RfD 0,83, RfE 0,78, RfH 0,79, R,P 0,80, RfQ 0,79.

Stufe ((59) (A=D-Tyr(Me))

Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in Methanol/Wasser (8:2 V/V) mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 6 st.

Stufe @) (A=D-Tyr(Me))

Wie Stufe ^8) . Das Produkt wurde durch Silicagelko-lonnenchromatografie unter Verwendung von Äther als Lösungsmittel gereinigt.

Stufe (A=D-Tyr(Me))

Eine Lösung von 4,85 g (6,69 mMol) Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-MeLeu-OMe und 120,7 mMol Hydrazinhydrat in 150 ml Methanol wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Hydrazid wurde durch Zusatz von Wasser ausgefällt, gesammelt und aus Methanol/Wasser kristallisiert. Ausbeute 91,1%, Fp 129-131 °C, RfD 0,79, RfE 0,60, RfF 0,68, R,H 0,73, R,Q 0,77.

Stufen (72) und (§) (A=D-Tyr(Me)) Umkristallisiert aus Methanol/Äther, Ausbeute 23,8%, Fp 152 bis 154 °C, RfA 0,67, RfB 0,68, RfC 0,58, R,D 0,59, R,H 0,50, R,K 0,94, RfQ 0,35.

Beispiele 9 und 10 Durch Anwendung eines der in den Beispielen 1 bis 8 aufgeführten allgemeinen Verfahren (m) oder (n) können die folgenden Verbindungen hergestellt werden.

Qjlu-His-Trp-Ser-A-B-Arg-Pro-Azgly-NH2

Bei- A B Papierelektrophorese Rf RfA

spiel (bezogen auf Luliberin)

Nr. ph 2,1 pH 6,5

9 D-Ser Leu 0,94 0,96 0,25

10 D-Phe MeLeu 0,84 0,87 0,35

Beispiel 11

Die Verbindung der Formel I, worin A für D-Ser(Bu') steht, B für Leu steht, E für Azgly steht und F für NH2 steht, wurde wie in Schema 6 angegeben hergestellt, wobei Reaktionsbedingungen und Aufarbeitungsverfahren angewandt wurden, die den für entsprechende Kupplungsreaktionen in den vorhergehenden Beispielen analog sind. Das Produkt hatte die gleichen analytischen Eigenschaften wie dasjenige von Beispiel 7.

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5

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20

25

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45

D

Glu His Trp Ser

Tyr

D-Ser(Bufc) Leu

Arg

Pro

Z-Z

• Nj H-

i^Bz!

Bzl

-N-j

Boc ■ Bo'c-H-

/

N0o

■JOH H. NO-,

NO.

NO,

/

H

-OMe -OMe -OMe •OMe

-OMe -OMe

-MHNH.

-N,

Azgly

H

NH-

-NH,

OS

N) •>1

Claims

627 151

1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der Formel:

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I

worin A für D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu'), D-Phe, D-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht oder A für Azgly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine direkte Bindung steht und F für ein Äthylaminoradikal steht; sowie den pharmazeutisch und Veterinär zulässigen Säureadditionssalzen derselben, dadurch gekennzeichnet, dass man

^Glu-OH, ^Glu-His-OH, ^Glu-His-Trp-OH,

^GIu-His-Trp-Ser-OH, ßlu-His-Trp-Ser-Tyr-OH,

I-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH,

^GIu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OH,

^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH oder

'-GIu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH

oder ein aktiviertes Derivat davon mit H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F, H-Arg-Pro-E-F,

H-Pro-E-F bzw. H-Azgly-NH2

oder einem aktivierten Derivat davon in einer Standardpeptid-kupplungsreaktion umsetzt und das erhaltene Produkt, wenn es in der unprotonierten Form vorliegt, mit einer Säure, die ein pharmazeutisch oder Veterinär zulässiges Anion liefert, umsetzt, falls man ein Salz herzustellen wünscht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als aktiviertes Derivat der ersten Komponente ein Azid verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass A für D-Ser(Bu') steht, B für Leu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.