CH627190A5

CH627190A5 -

Info

Publication number: CH627190A5
Application number: CH861377A
Authority: CH
Inventors: Alfred Dr Weber; Mario Dr Kennecke; Helmut Dr Dahl
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1976-07-16
Filing date: 1977-07-12
Publication date: 1981-12-31
Also published as: HU179344B; DE2632677C2; ATA504677A; FR2372175A1; US4179336A; FR2365588B1; DK323677A; IE45304L; DK142372B; GB1585786A; YU164277A; IE45304B1; BE856860A; DD136141A5; HU182789B; DD136142A5; CS200517B2; JPS5315493A; CH629222A5; AT363196B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Androstan-17-on-Derivaten der allgemeinen Formel I

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worin die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbin-

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worin Ri und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen, die

Bindungen Einfachbindungen oder Doppelbindungen darstellen, R4 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder is eine Äthylgruppe bedeutet, charakterisiert werden können.

Besonders geeignete Sterin-Derivate der allgemeinen Formeln IIa und IIb sind die A4-Steroide und die 5 a-Sterin-Derivate dieser Formeln.

Es ist bekannt, dass zahlreiche Mikroorganismen (so zum 20 Beispiel solche der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Nocardia, Strepto-myces und insbesondere Mycobacterium) die natürliche Fähigkeit besitzen, Zoo- und Phytosterine zu Kohlendioxyd und Wasser abzubauen und dass bei diesem Abbau intermediär 4-An- 25 drosten-3,17-dionund l,4-Androstadien-l,17-dion gebildet werden.

Da zahlreiche Zoo- und Phytosterine (wie zum Beispiel das Cholesterin, das Stigmasterin, das Campesterin, das Brassica-sterin oder die Sitosterine) in der Natur weit verbreitet und 30 somit leicht zugängliche Rohstoffe für die Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide sind, wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, den Abbau der Sterine so zu lenken,

dass bei der Fermentation ein weiterer Abbau des gebildeten 4-Androsten-3,17-dions und des l,4-Androstadien-3,17-dions 3s verhindert wird.

So war es beispielsweise möglich, den weiteren Abbau von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion dadurch zu verhindern, dass man den Fermentationsansätzen Inhibitoren zusetzt. (Siehe deutsche Offenlegungsschriften 40 1 543 269 und 1 593 327, sowie die US-Patentschrift 1208 078.) Durch die Verwendung von Inhibitoren wird aber eine technische Durchführung dieser Umsetzungen sehr aufwendig; dies nicht zuletzt deshalb, weil die verwendeten Inhibitoren nach erfolgter Umsetzung aus den Fermentationskultu- 4S ren entfernt werden müssen, um zu vermeiden, dass diese Stoffe in die Abwässer gelangen. Darüberhinaus haben diese bekannten Umsetzungen den Nachteil, dass bei ihnen stets 1,4-Androstadien-3,17-dion oder Gemische von 1,4-Androsta-dien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion gebildet werden. so Das gebildete l,4-Androstadien-3,17-dion ist aber als Ausgangssubstanz für die Synthese zahlreicher pharmakologisch wirksamer Steroide wenig geeignet.

Andererseits konnte der weitere Abbau von 1,4-Androsta-dien-3,17-dion und von 4-Androsten-3,17-dion auch dadurch ss verhindert werden, dass man zur fermentativen Umwandlung der Sterine mutierte Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium verwendete. (Siehe US-Patentschrift 3 684 657.) Die bisher gezüchteten Mutanten haben aber den Nachteil, dass sie nur eine sehr begrenzte Fähigkeit besitzen, 60 aus Sterinen l,4-Androstadien-3,17-dion oder 4-Androsten-3,17-dion zu bilden.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Seitenkettenabbau von Sterinen zu erstellen, dem die Nachteile der bekannten Verfahren nicht anhaften. 6s

Diese Aufgabe wurde durch die Bereitstellung eines Verfahrens gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II mit einer zum Sei-

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(IIb),

tenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.

Für den Fachmann ist es sehr überraschend, dass bei dieser fermentativen Umwandlung in hohen Ausbeuten die Andro-stan-17-on Derivate der allgemeinen Formel I gebildet werden. Dies deshalb, weil bekannt ist, dass der Seitenkettenabbau von Sterinen durch ein sehr komplexes Fermentsystem bewirkt wird und man nicht erwarten konnte, dass alle am Seitenkettenabbau natürlicher Steroide mitwirkenden Enzyme die Fähigkeit besitzen, auch den Seitenkettenabbau der in der Natur nicht vorkommenden Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II zu bewirken. Darüberhinaus konnte man nicht vorhersehen, dass die den Abbau des l,4-Androstadien-3,17-dions und des 4-Androsten-3,17-dions bewirkenden Enzymsysteme nicht befähigt sind, die Androstan-17-on-Derivate der allgemeinen Formel I abzubauen.

Abgesehen von der Verwendung anderer Ausgangsverbin-dungen und von der Tatsache, dass die Umsetzung in Abwesenheit von Inhibitoren durchgeführt werden kann, kann das erfindungsgemässe Verfahren unter den gleichen Fermentationsbedingungen durchgeführt werden, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Seitenkettenabbau-Reaktio-nen von Sterinen anwendet.

Erfindungsgemäss kann die Fermentation unter Verwendung der Mikroorganismenkulturen durchgeführt werden, welche man üblicherweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen verwendet. Geeignete Kulturen sind beispielsweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Bakterienkulturen der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium. Als geeignete Mikroorganismen seien beispielsweise genannt: Microbacterium lactum IAM-1640, Protaminobacter alboflavus IAM-1040, Bacillus roseus IAM-1257, Bacillus sphäricus ATTC-7055, Nocardia gardneri IAM-105, Nocardia minima IAM-374, Nocardia corallina IFO-3338, Streptomyces rubescens IAM-74 oder insbesondere die Mikroorganismen Mycobacterium avium IFO-3082, Mycobacterium phlei IFO-3158, Mycobacterium phlei (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 29), Mycobacterium phlei ATCC-354, Mycobacterium smegmatis IFO-3084, Mycobacterium smegmatis ATCC-20, Mycobacterium smegmatis (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 27), Mycobacterium smegmatis ATCC-19979, Mycobacterium fortuitum CBS-49566, Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 und Mycobacterium spec. NRRL-B-3683.

Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden vorzugsweise in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen in der Regel das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonoethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, in dem man dieses in mikronisier-

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ter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polygly-kolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin(R), Tagat(R), Tween(R) und Span(R) beispiels-mässig genannt.

Häufig ermöglicht die Emulgierung der Substrate einen erhöhten Substratdurchsatz und somit eine Steigerung der Substratkonzentration. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, bei dem erfindungsgemässen Verfahren andere Methoden zur Steigerung des Substratdurchsatzes, wie sie dem Fermentationsfachmann wohl bekannt sind, anzuwenden.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus abhängig. Diese Grössen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungeii allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.

Die erfindungsgemäss hergestellten Androstan-17-on-Derivate der allgemeinen Formel I sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung pharmakologisch wirksamer Steroide.

Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren bezieht sich auf die Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel

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worin die Bindung—r. di e weiter oben genannte Bedeutung besitzt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zuerst ein Androstan-17-on-Derivat der allgemeinen Formel Ia

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herstellt, worin -, Ri und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen, in Gegenwart von H+-Ionen oder Lewis-Säuren spaltet.

Diese Spaltung wird vorzugsweise unter den Bedingungen durchgeführt, welche man konventionellerweise zur Hydrolyse oder Alkoholyse von Acetalen anwendet. So kann man beispielsweise die Verbindungen spalten, indem man sie in einem niederen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol oder in einem wasserhaltigen organischen Lösungsmittel wie Glykolmanome-thyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid,

Dimethylsulfoxyd, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Aceton mit einer Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Perchlorsäure, einer Sulfonsäure wie p-Toluolsul-fonsäure einer stark aciden Carbonsäure wie Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, saure Ionenaustauscher, oder mit einer Levis-Säure wie Bortrifluorid, Zinkchlorid oder Zinkbromid umsetzt.

Auf diesem Wege lässt sich beispielsweise in einfacher Weise 3ß-Hydroxy-5-androsten-17-on herstellen, dessen Ester bekanntlich pharmakologisch wirksame Substanzen sind. (Chem. Abstr. 65,1966, 12264f) und Deutsche Offenlegungsschrift 1 643 046.

Die Ausgangsverbindungen für das erfindungsgemässe Verfahren sind bekannt, oder können mittels bekannter Methoden hergestellt werden (J. Pharm. See. 54,514 [1965]; Can. J. Chem. 49, 2418 [1971], Synthesis 1975, 276, und 1976, 244, Tetrahedron Letters 1976, 809 Can. J. Chem 50, 2788 [1972] und Bull. Soc. Chim. France 1960, 297).

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung:

A) Ausführungsbeispiele betreffend den mikrobiologischen Seitenkettenabbau

Beispiel 1

a) ein 750 ml Erlenmeyerkolben wird mit 200 ml einer sterilen Nährlösung, enthaltend 1% Hefeextrakt, 0,45% Dina-triumhydrogenphosphat, 0,34% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2% Tagat(R)02 - eingestellt auf pH 6,7 - beschickt, mit einer Abschwemmung einer Trockenkultur von Microbacterium spec. NRRL-B-3805 beimpft und 3 Tage lang mit 190 Umdrehungen pro Minute bei 30 °C geschüttelt.

b) Ein 501 Fermenter mit 40 1 einer sterilen Nährlösung, enthaltend 1,23% Hefeextrakt (65%ig), 0,68% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2% Tagat(R)02 - eingestellt auf pH 6,0 - wird mit 200 ml der Microbacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und die Vorkultur bei 30 °C unter Belüftung (2 m3 pro Stunde) 48 Stunden lang ineubiert.

c) 400 g Cholesterin werden in 61 Formaldehyddimethyl-acetal gelöst, unter Rühren bei Raumtemperatur mit 400 g Kieselgur und portionsweise mit 200 g Phosphorpentoxid versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird vom Unlöslichen abfiltriert, mit Formaldehyddimethylacetal gewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Nach Zugabe von Natriumhydrogencarbonatlösung wird das feste Rohprodukt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und man erhält nach Trocknung 440 g 3ß-Methoxymethoxy-5-cholesten. Die aus Aceton umkristallisierte Verbindung schmilzt bei 79 bis 80°C.

400 g des so dargestellten 3ß-Methoxymethoxy-5-chole-stens werden mit 120 g Tegin(R), 10 1 vollentsalztem Wasser und 40 ml ln-Natronlauge bei 95°C mit einem Dispax(R)-Reaktor DR-3-6-6 (Firma Jahnke und Kunkel, Bundesrepublik Deutschland) 30 Minuten lang emulgiert. Man sterilisiert die Emulsion 20 Minuten bei 120°C.

d) Ein 50 1 Fermenter wird mit 40 1 steriler Nährlösung, enthaltend 2,0% Cornsteep liquor, 0,3% Diammoniumhydro-genphosphat und 0,25 % Tagat(R->02 - eingestellt auf pH 6,5 -beschickt, mit 2 1 Mycobacterium spec. Vorkultur beimpft und unter Belüften (0,5 m3 pro Stunde) und Rühren (250 Umdrehungen pro Minute) 24 Stunden lang bei 30°C ineubiert. Dann setzt man der Kultur die gemäss Abschnitt c) hergestellte 3ß-Methoxymethoxy-5-cholesten-Emulsion zu und fermentiert weitere 120 Stunden lang.

Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur 3mal mit je 5 1

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Äthylenchlorid extrahiert, der Äthylenchloridextrakt filtriert und im Vakuum eingeengt.

Der Rückstand (156 g) wird über eine Kieselgelsäule chro-matographiert, aus Äthylacetat umkristallisiert und man erhält 86 g 3ß-Methoxymethoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 129/131 bis 132°C.

Beispiel 2

a) Ein 2 1 Erlenmeyerkolben mit 500 ml sterilem Nährmedium wird unter den Bedingungen des Beispiels la) mit Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 angezüchtet.

b) 10 g Sitosterin werden, wie im Beispiel lc) beschrieben, umgesetzt und man erhält 11g 24-Äthyl-3ß-methoxymethoxy-5-cholesten. Die aus Aceton umkristallisierte Verbindung schmilzt bei 70 bis 71°C.

10 g des so dargestellten 24-Äthyl-3ß-methoxymethoxy-5-cholestens werden mit 4 g Tegin(R) und 300 ml Wasser bei 95°C mit einem Ultra-Turrax(R) (Firma Jahnke und Kunkel, Bundesrepublik Deutschland) 10 Minuten emulgiert. Man sterilisiert die Emulsion 20 Minuten lang bei 120°C.

c) 20 Erlenmeyerkolben mit jeweils 85 ml sterilem Nährmedium, enthaltend 2,0% Cornsteep liquor, 0,3% Diammonium-hydrogenphosphat und 0,25 % Tagat(R)02 - eingestellt auf pH 6,5 - werden mit jeweils 5 ml der Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und 24 Stunden lang bei 30°C mit 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

Dann setzt man jeder Kultur 14 ml der 24-Äthyl-3ß-meth-oxymethoxy-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 24-Äthyl-3ß-methoxymethoxy-5-cholesten) zu und fermentiert weitere 120 Stunden lang bei 30°C auf einem Schüttler.

Nach der wie im Beispiel ld) beschriebenen Aufarbeitung erhält man 2,1 g 3ß-Methoxymethoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 130 bis 132°C.

Beispiel 3

a) 10,5 g Stigmasterin werden, wie im Beispiel lc) beschrieben, umgesetzt und man erhält 10,75 g 24-Äthyl-3ß-methoxy-methoxy-5,22-cholestadien. Die aus Aceton umkristallisierte Verbindung schmilzt bei 103 bis 104 °C.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g 24-Äthyl-3ß-methoxymethoxy-5,22-cholestadien emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 85 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 24-Äthyl-3ß-meth-oxymethoxy-5,22-cholestadien-Suspension (dies entspricht 0,5 g 24-Äthyl-3ß-methoxymethoxy-5,22-cholestadien) versetzt. Nach weiteren 120 Stunden Incubation bei 30°C auf einem Schüttler erfolgt die Aufarbeitung wie in Beispiel ld) beschrieben.

Man erhält 2,3 g 3ß-Methoxymethoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 130 bis 132°C.

Beispiel 4

a) 20 g Cholesterin werden in 300 ml Formaldehyddiäthyl-acetal gelöst, unter Rühren bei Raumtemperatur mit 30 g Kieselgur und portionsweise mit 15 g Phosphorpentoxid versetzt und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird vom Unlöslichen abfiltriert, mit Formaldehyddiäthylacetal gewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand kristallisiert bei 0°C. Nach Zugabe von Natriumhy-drogencarbonatlösung wird das Rohprodukt abgesaugt, mit Wasser gewaschen und man erhält nach Trocknung 22,5 g 3ß-

Äthoxymethoxy-5-cholesten. Die aus Essigester umkritstalli-sierte Verbindung schmilzt bei 64 bis 66°C.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g3ß-Äthoxymethoxy-5-cholesten emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 85 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 3ß-Äthoxymeth-oxy-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3 ß-Äthoxy-methoxy-5-cholesten) versetzt.

Nach weiteren 120 Stunden Incubation bei 30°C auf einem Schüttler erfolgt die Aufarbeitung wie in Beispiel ld) beschrieben.

Man erhält 1,5 g 3ß-Äthoxymethoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 121 bis 123°C.

Beispiel 5

a) 38,67 g Cholesterin werden in 250 ml Methylenchlorid und 164,2 g Formaldehyd-bis-glykolmonomethylätheracetal (herstellbar z. B. nach der deutschen Offenlegungsschrift

2 405 633) gelöst, unter Rühren bei Raumtemperatur 60 g Kieselgur und 30 g Phosphorpentoxid zugesetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Es wird vom Unlöslichen abfiltriert, mit Methylenchlorid gewaschen und mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung neutralisiert. Nach dem Abdestillieren der Lösungsmittel im Vakuum wird mit Methanol aufgenommen, filtriert und die Substanz durch langsames Verdunsten kristallisiert. Man erhält 25 g 3ß-(2,5-Dioxahexyloxy)-5-cholesten vom Schmelzpunkt 41 bis 42°C.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g 3ß-(2,5-Dioxahexyloxy)-5-cholesten emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 25 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 3ß-(2,5-Dioxahe-xyloxy)-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3ß-[2,5-Dioxahexyloxy]-5-cholesten) versetzt.

Man erhält 1,75 g 3ß-(2,5-Dioxahexyloxy)-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 65 bis 67°C.

Beispiel 6

a) 12 g Cholesterin werden in 100 ml Acetaldehyddimethyl-acetal suspendiert, unter Rühren bei Raumteperatur mit 25 g Kieselgur portionsweise mit 12 g Phosphorpentoxid versetzt und 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Es wird vom Unlöslichen abfiltriert, mit Methylenchlorid gewaschen und die Lösung mit methanolischer Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Nach dem Abdestillieren der Lösungsmittel im Vakuum wird das Rohprodukt unter Zugabe von Aktivkohle aus Aceton umkristallisiert. Man erhält 10,2 g 3ß-(l-Methoxyäthoxy)-5-cholesten vom Schmelzpunkt 94 bis 95°C.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g 3ß-(l-Methoxyäthoxy)-5-cholesten emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 85 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 3ß-(l-Methoxyäth-oxy)-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3ß-[l-Methoxyäthoxy]-5-cholesten) versetzt. Nach weiteren

120 Stunden Incubation bei 30°C auf einem Schüttler erfolgt die Aufarbeitung wie in Beispiel ld) beschrieben.

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Man erhält 1,89 g 3ß-(l-Methoxyäthoxy)-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 111 bis 118°C.

Beispiel 7

a) 19,33 g Cholesterin werden in 200 ml Methylenchlorid mit 23,6 ml Vinyläthyläther und 86 mg p-Toluolsulfonsäure (wasserfrei) versetzt und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Neutralisieren mit Natriumhydrogencarbo-natlösung wird mit Natriumchloridlösung extrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Das ölige Rohprodukt wird mit Hexan-Essigsäureäthylester-Gemi-schen an Kieselgel chromatographiert. Man erhält 18,4 g 3ß-(l-Äthoxyäthoxy)-5-cholesten als farblose, wachsartige Verbindung.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g 3ß-(l-Äthoxyäthoxy)-5-cholesten emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 85 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 3ß-(l-Äthoxyäth-oxy)-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3ß-(l-Äthoxyäthoxy)-5-cholesten) versetzt. Anschliessend wird weitere 120 Stunden auf einem Schüttler ineubiert (bei 30°C). Die vereinigten Kulturen werden mit Äthylenchlorid extrahiert. Die Extrakte im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit 70 ml Methanol, 12 ml Wasser und 6 ml HCl conc. versetzt und 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlung auf 12°C wird mit 100 ml Wasser das Reaktionsprodukt gefällt und abfiltriert. Nach Umkristallisation in Aceton erhält man 0,62 g 5-Androsten-3ß-ol-17-on vom Schmelpunkt 138/148 bis 149°C.

Beispiel 8

a) 38,7 g Cholesterin werden in 500 ml Methylenchlorid gelöst, bei 0°C mit 25 ml Äthylenoxid versetzt und 0,5 ml Bortrifluorid-Ätherat zugegeben. Es wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, mit Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Das Rohprodukt (50 g) wird an Kieselgel mit Hexan-Essigester-Gemischen chromatographiert. Man erhält 10 g 3ß-(2-Hydroxyäthoxy)-5-cholesten vom Schmelzpunkt 91 bis 95°C.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g 3ß-(2-Hydroxyäthoxy)-5-cholesten emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 85 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 3ß-(2-Hydroxyäth-oxy)-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3ß-[2-Hydroxyäthoxy]-5-cholesten) versetzt. Nach weiteren 120 Stunden Incubation bei 30°C auf einem Schüttler erfolgt die Aufarbeitung wie in Beispiel ld) beschrieben. Man erhält 2,1 g

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3ß-(2-Hydroxyäthoxy)-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 173/175 bis 177°C.

Beispiel 9

a) 20 g 5<x-Cholestan-3ß-ol werden - wie im Beispiel lc) beschrieben, mit Formaldehyddimethylacetal umgesetzt und man erhält 21,5 g 3ß-Methoxymethoxy-5a-cholestan. Die aus Aceton umkristallisierte Verbindung schmilzt bei 65 bis 68°C.

b) Unter den in Beispiel 2b) beschriebenen Bedingungen werden 10 g 3ß-Methoxymethoxy-5a-cholestan emulgiert.

c) Unter den in Beispiel 2a) und c) beschriebenen Bedingungen werden 85 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-3805-Kultur hergestellt und mit 14 ml der 3ß-Methoxymeth-oxy-5a-cholestan-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3ß-Meth-oxymethoxy-5 a-cholestan) versetzt. Nach weiteren 120 Stunden Incubation bei 30°C auf dem Schüttler erfolgt die Aufarbeitung wie in Beispiel ld) beschrieben.

Man erhält 2,05 g 3ß-Methoxymethoxy-5a-androstan-17-on vom Schmelzpunkt 97 bis 98°C.

B. Ausführungsbeispiele betreffend die chemische Weiterverarbeitung der Androstan-17-on-Derivate

Beispiel 10

25 g des in den Beispielen 1 bis 3 enthaltenen 3ß-Methoxy-methoxy-5-androsten-17-ons werden mit 125 ml Methanol, 25 ml Wasser und 12,5 ml konzentrierter Salzsäure 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt, abgekühlt, mit Wasser gefüllt und abfiltriert.

Man erhält 21,6 g 5-Androsten-3ß-ol-17-on vom Schmelzpunkt 148 bis 149°C (aus Methanol).

Beispiel 11

0,5 g des im Beispiel 4 erhaltenen 3ß-Äthoxymethoxy-5-androsten-17-ons werden unter den in Beispiel 10 genannten Bedingungen umgesetzt. Man erhält 0,4 g 5-Androsten-3ß-ol-17-on vom Schmelzpunkt 148 bis 149°C (aus Methanol).

Beispiel 12

0,38 g des im Beispiel 5 erhaltenen 3ß-(2,5-Dioxahexyl-oxy)-5-androsten-17-ons werden analog Beispiel 10 umgesetzt und aufbereitet. Nach Kristallisation aus Methanol erhält man 0,2 g 5-Androsten-3ß-ol-17-on vom Schmelzpunkt 148 bis 149°C.

Beispiel 13

1 g des im Beispiel 6 erhaltenen 3ß-(l-Methoxy-äthoxy)-5-androsten-17-ons werden unter den in Beispiel 10 genannten Bedingungen, jedoch 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, umgesetzt. Man erhält 0,8 g 5-Androsten-3ß-ol-17-on vom Schmelzpunkt 148 bis 149°C (aus Methanol).

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Androstan-17-on-Derivaten der allgemeinen Formel I

R20(CHRl)n°

CD,

worin die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbin-

dung,

n die Ziffern 1 oder 2 und

Ri ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten und worin

R2 eine gegebenenfalls durch ein Sauerstoffatom unterbrochene Alkylgruppe, oder falls n die Ziffer 2 bedeutet, auch ein Wasserstoffatom darstellt,

20 dadurch gekennzeichnet,

dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II

Ro0(CHR ) 2 In worin—-, n Ri und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen und R3 den 8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins darstellt, mit einer zum Seitenket-tenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur

(II) ,

fermentiert.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel IIa

R20CHRr0

worin—Ri und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen und R4 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe darstellt, mit einer zum Seitenkettenabbau von

(Ha) ,

Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert. 3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ss dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel üb

3

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worin und R2 die in Anspruch 1 genannte Bedeutung besitzen und R4 ein Wasserstoff atom, eine Methylengruppe oder eine Äthylgruppe darstellt, mit einer zum Seitenketten-abbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Fermentation eine zum Seitenketten-abbau von Sterinen befähigte Mikroorganismenkultur der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus Nocardia, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium verwendet.
5. Verfahren zur Herstellung von Androstan-17-on-Deriva-ten der allgemeinen Formel V

(V),

worin die Bindung eine Einfachbindung oder eine

Doppelbindung bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren nach Anspruch 1 eine Verbindung der allgemeinen Formel

(la)

R OCHR

worin die obengenannte Bedeutung besitzt und Ri ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet und worin R2 eine gegebenenfalls durch ein Sauerstoffatom unterbrochene Alkylgruppe darstellt, herstellt und anschliessend die erhaltene Verbindung der Formel Ia in Gegenwart von H+-Ionen oder Lewis-Säuren spaltet.

dung,

n die Ziffern 1 oder 2 und

Ri ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten und worin

R2 eine gegebenenfalls durch ein Sauerstoffatom unterbrochene Alkylgruppe, oder falls n die Ziffer 2 bedeutet, auch ein Wasserstoffatom darstellt,

welches dadurch gekennzeichnet ist,

dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II

10

20

Ro0(CHR ) 0 2 In

(II)

25

worin—, n, Ri und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen und

R3 den 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwas-30 serstoffrest eines Sterins darstellt, mit einer zum Seitenketten-abbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.

Unter einer Alkylgruppe Ri oder R2 soll beispielsweise eine 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltende - vorzugsweise gerad-35 kettige - Alkylgruppe verstanden werden. Geeignete Alkyl-gruppen Ri oder R2 sind beispielsweise die Propylgruppe, die Butylgruppe, die Isopropylgruppe, die sec.-Butylgruppe und insbesondere die Methylgruppe und die Äthylgruppe. Unter einer durch ein Sauerstoffatom unterbrochenen Alkylgruppe 40 soll vorzugsweise eine Gruppe verstanden werden, welche 3 bis 6 Kohlenstoffatome besitzt. Solche Gruppen sind beispielsweise 2-Alkoxyäthylgruppen wie die 2-Methoxy-äthylen-gruppe oder die 2-Äthoxy-äthylengruppe.

Unter einem 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Koh-45 lenwasserstoffrest R3 soll ein Rest verstanden werden, wie er in den Seitenketten von natürlich vorkommenden Zoo- oder Phytosterinen, wie zum Beispiel Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Brassicasterin oder den Sitosterinen vorliegt.

Geeignete Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II sind so beispielsweise solche Verbindungen, die durch die allgemeine Formel IIa oder IIb