CH630631A5

CH630631A5 - Verfahren zur herstellung von clavulansaeureestern sowie deren verwendung zur herstellung von clavulansaeure und deren salzen.

Info

Publication number: CH630631A5
Application number: CH947280A
Authority: CH
Inventors: Martin Cole; Thomas Trefor Howarth; Christopher Reading
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1974-04-20
Filing date: 1980-12-22
Publication date: 1982-06-30
Also published as: JPS532495A; NO145247C; FR2267778A1; DE2559411A1; DK141254C; IL47087A0; DD121799A5; SE435286B; FR2267778B1; RO69984A; SE435287B; SE422063B; DK167275A; JPS521996B2; YU42745B; YU274481A; NL163824B; YU90875A; SE7811202L; JPS533590A

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Estern der Clavulansäure der Formel I

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CO„R

worin R ein organischer Rest ist. Die Verbindungen haben eine die ß-Lactamase hemmende sowie eine antibakterielle Wirksamkeit.

ß-Lactamasen sind Enzyme, die den ß-Lactamring von Penicillinen und Cephalosporinen öffnen und Produkte liefern, die keine antibakterielle Wirksamkeit mehr besitzen. Derartige Enzyme werden von verschiedenen Bakterien erzeugt, z.B. Spezies oder Stämmen von Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter und Staphylo-coccus. Diese Enzyme sind in vielen Fällen die Erklärung für eine Widerstandsfähigkeit bestimmter Stämme solcher Organismen gegenüber manchen Penicillinen und Cephalosporinen. Die Bedeutsamkeit einer ß-Lactamase-Erzeugung wird verständlich, wenn offensichtlich wird, dass ein hoher Anteil von klinisch isolierten Organismen ß-Lactamasen erzeugen (vgl. z.B. M. Wilson und I. A. Freeman in Bacterio-logical Proceedings 80 (1969), wo in dem Aufsatz «Penicillin Inactivation by Gram-negative Bacilli» die Autoren gezeigt haben, dass 84 Prozent der gramnegativen Organismen, die in einem amerikanischen Krankenhaus isoliert worden sind, ß-Lactamase erzeugen). In zahlreichen Fällen sind bestimmte Penicilline oder Cephalosporine unwirksam bei der Behandlung von Krankheiten, die keine ß-Lactamase erzeugenden Organismen wegen des allgemeinen Auftretens einer Nebeninfektion durch einen ß-Lactamase-Erzeuger zugeschrieben werden [vgl. z.B. R. May und Mitarbeiter in Brit. J. Dis. Chest. 66 (1972), S. 185]. Von Gemischen von ß-Lactamase--Hemmsubstanzen mit einem Penicillin oder einem Cephalosporin könnte man erwarten, dass das letztere vom Abbau durch bakterielle ß-Lactamase geschützt sei, so dass sie dadurch ihre antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche infektiöse Organismen steigern. Eine derartige Steigerung einer antibakteriellen Wirksamkeit nennt man Synergismus, wenn die antibakterielle Wirksamkeit des Gemisches über eine einfache Addition der Wirksamkeiten der beiden Einzelsubstanzen hinausgeht. Die ß-Lactamase-Hemmsubstanz der Mischung wird als Synergist bezeichnet. Derartige Substanzen sind vorteilhaft zur Erhöhung der antibakteriellen Wirksamkeit von Penicillinen und Cephalosporinen gegen resistente Organismen. Es ist eine Aufgabe vorliegender Erfindung, derartige Synergisten bereitzustellen.

Anwendungsbeispiele von bestimmten ß-Lactamase-resi-stenten halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen als ß-Lactamase-Hemmstoffe und Synergisten für Penicilline und Cephalosporine sind bereits in der Literatur beschrieben, z.B. von Sutherland und Mitarbeiter in Nature 201 (1964), 868; Sabath und Mitarbeiter in Nature 204 (1964), 1066; O'Callaghan und Mitarbeiter in Antimicrob. Agents and Chemotherapy 1968 (1969), 67. Jedoch besitzt keine dieser bekannten Substanzen einen besonders eindrucksvollen Effekt auf das Spektrum des anderen, im Gemisch vorliegenden Antibiotikums.

Es ist auch von einigen Actinomycetes-Züchtungen beschrieben worden, dass sie ß-Lactamase-Hemmstoffe erzeugen, die mit Penicillinen oder Cephalosporinen synergistisch wirken, z.B. die in der GB-PS 1 363 075 und von Hata und

Mitarbeitern in J. Antibiotics 25 (1972), S. 473 und Ume-zawa und Mitarbeitern in J. Antibiotics 26 (1973), S. 51, beschriebenen Züchtungen. Von diesen ß-Lactamase-Hemmstof-fen von Actinomycetes ist bisher noch keine klinische Verwendbarkeit festgestellt worden. Besonders bemerkenswerte Merkmale, die Clavulansäure von anderen ß-Lactamase--Hemmstoffen von Actinomyceten unterscheiden, sind ihre Extrahierbarkeit in organische Lösungsmittel aus dem Nährmedium bei pH 2, ihre hohe Stabilität in Menschenblut und ihr breites Antibiotika-Spektrum und ß-Lactamase-Hemm-wirkung, ihr niedriges Molekulargewicht und ihr hoher RrWert bei der Papierchromatographie bei Anwendung zahlreicher Lösungsmittelsysteme.

Erfindungsgemäss wird eine ß-Lactamase Hemmsubstanz erzeugt, die auch eine antibakterielle Wirksamkeit besitzt. Diese neue Substanz wird als Clavulansäure, bzw. Clavu-lansäureester bezeichnet.

Die Clavulansäure hat folgende Eigenschaften:

(a) Sie ist eine Carbonsäure;

(b) sie bildet ein Natriumsalz, das ein charakteristisches Infrarot-Spektrum besitzt, wie es im wesentlichen aus der Zeichnung hervorgeht;

(c) sie vermag das Wachstum von Staphylococcus aureus-Stämmen zu hemmen;

(d) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen;

(e) sie kann die antibakterielle Wirksamkeit von Cephalo-ridin gegenüber ß-Lactamase erzeugenden Stämmen von Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus synergistisch beeinflussen; und

(f) sie bildet einen Methylester, der aufgrund der Massenspektroskopie ein Molekulargewicht von 213,0635 entsprechend der Formel C9HnN05 besitzt.

Die Clavulansäure kann als einwertige Carbonsäure der Formel C8H9N05 betrachtet werden, die in Form des Natriumsalzes ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspek-trum besitzt, das im wesentlichen dem in der Zeichnung gezeigten entspricht.

Die Verbindung mit den vorgenannten Eigenschaften besitzt die Formel

CHo0H

C0„H

Die Clavulansäure kann als 3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7--oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carbonsäure bezeichnet werden.

In stereochemischer Hinsicht sind die Kohlenstoffatome in 2- und 5-Stellung der Clavulansäure gleich wie bei den natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen, so dass die Clavulansäure durch die nachstehende Strukturformel dargestellt werden kann:

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(I)

Deshalb ist der vollständigere chemische Name für Clavulansäure Z-(2R,5R)-3-(ß-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa--l-azabicyclo[3,2,0]-heptan-2-carbonsäure.

Clavulansäure der Formel I und deren Salze sind erhältlich durch aerobe Züchtung von Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 und Gewinnung der Clavulansäure bzw. von deren Salz aus dem Kulturmedium. Der genannte Mikroorganismus ATCC 27064 wurde unter dieser Nummer bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, deponiert und ist dort seit 18. Mai 1971 der Öffentlichkeit zugänglich.

Die hervorragende Brauchbarkeit der Clavulansäure wird erst richtig erkannt, wenn man sich vergegenwärtigt, dass bestimmte Stämme von Klebsiella aerogenes A, deren Wachstum durch die Anwesenheit von 125 (ig/ml Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin oder Benzylpenicillin oder durch die Anwesenheit von 10 [ig/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorhandensein von unter 12,5 [ig/ml der vorerwähnten Penicilline jedoch gehemmt werden, wenn gleichzeitig 5 [ig/ml Clavulansäure vorhanden sind. Ähnliche Ergebnisse sind bei Gemischen mit einem Gehalt verschiedener Ester der Clavulansäure beobachtet worden. Zum Beispiel werden Stämme von Klebsiella aerogenes A, deren Wachstum durch 125 [ig/ml Ampicillin oder durch 10 |Xg/ml Clavulansäure-methylester nicht gehemmt wird, jedoch von unter 12,5 [ig/ml Ampicillin in Gegenwart von 5 [ig/ml Clavulansäure-methylester gehemmt. Es ist ferner festgestellt worden, dass Stämme von Staphylococcus aureus Russell, deren Wachstum durch die Gegenwart von 100 jig/ml Ampicillin oder durch 5 [ig/ml Clavulansäure nicht gehemmt wird, durch das Vorliegen von unter 10 (ig/ml Ampicillin in Gegenwart von 1 [ig/ml Cylavulansäure gehemmt werden. Bei Untersuchungen an weiblichen Mäusen ist festgestellt worden, dass beträchtlich über 5 [ig/ml liegende Mengen an Clavulansäure im Blut und Gewebe in einfacher Weise durch eine subcutane Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes der Clavulansäure erreicht werden können und dass brauchbare Mengen an Clavulansäure nach einer oralen Verabreichung von 100 mg/kg des Natriumsalzes-der Clavulansäure erhalten werden können.

Zweckmässige Ester der Clavulansäure sind diejenigen, die sich von den betreffenden Alkoholen ableiten, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, 2,2,2-Trichloräthanol, 2,2,2-TrifIuoräthanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, Phenol, Acetoxymethanol, Trimethylacetoxymethanol, 2-Di-methylaminoäthanol und anderen üblichen Alkoholen. Zahlreiche Ester der Clavulansäure sind wertvolle Zwischenprodukte bei bestimmten Verfahren zur Reindarstellung der Clavulansäure. Viele Clavulansäureester sind wertvolle synergistische Verbindungen. Die Wirksamkeit derartiger Ester dürfte in einer Hydrolyse des Esters zur freien Säure liegen.

Wenn vorstehend der Ausdruck «Ester» verwendet wird, so schliesst er die Ester mit ein, die sich begrifflich von einem Alkohol oder einem Thiol der allgemeinen Formeln ROH oder RSH ableiten, in denen R ein organischer Rest ist. Geeignete Reste für R sind Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Arylalkyl- oder andere ähnliche Reste, die auch substituiert sein können. Um das Molekulargewicht nicht übermässig zu erhöhen, sollten die Reste R normalerweise nicht über 16 Kohlenstoffatome, zweckmässigerweise nicht über 12 Kohlenstoffatome und besonders bevorzugt nicht über 8 5 Kohlenstoffatome enthalten.

Vorzugsweise leitet sich der Rest R von einem Alkohol ROH oder nicht ganz so bevorzugt von einem Thiol RSH ab, die pharmakologisch verträglich sind.

Beispiele von geeigneten Substituenten an den Resten R io sind Halogenatome, Hydroxylgruppen, niedere Alkoxy-, niedere Acyloxy-, niedere Alkylamino- oder niedere Dialkyl-aminoreste. Der Ausdruck «nieder» gibt an, dass der Rest bis 6 Kohlenstoffatome und vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoffatome enthält. Demzufolge kann R die Methyl-, Äthyl-, 15 n-Propyl-, Isopropyl-, geradkettige oder verzweigte Butyl-, Pentyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Vinyl-, Allyl-, Butenyl-, Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclo-pentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cyclohexenyl-, Cyclo-hexadienyl-, Methylcyclopentyl-, Methylcyclohexyl-, Benzyl-, 20 Benzhydril-, Phenyläthyl-, Naphthylmethyl-, Phenyl-, Naph-thyl-, Propinyl-, Tolyl-, 2-Chloräthyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-, 2,2,2-Trifluoräthyl-, Acetylmethyl-, Benzoylmethyl-, 2-Meth-oxyäthyl-, 2-Dimethylaminoäthyl-, 2-Diäthylaminoäthyl-, 2-Piperidinoäthyl-, 2-Morpholinoäthyl-, 3-Dimethylamino-25 propyl-, p-Chlorbenzyl-, p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Brombenzyl-, m-Chlorbenzyl-, 6-Methoxynaphthyl-2-me-thyl-, p-Chlorphenyl- und die p-Methoxyphenylgruppe und ferner solche Gruppen bedeuten, die aus der Penicillin- oder Cephalosporin-Chemie zur Herstellung solcher Ester bekannt 30 sind, die in vivo leicht zur antibiotischen Stammsubstanz hy-drolysieren.

Leicht hydrolysierbare Ester umfassen auch die Ester der allgemeinen Formel V und VI, doch sind sie nicht auf diese beschränkt.

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(V)

o— c— x A2

CO

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(VI)

= Y

in denen A1 etin Wasserstoffatom oder ein Alkyl-, Aryl oder Aralkylrest ist, AG ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe bedeutet, A3 für einen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest steht, 65 X und Y Sauerstoff und/oder Schwefelatome sind und Z einen zweiwertigen organischen Rest darstellt. Ester der Formeln V und VI, die nach einer Verabreichung zeimlich leicht die Clavulansäure im Blutkreislauf freisetzen, schliessen

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auch solche ein, in denen ein Wasserstoffatom, A2 ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe und A3 die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Benzyl- oder die Phenylgruppe sind, sowie solche, in denen X ein Sauerstoffatom, Y ein Sauerstoffatom ist und Z eine der Gruppierungen -CH2CH2-, -CH:CH-,

QC »der

OCH,

OCH-

darstellt.

Wenn in Verbindung mit den vorstehenden Formeln der Ausdruck «Alkyl» verwendet wird, schliesst er Alkylreste bis zu 6 Kohlenstoffatomen ein. Der Ausdruck «Aryl» bedeutet die Phenyl- oder die Naphthylgruppe oder ferner einen Phenylrest, der durch einen inerten Substituenten, wie ein Fluor- oder Chloratom oder die Methyl- oder Methoxyl-gruppe oder dergleichen, substituiert ist. Wenn hierin der Ausdruck «Aralkyl» verwendet wird, bedeutet er einen durch einen Arylrest substituierten Alkylrest.

Besonders zweckmässige Ester der Formeln V und VI sind diejenigen der Formeln VII und VIII

:H0OH 2 A,

0 - CH - 0 - CO - Ac <VII) ?

(VIII)

In diesen Formeln bedeutet A4 ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe, A5 die Methyl-, tert.-Butyl- oder die Phenylgruppe und A6 ein Wasserstoffatom und/oder die Meth-oxygruppe.

Zahlreiche Ester der Clavulansäure unterscheiden sich von analogen Estern von Penicillinen oder Cephalosporinen darin, dass sie eine erhöhte Bereitschaft zur Hydrolyse zu Clavulansäure unter milden Bedingungen zeigen. So hydroly-sieren z.B. einfache Alkylester, wie der Methylester, langsam in auf pH 7 gepuffertem Wasser zu Clavulansäure. Ester, die schon unter milden Bedingungen in gewissem Grad eine Hydrolyse erleiden, sind solche der Formel IX

H20H

(IX)

in der R1 ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist, der durch Halogenatome, niedere Alkoxyreste, Hydroxylgruppen oder durch gegebenenfalls in Salzform vorliegende NR2R3-Reste substituiert sein kann, wobei R2 und R3 geich oder verschieden sind und Wasserstoffatome und/

oder niedere Alkylreste bedeuten und auch zusammen mit dem Stickstoffatom einen 5- oder ögliedrigen Ring bilden können.

Wenn unter Bezugnahme auf die Formel IX der Aus-5 druck «nieder» verwendet wird, bedeutet er, dass der Rest 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.

Geeignete Reste für R1 sind Alkyl- und Aralkylreste, die gegebenenfalls durch Halogenatome, Hydroxyl- oder Meth-oxygruppen oder durch in Salzform vorliegende NR2R3-Reste io substituiert sein können, wobei R2 der Methyl- oder Äthylrest und R3 der Methyl- oder Äthylrest ist oder mit dem Rest R2 unter Einschluss des Stickstoffatoms zu einem Pyrrolidin-, Piperidin- oder Morpholinrest verbunden ist.

Die zweckmässigsten Alkylreste für R1 sind geradkettige 15 Reste bis zu 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch eine Methoxy- oder eine Hydroxylgruppe, einen in Salzform vorliegenden NR2R3-Rest oder ein Chlor-, Brom- oder Jodatom oder durch die CCI3- oder CF3-Gruppe substituiert sind.

Die Ester der Clavulansäure sind besonders brauchbar als 20 Synergisten, wenn sie in Geweben von Säugern, insbesondere im menschlichen Blut unter Bildung von Clavulansäure oder dessen Salz hydrolysieren, da man annimmt, das Clavulansäure oder deren Salze etwas stärker wirksame antibakterielle Mittel als die Ester per se sein dürften. Zahlreiche 25 Ester der Formeln V bis IX sind für diese Zwecke brauchbar.

Eine weitere Gruppe besonders geeigneter Ester sind jene wertvollen Zwischenprodukte, die leicht in Clavulansäure oder deren Salz durch chemische oder biochemische Methoden, die aus der Penicillin- oder Cephalosporin-Chemie be-30 kannt und ausreichend milde sind, die reaktionsfähigen säurelabilen ß-Lactamringe aufzuspalten, überführt werden.

Am zweckmässigsten ist natürlich ein Ester, der durch Hydrierung spaltbar ist. Übliche Ester für ein derartiges Verfahren sind die Benzyl-, substituierten Benzyl-, Benzhy-35 dril-, substituierten Benzhydril- oder die Tritylester. Der Benzylester hat sich als besonders zweckmässig für dieses Verfahren erwiesen.

Im grossen und ganzen ist die Art eines Substituenten im Esterrest ohne Bedeutung, so lange er nicht bei der Spaltung 40 durch Hydrierung stört.

Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen, die wie erwähnt, wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen, können für ihre Anwendung zusammen mit pharmakologisch unbedenklichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln 45 verarbeitet werden. Derartige Arzneimittel umfassen solche in einer Form die für eine orale, lokale oder parenterale Anwendung geeignet sind und die zur Behandlung von Infektionen bei Säugern, einschliesslich Menschen, verwendet werden können.

50 Zweckmässige Formen der Arzneimittel sind Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, Suspensionen, Lösungen, Trok-kensäfte und sterile, zu Injektions- oder Infusionszwecken geeignete Formen. Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungs-55 mittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallhilfsmittel und dergleichen gemäss einer üblichen pharmakologischen Praxis zur Formulierung von Antibiotika enthalten, wie sie dem Fachmann bekannt ist. Injizierbare oder infundierbare Arzneimittel der Clavulan-60 säure oder deren Salze sind besonders zweckmässig, da grosse Mengen der Verbindung Clavulansäure im Gewebe nach einer Verabreichung durch Injizieren oder Infundieren auftreten können. Demzufolge ist ein besonderes bevorzugtes Arzneimittel die Clavulansäure oder deren Salz in steriler 65 Form.

Einzeldosierungen mit einem Gehalt an Clavulansäure oder deren Salz oder Ester, die für eine orale Verabreichung angepasst sind, bilden ein weiteres bevorzugtes Arzneimittel.

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Unter bestimmten Voraussetzungen kann die Wirksamkeit der oralen Arzneimittel mit Clavulansäure und deren Salze oder Ester verbessert werden, wenn derartige Arzneimittel eine Puffersubstanz enthalten oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehen sind, so dass die Wirkstoffe keine lange Berührungszeit mit dem hochgradig sauren Magensaft haben. Derartige gepufferte oder mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehene Arzneimittel können nach den üblichen pharmazeutischen Techniken hergestellt werden.

Die Clavulansäure oder deren Salze oder Ester können in den Arzneimitteln als einziger therapeutischer Wirkstoff vorliegen oder sie können zusammen mit anderen therapeutischen Mitteln, wie einem ß-Lactam-Antibiotikum, vergesellschaftet sein. Geeignete ß-Lactam-Antibiotika zum Einarbeiten in derartige synergistische Arzneimittel schliessen nicht nur solche ein, die in hohem Masse gegen ß-Lactamase empfindlich sind, sondern auch solche, die einen guten Grad an innewohnender Widerstandsfähigkeit gegen ß-Lactamasen haben. Demzufolge sind geeignete ß-Lactam-Antibiotika zum Einarbeiten in die Arzneimittel Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Carbenicillin, Methicillin, Propicillin, Ampicillin, Amoxycillin, Epicillin, Ticarcillin, Cyclacillin, 6-Ami-nopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure, Cephaloridin, Cephalothin, Cefazolin, Cephalexin, Cefoxitin, Cephacetril, Cephamandol, Cephapirin, Cephradin, Cephaloglycin und andere gut bekannte Penicilline und Cephalosporine oder deren Vorstufen, wie Hetacillin, Metampicillin, ferner die Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder die Phthalidylester von Benzylpenicillin, Ampicillin, Amoxycillin oder Cephaloglycin oder der Phenyl-, Tolyl oder Indanyl-a-ester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder dergleichen.

Wenn natürlich das im Arzneimittel vorliegende Penicillin oder Cephalosporin nicht für eine orale Verabreichung geeignet ist, dann wird das Arzneimittel für eine parenterale Verabreichung angepasst.

Wenn die Clavulansäure oder deren Salze oder Ester in den Arzneimitteln zusammen mit einem ß-Lactam-Antibiotikum vorliegen, kann das Verhältnis der vorhandenen Clavulansäure oder deren Salz oder Ester zum vorhandenen ß-Lac-tam-Antibiotikum von beispielsweise 10:1 bis 1:10 und vorteilhafterweise von 3:1 bis 1:3 sein.

Die Gesamtmenge der in einer Einzeldosierungsform vorhandenen antibakteriellen Mittel liegt gewöhnlich zwischen 50 und 1500 mg und üblicherweise zwischen 100 und 1000 mg.

Die Arzneimittel können zur Behandlung von Infektionen von u.a. der Atemwege, des Harnsystems und der Weichteile beim Menschen verwendet werden. Sie können auch zur Behandlung von Infektionen bei Haustieren, wie der Mastitis beim Vieh, eingesetzt werden.

Üblicherweise werden zwischen 50 und 6000 mg der er-findungsgemäss hergestellten Verbindung je Behandlungstag verabreicht, jedoch vorzugsweise zwischen 500 bis 3000 mg je Tag. Jedoch für eine Behandlung schwerer Körperinfektionen oder Infektionen eines besonders schwer beeinflussbaren Organismus können in Übereinstimmung mit der klinischen Praxis höhere Dosen verwendet werden.

Die genaue Form der Arzneimittel hängt in bestimmtem Mass von dem zu behandelnden Mikroorganismus ab. Für eine Behandlung von Infektionen werden die Arzneimittel üblicherweise so eingestellt, dass sie ein Maximum beim Blutspiegel von mindestens 0,1 [Xg/ml, noch zweckmässiger von mindestens 0,25 [ig/ml und vorzugsweise von mindestens 1 [ig/ml Clavulansäure hervorrufen.

Die Penicilline oder Cephalosporine in den synergistisch wirkenden Arzneimitteln sind üblicherweise bis zu oder bei annähernd einer üblicherweise verwendeten Menge vorhanden, wenn das betreffende Penicillin oder Cephalosporin als einziges, bei der Behandlung der Infektion verwendetes therapeutisches Mittel vorliegt.

Besonders begünstigte Arzneimittel enthalten 150 bis 1000 mg Amoxycillin, Ampicillin oder eine deren Vorstufen und 50 bis 500 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbaren Ester, noch zweckmässiger 200 bis 500 mg Amoxycillin, Ampicillin oder deren Vorstufen und 50 bis 250 mg Clavulansäure oder deren Salz oder deren in vivo hydrolysierbaren Ester.

Die Substanzen in derartigen Arzneimitteln können gegebenenfalls in hydratisierter Form vorliegen. Die Gewichte der Antibiotika in solchen Arzneimitteln werden auf der Grundlage des aus dem Arzneimittel theoretisch verfügbaren Antibiotikums und nicht auf der Basis des Gewichts pro Arzneimittel ausgedrückt.

Gegenstand der Erfindung sind somit die in den Patentansprüchen 1-3 definierten Verfahren zur Herstellung von Estern der Clavulansäure.

Aus den nach einem dieser Verfahren hergestellten Estern kann erfindungsgemäss durch hydrierende Spaltung die freie Clavulansäuren oder ein Salz davon hergestellt werden, wie in den Patentansprüchen 4-6 definiert.

In den hierbei verwendeten Estern der Formel X ist A7 am zweckmässigsten ein Wasserstoffatom oder die Phenyl-, Tolyl-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe und A8 die Phenyl-, Tolyl-, Chlorphenyl- oder Methoxyphenylgruppe.

Vorzugsweise ist A7 ein Wasserstoffatom und A8 die Phenylgruppe.

Die Ester der Formel X können durch Hydrogenolyse gespalten werden, wodurch man die Clavulansäure oder ihr Salz erhält.

Das bevorzugte Verfahren zur Bildung eines erwünschten Esters der Clavulansäure besteht in der Reaktion eines Salzes der Clavulansäure mit einem Veresterungsmittel, wie einem reaktionsfähigen Halogenid, einem Sulfonatester oder dergleichen, wie nachstehend beschrieben wird. Derartige Reaktionen werden häufig in einem organischen Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstanten durchgeführt, wie Dimethylformamid, einem Gemisch von Dime-thylformamid und Aceton, in Dimethylsulfoxid, N-Methyl-acetamid, Hexamethylphosphoramid und dergleichen.

Gegebenenfalls kann das Salz der Clavulansäure in üblicher Weise in dem Lösungsmittel gelöst oder es kann an ein polymeres Trägermaterial gebunden werden. Geeignete Trägermaterialien zur Verwendung bei diesem Verfahren umfassen stark basische Anionenaustauscherharze, insbesondere solche von makroretikularer Natur, die die Anwendung von nicht-wässrigen Lösungsmittelsystemen gestatten. Es ist gefunden worden, dass für diesen Zweck «Amberblyst A26» geeignet ist. Das Clavulansäuresalz kann an das Harz aus dem Filtrat der Nährlösung adsorbiert werden. Danach kann das Harz in Dimethylformamid mit einem Gehalt an Na-triumjodid suspendiert oder gegebenenfalls in der Säule mit einer Lösung von Natriumjodid in Dimethylformamid oder in einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton eluiert werden.

Einmal gebildet, kann der verunreinigte Ester der Clavulansäure chromatographisch gereinigt werden. Bei derartigen Verfahrensschritten wird der Ester üblicherweise in einem organischen Lösungsmittel gelöst, wie Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Cyclohexan oder ähnlichen Lösungsmitteln. Die bei dem chromatographischen Verfahren verwendete feste Phase ist normalerweise eine inerte Substanz, wie Silikagel oder ähnliche, für chromatographische Zwecke geeignete Substanzen.

Die aus der Säule austretenden Fraktionen können hinsichtlich des Vorliegens von Clavulansäure untersucht wer5

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den, indem von synergistischen Eigenschaften Gebrauch gemacht wird. Normalerweise vereinigt man die aktiven Fraktionen und dampft das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab.

Der bei diesem Verfahren erhaltene Ester weist gewöhnlich eine annehmbare Reinheit auf, doch kann die Substanz gegebenenfalls nochmals chromatographiert werden.

Der gereinigte Ester der Clavulansäure kann in Clavulansäure oder deren Salz nach dem vorherbeschriebenen Verfahren umgewandelt werden.

Ein besonders zweckmässiges Verfahren,, um Clavulansäure oder deren Salz zu erhalten, ist die Hydrierung einer Verbindung der allgemeinen Formel X, wie es zuvor beschrieben worden ist.

Derartige Reaktionen finden üblicherweise in Gegenwart eines Katalysators eines Übergangsmetalls unter Anwendung von niedrigen oder mittleren Wasserstoff drücken statt. Die Reaktion kann bei erhöhten normalen oder erniedrigten Temperaturen, z.B. bei 0 bis 100°C, durchgeführt werden. Besonders zweckmässige Reaktionsbedingugen für derartige Hydrierungen verwenden einen geringen Überdruck an Wasserstoff bei annähernd Raumtemperatur von 12 bis 20°C. Die Reaktion kann in üblichen Lösungsmitteln, wie niederen Al-kanolen, z.B. Äthanol, durchgeführt werden. Es ist gefunden worden, dass ein besonders zweckmässiger Katalysator Palladium auf Holzkohle ist. Falls die Hydrierung in Gegenwart einer Base durchgeführt wird, bildet sich ein Salz der Clavulansäure, z.B. das Natrium- oder Kaliumsalz, wenn die Reaktion in Gegenwart von Natrium- oder Kaliumbicarbonat durchgeführt wird.

Die Clavulansäure oder deren Salze aus derartigen Reaktionen sind im allgemeinen von guter Reinheit.

Geeignete Salze der Clavulansäure, die mit Verbindungen R-Q reagieren können, sind Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder andere übliche Salze, wie das Silbersalz.

Geeignete Reste Q schliessen solche Atome oder Gruppen ein, die in bekannter Weise durch Carbonsäureanionen ersetzbar sind. Es handelt sich um Chlor-, Brom- und Jodatome, Sulfonsäureester, wie die -0-S02CH3- oder die -0-S02C6H4-CH3-Gruppen, um aktive Estergruppen, wie die -O-CO-H-oder -0-C0-CF3-Gruppen und andere übliche, durch nukleo-phile Reste ersetzbare Gruppen.

Die vorstehende Reaktion wird normalerweise in einem organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismässig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Dimethylformamid, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran oder dergleichen, und bei einer nicht aussergewöhnlichen Temperatur, wie von —5 bis 100°C, im allgemeinen bei +5 bis 30°C, z.B. bei Raumtemperatur, durchgeführt.

Die Umsetzung der Clavulansäure mit einem Diazoalkan ist ein mildes Verfahren zur Herstellung von Alkyl- oder Ar-alkyl- Estern. Die Diazotierung kann unter üblichen Reaktionsbedingungen erfolgen, z.B. bei einer nicht extremen Temperatur und in einem üblichen Lösungsmittel. Derartige Reaktionen werden üblicherweise bei Temperaturen von —5 bis 100°C, gewöhnlich bei 5 bis 30°C, z.B. bei Raumtemperatur, durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für diese Reaktion sind niedere Alkanole, wie Methanol und Äthanol, und Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, Dioxan und dergleichen. Äthanol hat sich als besonders zweckmässiges Lösungsmittel bei dieser Reaktion erwiesen.

Die Reaktion der Clavulansäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels findet normalerweise in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer verhältnismässig hohen Dielektrizitätskonstanten, wie Acetonitril, statt. Die Reaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur oder bei erniedrigter Temperatur, z.B.

bei —10 bis 22°C, gewöhnlich bei —5 bis 18°C, z.B. anfänglich bei 0°C und danach allmählich unter Erwärmen bis zu 15°C, durchgeführt. Die verwendeten, die Kondensation beschleunigenden Mittel sind üblicherweise solche, die Wasser aus dem Reaktionsgemisch entfernen. Beispiele geeigneter Mittel sind Carbodiimide, Carbodiimidazole oder äquivalente Reagentien. Dicyclohexylcarbodiimid hat sich als die Kondensation beschleunigendes Mittel zur Anwendung bei diesem Verfahren als besonders zweckmässig erwiesen. Um eine Selbstkondensation der Clavulansäure weitgehend zu unterdrücken, wird die Reaktion gewöhnlich in Gegenwart eines beträchtlichen Überschusses an Alkohol durchgeführt.

Beispiel 1

Herstellung von Clavulansäure-Trimethylmethoxymethylester

Zu einer gerührten Lösung von 0,37 g Trimethylessig-säure-brommethylester in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,49 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 20 ml Wasser behandelt. Das Gemisch trennt sich in zwei Schichten auf. Die nicht-wässrige Schicht wird abgetrennt, mit 20 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird eingedampft. Man erhält 500 mg eines schwachgelben Öls.

NMR (CDC13): 1,26 (s, 9); 3,13 (d, 1, J= 17 Hz); 3,62 (dd, 1, J= 17 Hz, Ji=2,5 Hz); 4,3 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, j =7,5 Hz, J2= 1,5 Hz); 5,16 (d, 1, J = l,5 Hz); 5,79 (d, 1, J=2,5 Hz); 5,92 5 (s, 2).

1R (flüssiger Film): ß-Lactom-C.O 1800 cm-1,

Ester-C=0 1760 cm-1.

Beispiel 2

Herstellung des Clavulansäure-phthalidesters

Zu einer gerührten Lösung von 0,43 g 3-Bromphthalid in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,5 g Natriumsalz der Clavulansäure gegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 20 ml Äthylacetat, 10 ml Cyclohexan und 30 ml Wasser gut durchgeschüttelt. Die nicht-wässrige Schicht wird mit 20 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält eine blassgelbe, gummiartige Substanz. Die beiden diastereomeren Ester werden unter Anwendung einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie an einer 40 cm X 10 mm-Säule von Silikagel («Merckosorb SI 60» mit einem Teilchendurchmesser von 5 p.) aufgetrennt, wobei mit Äthylacetat bei einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/ Min. eluiert wird.

Der erste Phthalidester mit einer Rezensionszeit von 7,15 Minuten kristallisiert aus Äthylacetat als Nadeln vom Schmelzpunkt 102°C und hat die nachstehenden Eigenschaften.

IR (Nujol, warm): v ß-Lactam-C=0 1790 cm-1,

Ester-C=0 1755 cm-1 NMR (CD3COCD3): 3,14 (d, 1, j= 17,5 Hz); 3,76 (dd, 1, ji= 17,5 Hz, j2=2,5 Hz); 4,25 (d, 2, j=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, ji=7,5 Hz, j2= 1,5 Hz); 5,4 (s, 1, j= 1,5 Hz); 5,82 (d, 1, j=2,5 Hz); 7,7 (s, 1); 8,06 § (m, 4); Molekulargewicht (Massenspektrum): 331,0696 entspricht c16h13no7 (berechnet 331,0692).

Das zweite Diastereoisomere mit einer Retensionszeit von 8,85 Minuten hat die folgenden Eigenschaften: IR (CH2CI2-Lösung): v ß-Lactam-C=0 1800 cm-1, Ester-C—O 1780 cm"1;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

630631

8

NMR (CDCI3): 2,42 (breites s, 1 austauschbar mit D20); 3,12 (d, 1, J = 18 Hz); 3,60 (dd, 1, ^=18 Hz, J2=2,5 Hz); 4,30 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,0 (dt, 1, Ji=7,5 Hz, J2=l,5 Hz); 5,76 (d, 1, J=2,5 Hz); 7,52 (s, 1); 7,85 8 (m, 4).

Beispiel 3

Herstellung des Clavulansäure-nonylesters

44 mg des Natriumsalzes der Clavulansäure in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden mit 76 mg Nonyljodid behandelt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird eingedampft. Der Rückstand wird an Sili-kagel fraktioniert, wobei mit einem Gemisch aus Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 2:1 eluiert wird. Man erhält ein öliges Produkt.

IR (Film): 1800,1745,1690 cm-1;

Molekulargewicht (Massenspektrometrie): 325,1890 entspricht C17H27NOs (berechnet 325,1889).

Beispiel 4 Herstellung von Clavulansäure

100 mg Clavulansäure-benzylester in 5 ml Äthanol werden 45 Minuten bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 30 mg eines 10 Prozent Palladium-auf-Kohle-Katalysators hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 58 mg Clavulansäure als instabiles viskoses Öl.

NMR (C5D5N): 3,05 (d, 1, J= 18 Hz); 3,60 (dd, 1, J,= 18 Hz, J2=2,5 Hz); 4,75 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,58 (t, 1, J = 7,5 Hz); 5,66 (s, 1); 6,0 § (d, 1, J = 18 Hz).

Beispiel 5

Herstellung des Clavulansäure-methylesters

130 mg Clavulansäure in 10 ml Äthanol werden mit überschüssigem Diazomethan in Äther behandelt. Nach 2 Minuten bei Raumtemperatur zeigt die Dünnschicht-Chromatographie, dass die Umsetzung vollständig ist. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Silikagel unter Eluierung mit Äthylacetat gereinigt. Die den Clavulansäure-methylester enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 104 mg eines klaren Öls.

Beispiel 6

Herstellung des Clavulansäure-methylesters

200 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei 0°C gerührt. Dann werden 0,5 ml Methanol und 206 mg Dicyclohexyldicarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den rohen Clavulansäure-methylester der durch Chromatographie an Silikagel unter Eluieren mit Äthylacetat gereinigt wird. Man erhält 140 mg eines klaren Öls.

Beispiel 7

Herstellung des Clavulansäure-phenylesters

100 mg Clavulansäure in 5 ml Acetonitril werden gekühlt und bei 0°C gerührt. Zur Lösung werden 0,94 g Phenol und 100 mg Dicyclohexyldicarbodiimid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die

Suspension wird filtriert. Das Filtrat wird eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch von Äthylacetat und Hexan im Verhältnis 1:1 fraktio- • niert. Man erhält 70 mg Clavulansäure-Phenylester.

5 IR (Film): 1800,1770,1690 cm-1;

NMR (CDCI3): 2,18 (breites s, 1); 3,06 (dd, 1, ^=17 Hz, J2=0,9 Hz); 3,54 (dd, 1, ix=ll Hz, J2=2,6 Hz); 4,29 (d, 2, J=7,5 Hz); 5,1 (dt, 1, ^=7,5 Hz, J2=l,5 Hz); 5,29 (d, 1, J= 1,5 Hz); 5,76 (dd, 1, Jx=2,6 Hz, J2=0,9 Hz);

10 7, 35 S (m, 5).

Molekulargewicht (Massenspektrometrie) = 275,0777 entspricht C14H13NOä (berechnet 275,0794).

15 Beispiel 8

Herstellung des Natriumsalzes der Clavulansäure

840 mg Clavulansäure-benzylester in 30 ml Äthanol und 5 ml Wasser werden 25 Minuten bei Raumtemperatur und 20 Normaldruck in Gegenwart von 267 mg lOprozentigem Palladium auf Kohle und 244 mg Natriumbicarbonat hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Wasser und Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt wird aus einem 25 Gemisch von Wasser und Aceton innkristallisiert. Man erhält 565 mg Mikronadeln. Umkristallisieren aus einem Gemisch von Wasser und Aceton liefert Nadeln, die nach 24-stündigem Trocknen über P2Oä unter vermindertem Druck die nachstehende Analyse liefern:

30 C 41,01 H 3,77 N 5,68 40,86 3,64 5,51

IR (KBr-Platte): 1785, 1700, 1620 cm"1;

NMR (D20): 3,06 (d, 1, J=18,5 Hz); 3,57 (dd, 1, J!=18,5 Hz, J2=2,5 Hz); 4,15 (d, 2, J=8 Hz); 5,3 (HOD); 4,9 (m); 35 5,71 (d, 1, J=2,5 Hz).

Versuch

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin 40 und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Die Mindest-Hemmkonzentrationen von Ampicillin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Ampicillin in Gegenwart von 1 jig/ml des Natriumsalzes der Clavulan-45 säure werden bei einer Reihe von ß-Lactamase-erzeugenden Bakterien bestimmt. Die Organismen werden in eine «Oxoid»-Empfindlichkeits-Testflüssigkeit überimpft, die sich in kleinen Löchern in einer Plastikcuvette befinden und die unterschiedliche Konzentrationsgradienten von einmal Ampicillin, zum 50 anderen von dem Natriumsalz der Clavulansäure und zum dritten von Ampicillin plus 1 u.g/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure (Mikrotiter-Methode) enthalten. Die Endver-dünnung des Impfstoffes beträgt 0,5 X IO-2. Die Cu vette wird bei 37°C über Nacht bebrütet. Eine Aufzeichnung der 55 Endprodukte des bakteriellen Wachstums wird am nächsten Morgen vorgenommen. Die Mindest-Hemmkonzentrations-werte in [J.g/ml sind in der Tabelle V verzeichnet, die auch aufzeigt, dass der Synergismus bei der niedrigen Konzentration von 1 (ig/ml in bemerkenswerter Weise die antibakte-60 rielle Wirksamkeit von Ampicillin gegenüber bestimmten grampositiven und gramnegativen Bakterien steigert. Der Mechanismus dieses Synergismus besteht wahrscheinlich darin, die Hemmung der Ampicilin-zerstörenden ß-Lactamase-Enzyme nach sich zu ziehen, doch kann die Existenz anderer 65 Mechanismen nicht ausgeschlossen werden.

Ähnliche Ergebnisse wie die in Tabelle V angegebenen werden erhalten, wenn man Ampicillin durch Amoxycillin oder durch den Phthalidylester des Ampicillins ersetzt.

TABELLE V

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

Mindest-Hemmkonzentrationen — Ug/ml Nafn„m^l7 Ampicillin in Gegenwart

Bakterienstamm der clavulansäure Ampicillin von 1 [xg(ml Natriumsalz der Clavulansäure

Escherichia coli NCTC 10418

31

1,8

<0,4

Escherichia coli B 11

62

> 500

125

Klebsiella aerogenes A

31

125

< 0,4

Klebsiella sp 62

31

125

<0,4

Enterobacter cloacae

62

250

62

Serratia marcescens

125

> 500

62

Staphylococcus aureus (Russell)

15

500

<0,4

Staphylococcus aureus

62

250

7,5

Antibakterieller Synergismus zwischen Cephaloridin und dem Natriumsalz der Clavulansäure

30

Die Mindest-Hemmkonzentrationen von Cephaloridin, von dem Natriumsalz der Clavulansäure und von Cephaloridin in Gegenwart von 5 [ig/ml des Natriumsalzes der Clavulansäure werden nach dem in Beispiel 42 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle VI zeigen, 35 dass ein Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und Cephaloridin erhalten werden kann, insbesondere beim ß-Lactamase-erzeugenden Stamm von Staphylococcus aureus (Russell).

TABELLE VI

Mindest-Hemmkonzentrationen [ig/ml Natriiirn^l? Cephaloridin in Gegenwart

Bakterienstamm . Cephaloridin von 5 [ig/ml Natriumsalz der Clavulansäure der clavulansäure

7,5 < 0,03 ** 3,7

* Endpunkt

** der gleiche Wert wird erhalten, wenn 1 [ig/ml anstatt 5 [xg/ml Synergist zugegeben wird.

Antibakterieller Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen

Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse werden nach dem im vorstehenden Versuch beschriebenen Verfahren erhalten.

Proteus mirabilis 899 Staphylococcus aureus (Russell) Staphylococcus aureus

> 500 * 62

15 3,1

62 15

630631 10

TABELLE VII

Antibakterieller Synergismus zwischen dem Natriumsalz der Clavulansäure und verschiedenen Penicillinen gegenüber Stämmen von Klebsiella aerogenes

Stamm allein

Amoxycillin

+ 5 [xg/ml Synergist allein

Carbenicillin *

+ 5 ug/ml Synergist

Benzylpenicillin allein + 5 allem Synergist

A

500

0,97

500

7,8

250

7,8

E 70

500

3,9

500

15

500

15,6

62

250

15,6

125

7,8

250

15,6

* Ähnliche Ergebnisse werden beobachtet, wenn Carbenicillin durch den Phenyl-a-ester des Carbenicillins oder durch Ticarcillin ersetzt wird.

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und Estern der Clavulansäure Die in der Tabelle VIII angegebenen Ergebnisse werden nach dem im vorstehenden Versuch beschriebenen Verfahren erhalten.

20

TABELLE VIII

Antibakterieller Synergismus zwischen Ampicillin und Estern der Clavulansäure gegenüber Stämmen von Klebsiella aerogenes

25

Stamm

Ampicillin allein

Ampicillin + Ampicillin +

5 jxg/ml des Me- 5 [Jig/ml des Ben-thylesters der zylesters der Clavulansäure Clavulansäure

A E 70 62

500 500 500

1,9 3,9 3,9

35

Weder Clavulansäure-methylester noch Clavulansäure-benzylester 40 hemmen das Wachstum der Testorganismen bei Konzentrationen von 100 [ig/ml.

Antibakterielle Wirksamkeit von Clavulansäure-Estern

Beim Verfahren wie bei der Bestimmung des antibakteriellen Spektrums der Clavulansäure, jedoch unter Verwen- 45 dung einer Verdünnung von 1/100 bei der über Nacht angesetzten Bebrütung werden die in Tabelle IX angegebenen Mindest-Hemmkonzentrationswerte bei bestimmten Estern der Clavulansäure gegenüber einer Anzahl von Organismen erhalten. 50

TABELLE IX

Antibakterielle Wirksamkeit von Clavulansäureestern

Organismus

Mindest-Hemmkonzentrationen von Clavulansäureestern Benzylester Nonylester

Trimethylacetoxy-methylester

Phthalidyl-ester

Mindest-Hemmkon-zentration des Natriumsalzes der Clavulansäure *

Bacillus subtilis A Staph. aureus Oxford Staph. aureus Russell Escherichia coli 10418

250 62 125 125

31 31 31 250

62 31 62 125

125 31 15 125

62 15 15 125

* Die Mindest-Hemmkonzentration des Natriumsalzes der Clavulansäure ist zu Vergleichszwecken mit aufgeführt worden. Die hohen Mindest-Hemmkonzentrationswerte beruhen auf dem verwendeten Grundimpfstoff.

11

630631

Bestimmung der Clavulansäure Grundlagen des Versuchs Lösungen mit einem Gehalt an Clavulansäure werden 15 min in ß-Lactamase-Präparat bei 37°C in einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 bebrütet. Währenddessen tritt eine Enzymhemmung oder eine Inaktivierung auf. Dann wird ein Substrat (Benzylpenicillin) zugegeben und das Bebrüten bei 37°C 30 min fortgesetzt. Die Menge des enzyma-tischen Abbaus des Substrats zu Penicillansäure wird mittels des Hydroxylamin-Versuchs für Penicillin bestimmt. Die Menge der verwendeten ß-Lactamase errechnet sich aus einer 75prozentigen Hydrolyse des Benzylpenicillins in 30 Minuten bei 37°C.

Das Ausmass der Hydrolyse ist der Einfluss der Menge des ungehemmt verbleibenden Enzyms. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in Prozent Hemmung der Enzymaktivität durch eine gegebene Verdünnung der Clavulansäure enthaltenden Lösung (z.B. des Filtrats der Nährbouillon) oder durch die Konzentration der Clavulansäure in [ig/ml bei gegebener 50prozentigen Hemmung des Enzyms unter den vorstehend genannten Bedingungen (I50).

fi-Lactamase-Enzym Es wird die mittels Escherichia coli JT4 erzeugte ß-Lactamase als Enzym verwendet. Diese Züchtung ist ein Ampicillin-resistenter Stamm und verdankt seine Resistenz einer Erzeugung der den R-Faktor steuernden ß-Lactamase. Gegebenenfalls können ähnliche den R-Faktor steuernde ß-Lactamasen verwendet werden.

Die auf einem Schrägagar gehaltene Züchtung wird in einem 400 ml sterilen Trypton-Medium bebrütet, das in einer konischen Fiasche von 2 Liter Inhalt enthalten ist. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung: 32 g/Liter Trypton, 20 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter Natriumchlorid und 2,2 g/Liter Calciumchlorid mit 6 Mol Hydratwasser. Der pH-Endwert wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,4

eingestellt. Die Flasche wird 20 Stunden auf einem Drehschüttler mit 240 UpM bei 25°C geschüttelt.

Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt, mit 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewa-5 sehen (nochmals suspendiert und zentrifugiert) und dann in Wasser nochmals suspendiert, wodurch man eine 25fache Zellkonzentration in dem Kulturmedium erhält. Diese Zellsuspension wird dann bei 4°C in einem MSE-Ultraschall--Disintegrator zertrümmert. Die Zellbruchstücke werden io durch Zentrifugieren entfernt, und aliquote Anteile der überstehenden Lösung werden im tiefgefroreren Zustand gelagert. Zur Verwendung bei dem Versuchsverfahren wird das Überstehende mit einer 0,005-m Phosphatpufferlösung verdünnt, bis man eine etwa 75prozentige Hydrolyse einer 1 mg/ml ent-15 haltenden Lösung von Benzylpenicillin in 30 Minuten bei 37°C erhält.

V ersuchsv erfahren Geeignete Verdünnungen des Hemmpräparats und der 20 ß-Lactamase-Lösung werden vermischt und 15 Minuten bei 37°C bebrütet (Test). Ein Kontrollversuch mit einer Pufferlösung anstelle des Inhibitorpräparats wird ebenfalls bebrütet. Dann wird eine Benzylpenicillin-Lösung (Substrat) zu dem Test- und dem Kontrollgemisch gegeben. Dann wird die Be-25 brütung weitere 30 Minuten bei 37°C fortgesetzt. Es wird dann das restliche Benzylpenicillin in jedem Gemisch unter Verwendung des Hydroxylaminversuchs bestimmt, wie er beschrieben ist von Batchelor und Mitarbeitern in Proc. Roy. Soc. B 154 (1961), S. 498. Zu allen Tests werden 6 ml Hy-30 droxylamin-Reagens zugegeben. Die Kontrollversuche und die Versuche mit den reinen Substanzen lässt man 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren, bevor man 2 ml eines Eisen-(III)-ammoniumsulfat-Reagens zusetzt. Die Absorption der Endlösungen wird in einem E.E.L.-Colorimeter oder in einem 35 Spektrophotometer bei 490 nm gegenüber dem reinen Reagens gemessen. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen, der Testlösungen und der reinen Substanzen vor dem Hydroxylamin-Versuch sind wie folgt.

Bestandteile (alle gelöst in oder verdünnt mit 0,005-m Phosphatpuffer vom pH 7)

Test reines Benzylpenicillin ml

Kontrollversuch ml reines Reagens ml

Escherichia coli-ß-Lactamase-Lösung

1,9

0,0

1,9

Inhibitor

0,1

0,0

Benzylpenicillin 5 mg/ml

0,5

0,0

0,005-m Phosphatpuffer vom pH 7

0,0

2,0

0,1

0,6

Berechnung der Ergebnisse Die prozentuale Hemmung der ß-Lactamase wird wie 55 folgt berechnet:

Absorption des reinen Benzylpenicillins minus Absorption der Kontroilösung (nicht gehemmte Reaktion) = x Absorption der Testlösung (gehemmte Reaktionslösung) minus Absorption der Kontroilösung (nicht gehemmte 60 Reaktion) = y y

Hemmung in % = X 100

x

6S Um den I60-Wert zu erhalten, wird das Hemmpräparat verdünnt, bis eine 50prozentige Hemmung der ß-Lactamase-Inaktivierung des Benzylpenicillins bei dem vorgenannten Verfahren erhalten wird.

630631

12

Papierchromatographische Bestimmung der Clavulansäure

Das Filtrat der Nährbouillon und eine Bezugslösung der Clavulansäure (250 (ig/ml eines teilweise gereinigten Präparats) werden auf 1 cm breite Papierstreifen (Whatman No. 1) (20 {i/Liter der Ausgangslösung) getüpfelt. Die Chromato-gramme laufen bei absteigender Chromatographie 16 Stunden bei 5°C unter Verwendung eines Gemisches von n-Bu-tanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 als Lösungsmittel. Die Streifen werden bei 40°C getrocknet und auf Agarplatten ausgelegt, die 6 [ig/ml Benzylpenicillin enthalten und dann mit einem ß-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes (synergistisches System) beimpft. Die Platten werden über Nacht bei 30°C bebrütet, und die Clavulansäure zeigt sich als Zone eines gehemmten Wachstums. Der Rf-Wert der Zone ist 0,46. Die Menge von 6 [ig/ ml Benzylpenicillin allein liegt unterhalb der erforderlichen Konzentration, um Klebsiella aerogenes abzutöten. Jedoch in Gegenwart eines ß-Lactamase-Hemmstoffes wird diese Konzentration toxisch, was hinsichtlich des Synergismus zu sagen ist.

Die Verwendung des vorgenannten synergistischen Systems ermöglicht die Feststellung der Clavulansäure bei Konzentrationen unterhalb denjenigen, bei denen sie eine antibakterielle Wirksamkeit zeigt.

Dünnschicht-chromatographische Bestimmung des Natriumsalzes der Clavulansäure Lösungen von Präparaten des Natriumsalzes der Clavulansäure werden auf Glasplatten, die mit einer 0,25 mm dik-ken Schicht von Silikagel (F254) beschichtet sind, in einer Menge von 5 jx/Liter von 1 mg/ml getüpfelt. Die Chroma-

togramme laufen bei 22°C unter Verwendung einer oberen Phase eines Gemisches von n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis von 4:1:5. Die Chromatogrammplatten werden bei 40°C getrocknet. Das Natriumsalz der Clavulan-j säure wird durch Bioautographie auf Agarplatten mit einem Gehalt von 6 ng/ml Benzylpenicillin angeordnet und mit Klebsiella aerogenes beimpft (synergistisches System wie bei der vorstehend besprochenen Papierchromatographie). Die Agaroberfläche wird mit einem feinen Filtertuch abgedeckt, io bevor die Dünnschicht-Chromatographieplatte darübergelegt wird. Nach 15- bis 30minütigem Ruhenlassen zum Befeuchten und Diffundieren wird die Dünnschicht-Chromatographieplatte mit Hilfe des Filtertuches abgehoben und die Agar-platte über Nacht bei 30°C bebrütet, um die Zonen eines ge-15 hemmten Wachstums aufzuzeigen. Der RrWert des Natriumsalzes der Clavulansäure in dem vorgenannten Lösungsmittel beträgt annähernd 0,37. Zwei sprühbare Reagentien, nämlich Ehrlich'sches Reagens und Triphenyltetrazolium-chlorid, werden ebenfalls verwendet, um die Zone des Na-20 triumsalzes der Clavulansäure aufzuzeigen. Das erstgenannte Reagens besteht aus 300 mg p-Dimethylaminobenzaldehyd, das in 9 ml Äthanol, 54 ml n-ButanoI und 9 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst ist. Beim 1- bis 2minü-tigen Erhitzen der besprühten Dünnschicht-Chromatogra-25 phieplatte auf 120°C erscheint das Natriumsalz der Clavulansäure als rosaroter Flecken. Das Triphenyltetrazolium--chlorid-Reagens besteht aus einem Gemisch von 1 Volumenteil einer 4prozentigen Lösung dieser Verbindung in Methanol und 1 Volumenteil methanolischer Natronlauge. 30 Nach dem Aufsprühen werden die Dünnschicht-Chromatographieplatten auf 80°C erhitzt. Das Natriumsalz der Clavulansäure erscheint als roter Punkt auf weissem Untergrund.

v

1 Blatt Zeichnungen

Claims

630631

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Esters der Clavulansäure der Formel I

ch2oh worin X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet, in Gegenwart eines die Kondensation beschleunigenden Mittels umgesetzt wird.
4. Verwendung von nach dem Verfahren nach Anspruch 1 5 2 hergestellten Verbindungen der Formel

(Dio

(X)

15

CO-O-CH-A.

8

worin R einen organischen Rest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Salz der Clavulansäure mit einer Verbindung der Formel Q-R, in der Q eine leicht ersetzbare Gruppe darstellt, umgesetzt wird.
2. Verfahren zur Herstellung eines Esters der Clavulansäure der Formel I

ch2oh

20

25

worin A, Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe und A8 eine gegebenenfalls substituierte Phe-nylgruppe bedeutet,

zur Herstellung von Clavulansäure oder einem Salz davon, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen hydrierend spaltet.
5. Verwendung von nach dem Verfahren nach Anspruch 2 hergestellten Verbindungen der Formel

(I)

30

CH2OH

35

worin R ein Alkyl- oder Aralkylrest ist, dadurch gekennzeichnet, dass Clavulansäure mit einem entsprechenden Diazoalkan umgesetzt wird.
3. Verfahren zur Herstellung eines Esters der Clavulansäure der Formel I 40

ch20h

45

(X)

CO-O-CH-A-

I 7

A8

worin A7 Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe und As eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe bedeutet,

zur Herstellung von Clavulansäure oder einem Salz davon, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen hydrierend spaltet.
6. Verwendung von nach dem Verfahren nach Anspruch 3 hergestellten Verbindungen der Formel

(I)

worin R ein organischer Rest ist, dadurch gekennzeichnet, dass Clavulansäure mit einer Verbindung der Formel RXH,

50

55

r~

(X)

worin A, Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe und A8 eine gegebenenfalls substituierte Phe-60 nylgruppe bedeutet,

zur Herstellung von Clavulansäure oder einem Salz davon, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen hydrierend spaltet.

65