CH630643A5

CH630643A5 - Process for concentrating a placenta-specific glycoprotein.

Info

Publication number: CH630643A5
Application number: CH465377A
Authority: CH
Inventors: Hans Dr Bohn
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1976-04-17
Filing date: 1977-04-14
Publication date: 1982-06-30
Also published as: DE2616984C3; FI60875B; NO771316L; IT1075832B; FI60875C; CH632091A5; SE7704359L; IL51883A; IE44824L; AT362057B; DK168577A; DE2616984A1; AU517434B2; NZ183878A; DE2616984B2; NL7703963A; ES457714A1; FR2348222B1; FI771186A7; JPS52154509A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung eines in der menschlichen Plazenta vorkommenden von H. Bohn 1972 im wässrigen Plazentenextrakt gefundenen als PP5 bezeichneten Plazentaproteins sowie dessen Verwendung zum Nachweis von PP5 und von gegen PP5 gerichteten Antikörpern.

Wie von H. Bohn in Archiv für Gynäkologie, Bd 212, Seite 165 bis 175, 1972, beschrieben, kann mit Hilfe von Antiseren, die durch Immunisierung von Plazentenfraktionen gewonnen worden waren, im Extrakt von Plazenta eine Reihe löslicher Antigene immunologisch nachgewiesen werden. Für das mit PPS bezeichnete Protein konnte gezeigt werden, dass es offensichtlich plazentaspezifisch ist, denn die Nach weis versuche dieses Proteins mit immunologischen Standardtechniken in einer Reihe von embryonalen und adulten menschlichen Organen oder auch im Humanplasma sowie Erythrozytenlysaten führten zu keiner positiven Reaktion.

In der elektrophoretischen Wanderung in Agar zeigt sich PP5 als ßj-Globulin. In einem Polyacrylamidgel wandert es im Vergleich zu Albumin = 100 mit einer relativen Beweglichkeit von 75. Aufgrund seines Verhaltens bei der Gelfiltration auf quervernetztem Dextran wurde ein Molekulargewicht für PP5 von etwa 50 000 abgeleitet. Das PP5 ist selbst im Plazentenextrakt in relativ niedriger Konzentration vorhanden, so dass seine Reindarstellung trotz aufwendiger Verfahren der biochemisch präparativen Techniken bisher nicht möglich war, insbesondere weil diese Verfahren nicht hinreichend selektiv sind.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass PP5 durch Immunadsorption soweit angereichert werden kann, dass in einer anschliessenden Reinigung nach konventionellen Frak-tionierungsmethoden oder auch in einem weiteren Immun-adsorptionsverfahren, in welchem die restlichen Serumproteine und Plazentenproteine entfernt werden können, das reine PP5 erhalten werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Anreicherung des Proteins PP5 aus dessen Lösungen, vorzugsweise aus dem wässrigen Extrakt von Plazenten.

Serologisch mit PP5 verwandte Antikörper sind zur ad-sorptiven Gewinnung sowohl von PP5 als auch von damit antigenverwandten Proteinen einsetzbar.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine PP5 enthaltende Proteinlösung, vorzugsweise den wässrigen Extrakt von Plazenten — im besonderen menschlichen Plazenten —, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP5 in Berührung bringt, den Träger, der das PP5 gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PP5 mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2-4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden

Stoffes bei einem pH-Wert von 4-9, vorzugsweise etwa pH 7, behandelt.

Als Ausgangsmaterial dient bevorzugt die menschliche Plazenta, aus der man etwa 10-20 mg PP5 pro Plazenta durchschnittlicher Grösse (ca. 500-600 g) extrahieren kann. Zur Herstellung des wässrigen Extraktes werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösung behandelt und die flüssige Phase gewonnen.

Geeignete Salze für die Salzlösung sind möglichst inerte Salze, wie sie als Bestandteile von Lösungen für die Extraktion von Geweben bekannt sind. Verwendet werden dazu Neutralsalze und Puffersubstanzen, insbesondere Kochsalz oder Tris-hydroxymethylaminomethan, ferner Alkalisalze der Phosphor- oder Citronensäure. Zweckmässig liegen die Salzkonzentrationen bei 0,1 bis 5%.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann das PP5 aus üblicherweise verwendeten Plazentenextrakten, in denen es in einer Konzentration von etwa 1-2 mg pro 100 ml vorliegt bis zu einer Konzentration von etwa 100-1 000 mg/ 100 ml angereichert werden. Die spezifische Anreicherung liegt bei etwa 2 500-5 000.

Der für die Anreicherung des PP5 benötigte Antikörper, der in bekannter Weise an einen festen Träger gebunden werden kann, wird durch Immunisierung von Tieren mit PP5 erhalten. Solange das Reinprotein nicht zur Verfügung steht, wird der für die Immunisierung von Wirbeltieren, insbesondere Kaninchen, mit einer durch Fällungsverfahren in bezug auf PP5 angereicherten Plazentenfraktion hergestellt: beispielsweise nach der von H. Bohn 1972 beschriebenen Methode.

Bei der Immunisierung mit derartigen Rohrfraktionen werden Antiseren mit multispezifischen Antikörpern erhalten. Die nicht spezifisch gegen PPS gerichteten Antikörper werden mit geeigneten Antigenen aus Blutserum und Plazentenfraktionen behandelt, wonach mit Hilfe der resultierenden Anti-gen-Antikörperreaktion die unspezifischen Antikörper entfernt werden könen.

Die Gewinnung der Immunoglobulinfraktion, in der sich PPä-Antikörper befinden, erfolgt in bekannter Weise. Das danach erhaltene Anti-PP5 wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, Seite 259, Naturwissenschaften 58 (1971), Seite 389 oder Nature 314 (1967), Seite 1302. Besonders geeignete Träger sind hochpolymere Kohlenhydrate, wie Cellulose oder Agar, synthetische Harze, wie Polyacrylamid oder Co-Polymere aus Äthylen/Maleinsäure-Anhydrid; auch Glaspartikel können als Träger verwendet werden.

Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von 20-200 p,m an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen PP5 kovalent gebunden werden können.

Für die Isolierung des PP5 aus Lösungen, im Besonderen aus Plazentaextrakten, die ausserdem andere Proteine und Kohlehydrate enthalten, wird die PP5-Lösung mit dem den Antikörper tragenden Adsorbens in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert auf > 4 eingestellt wird. Um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, wird der pH-Wert nicht höher als 9 eingestellt. Die Salzkonzentration der Lösung ist nicht kritisch. Jedoch sollten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vorteilhaft enthält die wässrige Lösung neutrale Salze und/oder Puffersubstanzen, wie sie allg. in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Tris-Hydroxymethylamino-methan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Handbook of Biochemistry, Published by The

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Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, USA, 2nd Edition S.J238, beschrieben sind. Die Konzentration dieser Substanzen liegt zweckmässig im Bereich zwischen 0,01 und 2 Mol/1. Das Verhältnis Proteinlösung:Adsorbens ist zweckmässig im Bereich 1:1 -10:1, vorzugsweise 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung 0,1 bis 5 Stunden in Berührung bleiben, damit genügend Zeit zur Verfügung steht, die Antigen-Antikörper-Bindung zu knüpfen.

Die Adsorption und die Elution des PP5 kann sowohl im sogenannten batch-Verfahren als auch in einer Chromatographie-Säule durchgeführt werden. Hierzu wird das Adsorbens von der Lösung abgetrennt, im batch-Verfahren durch Zentrifugierung oder Filtration mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren. In dem Säulenverfahren wird die Lösung durch gründliches Spülen mit Pufferlösung aus der Säule entfernt.

Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger kann auf bekannte Weise durch Massnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen-Antikörper-Bindungen bewirken. So erfolgt die Elution durch Behandlung des Trägers mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2 und 4. Die entsprechende Lösung sollte im allgemeinen Salze und geeignete Puffersubstanzen in geeigneter Konzentration, vorzugsweise 0,2-8 Mol/1 enthalten.

Im batch-Verfahren empfiehlt es sich, die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1-2 Stunden lang zu belassen, wobei das PP5 vom Immunadsorbens desorbiert wird. Im Säulenverfahren lässt man die Elutionslösung durch die Säule hindurchfliessen. Nach Abtrennung des Adsorbens wird der pH-Wert der das PP5 enthaltenden Lösung im allgemeinen auf etwa neutral (pH 6-8) gestellt. Die angereicherte PP5-Lö-sung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung unterworfen werden.

Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger erfolgt auch mit Hilfe von Proteinbindungen dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstoff- oder Guanidinlösungen oder Lösungen von sogenannten chaotropen Salzen wie NaN03 NaBr, NaC104, CF3COONa, NaSCN oder CC13-COONa. Die Konzentration dieser Salze im Elutionsme-dium beträgt zweckmässig 2 bis 8 Mol/1. Zur Entfernung der chaotropen Salze aus der Lösung nach der Desorption des PP5 und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/1 dialysiert werden.

Das nach diesem Verfahren erhaltene PP5 besitzt einen Reinheitsgrad von 50 bis 80%. Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99 % angereichert werden.

Falls eine Weiterreinigung des durch Immunadsorption angereicherten PP5 gewünscht wird, kann diese mit gängigen Fraktionierungsverfahren vorgenommen werden. Bevorzugt werden dabei Fraktionierungsverfahren mit Hilfe eines Molekularsiebs mit dem Ziel, die PP5-Anteile in den Fraktionie-rungsbereichen von Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 anzureichern. Ein weiteres gängiges anwendbares Verfahren ist die Ionenaustausch-Chromatographie. Dabei werden die Ladungseigenschaften des PP6 verwertet, das sich bekanntlich wie ein ß^Globulin verhält Eine weitere Möglichkeit zur Rein-Darstellung des PP5 ist in Im-munadsorptionsverfahren gegeben, bei denen nicht die Antikörper gegen PP5 sondern gegen die zu entfernenden Verunreinigungen als trägergebundene Adsorbentien Verwendung finden. Das PP5 befindet sich nach Anwendung dieses Verfahrens in den nicht gebundenen Anteilen.

Der Fortschritt der Reinigungsverfahren ist in jedem Falle am einfachsten mit Hilfe entsprechender Antiseren überprüfbar. Bei den jeweiligen Fraktionierungsverfahren werden diejenigen Fraktionen vewonnen, die mit den spezifisch gegen

PP5 reagierenden Antiseren eine immunologische Reaktion, insbesondere eine Immunpräzipitation, zeigen.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältliche PP5 ist besonders geeignet, spezifisch dagegen gerichtete Antiseren herzustellen. Mit dem erfindungsgemäss erhältlichen PP5 kann deshalb ein Anti-PPr>-Serum hergestellt werden. Dabei werden Tiere nach bekannten Methoden mit PP5 immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewonnen. Mit Hilfe dieser neuen Antiseren lässt sich PP5 durch immunologische Methoden, wie beispielsweise dem Häm-agglutinationshemmungstest, der Komplimentbindungsreaktion, dem Radioimmunoassay, der Latexagglutination u. ähnlichen empfindlichen Methoden, in Körperflüssigkeiten nachweisen.

So last sich zeigen, dass PP5 während der Schwangerschaft in geringen Konzentrationen im Blut der Schwangeren erscheint. Ferner ist PP5 in der Tumordiagnostik von Bedeutung. Es kann im Blut und Tumorgewebe von Kranken mit trophoblastischen Tumoren nachgewiesen werden. In der Regel bestehen die entsprechenden diagnostischen Mittel im wesentlichen aus Anti-PP5, und bei bestimmten Verfahren, beispielsweise in radioimmunologischen Testsystemen, wird PP5 selbst als Standardsubstanz mitgeführt. In diagnostischen Mitteln zum Nachweis von gegen PP5 gerichteten Antikörpern ist PP5 der wesentliche Bestandteil des Reagens.

Das nachfolgende Beispiel erläutert das Verfahren.

1. Herstellung des Immunadsorbens

150 ml eines Anti-PP5-Serums vom Kaninchen werden gegen 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobuline an DEAE-Zellulose chromato-graphiert. Die Immunglobulinfraktion (1,3 g Protein) wird dann mit 258 g besonders gereinigter Agarose in Kugelform (Sepharose ® 4B der Pharmacia Uppsala, Schweden), die mit 16,1 g Bromcyan aktiviert worden war, umgesetzt und so kovalent an diesen Träger gebunden.

Das Verfahren ist beschrieben von Axen R., Porath J., Embach S.. Nature 214, 1302, (1967).

Mit Hilfe eines auf diese Weise hergestellten Immunadsorbens kann das Plazentaprotein PP5 aus dessen Lösungen, insbesondere aus PP5-angereicherten Plazentaextraktfraktionen isoliert werden.

2. Anreicherung des PP5 aus Plazentaextrakt

2.1. Anreicherung der PP5 Eiweissfraktion

150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wässrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalem Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3 %igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat (Rivanol®) versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand, der das PPS zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Ab-scheidung des noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.

500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit «Tris» abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05 % Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt.

Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 mo5

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larem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert.

Den vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze verrührt. Der Niederschlag, der das PP5 enthält, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen einen 0,1 molaren Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter und 0,1 % Natriumazid enthält, dialysiert. Man erhält 200 ml einer Lösung mit ca. 6% Eiweiss und etwa 30 mg PP5. Aus dieser Fraktion kann PP5 durch Immunadsorption isoliert werden.

Das unter 2.1 vorgestellte Anreicherungsverfahren ist nicht erfindungswesentlich. Die Immunadsorption kann auch mit Plazentenextrakt direkt durchgeführt werden.

2.2. Immunadsorption des PP5

Das Immunadsorbens wird in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/1 NaCl und 0,1% NaN3 enthält (nachstehend Pufferlösung I) suspendiert, dann in eine Chromatographiesäule gefüllt (3 X 20 cm) und mit Pufferlösung I nachgespült. Dann lässt man langsam 100 ml einer PP5-haltigen Lösung durch die Säule wandern, wobei PP5 immunadsorp-tiv gebunden wird. Man wäscht die Säule gründlich mit Puffer I nach und eluiert dann das adsorbierte Protein mit 0,5 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5). Die PP5-haltigen Eluate werden mit 1 n NaOH auf pH 7,0 eingestellt und im Ultrafilter auf ca. 10 ml eingeengt. Ausbeute pro Adsorption — 2 mg PP5.

Das Adsorbens in der Säule wird unmittelbar nach der Elution von PP5 wieder mit Pufferlösung I neutralisiert und gründlich gewaschen; es kann dann erneut zur immunadsorp-tiven Bindung von PP5 eingesetzt werden.

Das durch Immunadsorption gewonnene Protein ist häufig durch unspezifisch gebundene Serumproteine (hauptsächlich 5 IgG und daneben etwas IgA) verunreinigt. Die Abtrennung dieser Begleitproteine gelingt, z.B. durch Gelfiltration, Mole-kularsiebfraktionierung z.B. bevorzugt mit Hilfe von quer-vernetztem Dextran wie Sephadex® G-100; die Serumproteine können aber auch durch Immunadsorption, d.h. mit Hilfe von io trägergebundenen Antikörpern gegen Serumproteine, entfernt werden.

Das im Rahmen des im obigen Verfahren verwendeten Anti-PP5-Serums wurde wie folgt erhalten:

i Es wurden Kaninchen mit dem gereinigten PP5 unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert.

Das PPS wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Alumi-20 niumhydroxid zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen, erhalten an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i.v. injiziert.

Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinander folgenden Tagen 25 mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das 30 Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.

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Claims

630643 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Anreicherung des plazentaspezifischen Proteins PPa, dadurch gekennzeichnet, dass man eine PP5 enthaltende Proteinlösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP5 in Berührung bringt, den Träger, der das PPg gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PP5 mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2 bis 4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert von 4 bis 9 behandelt.

2. Verwendung des nach Anspruch 1 erhaltenen plazentaspezifischen Proteins PP5 in einem diagnostischen Mittel zum Nachweis des PP5 und von gegen PP5 gerichteten Antikörpern.