CH632091A5 - Process for the preparation of an antiserum directed against placenta-specific glycoprotein - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung eines gegen das plazentaspezifische Protein PPs gerichteten Antiserums, dadurch gekennzeichnet, dass man eine PPs enthaltende Proteinlösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlösli- 5 chen Träger gebundenen Antikörper gegen das PPs in Berührung bringt, den Träger, der das PPs gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt, zur Ablösung des PPs mit einem wäss-rigen Medium vom pH-Wert 2 bis 4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Stoffes bei einem io pH-Wert von 4 bis 9 behandelt, mit dem erhaltenen PPs Tiere immunisiert und aus dem Blut der immunisierten Tiere das Antiserum gewinnt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gegen das in der menschlichen Plazenta vorkommende, von 20 H. Bohn 1972 im wässrigen Plazentenextrakt gefundene und als PPs bezeichnete Plazentaprotein gerichteten Antiserums.

Wie von H. Bohn in Archiv für Gynäkologie, Bd. 212, Seite 165 bis 175,1972, beschrieben, kann mit Hilfe von Antiseren, die durch Immunisierung von Plazentenfraktionen gewonnen wor- 25 den waren, im Extrakt von Plazenta eine Reihe löslicher Antigene immunologisch nachgewiesen werden. Für das mit PPs bezeichnete Protein konnte gezeigt werden, dass es offensichtlich plazentaspezifisch ist, denn die Nachweisversuche dieses Proteins mit immunologischen Standardtechniken in einer 30 Reihe von embryonalen und adulten menschlichen Organen oder auch im Humanplasma sowie Erythrozytenlysaten führten zu keiner positiven Reaktion.

In der elektrophoretischen Wanderung in Agar zeigt sich PPs als ßi-Globulin. In einem Polyacrylamidgel wandert es im 35 Vergleich zu Albumin = 100 mit einer relativen Beweglichkeit von 75. Aufgrund seines Verhaltens bei der Gelfiltration auf quervernetztem Dextran wurde ein Molekulargewicht für PPs von etwa 50 000 abgeleitet. Das PPs ist selbst im Plazentenextrakt in relativ niedriger Konzentration vorhanden, so dass 40 seine Reindarstellung trotz aufwendiger Verfahren der.bioche-misch präparativen Techniken bisher nicht möglich war, insbesondere weil diese Verfahren nicht hinreichend selektiv sind.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass PPs durch Immunadsorption soweit angereichert werden kann, dass in 45 einer anschliessenden Reinigung nach konventionellen Fraktio-nierungsmethoden oder auch in einem weiteren Immunadsorp-tionsverfahren, in welchem die restlichen Serumproteine und Plazentenproteine entfernt werden können, das reine PPs erhalten werden kann. 50

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines gegen das plazentaspezifische Protein gerichteten Antiserums durch Anreicherung des Proteins PPs aus dessen Lösungen, vorzugsweise aus dem wässrigen Extrakt von Plazenten und Immunisieren von Tieren mit dem gewönne- 55 nen Protein.

Serologisch mit PPs verwandte Antikörper sind zur adsorp-tiven Gewinnung sowohl von PPs als auch von damit antigen-verwandten Proteinen einsetzbar.

Die Anreicherung erfolgt durch in Berührung bringen einer 60 PPs enthaltenden Proteinlösung, vorzugsweise den wässrigen Extrakt von Plazenten - im besonderen menschlichen Plazenten -, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PPs durch Abtrennung des Trägers, der das PPs gebunden enthält, 65 von der flüssigen Phase und durch Behandlung zur Ablösung des PPs mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert 2 bis 4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden

Stoffes bei einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise etwa pH 7.

Als Ausgangsmaterial dient bevorzugt die menschliche Plazenta, aus der man etwa 10 bis 20 mg PPs pro Plazenta durchschnittlicher Grösse (etwa 500 bis 600 g) extrahieren kann. Zur Herstellung des wässrigen Extraktes werden zerkleinerte Pla-tenten mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösung behandelt und die flüssige Phase gewonnen.

Geeignete Salze für die Salzlösung sind möglichst inerte Salze, wie sie als Bestandteile von Lösungen für die Extraktion von Geweben bekannt sind. Verwendet werden dazu Neutralsalze und Puffersubstanzen, insbesondere Kochsalz oder Tris-hydroxymethylaminomethan, ferner Alkalisalze der Phosphoroder Citronensäure. Zweckmässig liegen die Salzkonzentratio-nèn bei 0,1 bis 5%.

Bei dem obigen Anreicherungsverfahren kann das PPs aus üblicherweise verwendeten Plazentenextrakten, in denen es in einer Konzentration von etwa 1 bis 2 mg pro 100 ml vorliegt bis zu einer Konzentration von etwa 100 bis 1000 mg/100 ml angereichert werden. Die spezifische Anreicherung liegt bei etwa 2500 bis 5000.

Der für die Anreicherung des PPs benötigte Antikörper, der in bekannter Weise an einen festen Träger gebunden werden kann, wird durch Immunisierung von Tieren mit PPs erhalten. Solange das Reinprotein nicht zur Verfügung steht, wird der für die Immunisierung von Wirbeltieren, insbesondere Kaninchen, mit einer durch Fällungsverfahren in Bezug auf PPs angereicherten Plazentenfraktion hergestellt: beispielsweise nach der von H. Bohn 1972 beschriebenen Methode.

Bei der Immunisierung mit derartigen Rohfraktionen werden Antiseren mit multispezifischen Antikörpern erhalten. Die nicht spezifisch gegen PPs gerichteten Antikörper werden mit geeigneten Antigenen aus Blutserum und Plazentenfraktionen behandelt, wonach mit Hilfe der resultierenden Antigen-Anti-körperreaktion die unspezifischen Antikörper entfernt werden können.

Die Gewinnung der Immunglobulinfraktion, in der sich PPs-Antikörper befinden, erfolgt in bekannter Weise. Das danach erhaltene Anti-PPs wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Biochem.40,1971, Seite 259, Naturwissenschaften 58 (1971), Seite 389 oder Nature 314 (1967), Seite 1302. Besonders geeignete Träger sind hochpoly-mere Kohlenhydrate, wie Cellulose oder Agar, synthetische Harze, wie Polyacrylamid oder Co-Polymere aus Äthylen/ Maleinsäure-Anhydrid; auch Glaspartikel können als Träger verwendet werden.

Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von 20-200 (im an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen PPs kovalent gebunden werden können.

Für die Isolierung des PPs aus Lösungen, im besonderen aus Plazentaextrakten, die ausserdem andere Proteine und Kohlehydrate enthalten, wird die PPs-Lösung mit dem den Antikörper tragenden Adsorbens in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert auf >4 eingestellt wird. Um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, wird der pH-Wert nicht höher als 9 eingestellt. Die Salzkonzentration der Lösung ist nich kritisch. Jedoch sollten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vorteilhaft enthält die wässrige Lösung neutrale Salze und/oder Puffersubstanzen, wie sie allgemein in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Tris-Hydroxymethylaminomethan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Hand-boock of Biochemistry, published by the Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, USA, 2nd Edition S.J238, beschrieben sind. Die

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Konzentration dieser Substanzen liegt zweckmässig im Bereich zwischen 0,01 und 2 Mol/1. Das Verhältnis Proteinlösung: Adsorbens ist zweckmässig im Bereich 1:1 bis 10:1, vorzugsweise 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung 0,1 bis 5 Stunden in Berührung bleiben, damit genügend Zeit zur Verfügung steht, die Antigen-Antikörper-Bindung zu knüpfen.

Die Adsorption und die Elution des PPs kann sowohl im sogenannten Batch-Verfahren als auch in einer Chromatogra-phie-Säule durchgeführt werden. Hierzu wird das Adsorbens von der Lösung abgetrennt, im Batch-Verfahren durch Zentri-fugierung oder Filtration mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren. In dem Säulenverfahren wird die Lösung durch gründliches Spülen mit Pufferlösung aus der Säule entfernt.

Die Elution des PPs vom Antikörper-haltigen Träger kann auf bekannte Weise durch Massnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen-Antikörper-Bindungen bewirken. So erfolgt die Elution durch Behandlung des Trägers mit einem wässrigen Medium vom pH-Wert zwischen 2 und 4. Die entsprechende Lösung sollte im allgemeinen Salze und geeignete Puffersubstanzen in geeigneter Konzentration, vorzugsweise 0,2 bis 8 Mol/1 enthalten.

Im Batch-Verfahren empfiehlt es sich, die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1 -2 Stunden lang zu belassen, wobei das PPs vom Immunadsorbens desorbiert wird. Im Säulenverfahren lässt man die Elutionslösung durch die Säule hin-durchfliessen. Nach Abtrennung des Adsorbens wird der pH-Wert der das PPs enthaltenden Lösung im allgemeinen auf etwa neutral (pH 6 bis 8) gestellt. Die angereicherte PPs-Lösung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung unterworfen werden.

Die Elution des PPs vom Antikörper-haltigen Träger erfolgt auch mit Hilfe von Proteinbindungen dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstoff- oder Guanidinlösungen oder Lösungen von sogenannten chaotropen Salzen wie NaNCh, NaBr, NaClOi, CF3COONa, NaSCN oder CChCOONa erfolgen. Die Konzentration dieser Salze im Elutionsmedium beträgt zweckmässig 2 bis 8 Mol/1. Zur Entfernung der chaotropen Salze aus der Lösung nach der Desorption des PPs und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/I dialysiert werden.

Das nach dieser Anreicherung erhaltene PPs besitzt einen Reinheitsgrad von 50 bis 80%. Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99% angereichert werden.

Falls eine Weiterreinigung des durch Immunadsorption angereicherten PPs gewünscht wird, kann diese mit gängigen Fraktionierungsverfahren vorgenommen werden. Bevorzugt werden dabei Fraktionierungsverfahren mit Hilfe eines Molekularsiebs mit dem Ziel, die PPs-Anteile in den Fraktionierungs-bereichen von Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 anzureichern. Ein weiteres gängiges anwendbares Verfahren ist die Ionenaustausch-Chromatographie. Dabei werden die Ladungseigenschaften des PPs verwertet, das sich ' bekanntlich wie ein ßi-Globulin verhält. Eine weitere Möglichkeit zur Reindarstellung des PPs ist in Immunadsorptionsver-fahren gegeben, bei denen nicht die Antikörper gegen PPs sondern gegen die zu entfernenden Verunreinigungen als trägergebundene Adsorbentien Verwendung finden. Das PPs befindet sich nach Anwendung dieses Verfahrens in den nicht gebundenen Anteilen.

Der Fortschritt der Reinigungsverfahren ist in jedem Falle am einfachsten mit Hilfe entsprechender Antiseren überprüfbar. Bei den jeweiligen Fraktionierungsverfahren werden diejenigen Fraktionen gewonnen, die mit dem spezifisch gegen PPs reagierenden Antiseren eine immunologische Reaktion, insbesondere eine Immunpräzipitation, zeigen.

Das derart angereicherte Protein PPs ist besonders geeignet, spezifisch dagegen gerichtete Antiseren herzustellen. Es wird deshalb zur Herstellung eines Anti-PPs-Serums verwendet. Dabei werden Tiere nach bekannten Methoden mit PPs s immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewonnen. Mit Hilfe dieser neuen Antiseren lässt sich PPs durch immunologische Methoden, wie beispielsweise dem Hämagglu-tinationshemmungstest, der Komplimentbindungsreaktion, dem Radioimmunoassay, der Latexagglutination und ähnlichen io empfindlichen Methoden, in Körperflüssigkeiten nachweisen.

So lässt sich zeigen, dass PPs während der Schwangerschaft in geringen Konzentrationen im Blut der Schwangeren erscheint. Ferner ist PPs in der Tumordiagnostik von Bedeutung. Es kann im Blut und Tumorgewebe von Kranken mit trois phoblastischen Tumoren nachgewiesen werden. In der Regel bestehen die entsprechenden diagnostischen Mittel im wesentlichen aus Anti-PPs und bei bestimmten Verfahren, beispielsweise in radioimmunologischen Testsystemen, wird PPs selbst als Standardsubstanz mitgeführt. In diagnostischen Mitteln 20 zum Nachweis von gegen PPs gerichteten Antikörpern ist PPs der wesentliche Bestandteil des Reagens.

Das nachfolgende Beispiel erläutert das Verfahren.

1. Herstellung des Immunadsorbens

25 150 ml eines Anti-PPs-Serums vom Kaninchen werden gegen 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobuline an DEAE-Zellulose chroma-tographiert. Die Immunglobulinfraktion (1,3 g Protein) wird dann mit 258 g besonders gereinigter Agarose in Kugelform 30 (Sepharose ®4B der Pharmacia Uppsala, Schweden), die mit 16,1 g Bromcyan aktiviert worden war, umgesetzt und so ko valent an diesen Träger gebunden.

Das Verfahren ist beschrieben von Axen R., Porath J., Embach S., Nature 214,1302(1967).

35 Mit Hilfe eines auf diese Weise hergestellten Immunadsorbens kann das Plazentaprotein PPs aus dessen Lösungen, insbesondere aus PPs-angereicherten Plazentaextraktfraktionen isoliert werden.

2. Anreicherung des PPs aus Plazentaextrakt 2.1 Anreicherung der PPs Eiweissfraktion

150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wässrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalen Natriumhydroxid 45 auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3%igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat(Rivanol ®) versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand, der das PPs zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des so noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.

500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags wer-55 den in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit «Tris» abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Puf-60 ferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt.

Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 molarem 65 Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert.

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Den vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze verrührt. Der Niederschlag, der das PPs enthält, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen einen 0,1 molaren Tris-Salz-säure-Puffer pH 8,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter und 0,1% Natriumazid enthält, dialysiert. Man erhält 200 ml einer Lösung mit etwa 6% Eiweiss und etwa 30 mg PPs. Aus dieser Fraktion kann PPs durch Immunadsorption isoliert werden.

Das unter 2.1 vorgestellte Anreicherungsverfahren ist nicht erfindungswesentlich. Die Immunadsorption kann auch mit Plazentenextrakt direkt durchgeführt werden.

2.2 Immunadsorption des PPs

Das Immunadsorbens wird in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/I NaCl und 0,1% NaN3 enthält (nachstehend Pufferlösung I) suspendiert, dann in eine Chromatographiesäule gefüllt (3 x 20cm) und mit Pufferlösung I nachgespült. Dann lässt man langsam 100 ml einer PPs-haltigen Lösung durch die Säule wandern, wobei PPs immunadsorptiv gebunden wird. Man wäscht die Säule gründlich mit Puffer I nach und eluiert dann das adsorbierte Protein mit 0,5 M Glycin-HCl-Puf-fer (pH 2,5). Die PPs-haltigen Eluate werden mit 1 n NaOH auf pH 7,0 eingestellt und im Ultrafilter auf etwa 10 ml eingeengt. Ausbeute pro Adsorption ~2 mg PPs.

Das Adsorbens in der Säule wird unmittelbar nach der Elution von PPs wieder mit Pufferlösung I neutralisiert und gründlich gewaschen; es kann erneut zu immunadsorptiven Bindung von PPs eingesetzt werden.

Das durch Immunadsorption gewonnene Protein ist häufig durch unspezifisch gebundene Serumproteine (hauptsächlich IgG und daneben etwas IgA) verunreinigt. Die Abtrennung dieser Begleitproteine gelingt, z. B. durch Gelfiltration, Molekular-5 siebfraktionierung z. B. bevorzugt mit Hilfe von quervernetz-tem Dextran wie Sephadex ®G - 100; die Serumproteine können aber auch durch Immunadsorption, d. h. mit Hilfe von trägergebundenen Antikörpern gegen Serumproteine, entfernt werden.

10 Das im Rahmen der Erfindung verwendete Anti-PPs-Serum wurde wie folgt erhalten:

Es wurden Kaninchen mit dem gereinigten PPs unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert.

15 Das PPs wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxid zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinander folgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i.v. injiziert.

20 Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinander folgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinander folgenden Tagen j e 0,06 mg des Antigens. Nach 25 einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.