CH634662A5 - Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren. - Google Patents

Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren. Download PDF

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Tri- sen Anknüpfung von Aminosäuren bis zum gewünschten Pep-peptidderivaten der Formel tidgerüst aus. Die übrigen Schutzgruppen werden vom Schluss-
30 produkt selektiv abgespalten, ohne dass die chromophore Ri_NH-CH(R3)-CO-Y-Arg-R2 I Gruppe beeinflusst wird. Diese Methode ist z.B. in «Peptide
Synthesis» von Miklos Bodanszky et al., Interscience Pubin welcher R1 Wasserstoff, eine gegebenenfalls in ca-Stellung lishers, 1966, Seiten 163-165, beschrieben.
eine Aminogruppe tragende Alkanoylgruppe mit 2 bis 18 Koh- 2. Bei der zweiten Methode wird die chromophore Gruppe lenstoffatomen, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 13 Koh- 35 an das fertig aufgebaute Peptidgerüst angekuppelt, und zwar lenstoffatomen, eine Phenylalkanoylgruppe, deren Alkanoyl- dadurch, dass nach erfolgtem, stufenweisem Aufbau des rest 2 bis 11 Kohlenstoffatome enthält und deren Phenylrest gewünschten Peptidgerüstes die C-terminale Carboxylgruppe gegebenenfalls eine Aminogruppe trägt, eine gegebenenfalls zuerst durch alkalische Hydrolyse des Esters freigesetzt wird, eine Amino- oder Aminoalkylgruppe tragende Cyclohexylcar- worauf die chromophore Gruppe an die Carboxylgruppe ange-bonylgruppe, eine gegebenenfalls eine Alkyl-, Amino- oder 40 hängt wird. Die übrigen Schutzgruppen werden zum Schluss Aminoalkylgruppe tragende Benzoylgruppe, eine Benzyloxy- selektiv abgespalten, und zwar unter Bedingungen, bei welchen carbonylgruppe, eine Alkylsulfonylgruppe mit 1 bis 12 Kohlen- die chromophore Gruppe intakt bleibt. Diese Methode ist in Stoffatomen oder eine Arylsulfonylgruppe, deren Arylrest ein- «Peptide Synthesis», siehe oben, Seiten 43 und 44, beschrieben, oder mehrkernig ist und gegebenenfalls Substituenten trägt, 3. Bei der dritten Methode wird die chromophore Gruppe darstellt, R3 einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest « an das fertig aufgebaute Peptidgerüst angekuppelt, nachdem mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, Y eine Glycyl- oder zuvor die übrigen Schutzgruppen abgespalten worden sind. Serylgruppe darstellt und R2 eine unter Bildung eines farbigen Die C-terminale Carboxylgruppe wird in diesem Fall durch oder fluoreszierenden Amins R2-H enzymatisch abspaltbare, racemisierungsfreie enzymatische Esterspaltung freigesetzt, chromogene, substituierte Aminogruppe darstellt, oder von Diese esterspaltenden Enzyme können entweder frei oder an Salzen dieser Tripeptide mit Mineralsäuren oder organischen so eine Matrix gebunden sein.
Säuren, als Substrate zur quantitativen Bestimmung von Uroki- Zum Schutz der Na-Aminogruppen während des stufenwei-nase und anderen Plasminogen-Aktivatoren sowie von Inhibi- sen Aufbaus der Peptidketten können gewöhnliche, bekannte toren dieser Enzyme und Plasminogen-Proaktivatoren in Kör- Aminoschutzgruppen, die selektiv abgespalten werden können, perflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere und Gewe- verwendet werden. Es handelt sich in erster Linie um Cbo, beextrakten, wobei die genannten Körperflüssigkeiten oder 55 MeOCbO, NChCbo, MCbo, BOC, TFA oder Formyl. Die a-Car-Gewebeextrakte mit einem der genannten Tripeptidderivate boxylgruppe der Aminosäuren kann nach verschiedenen oder einem ihrer Salze zur Reaktion gebracht werden und die bekannten Methoden reaktionsfähig gemacht werden, z.B. Menge des durch die hydrolytische Einwirkung der genannten durch Herstellung der p-Nitrophenylesterderivate, Trichlor-Enzyme auf das Tripeptidderivat oder sein Salz gebildeten phenylesterderivate, Pentachlorphenylesterderivate,
Spaltproduktes R2-H durch photometrisches, spektrophoto- eo N-Hydroxy-succinimidesterderivate und Isolierung dieser Deri-metrische oder fluoreszenzspektrophotometrische Methoden vate oder durch Herstellung in situ der Säureazide oder Säuregemessen wird. anhydride, die entweder symmetrisch oder asymmetrisch sein
R1 in der Formel I kann eine Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, können.
Pentanoyl-, Hexanoyl- usw. bis Octadecanoylgruppe sein. Diese Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann auch mittels Gruppen können in ra-Stellung eine Aminogruppe tragen. R1 es eines Carbodiimids, wie N,N ' -Dicyclohexylcarbodiimid, erfol-kann somit z.B. auch eine ra-Aminobutyryl-, (a-Aminohexanoyl- gen.
oder co-Aminodecanoylgruppe sein. R1 kann ferner eine Pheny- Die Carboxylgruppe, die in den Peptidderivaten C-terminal lacetyl-, 3-Phenylpropionyl-, 4-Phenylbutyryl- usw. bis 12-Phe- steht, wird entweder mittels der chromophoren Amidgruppe
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oder aber als Methyl-, Äthyl- oder Isopropylester während des stufenweisen Aufbaus des gewünschten Peptidgerüstes geschützt.
Die übrigen freien reaktionsfähigen Gruppen, die nicht am Aufbau des Peptidgerüstes beteiligt sind, können durch folgende spezielle Massnahmen blockiert werden: Die 8-Guanidi-nogruppe des Arginins wird durch NO2, Tos oder durch einfache Protonisierung geschützt, während die e-Aminogruppe des Lysins mittels CbO, BOC oder Tos geschützt wird.
Bei der Synthese der Tripeptidkette kann man zuerst die N-terminale Aminosäure oder Dipeptidsäure mit der Blockierungsgruppe (Acyl- oder Sulfonylgruppe) versehen, dann die Carboxylgruppe der blockierten Aminosäure oder Dipeptidsäure aktivieren und schliesslich das so erhaltene aktivierte Aminosäurederivat oder Dipeptidsäurederivat an das zur Vervollständigung der Peptidkette benötigte Dipeptidderivat anknüpfen.
Die Herstellung der erfindungsgemäss verwendeten Substrate nach den oben genannten Methoden ist in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
Die Analyse der gemäss den Beispielen erhaltenen Eluate und Produkte wurde durch Dünnschichtchromatographie ausgeführt. Zu diesem Zweck wurden mit Siliciumdioxydgel F 254 (Merck) überzogene Glasplatten verwendet. Zur Entwicklung der Dünnschichtchromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet:
A Chloroform/Methanol (9:1) B n-Propanol/Essigsäureäthylester/Wasser (7:1:2) C n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1)
Die Chromatogramme wurden zuerst im UV-Licht und dann durch Reaktion mit Chlor/Toluidin (siehe G. Pataki, «Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptid-Chemie», Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, S. 125) entwik-kelt.
In der vorliegenden Beschreibung (einschliesslich Patentansprüchen) werden folgende Abkürzungen verwendet:
Ala
= L-Alanin
ß-Ala
= ß-Alanin
Arg
= L-Arginin
But
= L-2-Aminobuttersäure
4-But
= 4-Aminobuttersäure
Gly
= Glycin
Ile
= L-Isoleucin
D-Ile
= D-Isoleucin
Leu
= Leucin
NLeu
= L-Norleucin
NVal
= N-Norvalin
Ser
= L-Serin
Val
= L-Valin
D-Val
= D-Valin
Ac
= Acetyl
AC2O
= Acetanhydrid
AcOH
= Essigsäure
BOC
= tert.-Butoxycarbonyl
Bz
= Benzoyl
Bzl
= Benzyl
BZ2O
= Benzoesäureanhydrid
Cbo
= Carbobenzoxy
DCCI
= N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
DCHA
= Dicyclohexylamin
DCH
= N,N'-Dicyclohexylharnstoff
DMF
= Dimethylformamid
DPA
= 1,3-Di(methoxycarbonyl>phenyl-(5)-amid
DSC
= Dünnschichtchromatogramnr'
EtsN
= Triäthylamin
HMPTA
= N,N,N' ,N ' ,N " ,N " -Hexamethylphosphorsäu-
retriamid
LMS
= Lösungsmittelsystem
MCbo
= p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy
MeOH
= Methanol
NA
= Naphthylamid
OtBu
= tert-Butoxy
OEt
= Äthoxy
OisoPr
= Iso-Propoxy
OMe
= Methoxy
OpNP
= p-Nitrophenoxy
OSu
= N-Succinimidoxy pNA
= p-Nitroanilin
Smp
- Schmelzpunkt
TFA
= Trifluoracetyl
Tos
= p-Toluolsulfonyl
Beispiel 1
I. Na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA • HCl la) N«-Cbo-Arg(N02>pNA
1. In einem 500-ml-Dreihalsrundkolben wurden 32,55 g (92,1 mMol) gut getrocknetes Cbo-Arg(NC>2)-OH in 200 ml von über P2O5 getrocknetem und frisch destilliertem N,N,N',N',N",N"-Hexamethylphosphorsäuretriamid unter Feuchtigkeitsaus-schluss bei 20 °C gelöst. Zu dieser Lösung wurden zuerst 9,32 g (92,1 mMol) Et3N und nachfolgend 18,90 g (115,1 mMol) p-Nitrophenylisocyanat in 25%igem Überschuss portionenweise zugesetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit bei Zimmertemperatur wurde die Reaktionslösung unter Rühren zu 1,5 Liter 2%iger NaHCC>3-Lösung zugetropft. Das ausgefällte Produkt wurde abfiltriert und dreimal mit je 0,7 Liter 2%iger NaHCC>3-Lösung, dreimal mit je 0,7 Liter dest. Wasser, dreimal mit je 0,5 Liter 0,5-n HCl und schliesslich dreimal mit je 0,5 Liter dest. Wasser gewaschen. Das derart gewonnene Produkt wurde im Vakuum bei 40 °C getrocknet und hierauf zweimal mit je 200 ml siedendem Methanol extrahiert, wobei die Hauptmenge des als Nebenprodukt angefallenen Na-Cbo- m-nitroargi-ninlactams neben nur geringen Mengen an gewünschtem Produkt herausgelöst wurde. Das auf diese Weise gewonnene, vorgereinigte Rohprodukt wurde nach dem Trocknen zweimal mit je 50 ml auf 70 °C erhitztem DMF extrahiert, wobei das gewünschte Produkt vollständig herausgelöst wurde, während das Nebenprodukt, nämlich N,N'-bis-p-Nitrophenylharnstoff, ungelöst zurückblieb. Die DMF-Lösung wurde im Vakuum bei 40 °C eingeengt. Nach Zusatz von MeOH kristallisierte eine Substanz aus, welche in den Lösungsmittelsystemen A und B chromatographisch einheitlich war und einen Smp. von 186-188,5 °C aufwies.
Ausbeute: 29,75 g (68,2% der Theorie). Durch Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C20H23N7O7 wurden folgende Werte ermittelt (die Werte für die Bruttoformel sind in Klammern gesetzt) 8: C = 50,42% (50,74%); H = 4,98% (4,90%); N = 20,90% (20,71%). [a]g = 1,27° (c = 1,0; AcOH).
2. In einem 500 ml Dreihalsrundkolben wurden 17,7 g (50 mMol) getrocknetes Cbo-Arg(N02>OH in 350 ml THF:DMF (1:1) gelöst, worauf unter Feuchtigkeitsausschluss 5,05 g (50 mMol) Et3N zugesetzt wurden. Nach Abkühlung der Reaktionslösung auf -10 °C wurden dann 6,85 g (50 mMol) Chlor-ameisensäureisobutylester, gelöst in 30 ml THF, innerhalb 15 Minuten zugetropft, wobei eine Temperatur von —10 bis —5 °C eingehalten wurde. Nach etwa 10 Minuten wurden 8,2 g (50 mMol) p-Nitroanilin, gelöst in 15 ml DMF, zugetropft, wobei wiederum eine Temperatur von -10 bis -5 °C eingehalten wurde. Nach 2 Stunden wurde die Kühlung unterbrochen und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur während 24 Stunden stehengelassen. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand nacheinander je dreimal mit dest. Wasser, dreimal mit 5%iger NaHCCh-Lösung und wiederum dreimal mit dest. Wasser dirigiert. Nach dem Trocknen im Vakuum wurde das Rohprodukt in Methanol gelöst und
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über eine mit Methanol äquilibrierte Säule von «Sephadex LH-20» (vernetztes Dextrangel) laufengelassen. Aus einer Fraktion des Eluats erhielt man 7,67 g Substanz (32,4% der Theorie) mit den gleichen physikalischen Eigenschaften wie das gemäss Absatz 1) erhaltene Endprodukt.
3.17,7 g (50 mMol) Cb0-Arg(N02>0H wurden in 75 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10 °C wurden der Lösung nacheinander 10,3 g (50 mMol) DCCI und 8,2 g (50 mMol) p-Nitroanilin zugesetzt. Nach 4 Stunden bei —10 °C und 20 Stunden bei 20 °C wurde der gebildete DCH abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde in MeOH gelöst und über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von «Sephadex LH-20» laufengelassen. Neben viel Nebenprodukt, nämlich N-Cbo-Arg-(N02)-N,N'-dicyclohexylharnstoff, wurden aus einer Fraktion des Eluats 4,32 g Substanz ( 17,9% der Theorie) gewonnen, welche die gleichen physikalischen Eigenschaften wie das nach Absatz 1 hergestellte Endprodukt aufwies.
Ib) N«-Cbo-Gly-Arg(N02>pNA
Unter Feuchtigkeitsausschluss wurden 9,5 g (20 mMol) Na-Cbo-Arg(N02>pNA (siehe Beispiel Ia) in einem Kolben mit 80 ml 2-n HBr in Eisessig unter Rühren eine Stunde bei 20 °C behandelt, wobei diese Substanz sich unter C02-Entwicklung löste. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 600 ml getrocknetem Äther langsam zugetropft, wobei HBr» H-Arg(N02>pNA ausfiel. Die Ätherphase wurde mit einem Filtrierstab abgesaugt. Die verbleibende Fällung wurde noch viermal mit je 150 ml trockenem Äther behandelt, um das gebildete Benzylbromid und überschüssiges HBr sowie Essigsäure zu entfernen. Nach dem Trocknen im Vakuum über NaOH-Plätt-chen wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. Das trockene Hydrobromidderivat wurde in 50 ml DMF gelöst, auf -10 °C gekühlt und mit 4,16 ml (30 mMol) Et3N versetzt, um H-Arg(N02>pNA aus dem Hydrobromid freizusetzen. Das gebildete Et3N • HBr-Salz wurde abgenutscht, mit wenig kaltem DMF nachgewaschen, und dem Filtrat wurden 6,94 g (21 mMol) Cbo-Gly-OpNP bei -10 °C zugesetzt. Nach einigen Stunden hatte die Reaktionslösung Zimmertemperatur angenommen. Sie wurde wieder auf -10 °C gekühlt und mit 1,4 ml (10 mMol) Et3N gepuffert. Nach etwa 5 Stunden wurden nochmals 1,4 ml Et3N zugesetzt. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 40 °C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde dreimal mit je 100 ml dest. H2O digeriert und wiederum im Vakuum bei 40 °C über NaOH-Plättchen getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert, wobei 6,77 g Substanz, die in den Lösungsmittelsystemen A und B chromatographisch einheitlich war, gewonnen wurden. Aus der Mutterlauge wurden durch Gelfiltration über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von «Sephadex LH-20» noch 4,29 g Substanz gewonnen. Total wurden somit 11,06 g (87,7% der Theorie) einheitlicher Substanz mit einem Smp. von 159-161 °C erhalten. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C22H26N8O8 ergaben die folgenden Werte (die aus der Bruttoformel errechneten Werte sind in Klammern gesetzt): C = 50,07% (C = 49,81%); H = 4,99% (H = 4,94%); N = 21,48% (N = 21,12%).
Ic) N«-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA
10,6 g (20 mMol) Na-Cbo-Gly-Arg(N02)-pNA (siehe Beispiel Ib) wurden mit 120 ml 2-n HBr in Eisessig (0,24 Mol) behandelt und wie im Beispiel Ib) aufgearbeitet. Das über NaOH-Plättchen im Vakuum getrocknete Hydrobromid des Dipeptidderi-vats wurde in 50 ml DMF gelöst und nach Kühlung mit 3,04 g Et3N in 10 mlDMF (30 mMol) versetzt. Gebildetes Et3N • HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Zum Filtrat wurden 8,20 g (22 mMol) Cbo-Val-OpNP gegeben. Die weitere Aufarbeitung erfolgte analog wie im Beispiel Ib. Durch Gelfiltrierung an einer mit MeOH äquilibrierten «Sephadex
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LH-20»-Säule wurden nach Eluierung mit MeOH 10,95 g (87,0% der Theorie) von in den Lösungsmittelsystemen A und B chro-matographisch-einheitlicher Substanz mit einem Smp. von 212-214 °C gewonnen. Die Elementaranalyse und die Berechnung aus der Bruttoformel C27H35N9O9 ergaben die folgenden Werte: C = 52,01% (51,50%); H = 5,68% (5,60%); N = 20,27% (20,02%). (Die aus der Bruttoformel errechneten Werte sind in Klammern gesetzt.)
Id) Na-Bz-Val-Gly-Arg(N02>-pNA
10,90 g (17,3 mMol) Na-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA (siehe Beispiel Ic) wurden mit 70 ml 2-n HBr in Eisessig (0,14 Mol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde wie im Beispiel Ib beschrieben aufgearbeitet. Nach Lösen des getrockneten Tri-peptidhydrobromidderivates in 60 ml DMF wurden der Lösung nach Abkühlung 3,60 ml Et3N (26 mMol) zugesetzt. Das gebildete Et3N • HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Das erhaltene Filtrat wurde mit 6,66 g (29,4 mMol) Benzoesäureanhydrid versetzt. Anschliessend wurde gepuffert und wie im Beispiel Ib) aufgearbeitet. Das getrocknete Produkt wurde aus MeOH umkristallisiert, wobei 4,28 g Substanz, die in den Lösungsmittelsystemen A und B chromatographisch einheitlich war, mit einem Smp. von 222-223 °C gewonnen wurden. Aus der Mutterlauge wurden durch Gelfiltration über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von «Sephadex LH-20» noch 3,75 g Substanz mit einem Smp. von 222-223 °C gewonnen. Total ergab dies somit 8,03 g (77,4% der Theorie) einheitlicher Substanz. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C26H33N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 51,88% (52,08%); H = 5,63% (5,55%); N = 21,56% (21,03%).
I. Na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA • HCl
6,044 g (10,08 mMol) N°-Bz-Val-Gly-Arg(N02)-pNA (siehe Beispiel Id) wurden in einem Erlenmeyerkolben mit Schliff eingewogen. 81 ml 1 molare Bor-tris-trifluoracetat in Trifluoressig-säure wurden zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 2 Stunden bei 0 °C und anschliessend 22 Stunden bei 20 °C wurde unter Rühren und Ausschluss von Luftfeuchtigkeit die Nitro-schutzgruppe abgespalten. Die Reaktionslösung wurde zur Trockne im Vakuum eingeengt, der Rückstand in MeOH aufgenommen. Um das Peptidderivat in das HCl-Salz überzuführen, wurden 1,0 ml konz. HCl zugesetzt und die Lösung zur Trockne im Vakuum eingeengt. Nach dreimaligem Wiederholen dieses Vorgangs wurde der Rückstand in 200 ml 30%iger Essigsäure gelöst. Zur Reinigung wurde die AcOH-Lösung auf eine mit 30%iger AcOH äquilibrierte «Sephadex G-15»-Säule aufgetragen und mit 30%iger AcOH eluiert. Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten liess, wurde nach dem Zusatz von 0,85 ml (10,1 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 4,75 g (79,7% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC in LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C26H35N8O6C ergaben die folgenden Werte: C = 52,71% (52,83%); H = 5,88% (5,97%); N = 19,07% (18,96%) und Cl = 5,95% (6,00%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,97 - Gly: 1,0 - Val: 0,98.
Beispiel 2
II. H-Val-Gly-Arg-pNA • 2HC1
630 mg (1 mMol) von gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestelltem Na-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA wurden im Reaktions-gefäss eines Sakakibara-Apparates eingewogen. 10 ml getrocknetes Fluorwasserstoffgas wurden im Reaktionsgefäss kondensiert. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 0 °C wurde unter Rühren die Na-Carbobenzoxyschutzgruppe sowie die Nitroschutzgruppe von Arginin abgespalten. Das kondensierte Fluorwasserstoffgas wurde im Vakuum abgestilliert und der
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Rückstand in DMF gelöst. Um das Peptidderivat in das HC1-Salz überzuführen, wurden 0,2 ml konz. HCl zugesetzt und die Lösung zur Trockne eingeengt. Nach zweimaligem Wiederholen dieses Vorgangs wurde der Rückstand in 25 ml 30%iger AcOH gelöst. Zur Reinigung wurde die AcOH-Lösung auf eine mit 30%iger AcOH äquilibrierte «Sephadex G-15»-Säule aufgetragen und mit 30%iger AcOH eluiert. Der Teil des AcOH-Elua-tes, der sich durch Trypsinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten Hess, wurde nach Zusatz von 160 jil (2 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 360 mg (68,8% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC in LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C19H32N8O5CI2 ergaben die folgenden Werte: C = 43,85% (43,60%); H = 6,23% (6,16%); N = 21,65% (21,41%) und Cl = 13,42% (13,55%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,98 - Gly: 1,00 - Val: 0,96.
Beispiel 3
III. N°-Bz-Ile-Gly-Arg-pNA • HCl lila) Na-Cbo-Ile-Gly-Arg(N02>pNA
5,3 g (10 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblok-kiert, in 35 ml DMF gelöst und mit 2,08 ml (15 mMol) Et3N versetzt. Nach Kühlen auf -10 °C wurde das gebildete EtiN • HBr abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Das erhaltene Filtrat wurde mit 4,25 g (11 mMol) Cbo-Ile-OpNP versetzt und die Reaktionslösung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 5,50 g (85,5% der Theorie) der kristallinen Verbindung lila, die bei 197-200 °C schmolz und im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H37N9O9 ergaben die folgenden Werte: C = 51,98% (52,25%); H = 5,91% (5,79%) und N = 19,73% (19,59%).
Illb) N«-Bz-Ile-Gly-Arg(N02)-pNA
1,29 g (2 mMol) der gemäss Beispiel 3, Absatz lila, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 15 ml DMF gelöst und mit 420 n.1 (3 mMol) Et3N versetzt. Nach Kühlen auf -10 °C wurde das Reaktionsgemisch mit 680 mg (3 mMol) BZ2O versetzt, und die Reaktionslösung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 1,05 g (85,6% der Theorie) der amorphen Verbindung Illb, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H35N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 52,54% (52,85%); H = 5,85% (5,75%) und N = 20,68% (20,54%).
III. N«-Bz-Ile-Gly-Arg-pNA - HCl
614 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 3, Absatz Illb, hergestellten Verbindung wurden im Reaktionsgefäss eines Sakaki-bara-Apparates eingewogen. 10 ml getrocknetes Fluorwasserstoffgas wurden im Reaktionsgefäss kondensiert. Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 0 °C wurde unter Rühren die Arginin-Nitroschutzgruppe abgespalten. Das kondensierte Fluorwasserstoffgas wurde im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert und der Rückstand in DMF gelöst. Um das Peptidderivat in das HCl-Salz überzuführen, wurden 0,2 ml (~2,5 mMol) konz. HCl zugesetzt und die Lösung zur Trockne eingeengt. Nach zweimaligem Wiederholen dieses Vorgangs wurde der Rückstand in 50 ml 30%iger AcOH gelöst. Zur Reinigung wurde die AcOH-Lösung auf eine mit 30%iger AcOH äquilibrierte «Sephadex G-15»-Säule aufgetragen und mit 30%iger AcOH eluiert. Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten Hess, wurde nach Zusatz von 80 n.1 (1 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 505 mg (83,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC in LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H37N8O6CI ergaben die folgenden Werte: C = 53,28% (53,59%); H = 6,21% (6,16%); N = 18,70% (18,52%) und Cl = 5,82% (5,86%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Ile: 0,98.
Beispiel 4
IV. Na-Bz-Leu-Gly-Arg-pNA- HCl IVa) Na-Cbo-Leu-Gly-Arg(N02)-pNA
2,65 g (5 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblok-kiert, in 25 ml DMF gelöst und mit 1,04 ml (7,5 mMol) Et3N ver-setzt.Nach Kühlen auf -10 °C wurde das gebildete Et3N-HBr abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Das erhaltene Filtrat wurde mit 2,13 g (5,5 mMol) Cbo-Leu-OpNP versetzt und die Reaktionslösung wurde weiterbehandelt gemäss Beispiel 1, Absatz Ib. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 2,85 g (88,6% der Theorie) der kristallinen Verbindung IVa, die bei 189-191 °C schmolz und im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H37N9O9 ergaben die folgenden Werte: C = 52,05% (52,25%); H = 5,79% (5,79%) und N = 19,91% (17,59%).
IVb) N«-Bz-Leu-Gly-Arg(N02)-pNA
1,29 g (2 mMol) der gemäss Beispiel 4, Absatz IVa, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 15 ml DMF gelöst und mit 420 (il (3 mMol) Et3N versetzt. Nach Kühlen auf -10 °C wurde das Reaktionsgemisch mit 680 mg (3 mMol) BZ2O versetzt und die Reaktionslösung gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 0,99 g (80,7% der Theorie) der amorphen Verbindung IVb, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H35N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 52,49% (52,85%); H = 5,81% (5,75%) und N = 20,59% (20,54%).
IV. Na-Bz-Leu-Gly-Arg-pNA • HCl
614 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 4, Absatz IVb, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 2, Absatz II, zur Verbindung IV umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an «Sephadex G-15» in 30%iger AcOH.
Ausbeute: Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten Hess, wurde nach Zusatz von 80 jxl (1 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 508 mg (84,0% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H37N8O6CI ergaben die folgenden Werte: C = 53,75% (53,59%); H = 6,21% (6,16%); N = 18,74% (18,52%) und Cl = 5,76% (5,86%). Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,97 - Gly: 1,00 - Leu: 1,02.
Beispiel 5
V. Na-Bz-Val-Ser-Arg-pNA- HCl
Va) Na-B0C-Ser(0Bzl)-Arg(N02>pNA
3,55 g (7,5 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ia, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 35 ml DMF gelöst und mit 1,56 ml (11,3 mMol) Et3N versetzt. Nach Kühlen auf —10 °C wurde das gebildete Et3N • HBr abfiltriert und mit wenig kaltem DMF nachgewaschen. Das erhaltene Filtrat wurde mit 3,35 g (8 mMol) BOC-Ser(OBzl)-OpNP versetzt und die Reaktionslösung gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an
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«Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 4,09 g (88,4% der Theorie) einer teilweise kristallinen Verbindung Va, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H36N8O9 ergaben die folgenden Werte: C = 52,82% (52,59%); H = 5,78% (5,88%) und N = 18,30% (18,17%).
Vb)N«-B0C-Val-Ser(B0zl)-Arg(N02)-pNA
3,08 mg (5 mMol) der gemäss Beispiel 5, Absatz Va, hergestellten Verbindung wurden in einem Erlenmeyerkolben eingewogen und unter Feuchtigkeitsausschluss mit 15 ml Trifluores-sigsäure versetzt. Unter Rühren bei 20 °C, 30 Minuten, löste sich die Substanz unter C02-Entwicklung. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 250 ml getrocknetem Äther langsam zugetropft, wobei CF3COOH • H-Ser(OBzl)-Arg(N02>-pNA ausfiel. Die Ätherphase wurde mit einem Filtrierstab abgesaugt. Die verbleibende Fällung wurde noch dreimal mit je 50 ml trockenem Äther behandelt, um das gebildete tert. Butanol und überschüssige Trifluoressigsäure zu entfernen. Nach dem Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in fast quantitativer Ausbeute erhalten. Das trockene Trifluoracetatderivat wurde in 25 ml DMF gelöst, auf —10 °C gekühlt und mit 1,04 ml (7,5 mMol) Et3N versetzt, um H-Ser(0Bzl)-Arg(N02)-pNA aus dem Tri-fluoracetat freizusetzen, und danach wurde 1,73 g (5,5 mMol) BOC-Val-OSu zugesetzt. Nach einigen Stunden hatte die Reaktionslösung Zimmertemperatur angenommen. Sie wurde wieder auf -10 °C gekühlt und mit 0,35 ml (2,5 mMol) Et3N gepuffert. Nach etwa 5 Stunden wurden nochmals 0,35 ml Et3N zugesetzt. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 40 °C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 2,81 g (78,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C32H45N9O10 ergaben die folgenden Werte: C = 54,03% (53,70%); H = 6,40% (6,34%) und N = 17,88% (17,61%).
Vc)Na-Bz-Val-Ser(0Bzl>Arg(N02)-pNA
716 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 5, Absatz Vb, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 5, Absatz Vb, deblockiert, in 8 ml DMF gelöst und mit 210 jxl (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Kühlen auf — 10 °C wurden 450 mg (2 mMol) BZ2O zugesetzt und die Reaktionslösung gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 532 mg (73,9% der Theorie) der kristallinen Verbindung Vc, die bei 175-178 °C schmolz und im DCS in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H41N9O9 ergaben die folgenden Werte: C = 56,65% (56,74%); H = 5,69% (5,74%) und N = 17,83% (17,52%).
V. Na-Bz-Val-Ser-Arg-pNA • HCl
360 mg (0,5 mMol) der gemäss Beispiel 5, Absatz Vc, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 2, Absatz II, zur Verbindung V umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an «Sephadex G-15» in 30%iger AcOH.
Ausbeute: Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten liess, wurde nach Zusatz von 40 jxl (0,5 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 160 mg (51,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC in LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H37N8O7CI ergaben die folgenden Werte: C = 52,49% (52,21%); H = 6,08% (6,00%); N = 18,26% (18,04%) und Cl = 5,63% (5,71%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,99 - Ser: 0,95 - Val: 1,00.
Beispiel 6
VI. N«-Bz-Ile-Ser-Arg-pNA- HCl VIa)N°-B0C-Ile-Ser(0Bzl)-Arg(N02)-pNA
1,54 g (2,5 mMol) der gemäss Beispiel 5, Absatz Va, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 5, Absatz Vb, deblockiert, in 15 ml DMF gelöst und mit 520 jxl (3,75 mMol) Et3N versetzt. Nach Kühlen auf -10 °C wurden 905 mg (2,75 mMol) BOC-Ile-OSu zugesetzt und die Reaktionslösung gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 1,45 g (79,5% der Theorie) der amorphen Verbindung Via, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H47N9O10 ergaben die folgenden Werte: C = 54,82% (54,31%); H = 6,52% (6,49%) und N = 17,35% (17,27%).
VIb)N«-Bz-Ile-Ser(0Bzl)-Arg(N02)-pNA
730 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 6, Absatz Via, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 5, Absatz Vb, deblockiert und in 7 ml DMF gelöst. Nach dem Kühlen auf -10 °C wurde die Lösung mit 210 jxl (1,5 mMol) Et3N und gleich anschliessend mit 450 mg (2 mMol) BZ2O versetzt. Die Reaktionslösung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 615 mg (83,8% der Theorie) der amorphen Verbindung VIB, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C35H43N9O9 ergaben die folgenden Werte: C = 57,61% (57,29%); H = 6,01% (5,91%) und N = 17,53% (17,18%).
VI. Na-Bz-Ile-Ser-Arg-pNA- HCl
367 mg (0,5 mMol) der gemäss Beispiel 6, Absatz VIb, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 2, Absatz II, zur Verbindung VI umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an «Sephadex G-15» in 30%iger AcOH.
Ausbeute: Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zusatz von 40 jxl (0,5 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 168 g (45,8% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H39N8O7CI ergaben die folgenden Werte: C = 53,21% (52,95%); H = 6,26% (6,19%); N = 17,88% (17,64%) und Cl = 5,57% (5,58%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,96 - Ser: 0,95 - Ile: 1,00.
Beispiel 7
VII. N°-Bz-Leu-Ser-Arg-pNA • HCl VIIa)N°-B0C-Leu-Ser(0Bzl>Arg(N02)-pNA
1,55 g (2,5 mMol) der gemäss Beispiel 5, Absatz Va, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 5, Absatz Vb, deblockiert, in 15 ml DMF gelöst und mit 520 (il (3,75 mMol) Et3N versetzt. Nach dem Kühlen auf -10 °C wurden 0,91 g (2,78 mMol) BOC-Leu-OSu zugesetzt und die Reaktionslösung gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 1,44 g (78,9% der Theorie) der amorphen Verbindung Vlla, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H47N9O10 ergaben die folgenden Werte: C = 54,70% (54,31%); H = 6,55% (6,49%) und N = 17,43% (17,27%).
VIIb)Na-Bz-Leu-Ser(0Bzl)-Arg(N02)-pNA
1,46 g (2 mMol) der gemäss Beispiel 7, Absatz VHa, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 5, Absatz Vb, deblockiert und in 15 ml DMF gelöst. Nach dem Kühlen auf -10 °C wurde die Lösung mit 420 (xl (3 mMol) Et3N und gleich
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anschliessend mit 0,90 g (4 mMol) BzîO versetzt. Die Reaktionslösung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 1,25 g (85,2% der Theorie) der amorphen Verbindung Vllb, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Eie- 5 mentaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C35H43N9O9 ergaben die folgenden Werte: C = 57,38% (57,29%); H = 5,98% (5,91%) und N = 17,57% (17,18%).
VII. Nu-Bz-Leu-Ser-Arg-pNA - HCl 10
735 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 7, Absatz Vllb, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 2, Absatz II, zur Verbindung VI umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an «Sephadex G-15» in 30%iger AcOH.
Ausbeute: Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Tryp- 15 sinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten liess, wurde nach Zusatz von 80 jj.1 (1 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 355 mg (55,9% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H39N8O7CI erga- 20 ben die folgenden Werte: C = 53,09% (52,95%); H = 6,09% (6,19%); N = 17,91% (17,64%) und Cl = 5,49% (5,58%). Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,95 - Ser: 0,93 - Leu: 1,00.
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Beispiel 8
VIII. Na-3-Phenylpropionyl-Val-Gly-Arg-pNA • HCl Villa) Na-3-Phenylpropionyl-Val-Gly-Arg(N02)-pNA
3,15 g (5 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblok- 30 kiert und in 25 ml DMF gelöst. Nach dem Kühlen auf -10 °C wurde die Lösung mit 1,05 ml (7,5 mMol) Et3N und anschliessend mit 1,50 g (5,5 mMol) 3-Phenylpropionsäure-p-nitrophenyl-ester versetzt. Die Reaktionslösung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex 35 LH-20» in MeOH erhielt man 2,75 g (87,6% der Theorie) der kristallinen Verbindung Villa, die bei 216-218 °C schmolz und im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H37N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 53,38% (53,58%); H = 6,02% (5,94%) und 40 N = 20,40% (20,09%).
VIII. Na-3-Phenylpropionyl-Val-Gly-Arg-pNA • HCl
1,26 g (2 mMol) der gemäss Beispiel 8, Absatz Villa, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz I, zur 45 Verbindung VIII umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an «Sephadex G-15» in 30%iger AcOH.
Ausbeute: Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten liess, wurde nach Zusatz von 160 [il (2 mMol) konz. HCl lyophi- 50 lisiert. Man erhielt 1,12 g (90,4% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H39N8O6CI ergaben die folgenden Werte: C = 54,58% (54,32%); H = 6,29% (6,35%); N = 18,40% (18,10%) und Cl = 5,67% (5,73%). 55
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Val: 1,02.
Beispiel 9
IX. Na-2-PhenyIacetyl-Val-Gly-Arg-pNA • HCl IXa)Na-2-Phenylacetyl-Val-Gly-Arg(N02)-pNA
1,57 g (2,5 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert und in 15 ml DMF gelöst. Nach dem Kühlen auf -10 °C wurde die Lösung mit 520 |il (3,75 mMol) Et3N und anschliessend mit 710 mg (2,75 mMol) 2-Phenylessigsäure-p-nitrophenylester versetzt. Die Reaktionslösung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an «Sephadex LH-20» in MeOH erhielt man 1,35 g (88,0% der Theorie) der kristallinen Verbindung IXa, die bei 180-184 °C schmolz und im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H35N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 53,09% (52,85%); H = 5,82% (5,75%) und N = 20,91% (20,54%).
IX. Na-2-Phenylacetyl-V al-Gly-Arg-pN A • HCl
615 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 9, Absatz IXa, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz I, zur Verbindung IX umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an «Sephadex G-15» in 30%iger AcOH.
Ausbeute: Der Teil des AcOH-Eluats, der sich durch Trypsinbehandlung, unter Freisetzung von p-Nitroanilin, spalten liess, wurde nach Zusatz von 80 p.1 (1 mMol) konz. HCl lyophilisiert. Man erhielt 515 mg (85,1% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H37N8O6CI ergaben die folgenden Werte: C = 53,19% (53,59%); H = 6,21% (6,16%); N = 18,77% (18,52%) und Cl = 5,75% (5,86%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,94 - Gly: 1,00 - Val: 0,98.
Die erfindungsgemäss zu verwendenden Substrate, z.B. das gemäss Beispiel 1 erhaltene Substrat, nämlich na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA • HCl, wurden zur Bestimmung verschiedener Enzyme in Blutplasma angewendet. Die Bestimmung erfolgte nach dem Prinzip, dass das durch die enzymatische Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt ((H-R2) ein UV-Spektrum aufweist das von demjenigen des Substrates verschieden und nach höheren Wellenlängen verschoben ist. So weist das Substrat gemäss Beispiel l,d.h. Na-Bz-V al-Giy-Arg-p • N A • HCl, ein Absorptionsmaximum bei 302 nm (Nonameter) und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 12 950 auf. Die Absorption des Substrates ist bei 405 nm praktisch Null. p-Nitroanilin (pNA), das bei der enzymatischen Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt (H-R2), weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm und einen molaren Extinktionsfkoeffizienten von 13 200 auf. Bei 405 nm sinkt der Extinktionskoeffizient nur wenig, d.h. auf 9650.
Durch spektrophotometrische Messung bei 405 nm lässt sich der Grad der enzymatischen Hydrolyse des Substrates, welcher der Menge an abgespaltenem p-Nitroanilin proportional ist, leicht bestimmen. Das im Überschuss vorhandene Substrat stört somit die Messung bei 405 nm nicht. Die Verhältnisse sind für die anderen Substrate, die eine p-Nitroanilinogruppe als chromophore Gruppe enthalten, praktisch identisch. Die spektrophotometrische Messung wurde deshalb in allen diesen Fällen bei 405 nm durchgeführt.
Die enzymatische Hydrolysereaktion kann schematisch fol-gendermassen dargestellt werden:
E + S
634662
kl k3
>■ ES y ES1 + Chromophor P-^
k.
I
E + P,
E = Enzym S = Substrat
ES = Enzym-Substrat-Komplex Pi und P2 = Produkte ki, k2, kî und k4 = Geschwindigkeitskonstanten Dissoziationskonstante für ES = k2/ki = Km (Michaelis-Konstante)
Wenn [S] > [E] und k« < k3, gilt:
k m
{[E] - [ES]) • [S] [ES]
(1)
Die Geschwindigkeitskonstante, bei welcher Pi gebildet wird, ist:v = k3«[ES]
[e] • [s]
v =
"k + [s]"
m ^ L 1
(2)
Wenn E vollständig an S gebunden ist, so gilt: [ES] = [E] und v = v„
= k3-[E]
(3)
stärke 0,30 bei 37 °C eingetragen, worauf zuerst 0,25 ml einer wässrigen Urokinaselösung einer Konzentration von 400 CTA/ml zugesetzt wurde. Die Mischung wurde 1 Minute bei 37 °C prä-inkubiert. Der prä-inkubierten Mischung wurde dann 15 0,25 ml Substratlösung zugesetzt. Der Verlauf der enzymatischen Hydrolyse des Substrates wurde für die verschiedenen Substratkonzentrationen mittels eines Photometers bei 405 nm während 10 Minuten verfolgt. Der Wert der pro Minute gebildeten Menge p-Nitroanilin ist ein Mass für die Geschwindigkeit 20 der Hydrolyse für eine gegebene Substratkonzentration. In einem Koordinatensystem wurden auf der Abszisse die reziproken Werte der Substratkonzentrationen, auf der Ordinate die zugehörigen reziproken Werte der Hydrolysengeschwindigkeit aufgetragen. In diesem sogen. Lineweaver-Burk-Diagramm 25 erhielt man für die erfindungsgemäss verwendeten Substrate gerade Kurven, was ein Beweis dafür war, dass die Hydrolyse der Substrate durch Urokinase dem Gesetz von Michaelis-Menten folgte und demgemäss die Substrate für die Bestimmung von Urokinase ideal sind. Aus den Schnittpunkten der 30 Kurven mit der Abszisse und der Ordinate wurden die kinetischen Konstanten Km und vmax ermittelt.
Tabelle I
Lineweaver-Burk-Gleichung:
1 = K
~ m
35
max
• r§T +
(4)
max
40
Aus der Gleichung (2) folgt, dass die Konstanten Km und ki die Wirksamkeit des Substrats für ein gegebenes Enzym bestimmen. Zur Bestimmung dieser Konstanten wendet man die folgende Methode an:
Man mischt das Enzym und das Substrat in einer Pufferlö- « sung und verfolgt die Hydrolysereaktion während 2 bis 30 Minuten. Die Konzentration des Substrates [S] wird variiert, während die Enzymkonzentration konstant gehalten wird.
Wenn die Extinktion (OD = optische Dichte) in einem Koordinatensystem als Funktion der Zeit aufgetragen wird, erhält man so eine Kurve, deren Tangente im Nullpunkt dem idealen Verlauf der Hydrolyse entspricht. Mit Hilfe dieser Tangente kann man die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse ermitteln.
Wenn 1/v als Funktion von 1/[S] aufgetragen wid, erhält man ein Lineweaver-Burk-Diagramm (siehe «Kurzes Lehrbuch 55 der Biochemie» von P. Karlson, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, Seite 70), aus welchem sich vmax und Km graphisch ermitteln lassen.
Km und k3 = vmax/E wurden unter Verwendung der erfin-dungsgemässen Substrate, z.B. Na-Val-Gly-Arg-pNA- HCl (Sub- 60 strat I gemäss Beispiel 1) für Urokinase bestimmt.
Für das Substrat I wurde eine Urokinaseaktivität von 6,06 x 10~5kmMol/Liter und 7,27 x 10~5 vraax (xMol/Min/CTA ermittelt.
Zur Bestimmung der kinetischen Konstanten Km und vmax 65 wurden wässrige Verdünnungsreihen der Substrate mit Konzentrationen von 0,1 bis 2 (iMol/ml hergestellt. In eine Messkü-vette wurden 2 ml Tris-Imidazol-Puffer mit pH 8,4 und Ionen-
1 |xM pNA pro Minute aus Substrat I
Entsprechende andere Einheiten
Urokinase
20250 CTA
Urinkallikrein
1688 BAEE
Humanthrombin
2174NIH
Humanplasmin
6850 CE
Rindertrypsin
36,6 NF
BAEE (Benztoyl-L-arginin-ethylester) - 1 BAEE-Einheit Urinkallikrein ist diejenige Menge Enzym, die 1 p.Mol Benzoyl-L-arginin-äthylester pro Minute unter Standardbedingungen hydrolysiert.
NIH ist eine von «US National Institute of Health» standardisierte Einheit.
CE = Caseineinheit, die am Casein unter Standardbedingungen gemessen wird.
NF = Trypsin-Einheit = diejenige Menge Enzym, die eine Absorptionsänderung A OD = 0,003 pro Minute, gemessen an Benzyol-L-arginin-äthylester, unter Standardbedingungen bewirkt (siehe «The National Formulary XII», herausgegeben von «The American Pharmaceutical Association», Washington, D.C., 1965, Seiten 417-418).
In der ersten Kolonne der Tabelle I ist die Menge verschiedener Enzyme angegeben, die das Substrat I bei 37 °C, pH 8,4 und Ionenstärke 0,3 und bei einer Substratkonzentration von 10-4 M mit einer Geschwindigkeit von 1 |j,M pro Minute spaltet. In der zweiten Kolonne ist die entsprechende Enzymmenge in anderen Enzymeinheiten angegeben. Aus Tabelle I ist ersichtlich, dass das im Urin zusammen mit Urokinase vorhandene Enzym Urinkallikrein das Substrat I nur wenig spaltet und deshalb die Bestimmung der Urokinase im Urin nicht stört. Auch von Thrombin wird das Substrat I sehr wenig und unspezifisch gespalten.
634662
Tabellen
Urokinase-Aktivität, gemessen mittels der Substrate gemäss
Beispielen 1 bis 9 bei konstanter Substrat- und Urokinase-Konzentration, bei 37 °C, pH 8,4 und Ionenstärke
0,3
Substrat Menge der durch 100 TA-Einheiten Urokinase in 1
Minute gebildeten Menge des Spaltprodukes NH2-R2 in
Nanomol
I
3,64 pNA
II
III
3,21 pNA
IV
1,00 pNA
V
2,82 pNA
VI
2,91 pNA
VII
1,73 pNA
VIII
1,32 pNA
IX
1,13 pNA
In der beiliegenden Zeichnung ist die einzige Figur eine graphische Darstellung, in welcher die Änderung der optischen Dichte À OD, welche durch die hydrolytische Wirkung von verschiedenen Mengen Urokinase auf das Substrat I innerhalb von 10 Minuten hervorgerufen wird, als Funktion der Urokinase-menge in einem Koordinatensystem aufgetragen ist. Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass Urokinasekonzentrationen im Bereiche von 1 bis 10 CTA/ml genau bestimmt werden können. Bei der Bestimmung des Urokinasegehaltes im Urin von 14 gesunden Testpersonen wurden Werte von etwa 8 CTA-Einhei-ten pro ml Urin gefunden.
Die Bestimmung von Urokinase im Urin ist besonders wichtig, da man dadurch, wie bereits oben erwähnt, pathologische Zustände verhältnismässig einfach und schnell feststellen kann. Die bisher am meisten verwendete Methode zur Bestimmung von Urokinase im Urin ist die sog. Fibrinplattenmethode [I. Bjerrehuus, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 4,179 (1952); F.E. Smyr-niotis et al., Thromb. Diath. et Haemorrh. Bd. III, 258 (1959)], die wie folgt ausgeführt wird: Nach der Methode von Mullertz [Acta physiol. Scand. 26,174 (1954)] werden Fibrinplatten (Fibrinogengehalt: 0,2%) hergestellt. Für jede Urokinasebestim-mung verwendet man eine Fibrinplatte und 30 Lambdatropfen (Lambdatropfenpipette) von unverdünntem, 1:2 und 1:4 verdünntem Urin (wenn die Urokinasekonzentration sehr hoch ist, kann man die Verdünnungsfaktoren verdoppeln). Die Platten werden während 16 Stunden bei 30 °C inkubiert. Die lysierten
Zonen werden durch Zugabe eines Tropfens Kongorots (0,l%ig) sichtbar gemacht. Das Produkt von zwei senkrecht zueinander stehenden Durchmessern (der lysierten Zonen) dient als Mass der lysierten Zonen. Die Urokinasekonzentration (Einheiten pro ml) wird anhand einer Vergleichskurve ermittelt, welche durch Verwendung einer Verdünnungsreihe mit Standard-Urokinase aufgestellt wird.
Bei dieser Methode wird die Urokinasekonzentration nicht direkt, sondern über die aus Plasminogen durch Urokinase gebildete Piasminmenge bestimmt. Diese über eine Kette von Reaktionen erfolgende Bestimmung von Endprodukten ist mit vielen Fehlerquellen behaftet. Weitere schwerwiegende Nachteile dieser Methode beruhen darauf, dass die Inkubationszeit sehr lang ist und für jede Bestimmung eine Eichkurve aufgestellt werden muss. Die Auswertung der Resultate ist ferner verhältnismässig konpliziert und wegen der Nichtlinearität der Eichkurve ungenau.
Mittels der erfindungsgemäss verwendeten Substrate lassen sich die Nachteile der oben beschriebenen Bestimmungsmethode glatt überwinden, da die Messung der Urokinasekonzentration direkt erfolgt und keine Nebenreaktionen das Messresultat verfälschen. Überdies stehen die Messresultate bereits nach 10 Minuten zur Verfügung, was für die klinische Diagnostik besonders wichtig ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Messresultate in Substrateinheiten angegeben werden können. Eine Änderung der optischen Dichte ÀOD von 0,010/min entspricht einem Gehalt von 1 Millieinheit Urokinase pro ml Inhalt des Testansatzes.
Wenn es darum geht, Plasminogen-Aktivatoren in Blutplasma zu bestimmen, so ist es oft zweckmässig, die Bestimmung in einer Pufferlösung durchzuführen, die Aprotinin und/ oder Hirudin enthält, da die letzteren auf die Plasminogen-Akti-vatoren nicht hemmend wirken, wohl aber andere, gegebenenfalls vorhandene, aktivierte Plasmaenzyme, wie z.B. Thrombin, Plasmin und Plasmakallikrein, welche bei der Bestimmung der Plasminogen-Aktivatoren unter gewissen Umständen störend wirken können, hemmen. Man kann z.B. einen Tris-Imidazol-oder Glycin-Puffer mit einem pH von 8,2 bis 8,6 und einer Ionenstärke von 0,15 bis 1,0 verwenden, welchem man 0,02 bis 0,2 Trypsin-Inhibitor-Einheiten Aprotinin und/oder 0,001 bis 10 Antithrombineinheiten Hirudin pro ml zugesetzt hat.
Die Substrate werden vorzugsweise in Form von Salzen von Mineralsäuren, z.B. HCl, HBr, H2SO4 oder H3PO4 oder organischen Säuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Oxalsäure oder Weinsäure, verwendet.
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1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

634662 PATENTANSPRÜCHE
1 Stunde bei 37 °C freisetzt (siehe N.U. Bang et al., «Thrombosis and Bleeding Disorders», Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1971, S. 377). Diese Methode kann nur zur Bestimmung von reinen Urokinasepräparaten angewendet werden, eignet sich
1. Spontan-Lyse eines Blutgerinnsels. Man lässt Blut spontan oder durch Zugabe von Thrombin gerinnen und beobachtet die Spontan-Lyse des Gerinnsels bei 37 °C. Eine Lyse findet normalerweise erst nach 24 Stunden statt. Diese Methode ist unspezifisch, da die Aktivatorenwirksamkeit nicht direkt, sondern indirekt über das Lysis-Enzym Plasmin gemessen wird (siehe I. Witt «Biochemie der Blutgerinnung und Fibrinolyse», Verlag Chemie, Weinheim, 1975, S. 119).
1. Verwendung von Tripeptidderivaten der Formel
R'-NH-CH(R3)-CO-Y -Arg-R2 I
in welcher R1 Wasserstoff, eine gegebenenfalls in ra-Stellung eine Aminogruppe tragende Alkanoylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 13 Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkanoylgruppe, deren Alkanoyl-rest 2 bis 11 Kohlenstoffatome enthält und deren Phenylrest gegebenenfalls eine Aminogruppe trägt, eine gegebenenfalls eine Amino- oder Aminoalkylgruppe tragende Cyclohexylcar-bonylgruppe, eine gegebenenfalls eine Alkyl-, Amino- oder Aminoalkylgruppe tragende Benzoylgruppe, eine Benzyloxy-carbonylgruppe, eine Alkylsulfonylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Arylsulfonylgruppe, deren Arylrest ein-oder mehrkernig ist und gegebenenfalls Substituenten trägt, darstellt, R3 einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, Y eine Glycyl- oder Serylgruppe darstellt und R2 eine unter Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Amins R2-H enzymatisch abspaltbare, chromogene, substituierte Aminogruppe darstellt, oder von Salzen dieser Tripeptide mit Mineralsäuren oder organischen Säuren, als Substrate zur quantitativen Bestimmung von Urokinase und anderen Plasminogen-Aktivatoren sowie von Inhibitoren dieser Enzyme und Plasminogen-Proaktivatoren in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere und Gewebeextrakten, wobei die genannten Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakte mit einem der genannten Tripeptidderivate oder einem ihrer Salze zur Reaktion gebracht werden und die Menge des durch die hydrolytische Einwirkung der genannten Enzyme auf das Tripeptidderivat oder sein Salz gebildeten Spaltproduktes R2-H durch photometrische, spektrophotome-trische oder fluoreszenzspektrophotometrische Methoden gemessen wird.
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2. Hydrolyse von Casein. Bei dieser Methode wird von der Eigenschaft des Plasmins, Casein hydrolytisch abzubauen, Gebrauch gemacht. Casein wird mit der zu untersuchenden Probe inkubiert. Zu Beginn und am Ende wird ein aliquoter Teil der Inkubationsmischung mit Trichloressigsäure versetzt. Im Überstand wird durch spektrophotometrische Messung bei 280 nm der Tyrosingehalt bestimmt, aus welchem sich indirekt die Aktivatorenwirksamkeit annähernd errechnen lässt [L.F. Rem-mert et al., J. Biol. Chem. 181,431 (1949)].
3. Esterolytische Methode (für Urokinase). Bei dieser Methode wird von der Eigenschaft der Urokinase, die Hydrolyse des Na-Acetyl-L-lysin-methylesters direkt zu katalysieren, Gebrauch gemacht. Diese Methode hat auch zur Aufstellung der sogen. CTA-Urokinase-Einheit gedient (CTA = Committee on Thrombolytic Agents of the National Heart Institute, USA). Eine CTA-Einheit ist diejenige Menge Urokinase, die aus Na-Acetyl-L-Iysin-methylester 46,2 x 10~3 jiM Methanol in
2. Verwendung gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die genannte Bestimmung ein Puffer verwendet wird, der Aprotinin und/oder Hirudin enthält, um andere in den Körperflüssigkeiten bzw. Gewebeextrakten gegebenenfalls vorhandene Enzyme, welche die Bestimmung der Plasminogen-Aktivatoren stören könnten, zu hemmen.
3. Verwendung gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Puffer mit einem pH von 8,2 bis 8,6 und einer Ionenstärke von 0,15 bis 1,0 verwendet wird, der 0,02 bis 0,2 Trypsin-Inhibitor-Einheiten Aprotinin pro ml enthält.
4. Verwendung gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Puffer mit einem pH von 8,2 bis 8,6 und einer Ionenstärke von 0,15 bis 1,0 verwendet wird, der 0,001 bis 10 Antithrombineinheiten Hirudin pro ml enthält.
5. Verwendung gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Puffer mit einem pH von 8,2 bis 8,6 und einer Ionenstärke von 0,15 bis 1,0 verwendet wird, der 0,02 bis 0,2 Trypsin-Inhibitor-Einheiten Aprotinin und 0,001 bis 10 Antithrombineinheiten Hirudin pro ml enthält.
6. Verwendung gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Körperflüssigkeiten bzw. Gewebeextrakten, welche Inhibitoren der Urokinase bzw. anderer Plasminogen-Aktivatoren enthalten, ein Überschuss an Urokinase zugesetzt und nach einigen Minuten Präinkubation die restliche Uroki-nase-Aktivität bestimmt wird, indem eines der genannten Tripeptidderivate zugesetzt und die Menge des Spaltproduktes gemessen wird.
7. Verwendung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Körperflüssigkeit unkonzentrierter Urin verwendet wird.
Der menschliche Organismus erzeugt mehrere Aktivatoren, die die Umwandlung des Proenzyms Plasminogen in das aktive Lysisenzym Plasmin bewirken. Zu dieser Gruppe von Aktivatoren gehören z.B. Gewebe- und Blutkinase und Urokinase. Diese Aktivatoren spielen im Mechanismus der Blutkoagulation eine wichtige Rolle. Bei einer abnorm grossen Ausschüttung dieser Aktivatoren besteht die Gefahr einer erhöhten Fibrinolyseaktivität und somit einer erhöhen Blutungstendenz oder Hämorrhagie. Umgekehrt wirkt sich eine zu schwache Ausschüttung dieser Aktivatoren in einer Störung des Gleichgewichts zwischen Koagulationsvermögen und Fibrinolyse und als Folge in einer erhöhten Thrombosegefahr aus. Der Bestimmung von Plasminogen-Aktivatoren in Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten kommt deshalb in der klinischen Praxis eine grosse Bedeutung zu, die z.B. von I. Witt in «Biochemie der Blutgerinnung und Fibrinolyse», Verlag Chemie, Weinheim, 1975, S. 119, wie folgt definiert wird: «Die Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität im Plasma oder Serum dient erstens der Erkennung von hyperfibrinolytischen Zuständen, mit denen verschiedene Krankheitsbilder einhergehen. Ausserdem sind in den letzten Jahren vielfach gute Ergebnisse bei der Lyse von intravasculären Thromben durch Verabfolgung von Plasminogen-Aktivatoren erreicht worden. Zur Kontrolle dieser thrombolytischen Therapie sind ebenfalls Messungen der fibrinolytischen Aktivität unerlässlich.» F.E. Smyrniotis et al. [Thromb. Diath. et Haemorrh. Bd. III, 257-270 (1959)] führen u.a. Folgendes aus: «Die Ausscheidung der Urokinase ist bei Normalpersonen unabhängig von Alter, Geschlecht und Harnmenge. Die Urokinaseausscheidung ist erhöht nach dem Auftreten eines Myokardinfarktes und nach einem Anfall von Koronarinsuffizienz. Die Ausscheidung ist vermindert bei Patienten mit Karzinose, kardialer Stauung und Urämie. Diese Unterschiede legen nahe, dass signifikante Veränderungen im fibrinolytischen System des Plasmas als Folge dieser Erkrankungen vorkommen können.»
Es gibt bisher keine wirklich zuverlässigen Methoden zur Bestimmung von Plasminogen-Aktivatoren in Körperflüssigkeiten und Organextrakten. Man kennt prinzipiell drei Methoden.
3 634662
jedoch nicht zur Bestimmung von Urokinase in Körperflüssig- nyldodecanoylgruppe bezeichnen. Der Phenylrest der genann-keiten oder Gewebeextrakten, da der genanne Ester durch ten Gruppen kann in p-Stellung eine Aminogruppe tragen, andere darin enthaltene proteolytische Enzyme (z.B. Plasmin, Somit kann R1 eine p-Aminophenyl-acetyl-, 3-p-Aminophenyl-Plasmakallikrein usw.) schneller gespalten wird als durch propionyl-, 4-p-Aminophenyl-butyryl- usw. bis 12-p-Aminophe-
Urokinase. 5 nyl-dodecanoylgruppe sein. R1 kann zusätzlich eine Cyclohexyl-
Es ist versucht worden, synthetische Amid- und Peptidsub- carbonyl-,
4-Aminocyclohexylcarbonyl-, 4-Aminomethylcyclo-strate für die Bestimmung von Urokinase zu entwickeln. Diese hexylcarbonyl-, 4-Aminoäthylcyclohexylcarbonyl-, 4-Amino-Versuche sind jedoch erfolglos geblieben [siehe z.B. W. Troll et propylcyclohexylcarbonyl- oder 4-Aminobutylcyclohexylcar-al., Journal of Biological Chemistry 208,85 (1954)]. bonylgruppe darstellen. R1 kann noch eine Benzoylgruppe dar-
Bei Versuchen, ein synthetisches Substrat für die Bestim- 10 stellen, die eine Amino-, Aminoalkyl- oder Alkylgruppe tragen mung von Kallikrein zu entwickeln, wurden auf Grund theoreti- kann, wobei das Alkyl Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl scher Überlegungen die folgenden Tripeptid-p-nitroanilide der oder Isobutyl sein kann.
Formel R1 kann z.B. auch eine Methyl-, Äthyl-, Phenyl-, Methylphe-
nyl- oder Naphthylsulfonylgruppe sein.
Pro-Phe-Arg-pNA und Val-Gly-Arg-pNA
'5 R2 bezeichnet enzymatisch abspaltbare, chromogene, sub-
A B stituierte Aminogruppen, die auf dem Peptidgebiet an sich bekannt sind. R2 kann insbesondere eine p-Nitrophenylamino-, synthetisiert. Diese Tripeptide enthalten die 3 letzten C-termi- 2-Naphthylamino-, 4-Methoxy-2-naphthylamino- oder nalen Aminosäuren der durch Einwirkung von Kallikrein auf l,3-Di(methoxycarbenyl>phenyl-(5)-aminogruppe (abgeleitet Kininogen entstehenden Spaltprodukte. Es hätte deshalb 20 von 5-Amino-isophthalsäure-dimethylester) sein.
erwartet werden können, dass diese beiden Substrate durch Die Herstellung der erfindungsgemäss verwendeten Sub-
Kallikrein hydrolysiert würden, was sich jedoch nur für das strate kann nach verschiedenen, z.T. bekannten Methoden Substrat der Formel A bewahrheitet hat. Es hat sich j edoch erfolgen :
überraschenderweise gezeigt, dass das durch Kallikrein über- 1- Bei der ersten Methode werden die chromophoren Grup-
haupt nicht spaltbare Substrat der Formel B durch Urokinase ^ pen (R2 in Formel I) an der C-terminalen Aminosäuregruppe und andere Plasminogen-Aktivatoren rasch amidolytisch angehängt. Diese Gruppen üben gleichzeitig die Funktion von gespalten wird. C-terminalen Carboxylschutzgruppen während der stufenwei-
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