DK149215B

DK149215B - Tri- eller tetrapeptider eller salte deraf til anvendelse som substrat til kvantitativ bestemmelse af plasminogenaktivatorer, inhibitorer for disse og plasminogen-praeaktivatorer samt trypsin, trypsin-inhibitorer og trypsinogen i legemsvaesker hos mennesker og pattedyr og i vaevsekstraktersamt en fremgangsmaade til kvantitativ bestemmelse af plasminogenaktivato

Info

Publication number: DK149215B
Application number: DK235577AA
Authority: DK
Inventors: Lars Gundro Svendsen
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1986-03-17
Also published as: LU77429A1; DK149215C; JPS52146694A; ATA375877A; DE2724211A1; DK235577A; NL184849B; FR2353063B1; NO771869L; CH634662A5; AU517375B2; BE855085A; NO156067C; AU2557177A; US4278762A; SE7706275L; JPS5624520B2; US4190574A; CA1086614A; IL52124A0

Description

149215

Den foreliggende opfindelse angår tri- eller tetrapeptider eller salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrat til kvantitativ bestemmelse af plasminogenaktivato-rer, inhibitorer for disse og plasminogen-præaktivatorer samt trypsin, trypsin-inhibitorer og trypsinogen i legemsvæsker hos mennesker og pattedyr og i vævsekstrakter.

2 149215

Den menneskelige organisme frembringer flere aktivatorer, der bevirker omdannelse af proenzymet plasminogen til det aktive lyse-enzym plasmin. Til denne gruppe af aktivatorer hører f.eks. vævs-og blodkinase og urokinase. Disse aktivatorer spiller en vigtig rolle i blodkoagulationsmekanismen. Ved en abnormt stor udløsning af disse aktivatorer er der fare for forhøjet fibrinolyseaktivitet og således for en forhøjet blødningstendens eller hæmorrhagi. Omvendt bevirker en for svag udløsning af disse aktivatorer en forstyrrelse af ligevægten mellem koagulationsevne og fibrinolyse og som følge deraf forhøjet thrombosefare. Bestemmelsen af plasminogen-aktiva-torer i legemsvæsker og vævsekstrakter har derfor stor betydning i den kliniske praksis, hvilket f.eks. er defineret af I. Witt i "Biochemie der Blutgerinnung und Fibrinolyse", Verlag Chemie,

Weinheim, 1975, side 119 (oversættelse): "Bestemmelsen af den fibrinolytiske aktivitet i plasma eller serum tjener for det første til erkendelse af hyperfibrinolytiske tilstande, der optræder ved forskellige sygdomsbilleder. Desuden er der i de senere år opnået mange gode resultater ved lyse af intravasku-lære thromber ved administration af plasminogen-aktivatorer.

Til kontrol af denne thrombolytiske terapi er det ligeledes absolut nødvendigt at kunne måle den fibrinolytiske aktivitet." F.E. Smyrniotis et al., [Thromb. Diath. et Haemorrh. bind III, 1959, s. 257 - 270] frenfører bl.a. følgende (oversættelse): "Udskillelsen af urokinase er hos raske mennesker uafhængig af alder, køn og urinmængde. Urokinaseudskillelsen er forhøjet efter et myocardieinfarktanfald og efter et anfald af coronar-insufficiens. Udskillelsen er nedsat hos patienter med carcinose, cardial emboli og uræmi. Disse forskelle gør det nærliggende, at der kan forekomme signifikante forandringer i det fibrinolytiske plasmasystem som følge af disse sygdomme.".

Der har hidtil ikke været kendt nogen virkelig pålidelige metoder til bestemmelse af plasminogen-aktivatorer i legemsvæsker og organekstrakter. Der kendes i princippet tre metoder: 3 149215 1. Spontanlyse af et blodkoagulat. Man lader blod koagulere spontant eller ved tilsætning af thrombin og iagttager spontan-lysen af koagulatet ved 37°C. Lyse finder normalt først sted efter 24 timer. Denne metode er uspecifik, da aktivator-aktiviteten ikke måles direkte, men indirekte via lyse-enzymet plasmin (jfr.

1. Witt "Biochemie der Blutgerinnung und Fibrinolyse", Verlag Chemie, Weinheim, 1975, side 119).

2. Hydrolyse af casein. Ved denne metode gøres der brug af plasmins evne til hydrolytisk at nedbryde casein. Casein inkuberes med den prøve, der skal undersøges. I starten og ved slutningen sættes trichloreddikesyre til en alikvotdel af inkubationsblandingen. I den overstående væske bestemmes tyrosinindholdet ved spektrofotome-trisk måling ved 280 nm, af hvilket indhold aktivatoraktiviteten indirekte kan måles tilnærmelsesvist [L.F. Remmert et al., J. Biol. Chem. 181, 431 (1949)].

3. Esterolytisk metode (til urokinase). Ved denne metode gøres der brug af urokinases evne til direkte at katalysere hydrolysen af Na-acetyl-L-lysin-methylesteren. Denne metode er også blevet anvendt til opstilling af den såkaldte CTA-urokinaseenhed (CTA = Committee on Thrombolytic Agents of the National Heart Institute, USA). En CTA-enhed er den mængde urokinase, som på 1 time ved 37°C frigør — *5 ft 46,2 x 10 ^uM methanol fra N -acetyl-L-lysin-methylester (jfr.

N.U. Bang et al., "Thrombosis and Bleeding Disorders", Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1971, side 377). Denne metode kan kun anvendes til bestemmelse af rene urokinasepræparater, men kan ikke anvendes til bestemmelse af urokinase i legemsvæsker eller vævsekstrakter, da den nævnte ester spaltes hurtigere af andre deri værende proteolytiske enzymer (f.eks. plasmin og plasmakallikrein) end af urokinase.

I J. Org. Chem. 30. (1965) 1781-1785 beskrives syntesen af chromo-gene argininderivater, der skal anvendes som substrater til bestemmelse af trypsin i blodserum. De nævnte argininderivater spaltes ikke kun af trypsin, men også af de i blodserum tilstedeværende trypsininhibitorer, og de er derfor uegnede til en pålidelig tryp-sinbestemmelse.

4 149215 I Arch. Biochem. Biophys. 108 (1964) 266-274 beskrives de samme chromogene argininderivater.

I USA patentskrift nr. 3.862.011 er det foreslået at anvende forbindelsen benzyloxycarbonyldiglycyl-l-arginyl-4-methoxy-2-naph-thylamid til bestemmelse af trypsin. Denne forbindelse adskiller sig fra den i J. Org. Chem. 3£ (1965),side 1781-1785, nævnte forbindelse kun derved, at den chromogene naphthylgruppe er substitueret med en methoxygruppe. Som ovenfor anført er forbindelser, som har diglycyl-arginyl-struktur, uanvendelige til bestemmelse af trypsin i nærværelse af trypsininhibitorer.

I USA patentskrift nr. 3.886.136 er beskrevet tripeptidderivater, der bl.a. skal anvendes til bestemmelse af trypsin. De to første aminosyrer i disse peptidderivater indeholder ifølge definitionen i alle tilfælde sidekæder med mindst tre carbonatomer, hvilket medfører, at peptidderivaterne har kraftig hydrofob karakter og derfor er ufølsomme over for plasminogenaktivatorer såsom urokinase.

Det har været forsøgt at udvikle syntetiske amid- og peptidsubstrater til bestemmelse af urokinase. Disse forsøg har dog hidtil været resultatløse (jfr. f.eks. W. Troll et al., Journal of Biological Chemistry 208, 85 (1954)].

Ved forsøg på at udvikle et syntetisk substrat til bestemmelse af kallikrein er de nedenfor anførte tripeptid-p-nitro-anilider med formlerne A og B

Pro-Phe-Arg-pNa og Val-Gly-Arg-pNa

A B

syntetiseret på baggrund af teoretiske overvejelser. Disse tri-peptider indeholder de tre sidste C-terminale aminosyrer af de ved indvirkning af kallikrein på kininogen dannede spaltningsprodukter. Det kunne derfor ventes, at disse to substrater ville blive hydrolyseret af kallikrein, hvilket dog kun har vist sig at holde stik for substratet med formlen A. Det har imidlertid overraskende nok vist sig, at det af kallikrein overhovedet ikke spaltelige substrat med formlen B hurtigt spaltes amidolytisk af urokinase og andre plasminogen-aktivatorer.

5 149215

Opfindelsen bygger på denne erkendelse, og tri- eller tetrapepti-derne til den ovennævnte anvendelse er ejendommelige ved, at de har den almene formel R1-NH-CH(R3)-CO-Y-Arg-R2 hvor R^ betegner hydrogen, en eventuelt i ω-stilling med amino substitueret alkanoylgruppe med 2-18 carbonatomer, en phenylal-kanoylgruppe, hvis alkanoyldel indeholder 2-6 carbonatomer, og hvis phenyldel eventuelt er substitueret med en aminogruppe, en eventuelt med amino eller aminomethyl substitueret cyclohexyl-carbonylgruppe, en eventuelt med methyl, amino eller aminomethyl substitueret benzoylgruppe, en benzyloxycarbonylgruppe eller en methyl-, ethyl-, phenyl-, methylphenyl- eller·naphthylsulfony1- 3 gruppe, R betegner en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en cyclohexyl- eller cyclohexylmethyl- 2 gruppe, Y betegner en glycyl- eller serylgruppe, og R betegner en p-nitrophenylamino-, 2-naphthylamino- eller 4-methoxy-2-naph-thylaminogruppe.

Gruppen R er en chromogen gruppe, der fraspaltes ved den hy-drolytiske indvirkning, dels af plasminogenaktivatorer, dels af trypsin, og danner et farvet eller fluorescerende spaltnings-produkt R H, hvis mængde kan måles ved fotometriske, spektrofo-tometriske eller fluorescensfotometriske metoder.

De omhandlede substrater kan være protoniseret med en mineralsyre, f.eks. saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre eller phosphorsyre, eller med en organisk syre, f.eks. myresyre, eddikesyre, oxalsyre eller vinsyre.

Ved udviklingen af tri- og tetrapeptidderivaterne ifølge opfindelsen er det overraskende nok konstateret, at for at et peptidderivat kan anvendes til bestemmelse af plasminogenaktivatorer, skal det som midteraminosyre i tripeptider eller som tredie aminosyre i tetrapeptider indeholde en ikke-hydrofob aminosyre, som højst indeholder ét carbonatom i sidekæden. Det er endvidere konstateret, at ved indføring af en ikke-hydrofob midter - eller tredie - aminosyre, som kun indeholder et carbonatom i sidekæden, „ 149215 forøges tripeptidsubstraternes følsomhed over for trypsin signifikant. De omhandlede peptidderivater er ca. 5 gange så følsomme som de mest følsomme af de i USA patentskrift nr. 3.886.136 beskrevne tripeptidsubstrater.

De omhandlede peptidderivater er særlig velegnede til bestemmelse af trypsin i duodenalsaft og i blodet ved akut panchreatitis, hvor trypsin kommer ind i blodbanen, men dog kun optræder i meget lav koncentration på grund af det store blodvolumen. De substrater, der tidligere er blevet anvendt til bestemmelse af trypsin, bl.a. de i USA patentskrift nr. 3.886.136 beskrevne tripep-tidderivater, er alt for lidt følsomme til bestemmelse af så lave koncentrationer.

De omhandlede peptidderivater har den yderligere fordel, at de • i modsætning til de substrater, der tidligere er blevet anvendt til bestemmelse af trypsin, ikke spaltes af trypsininhibitorer.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af plasminogen-aktivatorer og trypsin i legemsvæsker hos mennesker og pattedyr og i vævsekstrakter. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at de nævnte legemsvæsker eller vævsekstrakter omsættes med et af de omhandlede tri- eller tetrapeptidderivater, og mængden af det ved den enzymatiske hydrolytiske indvirkning af plasminogenaktivatorerne eller trypsin på tri- eller tetra- 2 peptidet dannede spaltningsprodukt R H bestemmes ved fotometriske, spektrofotometriske eller fluorescensspektrofotometris-ke metoder.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det endvidere muligt indirekte at bestemme inhibitorer og præaktivatorer for plasmi-nogenaktivatorer samt trypsininhibitorer og trypsinogen. Inhibitorerne kan bestemmes på den måde, at der til det inhibitor-holdige medium sættes et afmålt overskud af plasminogenaktiva-tor eller trypsin, hvorefter den ikke-inhiberede resterende mængde plasminogenaktivator eller trypsin bestemmes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Af differencen mellem den an- 149215 7 vendte mængde plasminogenaktivator eller trypsin og den resterende mængde af disse enzymer udregnes den oprindeligt, i det afprøvede medium værende inhibitormængde. Proenzymerne, dvs. plasminogen-præaktivatorerne og trypsinogen, kan bestemmes på den måde, at der til det proenzymholdige medium sættes en aktivator, der fuldstændigt omdanner det inaktive proenzym til det aktive enzym, dvs. plasminogenaktivator eller trypsin, og mængden af det dannede aktive enzym bestemmes derefter ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Da 1 molekyle proenzym danner 1 molekyle aktivt enzym, kan der af den dannede mængde af det aktive enzym beregnes den oprindeligt, i det afprøvede medium værende mængde proenzym.

Ved en variant af fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemmes plasmi-nogen-aktivatorer i blodplasma eller urin, f.eks. urokinase i urin i en pufferopløsning, som indeholder aprotinin og/eller hirudin, og det foretrækkes især, at der anvendes en puffer, som har en pH-værdi på 8,2 - 8,6 og en ionstyrke på 0,15 - 1,00 og indeholder 0,02 - 0,2 trypsinenheder aprotinin og/eller 0,001 -10 antithrombinenheder hirudin/ml.

Fremstillingen af tri- eller tetrapeptiderne ifølge opfindelsen kan ske efter forskellige, til dels kendte metoders 1) Ved den første metode hænges de chromogene grupper (R i formel 1) , på den C-terminale aminosyregruppe. Disse grupper virker samtidig som C-terminale carboxybeskyttelsesgrupper under den trinvise sammenknytning af aminosyrer' til opbygning af det ønskede peptidskelet. De øvrige beskyttelsesgrupper fraspaltes selektivt fra slutproduktet, uden at den chromogene gruppe påvirkes. Denne metode er f.eks. beskrevet i "Peptide Synthesis" af Miklos Bodanszky et al., Interscience Publishers, 1966, side 163 - 1965.

2) Ved den anden metode kobles den chromogene gruppe til det fær-digopbyggede peptidskelet, på den måde, at der først foretages en trinvis opbygning af det ønskede peptidskelet, hvorefter den C-terminale carboxygruppe frigøres ved alkalisk hydrolyse af esteren, hvorefter den chromogene gruppe hænges på carboxygrup-pen. De øvrige beskyttelsesgrupper fraspaltes til slut selektivt 8 149215 under betingelser, under hvilke den chromogene gruppe forbliver intakt. Denne metode er beskrevet i "Peptide Synthesis", jfr. ovenfor, side 43 og 44.

Til beskyttelse af Na-aminogrupperne under den trinvise opbygning af peptidkæderne kan anvendes de sædvanlige, selektivt fraspaltelige kendte amt"etiskyttelsesgrupper. Disse er først og fremmest:

Cbo, MeOCbo, NO^Cbo, MCbo, BOC, TFA eller formyl. α-Carboxygruppen i aminosyrerne kan gøres reaktionsdygtige efter forskellige kendte metoder, f.eks. ved fremstilling af p-nitrophenylesterderivaterne, trichlorphenylesterderivaterne, pentachlorphenylesterderivaterne eller. N-hydroxysuccinimidesterderivaterne og isolering af disse derivater, eller ved fremstilling in situ af syreaziderne eller syreanhydriderne, som kan være enten symmetriske eller asymmetriske.

Aktiveringen af carboxygruppen kan også ske ved hjælp af et carbo-diimid, f.eks. Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid.

Den C-terminale carboxygruppe i peptidderivaterne beskyttes under den trinvise opbygning af det ønskede peptidskelet enten med den chromogene amidgruppe eller som en methyl-, ethyl- eller isopropyl-ester.

Endvidere kan δ-guanidinogruppen i arginin beskyttes med NC^,

Tos eller ved simpel protonisering.

Ved syntesen af tripeptidkæden kan man først forsyne den N-terminale aminosyre eller dipeptidsyre med blokeringsgruppen (acyl- eller sulfonylgruppe), derefter aktivere carboxygruppen i den blokerede aminosyre eller dipeptidsyre og til sidst knytte det på denne måde Vundne aktiverede aminosyrederivat eller dipeptidsyrederivat til det til fuldstændiggørelse af peptidkæden nødvendige dipeptidderivat.

Fremstilling af tri- eller tetrapeptiderne ifølge opfindelsen efter de to ovenfor nævnte metoder er udførligere beskrevet i de følgende eksempler.

9 149215

Analysen af de ifølge eksemplerne fremstillede eluater og produkter er udført ved tyndtlagschromatografi. Til dette fomål anvendes glasplader, der er overtrukket med siliciumdioxidgel P 254 (Merck).

Til udvikling af tyndtlagschromatogrammerne anvendes følgende opløsningsmiddelsystemer: A chloroform/methanol (9:1) B n-propanol/ethylacetat/vand (7:1:2) C n-butanol/eddikesyre/vand (3:1:1).

Chromatogrammerne udvikles først i UV-lys og derefter ved reaktion med chlor/toluidin (jfr. G. Pataki, "Diinnschichtchromatographie in der Aminosåure- und Peptid-Chemie", Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, side 125).

1 nærværende beskrivelse med krav anvendes følgende forkortelser:

Ala = L-alanin Ø-Ala = β-alanin

Arg = L-arginin

But = L-2-aminosmØrsyre 4-But = 4-aminosmørsyre

Gly = glycin

Ile = L-isoleucin D-Ile = D-isoleucin

Leu = leucin CHA . = cyclohexylalanin

Lys = L-lysin NLeu = L-norleucin NVal = L-norvalin

Ser = L-serin

Val = L-valin D-Val = D-valin

Ac = acetyl

Ac20 = eddikesyreanhydrid

AcOH = eddikesyre BOC = tert.butoxycarbony1

Bz = benzoyl

Bzl = benzyl

Bz20 = benzoesyreanhydrid 149215 ίο

Cbo = benzyloxycarbonyl DCCI = N,N'-dicyclohexylcarbodiimid DCHA = dicyclohexylamin DCH = N,N'-dicyclohexylurinstof DMF = dimethylformamid DSC = tyndtlagschromatogram

Et^N = triethylamin HMPTA = N/N/N' ,Ν' /N" ,N"-hexamethylphosphor- syretriamid LMS - opløsningsmiddelsystem 2iCbo = p-methoxyphenylazobenzyloxycarbonyl

MeOH = methanol NA = naphthylamid

OtBu = tert.butoxy OEt = ethoxy

OisoPr = isopropoxy OMe = methoxy

OpNP = p-nitrophenoxy OSu = N-succinimidoxy pNA = p-nitroanilid TPA = trifluoracetyl

Tos = p-toluensulfonyl.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

I. Na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA.HC1. la) Na-Cbo-Arg(N02)-pNA.

1) I en 500 ml's tre-halset rundkolbe opløses 32,55 g (92,1 milli-mol) grundigt tørret Cbo-Arg(N02)-0H i 200 ml over P2Og ^rret og frisk destilleret Ν,Ν,Ν',N*,N",N"-hexamethylphosphorsyretriamid under udelukkelse af fugtighed ved 20°C. Til denne opløsning sættes portionsvis først 9,32 g (92,1 millimol) Et3N og derefter 18,90 g (.115,1 millimol) p-nitrophenylisocyanat i 25%'s overskud. Efter 24 timers reaktionstid ved stuetemperatur-dryppes reaktionsopløs- 11 149215 ningen under omrøring til 1,5 liter 2%'s natriumhydrogencarbonat-- opløsning. Det udfældede produkt frafiltreres og vaskes tre gange med hver gang 0,7 liter 2%'s natriumhydrogencarbonatopløsning, tre gange med hver gang 0,7 liter destilleret vand, tre gange med hver gang 0,5 liter 0,5N HC1 og endelig tre gange med hver gang 0,5 liter destilleret vand. Det på denne måde vundne produkt tørres i vakuum ved 40°C og ekstraheres derefter to gange med hver gang 200 ml kogende methanol, hvorved den overvejende mængde af det som biprodukt dannede Na-Cbo-o-nitroargininlactam opløses sammen med kun ringe mængder af det ønskede produkt. Det på denne måde vundne, forrensede råprodukt ekstraheres efter tørring to gange med hver gang 50 ml til 70°C opvarmet dimethylformamid, hvorved det ønskede produkt fuldstændig opløses, medens biproduktet, nemlig Ν,Ν'-bis--p-nitrophenylurinstof, bliver uopløst tilbage. Dimethylformamid-opløsningen inddampes i vakuum ved 40°C. Efter tilsætning af methanol udkrystalliserer en substans, som i opløsningsmiddelsystemerne A og B er chromatografisk rene og har smeltepunkt 186 - 188,5°C.

Udbytte: 29,75 g (68,2% af det teoretiske).

Ved elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C20H23N7°7 er opnået følgende værdier:

Beregnet: C 50,74 H 4,90 N 20,71 Fundet: C 50,42 H 4,98 N 20,90.

[<x]22 = 1,27° (c = 1,0 i AcOH) .

2) I en 500 ml's tre-halset rundkolbe opløses 17,7 g (50 millimol) tørret Cbo-ArgiNC^J-OH i 350 ml THFiDMF (1:1), hvorefter der under udelukkelse af fugtighed tilsættes 5,05 g (50 millimol) Et3N. Efter afkøling af reaktionsopløsningen til -10°C tilsættes der dråbevis i løbet af 15 minutter 6,85 g (50 millimol) chlormyre-syreisobutylester opløst i 30 ml tetrahydrofuran, medens temperaturen holdes mellem -10 og -5°C. Efter ca. 10 minutters forløb tildryp-pes 8,2 g (50 millimol) p-nitroanilin opløst i 15 ml dimethylform-amid, medens temperaturen igen holdes mellem -10 og -5°C. Efter 2 timers forløb afbrydes afkølingen, og reaktionsblandingen lades henstå ved stuetemperatur i 24 timer. Efter afdestillation af 12 149215 opløsningsmidlet i vakuum digereres remanensen tre gange med destilleret vand, tre gange med 5%'s natriumhydrogencarbonatopløsning og igen tre gange med destilleret vand i den anførte rækkefølge. Efter tørring i vakuum opløses råproduktet i methanol og lades løbe gennem en med methanol ækvilibreret søjle af "Sephadex®LH-20" (tværbundet dex-trangel). Af en fraktion af eluatet fås 7,67 g stof (32,4% af det teoretiske), med samme fysiske egenskaber som det i afsnit 1) vundne slutprodukt.

3) 17,7 g (50 millimol) Cbo-Arg(N02)-0H opløses i 75 ml dimethyl-f ormamid. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 10,3 g (50 millimol) DCCI og 8,2 5 (50 millimol} p-nitroanilin i den anførte rækkefølge. Efter 4 timer ved -10°C og 20 timer ved 20°C fra-filtreres det dannede DCH, og filtratet inddampes til tørhed. Råproduktet opløses i methanol og lades løbe over en med methanol ækvilibreret søjle af "Sephadex®LH-20". Foruden meget biprodukt, nemlig N-Cbo-Arg-(N02)-N,N'-dicyclohexylurinstof, vindes af en fraktion af eluatet 4,32 g stof (17,9% af det teoretiske), som har samme fysiske egenskaber som det ifølge afsnit 1) fremstillede slutprodukt .

Ib) Na-Cbo-Gly-Arg(N02)-pNA.

Under udelukkelse af fugtighed behandles 9,5 g (20 millimol)

Na-Cbo-Arg(N02)-pNA (jfr. eksempel la) i en kolbe med 80 ml 2N HBr i iseddike under omrøring i 1 time ved 20°C, hvorved dette stof opløses under C02-udvikling. Reaktionsopløsningen dryppes langsomt under kraftig omrøring til 600 ml tørret ether, hvorved der udfældes HBr.H-Arg(NC>2)-pNA. Etherfasen frasuges med en filterstav. Det tilbageværende bundfald behandles yderligere fire gange med hver gang 150 ml tør ether til fjernelse af det dannede ben-zylbromid og overskydende HBr samt eddikesyre. Efter tørring i vakuum over natriumhydroxidspåner fås det deblokerede produkt i kvantativt udbytte. Det tørre hydrobromidderivat opløses i 50 ml dimethylform-amid, afkøles til -10°C og tilsættes 4,16 ml (30 millimol) Et^N til frigørelse af H-Arg(N02)-pNA fra hydrobromidet. Det dannede EtgN.HBr-salt isoleres ved sugefiltrering og eftervaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid, og til filtratet sættes 6,94 g (21 millimol) Cbo-Gly-OpNP ved -10°C. Efter nogle timers forløb har reaktionsopløsningen antaget stuetemperatur. Den afkøles igen til 13 149215 -10°C og pufres med 1,4 ml (10 millimol) Et3N. Efter ca. 5 timers forløb tilsættes yderligere 1,4 ml Et^N. Efter yderligere 24 timers forløb inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen digereres tre gange med hver gang 100 ml destilleret vand og tørres igen i vakuum ved 40°C over NaOH-spåner. Det tørrede produkt omkrystalliseres af methanol, hvorved der fås 6,77 g stof, som i opløsningsmiddelsystemerne A og B er chromatografisk rene.

Af moderluden fås ved gelfiltrering over en med MeOH ækvilibreret søjle af "Sephadex LH-20" yderligere 4,29 g stof. Der fås i alt således 11,06 g (87,7% af det teoretiske) rent stof med smeltepunkt 159 - 161°C. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C22H26N8°8 9iver følgende værdier:

Beregnet: C 49,81 H 4,94 N 21,12 Fundet: C 50,07 H 4,99 N 21,48.

lc) Na-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA.

10,6 g (20 millimol) Na-Cbo-Gly-Arg(NC>2)“pNA (jfr. eksempel Ib) behandles med 120 ml 2N HBr i iseddike (0,24 mol) og oparbejdes som beskrevet i eksempel Ib). Det over NaOH-spåner i vakuum tørrede hydrobromid af dipeptidderivatet opløses i 50 ml dimethyl-formamid og tilsættes efter afkøling 3,04 g Et^N i 10 ral dimethyl-formamid (30 millimol). Dannet Et^N.HBr frafiltreres og vaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid. Til filtratet sættes 8,20 g (22 millimol) Cbo-Val-OpNP. Den videre oparbejdning foretages analogt med eksempel Ib. Ved gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"-søjle fås efter eluering med MeOH 10,95 g (87,0% af det teoretiske) af i opløsningsmiddelsystemerne A og B chromatografisk rent stof med smeltepunkt 212 - 214°C. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C27H35Ng°9 viser følgende værdier:

Beregnet: C 51,50 H 5,60 N 20,02 Fundet: C 52,01 H 5,68 N 20,27.

ld) Na-Bz-Val-Gly-Arg(N02)-pNA.

10,90 g (17,3 millimol) Na-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNa (jfr. eksempel Ic) behandles med 70 ml 2N HBr i iseddike (0,14 mol). Reaktions- 14 149215 blandingen oparbejdes som beskrevet i eksempel Ib. Efter opløsning af det tørrede tripeptidhydrobromidderivat i 60 ml dimethylform-amid sættes der til opløsningen efter afkøling 3,60 ml Et^N (26 millimol). Det dannede Et^N.HBr frafiltreres og vaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid. Til det vundne filtrat sættes 6,66 g (29,4 millimol) benzoesyreanhydrid. Opløsningen pufres derefter og oparbejdes som beskrevet i eksempel Ib). Det tørrede produkt omkrystalliseres af MeOH, hvorved der fås 4,28 g stof, der i opløsningsmiddelsystemerne A og B er chromatografisk rent, smeltepunkt 222 - 223°C. Af moderluden fås ved gelfiltrering og en med MeOH ækvilibreret søjle af "Sephadex LH-20" yderligere 3,75 g stof med smeltepunkt 222 - 223°C. I alt fås der således 8,03 g (77,4% af det teoretiske) rent stof. Ved elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen ^gHggNgOg fås følgende værdier:

Beregnet: C 52,08 H 5,55 N 21,03 Fundet: C 51,88 H 5,63 N 21,56.

I) Na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA. HC1.

6,044 g (10,08 millimol) Na-Bz-Val-Gly-Arg(N02)-pNA (jfr. eksempel Id) indvejes i en Erlenmeyerkolbe med slib. 81 ml 1M bor-tris-tri-fluoracetat i trifluoreddikesyre tilsættes. Efter en reaktionstid på 2 timer ved 0°C og derefter 22 timer ved 20°C fraspaltes nitrobeskyttelsesgruppen under omrøring og udelukkelse af luftfugtighed. Reaktionsopløsningen inddampes til tørhed i vakuum, og remanensen optages i MeOH. For at omdanne peptidderivatet til HCl--saltet tilsættes 1,0 ml koncentreret HC1, og opløsningen inddampes i vakuum til tørhed. Efter 3 ganges gentagelse af denne metodik opløses remanensen i 200 ml 30%'s eddikesyre. Til rensning overføres AcOH-opløsningen til en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle og elueres med 30%'s AcOH. Den del af AcOH--eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 0,85 ml (10,1 millimol) koncentreret HC1. Der fås 4,75 g (79,7% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C26H35N8°6C^ viser følgende værdier:

Beregnet: G 52,83 H 5,97 N 18,96 Cl 6,00 Fundet: C 52,71 H 5,88 N 19,07 Cl 5,95.

15 149215

Aminosyreanalyse viser de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,97 - Gly: 1,0 - Val: 0,98.

Eksempel 2.

II. H-Val-Gly-Arg-pNa.2HC1.

630 mg (1 millimol) af det som beskrevet i eksempel 1, afsnit Ic, fremstillede Na-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA indvejes i reaktionsbeholderen i et Sakakibara-apparat. 10 ml tørret hydrogenfluorid-gas kondenseres i reaktionsbeholderen. Efter en reaktionstid på 1 time ved 0°C fraspaltes Na-benzyloxycarbonylbeskyttelsesgruppen samt nitrobeskyttelsesgruppen for arginin. Den kondenserede hydro-genfluoridgas afdestilleres i vakuum, og remanensen opløses i dime thyl formamid. For at omdanne peptidderivatet til HCl-saltet tilsættes 0,2 ml koncentreret HCl, og opløsningen inddampes til tørhed. Efter to ganges gentagelse af denne metodik opløses remanensen i 25 ml 301's AcOH. Til rensning hældes AcOH-opløsningen på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle og elueres med 30%'s AcOH. Den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehand-ling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 160^,uliter (2 millimol) koncentreret HCl. Der fås 360 mg (68,8% af det teoretiske) af et amorft pulver, der er rent ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen cigH32N8°5C^2 giver følgende resultat:

Beregnet: C 43,60 H 6,16 N 21,41 Cl 13,55 Fundet: C 43,85 H 6,23 N 21,65 Cl 13,42.

Aminosyreanalysen viser de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,98 - Gly: 1,00 - Val: 0,96.

Eksempel 3.

III. Na-Bz-Ile-Gly-Arg-pNA . HCl.

Ilia) Na-Cbo-Ile-Gly-Arg(N02)-pNA.

5,3 g (10 millimol) af den ifølge eksempel 1, afsnit Ib, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, opløses 16 149215 i 35 ml dimethylformamid og tilsættes 2,08 ml (15 millimol) Et^N.

Efter afkøling til -10°C frafiltreres det dannede Et^N.HBr og vaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid. Til det resulterende filtrat sættes 4,25 g (11 millimol) Cbo-Ile-OpNP, og reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib . Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 5,50 g (85,5% af det teoretiske) af den krystallinske forbindelse Illa, som smelter ved 197 - 200°C og ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C28H37N9°9 9iver følgende resultat:

Beregnet: C 52,25 H 5,79 N 19,59 Fundet: C 51,98 H 5,91 N 19,73.

Illb) Na-Bz-:Ie-Gly-Aij(N02)~Pna* 1,29 g (2 millimol) af den ifølge eksempel 3, afsnit Illa, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, opløses i 15 ml dimethylformamid og tilsættes 420^uliter (3 millimol) Et3N. Efter afkøling til -10°C sættes 680 mg (3 millimol) Bz20 til reaktionsblandingen, og reaktionsopløsningen viderebehandles som beskrevet i eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 1,05 g (85,6% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse Illb, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementæranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C27H35N9°8 giver følgende resultat:

Beregnet: C 52,85 H 5,75 N 20,54 Fundet: C 52,54 H 5,85 N 20,68.

III. Na-Bz-Ile-Gly-Arg-pNA.HCl.

614 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 3, afsnit Illb, fremstillede forbindelse indvejes i reaktionsbeholderen i et Sakakibara--apparat. 10 ml tørret hydrogenfluoridgas kondenseres i reaktionsbeholderen. Efter en reaktionstid på 1 time ved 0°C fraspaltes arginin-nitrobeskyttelsesgruppen under omrøring. Den kondenserede hydrogenfluoridgas afdestilleres fra reaktionsblandingen under vakuum, og remanensen opløses i dimethylformamid. For at omdanne peptidderivatet til HCl-saltet tilsættes 0,2 ml (~2,5 millimol) koncentreret HCl, og opløsningen inddampes til tørhed. Efter to gan- 17 149215 ges gentagelse af denne teknik opløses remanensen i 50 ml 30%'s AcOH. Til rensning hældes AcOH-opløsningen på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle og elueres med 30%'s AcOH. Den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 80 ^aliter (1 millimol) koncentreret HC1. Der fås 505 mg (83,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromato-grafi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen CjyH^NgOgCl giver følgende resultat:

Beregnet: C 53,59 H 6,16 N 18,52 Cl 5,86 Fundet: C 53,28 H 6,21 N 18,70 Cl 5,82.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Ile: 0,98.

Eksempel 4.

IV. Na-Bz-Leu-Gly-Arg-pNA.HCl.

IVa) Na-Cbo-Leu-Gly-Arg(N02)-pNA.

2,65 g (5 millimol) af den ifølge eksempel 1, afsnit Ib, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, opløses i 25 ml dimethylformamid og tilsættes 1,04 ml (7,5 millimol)

EtgN. Efter afkøling til -10°C frafiltreres det dannede Et.jN.HBr og vaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid. Til det vund-ne filtrat sættes 2,13 g (5,5 millimol) Cbo-Leu-OpNP, og reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 2,85 g (88,6% af det teoretiske) af den krystallinske forbindelse IVa, der smelter ved 189 - 191°C og ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C28®37N9®9 følgende resultat:

Beregnet: C 52,25 H 5,79 N 17,59 Fundet: C 52,05 H 5,79 N 19,91.

18 149215 ’ IVb) N°-Bz-Leu-Gly-Arg (NC>2) -pNA.

1,29 g (2 millimol) af den ifølge eksempel 4, afsnit IVa, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, opløses i 15 ml dimethylformamid og tilsættes 420yUliter (3 millimol) EtjN. Efter afkøling til -10°C tilsættes 680 mg (3 millimol)

Bz20, og reåktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 0,99 g (80,7% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse IVb, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementar-analyse og beregning ud fra bruttoformlen C27H35N9°8 9iver følgende resultat:

Beregnet: C 52,85 H 5,75 N 20,54 Fundet: C 52,49 H 5,81 N 20,59.

IV. Na-Bz-Leu-Gly-Arg-pNA,HCl.

614 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 4, afsnit IVb, fremstillede forbindelse omsættes ifølge eksempel 2, afsnit II, til dannelse af forbindelse IV. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%'s AcOH.

Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der ved trypsinbehandling kan spaltes under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 80yuliter (1 millimol) koncentreret HC1. Der fås 508 mg (84,0% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C27%7N8°6C^ giver følgende resultat:

Beregnet: C 53,59 H 6,16 N 18,52 Cl 5,86 Fundet: C 53,75 H 6,21 N 18,74 Cl 5,76.

Aminosyreanalyse giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,97 - Gly: 1,00 - Leu: 1,02.

Eksempel 5.

V. Na-Bz-Val-Ser-Arg-pNA.HCl.

19

14921S

Va) Na-BOC-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA.

3,55 g (7,5 millimol) af den ifølge eksempel 1, afsnit la, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, opløses i 35 ml dimethylformamid og tilsættes 1,56 ml (11,3 millimol) Et^N. Efter afkøling til -10°C frafiltreres det dannede Et^N.HBr og eftervaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid. Til det vundne filtrat sættes 3,35 g (8 millimol) BOC-Ser(OBzl)-OpNP, og reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 4,09 g (88,4% af det teoretiske) af en delvis krystallinsk forbindelse Va, som ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C27H36Ng09 giver følgende resultat:

Beregnet: C 52,59 H 5,88 N 18,17 Fundet: C 52,82 H 5,78 N 18,30.

Vb) Na-BOC-Val-Ser (OBzl) -Arg (NC>2) -pNA.

3,08 mg (5 millimol) af den ifølge eksempel 5, afsnit Va, fremstillede forbindelse indvejes i en Erlenmeyerkolbe og tilsættes under udelukkelse af fugtighed 15 ml trifluoreddikesyre. Under omrøring ved 20°C i 30 minutter opløses stoffet under C02-udvikling. Reaktionsopløsningen dryppes langsomt under intensiv omrøring til 250 ml tørret ether, hvorved CF^COOH.H-Ser(OBzl)-Arg(NC>2)-pNA udfældes. Etherfasen frasuges med en filterstav. Det tilbageværende bundfald behandles yderligere tre gange med hver gang 50 ml tør ether til fjernelse af det dannede tert.butanol og den overskydende mængde trifluoreddikesyre. Efter tørring i vakuum over NaOH-spåner fås det deblokerede produkt i næsten kvantitativt udbytte. Det tørrede trifluoracetatderivat opløses i 25 ml dimethylformamid, afkøles til -10°C og tilsættes 1,04 ml (7,5 millimol) Et^N til frigørelse af Η-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA fra trifluoracetatet, og derefter tilsættes 1,73 g (5,5 millimol) BOC-Val-OSu. Efter nogen timers forløb har reaktionsopløsningen antaget stuetemperatur. Den afkøles igen til -10°C og pufres med 0,35 ml (2,5 millimol) Et^N. Efter ca. 5 20 149215 timers forløb tilsættes yderligere 0,35 ml Et^N. Efter yderligere 24 timers forløb inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 2,81 g (78,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, som ifølge tyndtlagschroma-tografi i LMS A og B er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C32H45Ng°io 5^νβΓ følgende resultat:

Beregnet: C 53,70 H 6,34 N 17,61 Fundet: C 54,03 H 6,40 N 17,88.

Vc) Na-Bz-Val-Ser(OBzl)-Arg(NC>2)-pNA.

710 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 5, afsnit Vb, fremstil-, léde forbindelse deblokeres ifølge eksempel 5, afsnit Vb, opløses i 8 ml dimethylformamid og tilsættes 210yUliter (1,5 millimol)

Et^N. Efter afkøling til -10°C tilsættes 450 mg (2 millimol)

Bz20, og reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 532 mg (73,9% af det teoretiske) af den krystallinske forbindelse Vc, der smelter ved 175 - 178°C og ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen c34H41Ng09 giver følgende resultat:

Beregnet: C 56,74 H 5,74 N 17,52 Fundet: C 56,65 H 5,69 N 17,83.

V. Na-Bz-Val-Ser-Arg-pNA.HC1.

360 mg (0,5 millimol) af den ifølge eksempel 5, afsnit Vc, fremstillede forbindelse omsættes ifølge eksempel 2, afsnit II, til dannelse af forbindelsen V. Rensning: gelfiltering på "Sephadex G-15" i.30%'s AcOH.

Udbytte: Den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbe-handling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 40yuliter (0,5 millimol) koncentreret HCl. Der fås 160 mg (51,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C^H^yNgO^Cl viser følgende resultat:

Beregnet: C 52,21 H 6,00 N 18,04 Cl 5,71

Fundet: C 52,49 H 6,08 N 18,26 Cl 5,63.

21 149215

Aminosyreanalysen viser de ventede aminosyrer i det rigtige forholds Arg: 0,99 - Ser: 0,95 - Val: 1,00.

Eksempel 6.

VI. Na-Bz-Ile-Ser-Arg-pNA.HCl.

Via) Na-B0C-Ile-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA.

1,54 g (2,5 millimol) af den ifølge eksempel 5, afsnit Va, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 5, afsnit Vb, opløses i 15 ml dimethylformamid og tilsættes 520^uliter (3,75 millimol) Et3N. Efter afkøling til -10°C tilsættes 905 mg (2,75 millimol) BOC-Ile-OSu, og reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 1,45 g (79,5% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse Via, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elemen-taranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C33H47N9°io viser følgende resultat:

Beregnet: C 54,31 H 6,49 N 17,27 Fundet: C 54,82 H 6,52 N 17,35.

VIb) Na-Bz-Ile-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA.

730 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 6, afsnit Via, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 5, afsnit Vb og opløses i 7 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 210^,uliter (1,5 millimol) Et-jN og lige derefter 450 mg (2 millimol) Bz20. Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 615 mg (83,8% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse VIb, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C35H43N9°g giver følgende resultat:

Beregnetr C 57,29 Η 5,91 Ν 17,18

Fundet: C 57,61 Η 6,01 Ν 17,53.

22 149215 VI. Na-Bz-lle-Ser-Arg-pNA.HCl.

367 mg (0,5 millimol) af den ifølge eksempel 6, afsnit VIb, fremstillede forbindelse omsættes ifølge eksempel 2, afsnit II/ til forbindelse VI. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%'s AcOH.

Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehand-ling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 40^,uliter (0,5 millimol) koncentreret HCl. Der fås 168 g (45,8% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndt-lagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C28H39N8°7C1 giver følgende resultat:

Beregnet: C 52,95 H 6,19 N 17,64 Cl 5,58 Fundet: C 53,21 H 6,26 N 17,88 Cl 5,57.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,96 - Ser: 0,95 - Ile: 1,00.

Eksempel 7.

VII. Na-Bz-Leu-Ser-Arg-pNA.HCl.

Vila) Na-BOC-Leu-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA.

1,55 g (2,5 millimol) af den ifølge eksempel 5, afsnit Va, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 5, afsnit Vb, opløses i 15 ml dimethylformamid og tilsættes 520^uliter (3,75 millimol)

EtgN. Efter afkøling til -10°C tilsættes 0,91 g (2,78 millimol) BOC-Leu-OSu, og reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 1,44 g (78,9% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse Vila, der ifølge tyndtlagschroma tograf i i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C^H^NgO-^Q giver følgende resultat:

Beregnet: C 54,31 H 6,49 N 17,27

Fundet: C 54,70 H 6,55 N 17,43.

23 149215

Vllb) Na-Bz-Leu-Ser (OBzl) -Arg (NC>2) -pNA.

1,46 g (2 millimol) af den ifølge eksempel 7, afsnit Vila, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 5, afsnit Vb, og opløses i 15 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C sættes 420yUliter (3 millimol) EtgN til opløsningen og lige derefter 0,90 g (4 millimol) Bz20. Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20” i MeOH fås 1,25 g (85,2% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse Vllb, som ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementar-analyse og beregning ud fra bruttoformlen C35H43N9°9 giver følgende resultat:

Beregnet: C 57,29 H 5,91 N 17,18 Fundet: C 57,38 H 5,98 N 17,57.

VII. Na-Bz-Leu-Ser-Arg-pNA.HCl.

735 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 7, afsnit Vllb, fremstillede forbindelse omsættes ifølge eksempel 2, afsnit II, til forbindelsen VII. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%'s AcOH.

Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehand-ling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 80yuliter (1 millimol) koncentreret HC1. Der fås 355 mg (55,9% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschroma tograf i i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C28H39N8°7C^ giver følgende resultat:

Beregnet: C 52,95 H 6,19 N 17,64 Cl 5,58 Fundet: C 53,09 H 6,09 N 17,91 Cl 5,49.

Aminosyreanalysen viser de ventede aminosyrer i det rigtige for hold: Arg: 0,95 - Ser: 0,93 - Leu: 1,00.

VIII. Na-3-phenylpropionyl-Val-Gly-Arg-pNA.HCl.

24 .

Eksempel δ.

149215

Villa) Na-3-phenylpropionyl-Val-Gly-Arg(N02)-pNA.

3,15 g (5 millimol) af den ifølge eksempel 1, afsnit Ic, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, og opløses i 25 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C tilsættes 1,05 ml (7,5 millimol) EtgN og deréfter 1,50 g (5,5 millimol) 3-phenylpro-pionsyre-p-nitrophenylester. Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 2,75 g (87,6% af det teoretiske) af den krystallinske forbindelse Villa, som smelter ved 216 - 218°C og ifølge tyndt-lagschromatografi i LMS A og B er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen CgøE^NgOg Siver følgende resultat:

Beregnet: C 53,58 H 5,94 N 20,09 Fundet: C 53,38 H 6,02 N 20,40.

VIII. Na-3-phenylpropionyl-Val-Gly-Arg-pNA.HCl.

1,26 g (2 millimol) af den ifølge eksempel 8, afsnit Villa, fremstillede forbindelse omsættes ifølge eksempel 1, afsnit I, til forbindelsen VIII. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%'s AcOH.

Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbe-handling under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 160^,uliter (2 millimol) koncentreret HC1. Der fås 1,12 g (90,4% af det teoretiske) af et amorft pulver, som ifølge tyndtlags-chromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C^gHggNgOgCl giver følgende resultat:

Beregnet: C 54,32 H 6,35 N 18,10 Cl 5,73 Fundet: C 54,58 H 6,29 N 18,40 Cl 5,67.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige for hold: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Val: 1,02.

IX. Να-2- phenylacetyl-Val-Gly-Arg-pNA. HC1.

Eksempel 9.

25 149215 IXa) Na-2-phenylacety1-Val-Gly-Arg(NO 2)-pNA.

1,57 g (2,5 millimol) af den ifølge eksempel 1, afsnit Ic, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 1, afsnit Ib, og opløses i 15 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C tilsættes 520^uliter (3,75 millimol) EtgN og derefter 710 mg (2,75 millimol ) 2-phenyleddikesyre-p-nitrophenylester. Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 1, afsnit Ib. Efter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fås 1,35 g (88,0% af det teoretiske) af den krystallinske forbindelse IXa, der smelter ved 180 -184°C og ifølge tyndtlagschromatografi i LMS A °5 B er ren. Elementar-analyse og beregning ud fra bruttoformlen giver følgende resultat:

Beregnet: C 52,85 H 5,75 N 20,54 Fundet: C 53,09 H 5,82 N 20,91.

IX. Na-2-phenylacetyl-Val-Gly-Arg-pNA.HCl.

615 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 9, afsnit IXa, fremstillede forbindelse omsættes ifølge eksempel 1, afsnit I, til forbindelsen IX. Rensning: gélfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%'s AcOH.

Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der ved trypsinbehandling kan spaltes under frigørelse af p-nitroanilin, lyofiliseres efter tilsætning af 80yUliter (1 millimol) koncentreret HCl. Der fås 515 mg (85,1% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlags-chromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C27H37N8°6C^ giver følgende resultat:

Beregnet: C 53,59 H 6,16 N 18,52 Cl 5,86 Fundet: C 53,19 H 6,21 N 18,77 Cl 5,75.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige for hold: Arg: 0,94 - Gly: 1,00 - Val: 0,98.

X. Na-Cbo-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.2HC1.

26

Eksempel 10.

149215

Xa. Na-Cbo-Arg-pNA.HCl.

I en 250 ml's tre-halset rundkolbe opløses 16,0 g (47,0 millimol) over P2°5 1 vakuum tørret Cbo-Arg-OH.HCl i 90 ml absolut HMPTA under udelukkelse af fugtighed ved 20°C. Ved stuetemperatur sættes til den vundne opløsning portionsvis først en opløsning af 4,74 g (47,0 millimol) Et^N i 10 ml HMPTA og derefter 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenylisocyanat '(100%1 s overskud). Efter 24 timers reaktionstid ved 20°C afdestilleres størstedelen af HMPTA i vakuum. Remanensen ekstraheres flere gange med 30%'s AcOH. Remanensen kasseres. De samlede eddikesyreekstrakter hældes til yderligere rensning på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15" søjle og elueres med 30%1 s AcOH. De fraktioner af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres.

Der fås 12,6 g af et amorft pulver, der ifølge-tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C20H25N6°5C1 giver følgende resultat:

Beregnet: C 51,67 H 5,42 N 18,08 Cl 7,63 Fundet: C 51,29 H 5,48 N 17,92 Cl 7,50.

Xb. Na-Cbo-Gly-Arg-pNA.HBr.

Under udelukkelse af fugtighed behandles 4,65 g (10 millimol) af forbindelsen Xa med 40 ml 2N HBr i iseddike under omrøring i 45 minutter ved 20°C. Aminosyrederivatet opløses derved under udvikling af C02· Reaktionsopløsningen dryppes under intensiv omrøring til 250 ml absolut ether, hvorved (2HBr).H-Arg.pNA udfældes. Etherfasen frasuges, hvorpå den faste fase vaskes yderligere fire gange med hver gang 100 ml absolut ether for at fjerne det som biprodukt dannede benzylbromid samt overskuddet af HBr og AcOH. Ved tørring i vakuum over NaOH-spåner fås det deblokerede produkt i kvantitativt udbytte. Det tørre (2HBr).H-Arg-pNA opløses i 25 ml dimethylformamid. Til den til -10°C afkølede opløsning sættes 1,40 ml (10 milli- 27 149215 mol) Et^N. Der dannes et bundfald af Et^N.HBr, der frafiltreres og eftervaskes med en ringe mængde koldt dimethylformamid. Til filtratet sættes 3/65 g (11 millimol) Cbo-Gly-OpNP ved -10°C. Efter nogle timers forløb er reaktionsopløsningens temperatur steget til 20°C. Opløsningen afkøles igen til -10°C og pufres med 0,35 ml (2,5 millimol) EtgN. Efter yderligere 16 timers forløb tilsættes yderligere 0,35 ml Et^N ved -10°C. Efter yderligere 24 timers forløb inddampes reaktionsopløsningen til tørhed ved 40°C i vakuum. Remanensen opløses i 33%'s AcOH. Opløsningen renses ved gelfiltrering på en med 33%'s AcOH ækvilibreret søjle af "Sephadex G-15".

De fraktioner af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehand-ling under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum. Remanensen opløses i 30 ml MeOH og dryppes under intensiv omrøring til 300 ml absolut ether, hvorved Na-Cbo-Gly-Arg-pNA.HBr udfældes. Etherfasen frasuges, hvorefter den faste fase yderligere vaskes to gange med hver gang 100 ml absolut ether til fjernelse af MeOH og spor af AcOH. Efter tørring i vakuum over NaOH-spåner fås 4,45 g (78,6% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C22H28N7°6Br giver følgende resultat:

Beregnet: C 46,65 H 4,98 N 17,31 Br 14,11 Fundet: C 46,33 H 5,04 N 17,88 Br 14,20.

Xc. Na-Cbo-cyclohexylglycy1-Gly-Arg-pNA.HC1.

2,85 g (5 millimol) af den ifølge eksempel 10, afsnit Xb, frem-· stillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 10, afsnit Xb, og opløses i 20 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C tilsættes 0,70 ml (5 millimol) Et^N og derefter 2,30 g (5,5 millimol) Na-Cbo-L-cyclohexylglycin-p-nitrophenylester (smeltepunkt 93 -94°C). Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 10, afsnit Xb. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'s AcOH. Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved tryp-sinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 400^uliter (5 millimol) koncentreret HC1. Der fås 2,47 g (74,7% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C3oH4iN8°7C^ giver følgende resultat: 28 149215

Beregnet: C 54,50 H 6,25 N 16,95 Cl 5,36 Fundet: C 54,15 H 6,33 N 17,18 Cl 5,18.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,97 - Gly: 1,00 - L-cyclohexylglycin: 1,05.

Eksempel 11.

XI. H-L-cyclohexylglycy1-Gly-Arg-pNA.2HC1.

660 mg (1 millimol) af det ifølge eksempel 10 fremstillede Na-Cbo--L-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.HCl deblokeres ifølge eksempel 10, afsnit Xb. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'s AcOH.

Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbe-handling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 160^uliter (2 millimol) koncentreret HC1. Der fås 465 mg (84,9% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlags-chromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse ig beregning ud fra bruttoformlen C22H36N8°4C12 9iver følgende resultat:

Beregnet: C 48,26 H 6,63 N 20,47 Cl 12,95 Fundet: C 47,95 H 6,75 N 20,90 Cl 12,42.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,99 - Gly: 1,00 - L-cyclohexylglycin: 1,03.

Eksempel 12.

XII. Na-Bz-L-cyclohexylglycin-Gly-Arg.pNA.HCl.

550 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 11 vundne forbindelse opløses i 10 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 140^uliter (1 millimol) Et^N og derefter 340 mg (1,5 millimol) BZ2O. Efter nogle timer er reaktionsopløsningens 29

14921S

temperatur steget til 20°C. Opløsningen afkøles igen til -10°C og pufres med 140^uliter (1 millimol) Et^N. Efter yderligere 4 timers forløb tilsættes yderligere 140 ml Et3N ved -10°C. Efter yderligere 16 timers forløb inddampes reaktionsopløsningen i vakuum ved 40°C til tørhed. Remanensen opløses i 20 ml MeOH. Ved gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20" søjle fås efter eluering med MeOH 530 mg endnu noget forurenet produkt. Til yderligere rensning opløses produktet i 33's AcOH og hældes på en med 33%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15" søjle og elueres med 33%'s AcOH. Den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsin-behandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 80^uliter (1 millimol) koncentreret HC1. Der fås 475 mg (75,3% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndt-lagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen ^gH^NgOgCl giver følgende resultat:

Beregnet: C 55,19 H 6,23 N 17,76 Cl 5,62 Pundet: C 54,92 H 6,34 N 17,96 Cl 5,51.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,01 - Gly: 1,0 - L-cyclohexylglycin: 0,98.

Eksempel 13.

XIII. H-D-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.2HC1.

Xllla. Na-Cbo-D-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.HCl.

2,85 g (5 millimol) af den ifølge eksempel 10, afsnit Xb, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 10, afsnit Xb, og opløses i 20 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 0,70 ml (5 millimol) EtgN og derefter 2,30 g (5,5 millimol) Na-Cbo-D-cyclohexylglycin-p-nitrophenylester (smeltepunkt 93,5°C). Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 10, afsnit Xb.

30 149215

Rensnings gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'s AcOH. Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 400 ^uliter (5 millimol) koncentreret HCl. Der fås 2,55 g (77,1% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen <'30H41N8O7C^· 9iver følgende resultat:

Beregnet: C 54,50 H 6,25 N 16,95 Cl 5,36 Fundet: C 54,01 H 6,30 N 17,05 Cl 5,28.

XIII. H-D-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.2HC1.

660 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 13, afsnit Xllla, fremstillede Na-Cbo-D-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.HCl deblokeres ifølge eksempel 10r afsnit Xb.

Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'s AcOH. Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 160/Uliter (2 millimol) koncentreret HCl. Der fås 460 mg (84,0% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C28H36N8°4C^2 9*ver følgende resultat:

Beregnet: C 48,26 H 6,63 N 20,47 Cl 12,95 Fundet: C 48,05. H 6,73 N 20,91 Cl 12,50.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,01 - Gly: 1,00 - Drcyclohexylglycin: 0,97.

Eksempel 14.

XIV. Na-Bz-D-cyclohexylglycyl-Gly-Arg.pNA.HCl.

550 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 13 fremstillede forbindelse opløses i 10 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C

149215 31 sættes til opløsningen 140^uliter (1 millimol) Et-jN og derefter 340 mg (1,5 millimol) BZjO, og reaktionsopløsningen viderebehand-les ifølge eksempel 12, afsnit XII.

Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'s AcOH. Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 80yUliter (1 millimol) koncentreret HCl. Der fås 450 mg (71,3% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatogra-fi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen c29H3gN806Cl giver følgende resultat:

Beregnet: C 55,19 H 6,23 N 17,76 Cl 5,62 Fundet: C 54,70 H 6,25 N 18,01 Cl 5,55.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - D-cyclohexylglycin: 0,98.

Eksempel 15.

XV. Na-Cbo-Val-Gly-Arg-pNA.HCl.

2,85 g (5 millimol) af den ifølge eksempel 10, afsnit Xb, fremstillede forbindelse deblokeres ifølge eksempel 10, afsnit Xb, og opløses i 20 ml dimethylformamid. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 0,70 ml (5 millimol) Et^N og derefter 2,05 g (5,5 millimol) Cbo-Val-OpNP. Reaktionsopløsningen viderebehandles ifølge eksempel 10, afsnit Xb.

Rensning: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'s AcOH. Udbytte: den del af AcOH-eluatet, der kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 400yuliter (5 millimol) koncentreret HCl. Der fås 2,55 g (82,1% af det teoretiske) af et amorft pulver, der ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C27H37NgO^Cl giver følgende resultat: 32 149216

Beregnet: C 52,21 H 6,00 N 18,04 Cl 5,71 Fundet: C 52,12 H 6,16 N 18,48 Cl 5,63.

Aminosyreanalysen giver de ventede aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,01 - Gly: 1,00 - Val: 0,97.

Eksempel 16 XVI. Na-B z-Val-Gly-Arg-2-Na.HC1 XVIa. Na-Bz-Val-Gly-Arg-OH. HC1 5,9 g af forbindelsen I (eksempel 1) opløses i 200 ml puffer med pH-værdi 8,2. Til denne opløsning sættes 2000 NF-enheder trypsin for at fraspalte p-nitroanilinogruppen racemiseringsfrit, idet pH-værdien holdes konstant ved tildrypning af IN natriumhydroxidopløsning. Efter endt reaktion tilsættes 40 ml koncentreret eddikesyre for at inaktivere trypsinet. Opløsningen inddampes til tørhed. Remanensen opløses i 50 ml 33%'s eddikesyre, og opløsningen chromatograferes på en "Sephadex G-15"-søjle, som er ækvilibreret med 33%'s eddikesyre. Fra den første fraktion fås 4,43 g (94,1%) af et amorft stof, som ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er rent.

Ved elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen C20H31N6°5C^ fås følgende resultat:

Beregnet: C 51,01 H 6,63 N 17,85 Cl 7,53

Fundet: C 50,48 H 6,71 N 18,17 Cl 7,38.

XVIb. Na-Bz-Val-Gly-Arg-2NA.HC1 I en tre-halset rundkolbe på 100 ml opløses 942 mg (2 millimol) af den tørrede forbindelse XVIa i en blanding af 7,5 ml frisk destilleret vandfrit dimethylformamid og 15 ml absolut tetrahydrofuran ved 20°C. Til den til den -10°C afkølede opløsning sættes under 149215 33 omrøring og udelukkelse af fugtighed 280 i^liter (2 millimol) tri-ethylamin. Til blandingen dryppes i løbet af 20 minutter en opløsning af 273 mg (2 millimol) chlormyresyre-isobutylester i 5 ml te-trahydrofuran, imedens reaktionstemperaturen ikke lades stige til over -5°C. Efter en yderligere reaktionstid på 10 minutter ved en temperatur på mellem -10 og -5°C dryppes der til reaktionsblandingen en opløsning af 286,4 mg (2 millimol) 2-naphthylamin i 5 ml di-methylformamid i løbet af 30 minutter, idet reaktionstemperaturen konstant holdes på under -5°C. Reaktionsblandingen lades viderere-agere i yderligere 1 time ved -5°C. Den omrøres natten over ved -20°C og afkøles derefter til -15°C for at lade Et3N.HCl udkrystallisere. Det dannede Et^N.HCl frafiltreres og eftervaskes med lidt koldt dimethylformamid. Filtratet inddampes til tørhed ved 50°C i vakuum sammen med vaskeopløsningen. Remanensen opløses i 10 ml 33%'s eddikesyre og renses ved gelfiltrering på en med 33%'s eddikesyre ækvilibreret søjle af "Sephadex G-15". Den hovedfraktion af eddikesyreeluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af 2-naphthylamin, inddampes til tørhed ved 40°C i vakuum. Efter tørring af remanensen i vakuumtørreskab ved 50°C over P205 fås 506 mg (42,5% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse XVI, som ifølge tyndtlagschromatografi i LMS C er ren. Elementaranalyse og beregning ud fra bruttoformlen giver følgende resultats

Beregnet: C 60,44 H 6,43 N 16,45 Cl 5,95

Fundets C 59,88 H 6,47 N 16,75 Cl 5,83.

Ved de i eksemplerne beskrevne metoder er syntetiseret en række yderligere substrater. Resultaterne af disse synteser er sammen-stillet i nedenstående tabel.

34 149215 ..

ω

hOO MO U O WS MO

aO aO <0 a0„ aO

<a;~ <;* .i·*· <! , <$ -

I H ·· H ^*H 1 2 ·· iH

>» is H >» is I rH -- ‘—I -- O *· H H ·· 01 o o ·· o , m o β®| Φ -HOO •HO' 3 CM O -- C— CT> h ^ id οι η o cn cdocn ooo <C cn σ> S >ι β >ι «β “ “ Η-~ Η * - β ,0 Μ - (¾ Μ Π3 Η >ΗΟ <ΗΟ S Η rH CQ ^ ΟΟΟ

UD CD to o CM CD CO o CO cn to CO H O to ^J* CM C— O

" ^'φΙΟΙΟ rH CM If) * t-H-t- O'CM CM · t-Ο ΙΛ H

• M A M ***»»%·* ·* Λ Λ Λ M n M Μ Λ ·» Λ Λ

a σ' to tn in c— m c— cm cn in to h c- in c~ cm rH to tn rH

(D tO i—I M" i—I i—I "M" r—I i—I M" i—1 i—I LD i—I t—I

I CQ

M

id -ipt +)<ϋ to o co tn to co lo æ cn cm co æ cotnOrH in oo c- in C ra+) o t n oo m c-cm co rH oo to tn c- β- ·μ- h in o c- cn <D >, ω --~ ~ " "cm " " " " ---- ~ ~ ~ ~ grifl cn to m in lOinc-Lj cn m to h c-- in c- cm rHtomo

Φ (d β UD rH rH I—I i—i Μ" i—I r—I in I—| I—I

HC3 rH U c, a U

H Idp« OSSO OSSffl OXScQ OSSfi OSSCQ

s 3 t s s * a * a <* ' o >i<#> ^ I " _ i ^ I " .. i " fcl~ •PrQ to 00 o CM o G"1 o O 0^1 Φ Ό rH co rH CO HC- rH CD rH t-

S O

• · · · · η I i i l c

•H

S — — —

Cd r-1 i—I i—I , i o o o ri

^ ^ jg ;|j O

i"H j? <C <CCVJ< <*= j. Cj-PSCMS-SCMS^.

S 3 s o, o, cm cu ft

Jj BO, I CM I —- I CM I CM

Ί3 cfltuj'— bD bC'-rbC^ .H ™ β a a ft a a Γ i <ccu < s <c cl, < o.

m Λ CM IS I ft I S IS

ij ^ nt I ft O rS ft ^4 ft

£ o 2 ^ rH O HI HO HO

SS ir X — O ·—· I 0-»β O O I

5.5 L·· OH I H Cd 1 H Q> I -- -P I —· <c £, Jj ^SOSOH X O H X Η β X Η X ~ β h . +3¾ · S < *ss -om · oo

S Η o ® s 5h S I a £ I ag i aS I

Å3 T, S ω o no η Έ o ωεο

rrt O S I CM S CM £> SCVIO S CM JO S CM O

•3 M-—- CM —Ό CM'—- O CM'—O CM —-O

o · c · · Φ < s < < S s o. s s I ft I O. ft

tf- i bO I I

i bc u ω bo

hD C. < Cl U

U < I <c < < I >» I i

Jj I rS Η

»if is H O H H

3 Η O I ϋ C5

>0 CS I β I I

0 I H cd Φ +d <

Μ Η O Η Η β X

ft tos c s m o

+) > · I I I I

β i< oa oa oa oa h ns jon jon nn nn 01 m cm ox ox ox ox 2

i S

jcjoors co οι o H

3

WWftH Η H CM CM

35 149215

MO hOO bDO bOO hOO bOO

MO MO mo mo mo mo «a*~ <C, - *a) ·> «3 - «a;*· <0 ~ .· 1—1 ·· rH ·· H ·· H ·· CM ·* Ή S >» >» >> >> >· Η «· Η ·· H ·· H ·· <-} ·· ·3 *·

O Ο Ο Ο Ο O

.. h 00 .-O'» .· H æ ·- OJ O ·· H OT ·· CVJ rH

HOOT HOOT HOOT HOO HOOT HOO

Crt·*·'« flj ·* ·* CtJ''*' CTJ ~ ^ ~ Cg ^

t>HO Ρ> Η O i>HO t» Η H t> Η O t> Η H

00 OT 00 O OT O CO CO COO t-H ID If) OT 00 UO 00 CM OJ 3- 00 ·+ in

10 CM H b- CO 3- CM t- σι t- CD b- 00 OT m CM ^OMM H 00 in CO

f-UDHVO CM b- CO m 00 00-^-.+ 1—1 in 00 in CO 10 H CM 2 «Ο U5 3" 3- oj in h in h in h 3- cm h in h

CO CO 00 00 lOC-rit. CO OT CM CM C- CO CO 00 COHffllfl lO CO 2 O

in co co in + + m ui 3-1—02 OOcoh cmhoto c- ot c> uo c- uo h uo cm 00 in σ> oo 2 3- h 2 co 2 couohcm 3-223- 3- cm in h in h uo h 3- cm h in h

Η Η Η Η Η H

0 0020 0220 0120 0220 0220 0220 3· m 3- c~- ,3- μ 3- cm„cm..cm~cm..h. ”

Η I cm H 1 CM Η i m 3 I CO 1-1 I H 1-1 I OT

CO 00 2 oo , OT . Γιο ω ca to X X X M ^ g H eq Η H—. H w

H

O — % H 2 S O 2 'S §a — -H — — .— CM —-ε —Ό

H ij f—I H i—I " H HI

0 ^ Ofl 02 JD CM OO OO

S Ο O 2 t- CM $ CM H CM H CM2 CM2 CM — —- 0)- —2— —2— '-'Οι -—CM — CM-

HH OH OH O 2 H

H vO HHO HHO HI >2 HOO

H “S H >,2 H >.2 H !>» MO H — 2 2¾ 0¾ 0¾ Η «Ο 2c • λ *C 'In ·£> ·2

PrlcM # CD CM £ cDCM Λ I o'"- 2 I CM

- £-p - ^0) - y o ήμ mo -

P^CM r°OCM 0+JCM 0 2 pm 02 CM

w Pm o — pMcn·—- Pmo Pm 2 PmO'— < H 2*1

O I I Oh < H

2 h£l hO I 2 cD

• Μ M bO &. >

C < < M I I

2 I I «3 bO O

a. >> >> i m o

1 Η H I i—I

MO Ο Η I 1 O

M i I O 2 !>> t2 +* «ΐ Η Η I Λ! H -—- · ,Μ i OJ cd H pj O cm* 3 >> > > as 2 I 22 Ο H I I > 0 H O a, 0

Ο Η Η I M CD —» I M

I SH SH >> ft > I hO ft H OO OO Hg I 2 M 6

cD C2 M2 O 0) >> 2<< <D

t> CD· Cd· I H HH I i H

I 2 < 0)3 Ο Η H OO Ο ϊ>» H

O 02 22 200) 12 2H 0) «3 o a COO. O 2 S 2 CM OO 2 CM CO 3· in jo CM CM CM CM nl "· 36 149215 οο η 00 oo oo cn cn Ο cn cn cn *. σ*» ·» «* * * Ο ~ Η Ο Ο Ο °

hOO bo“ ωο hOO too MO

kO fcO u o u o u o < - <t;o «* « «< *· “a;- < ~

#* i—I ·> n ·· H ·· i—1 ·* i—I ·· ' I

r*> !>>rl >> >> i>> rH ·· rH rH ·· rH ·’ rH ·· H ··

O O '· O C5 O O

.. rH .· CM ·· rH ·· <T1 ·· CVJ ·· O

HO HO HO HW HO rjO

cd ·> cd ~ co - cd - <0~ co ~

> η > rH > rH >0 > rH > rH

<xi co c- f- o cw cn co co to c\i co cn in io co «j· co t-rHcnto co cn c- σ> cm id in to σ> αο o t> c- H- co n- hco^oi

00 C- CO O CVJ to 00 If) If) VO lO't DlOOlO H· to to 00 IO OT O

^ HH U) H if) Η H" i—i i—I if) (—I H" r—! i—I

(DO HH if) ιΗ H" to ω COHO Η- H CO 00 CO CO CM C- to CM CO 00 in cm cm tf) cn Ο o oo oo to co to t-mcotf) cm tf) O to o c- in to co c- <η O rH t— cn if) H· to to H· oo to tn Ο H· to c~- H· oo to cn o H" (—{i—i tf) i—! tf) i—1 HH U) Η H" i—I i—i

rH iH rH rH rH rH

OIZO OSSO OSSO USSO OCd2C OECSU

CM H

rH tO CM CM CM 10 H tf H <X> H (- rH-H-H-H«

Ilf) I rH Ilf) 100 · 1 Η" ·|1ί) • co ·οο · (-. ·οο tn c~- moo οι m m m A! Αί

A! A! X Μ Η H

Η H £1 W

_L I HOr

r- — >L — O — OS

rH rH X HU H 20, H

00 Ο O CM Ο I — o HO O

S cd-^i °§

CMS CM o CM IS CMS CM I CMS

>rO «—HA, —·<Μ —Ο ΊήΟ H.O >>S S CM O— w Π Or.

s< X O, O - bd -< rH ΠΥΟ 5<H

5d\ H 1)0 Η 1 CM R\ O 12 WVO

8 fr, HSI H S — 8 f, !§ Jg . GQ — . O CD — . S . CQ ΰ · S .03 s

ό S Η Π rH H rH o Id, o S Λ I CM nS

Ή Ο Ή O >i O T30S tS Ο X Ο - «Ο

Ο S 2 Ο X »§ ρ,ΩΟ, pSH Ο X) CM pSH

pH CM Η pH Ο Η Ρη Ο Ο pH CM —' pH Ο — *** CM — 1 Μ ir <

O I rH I rH I I

I rH O O O rH I >>

rH XS OS CO rH <H

(d C · I · >H ctf O

> O <ί IO > rH I

I ί2 QSj, OS I O rH

o p, a PEj a-y o cm os|; as O pH Cd I V I ·£ I· O · -¾ > i o o te i Ms (CK i < _g i

WC HP, CM dr 'g »2 ^ O

— cm >>< s< g V a fxi a R o

CM· XI O I « II Vin I rH

S < (D >> I >, B1 CMbO I M S' Λ °

OS OH S H 6 Kk 3 P, 5 pr|S

— o, oo so® o < s<ii cm II H i I I II ll!j I*

CMhO O rH O rH 'T; CM>> O >. V, S C

Sin >> cd X) Cd P SrH OH S CVS

Sa; o> o>a so ooa so, eo σν o Η cm co

CM CM CO CO CO CO

37 149215 c- co r- co σι oo cn cn cn cn cn cn

0*0 0 0 0 0 ωο MO hflO hflO hOO hOO

UO uo uo uo uo uo •a; » <C~ ·<" «aj~ <C ~ <C ·> • 1—1 · I—t ·· H *' I—i *" r—t · I—1 !>> i—i * H ** H ·· H ·· H ·· H -· o o o o o o .. cn .· oo ·· σ> ·· O ·· σ> ·· h h cd h cn h cn η o H cn ho tO to" cD ~ cD ·* <D ~ cD ~

>0 >0 > O > H > O > H

cn ud cm ud t>- cm oo σ> o o cm tf · co od η o cncnoo HCOOO

in rl^co Ht-Ob· IflOOHO C- CO C— C- COODCM® Oint-lO

oo <o co in in lo c- tf- oo lo cn h tn in ud tf- <n in cn O in ud o- in

ΙΟ η LO H tf- HH io H 'tf HH LO H

OD H 00 cn LO LO CO H OCMOH H CO OD 00 CUUDCOO 00 LO H oo cm cu io co co c- co c- tf-oo oo co lo cn cn in h O tf· ud co ud co tf- co io co in tf· n c- tf- comcno in tn io tf· cniocno tf· ud c- tn

UD i—l UD H tf" H i—i UD H tf* I—l i—! UD H

Η Η Η <~I Η H

0X20 0X20 0X20 0X20 0X20 O X 3.0

CN CN H CN H CN

h m 'tfco Ho H co ^ cn Hco * i tf· * 1 n- .· I co .« i lo * I o ‘ i t-

Wn- u) i o W qo ulf^ l»J ►«_ λ: λ: ,¾ ^ ^ μ -

Μ Η Η Η Κ W

^ ο, —> ι

Η 2 Η -— Ο —·- I

ι—i I Ο Η 2 Ο ΗΟ Η - - Η • οη| ΟΟ 2 Ο I -—· Ο Η 2 >»ε 2 1 s gAH g ο ΟΗ κ ο ΐο ^[012 ε g μ cm ο oj ^2 Ί= >~>2

CMC" CM I —'X CMle CM X PS

— Q> CM ·—' 1 ·—· O-—· — CM — O CM c

JO·—· CHlH UH X CM H CD-- — .OCM

H IQI O > <d O O - HtfH H"

H >,X H T 2 8^2 w IW 3\0 ,, DnCVJ

hxh hh1 6ub M x—- o eg Hc — . pfc .2 *co Hx $oqe mqj

0(1)0 o I CM · X CM ‘.IX .X .XX

Ή2Η y O X X OS X Ο Λ0, 2 P I X Pool «2 CM Ή X 2 H *4 I '2

fetf-u feo— g CM — go° &CM — gtfO

bO I

u >.

< H

I Ο I Η I H

>> 1 >, l O H O

Η Η H OX (D IX

Ο Π3 a O I > H H · I > I I tf to >.< Η I Η Λ2 0X02 cO O jj Λ (o* ftjj cj CM U 2 t> CD v t>H V I w I · ί>> t

I I H 3 I Ο I bOg { I'-tf p hO

° A0,0 OX CMC.T3 ΌΙ2 3 Jj o l.olx ο o cm x < ο \/ a, x) <

I N/ · S I · Ο I Lj II HI

ΛΗ I < o. < I ί>> n, CMbi! >> >,

lOO (b| 2 X H g1 S in ΰ H

vx 2 α§ να so® cd<c oci

I · I I h 11 I I H '1 XI

OOtf o hO,_i 2bO OHh s>> XH

X 2 X Cl m CMC| x (D A) CM-I 1 cD

ο a ocg x c o > g x o tf- > ·» in ld r» co cn η co co co co ro 38 1492,5 t- σ» η oo σ» σ» σ» ο σ> σ> ~ “ ~ - Ο Ο Η Ο Ο ·· ·· ·· ·· ω" too mo ωο ωο

ί*ο GO IUO

C Ο <4 ~ <4 - <0 ~ <0 - • - Λ - - I—| - ι—1 · · ι-I --1-1 ί>*Η ί>» r·» r5"» ι—| Η ·· I-I - !-i * · rH -· ο ·· Ο Ο Ο Ο .. cvj ·* ο ·· σ» ·· αο ..oo 1—4 ο ι—i ο ι—i σ» η cn η φ erf·- «5 - erf - erf - cfl - > Η > rH > Ο >0 >0

H CM CO CO CO CO C— CO ·Φ HlO H1 H 0» CO C— ΙΟ σ» m CM

t- CO If) 00 CO CD CO aj- in in CM tf) 00 00 CVJ in O CO H

00 IT) f- CO f- LCO C- If) rH If) CO tf) CVJ tf) CD CO COCOCOCD

ι-H -Φ rH If) rH ·ί" rH 'd'rH

o co oo if> co to σ> co 14- in co co oih-hh co co m co to co oo *4- to to co m Hint-f-H wooh wntno oo in ¢- in t- m t- in rimtoin cm m o co co to cn co

-tf· rH -d" rH If) rH -d" CM ·4" H

rH rH rH rH rH

OKgo oaao oaao 0120 oxao

CM CM CN CN CM

rH Η Η H rH

in r-π co m ct

10 I O to 1 'if* m 1 00 mlin IfllrH

* 00 μ CO £ t> * t- H H fa H ^ W ^

rH i-H rH

—, -—- O -— I O — .0 rH rH I S ι—i ι—I Η I S Η I 2

Ο Ο η 5 0 2 OHE O-r1 E

S S Sr S to *2* 1=¾

g XJ g gCM B CtJ c d CM E G CM

•rH o *“ 0) ·Η Ο “ o -

CM d— CM mOJ CM rH Ci-— CM Cm CM CM Cw CM

·—* O rH —· rH'—' -—· IB OH ’ -'rH·—* ·—Ή-—' HO 3 Si Η 0 3 3

H J3 2 Η0)·3 H m Ό HWO

H O S HcJ-iH H .G Ο E HC-rH H G H

H 0 U ftH erf G erf G

o* >»CM 0NO *iD>»CM „·£ O S Λ O

S 0) - ΉβΗ -SaC “ -«PH -8-PH

ο ocm g ο -O n t ocm g Q)x; qux:

fa £- -— h a C fa CM Ch —· fa S O fa O

i

rH

< I >>H I I

S Η G O H H

ft (rf OK erf erf I > «Η · > >

faO I rH Η <4 1 I H

G HU 3d H HO

< >iffi to ft >,a: I g · Cl G G · >» 0 <1 CD bO o< O <

Η ΜΗ Z H G ChS 'US

C3 H ft erf-a; H ft H ft

I 3 1 Si I 3 ι 3 I

Η W6» P >> tobfl 10 hf·

erf CM .G H G G C G

> <0 »< ftC5 erf << erf <4

I N ι Crf 1 3 I Si I

ΜΗ Π >i - a H -P >-> P >,

OO ®H I erf ω H WH

E-·a ffl cs <a.> go o Ο H CM CO af •a· -a* ^ 39 1^9215

Nedenfor anvendes udtrykket "substrat" for "tri- eller tetrapep-tid".

Substraterne ifølge opfindelsen, f.eks. det ifølge eksempel 1 vundne substrat, nemlig Na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA.HC1, kan som nævnt anvendes til bestemmelse af forskellige enzymer i blodplasma. Bestemmelsen foretages efter det princip, at det ved den enzymatiske hydrolyse af 2 substratet dannede spaltningsprodukt (R H) har et UV-spektrum, der er forskelligt fra substratets og er forskudt mod højere bølgelængder. Således har substratet ifølge eksempel 1, dvs. Na-Bz-Val-Gly-Arg-p.NA.HCl, et absorptionsmaksimum ved 302 nm og en molær ekstinktionskoefficient, på 12950. Absorptionen af substratet er praktisk taget nul ved 405 nm. p-Nitroanilin, det ved den enzymatiske hydrolyse af substratet dannede spaltningsprodukt 2 (R H), udviser et absorptionsmaksimum ved 380 nm og en molær ekstinktionskoefficient på 13200. Ved 405 nm synker ekstinktionskoefficienten kun lidt, nemlig til 9650.

Ved spektrofotometrisk måling ved 405 nm kan graden af den enzymatiske hydrolyse af substratet let bestemmes, idet den er proportional med mængden af fraspaltet p-nitroanilin. Det i overskud tilstedeværende substrat forstyrrer således ikke målingen ved 405 nm. Forholdene er praktisk taget identiske for andre substrater ifølge opfindelsen, der som chromogen gruppe indeholder en p-nitroanilino-gruppe. Den spektrofotometriske måling udføres derfor i alle disse tilfælde ved 405 nm.

Den enzymatiske hydrolysereaktion kan udtrykkes skematisk på følgende måde: kl k3 E + S --> ES -> ES' + Chromophor P.

<- i l k2 I k4 E + P2 149215 40 E = enzym S = substrat E^> = enzym-substrat-complex P1 P2 = Pr°dukter k^, k.2/ kg og = hastighedskonstanter dissociationskonstant for ES = = K (Michaelis-konstant) v m K1 Når [S]» [E] og k^kg, gælder: ([E] - [ES]) * [S]

Km--(1) [ES]

Den hastighed, ved hvilken P^ dannes, er: v = kg ’ [ES] k, · [E] * [S] v = —- (2)

Km + [S] Når E er fuldstændig bundet til S, gælder: [ES] = [E] og v = vmax = k3 ‘ [E] (3)

Lineweaver-Burk-ligning: , K , 1 i = -JL— . _A_ + - (4) 41 149215

Af ligning (2) fremgår det, at konstanterne Km og k^ bestemmer substratets aktivitet for et givet enzym. Til bestemmelse af disse konstanter anvendes følgende metode:

Enzymet og substratet blandes i en pufferopløsning, og hydrolysereaktionen følges i 2 - 30 minutter. Substratets koncentration IS] varieres, medens enzymkoncentrationen holdes konstant. Når ekstinktionen (OD = optisk tæthed) optegnes i et koordinatsystem som funktion af tiden, fås en kurve, hvis tangent i nulpunktet svarer til det ideelle forløb af hydrolysen. Ved hjælp af denne tangent kan hydrolysebegyndelseshastigheden bestemmes.

1 1 Når v optegnes som funktion af - , fås et Lineweaver-Burk-diagram [S] (jfr."Kurzes Lehrbuch der Biochemie" af P. Karlson, Georg Thieme--Verlag, Stuttgart, 1967, side 70), ud fra hvilket v og K kan lliCtA All bestemmes grafisk, v K og k- = - bestemmes som angivet nedenfor under anvendelse af et m 3 [E] substrat ifølge opfindelsen, f.eks. Na-Bz-Val-Gly-Arg-pNA.HCl (substrat I ifølge eksempel 1), for urokinase og trypsin. Resultaterne er sammenfattet i nedenstående tabel I.

Tabel I

Urokinase-aktivitet målt ved hjælp af et tripeptidderivat ifølge opfindelsen son substrat.

Substrat Km (mol/liter) vmax(/Umol/minut) N-Bz-Val-

PNaThCi" 6,06 x 10"5 7,27 x 10-5 pr. 1 CTA

Trypsin-aktivitet målt ved hjælp af et tripeptidderivat ifølge opfindelsen scm substrat.

H-D-Val- I

pNA~2HCl I 1^83 x 10“5 4'17 x 10"3 Pr* 1 42 149215

En NF-enhed trypsin er den mængde enzym, som bevirker en absorptionsændring AOD på 0,003 pr. minut, målt på benzoyl-L-ar-ginin-ethylester under normale betingelser (jfr. "The National Formulary XII", udgivet af "The American Pharmaceutical Association", Washington D.C., 1965, side 417 og 418).

En CTA-enhed er den mængde urokinase, som af N-acetyl-L-lysin- _3 -methylester frigør 46,2 x 10 ^,umol methanol på 1 time ved 37°C (jfr. N.U. Bang et al., "Thrombosis and Bleeding Disorders",

Georg Thieme Verlag, 1971, side 377).

De ved hjælp af andre substrater ifølge opfindelsen for urokinase og trypsin beregnede værdier af Km og vmax er af samme størrelsesorden. Af de konstaterede Km~værdier fremgår det, at substraterne ifølge opfindelsen har særlig høj følsomhed over for urokinase og trypsin. Som sammenligningsværdier anvendes ^-værdierne fra acetyl-L-lysin-methylester for urokinase og fra benzoyl-L-arginin-ethylester for trypsin. Disse K^-værdier ligger ca. en tierpotens højere end de tilsvarende værdier for tri- og tetrapep- "4 tidderivaterne ifølge opfindelsen og andrager ca. 10 mol/liter, hvilket svarer til en følsomhed på ca. en tiendedel.

Til bestemmelse af de i tabel I anførte kinetiske konstanter K

m og vmax fremstilles vandige fortyndingsrækker af substraterne med koncentrationer på 0,1 - 2^,umol/ml. I en målecuvette optages 2 ml tris-imidazol-puffer med pH-værdi 8,4 og ionstyrke 0,30 ved 37°C, hvorefter der først tilsættes 0,25 ml af en vandig urokinaseopløs-ning med en koncentration på 400 CTA/ml. Blandingen forinkuberes i 1 minut ved 37°C. Den forinkuberede blanding tilsættes derefter 0,25 ml substratopløsning. Forløbet af den enzymatiske hydrolyse af substratet følges for de forskellige substratkoncentrationer ved hjælp af et fotometer i 10 minutter ved 405 nm. Værdien af den pr. minut dannede mængde p-nitroanilin er et mål for hydrolysehastigheden for en given substratkoncentration. I et koordinatsystem optegnes som abscisse den reciprokke værdi af substratkoncentrationerne, som ordinat den tilhørende reciprokke værdi af hydrolysehastigheden.

I dette såkaldte Lineweaver-Burk-diagram fås for de i tabel I an- 149215 43 førte substrater lige kurver, hvilket er et bevis for, at den af urokinase forårsagede hydrolyse af substratet følger Michaelis-Men-ten's lov, hvorfor substraterne er ideelle til bestemmelse af urokinase. Ud fra kurvernes skæringspunkter med abscissen og ordinanten bestemmes de i tabel I anførte kinetiske konstanter K og v m 3 max På analog måde bestemmes de tilsvarende K^- og v^^-værdier for trypsin.

Tabel II

Urokinase-aktivitet, målt ved hjælp af substraterne ifølge opfindelsen ved konstant substrat- og urokinasekoncentration, ved 37°C, pH-værdi 8,4 og ionstyrke 0,3.

Substrat Mængde af det af 100 CTA-enheder urokinase i 1 minut dannede spaltningsprodukt ΙΓΗ i nanomol

I 3,64 pNA

II 0,92 pNA

III 3,21 pNA

IV 1,00 pNA

V 2,82 pNA

VI 2,91 pNA

VII 1,73 pNA

VIII 1,32 pNA

IX 1,13 pNA

X 1,50 pNA

XI 1,33 pNA

XII 3,56 pNA

XIII 1,78 pNA

XIV 1,05 pNA

XV 1,12 pNA

XVI 2,41 2NA

XVII 2,19 4-MeO-2NA

XVIII 0,88 pNA

XIV 0,41 pNA

XX 0,29 pNA

XXI 0,75 pNA

44 149215

Tabel II fortsat

XXII 1,75 pNA

XXIII 1,66 pNA

XXIV 1,40 pNA

XXVI 2,93 pNA

XXVIII 2,48 pNA

XXIX 3,58 pNA

XXXI 1,64 pNA

XXXIII 2,22 pNA

XXXIV 3,39 pNA

XXXVI 2,11 pNA

XXXVIII 2,67 pNA

XXXIX 2,01 pNA

XL 2,59 pNA

XLI 2,71 pNA

XLII 2,48 pNA

XuIII 2,89 pNA

XLV 3,01 pNA

Tegningen viser en grafisk afbildning, hvor ændringen af den optiske tæthed /S^ OD, der er fremkaldt ved den hydrolytiske indvirkning af forskellige mængder urokinase på substrat I i løbet af 10 minutter, er optegnet som funktion af urokina-semængden i et koordinatsystem. Af denne figur fremgår det, at urokinasekoncentrationen kan bestemmes nøjagtigt i området mellem 1 og 10 CTA/ml. Ved bestemmelse af urokinase-indholdet i urin fra 14 sunde forsøgspersoner er der fundet værdier på ca. 8 CTA-enheder/ ml urin.

Bestemmelsen af urokinase i urin er særlig vigtig, da det herved, som ovenfor anført, er muligt at konstatere patologiske tilstande forholdsvis simpelt og hurtigt. Den tidligere, oftest anvendte metode til bestemmelse af urokinase i urin er den såkaldte fibrinplademetode [I. Bjerrehuus, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 4., 179 (1952); F.E. Smyrniotis et al., Thromb. Diath. et Haemorrh. Bd.

III, 258 (1959)], der udføres på følgende måde: Efter Mullertz' metode [Acta physiol. Scand. 2jS, 174 (1954)] fremstilles fibrin-plader (fibrinogenindhold: 0,2%). Til hver urokinasebestemmelse anvendes en fibrinplade og 30 lambdadråber (lambdadråbepipette) af ufortyndet, 1:2 og 1:4 fortyndet urin (når urokinasekoncentrationen 45

14921S

er meget høj, kan fortyndingsfaktoren fordobles). Pladerne inkuberes i 16 timer ved 30°C. De lyserede zoner gøres synlige ved tilsætning af en dråbe kongorødt (0,1%'s). Produktet af to vinkelret på hinanden stående diametre (de lyserede zoner) tjener som mål for de lyserede zoner· Urokinasekoncentrationen (enheder/ml) bestemmes ved hjælp af en sammenligningskurve, der er opstillet ved anvendelse af en fortyndingsrække med standard-urokinase.

Ved denne metode bestemmes urokinasekoncentrationen ikke direkte, men via den ud fra plasminogen med urokinase dannede plasminmængde. Denne via en række reaktioner foretagne bestemmelse af slutprodukterne er behæftet med mange fejlkilder, yderligere tungtvejende ulemper ved denne metode ligger i, at inkubationstiden er meget lang, og at der til hver bestemmelse skal opstilles en justérkurve. Vurderingen af resultaterne er endvidere forholdsvis kompliceret og på grund af justérkurvens ikke-linearitet unøjagtig.

Ved hjælp af substraterne ifølge opfindelsen kan den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetodes ulemper let overvindes, da målingen af urokinasekoncentrationen foretages direkte, og måleresultatet ikke forfalskes af bireaktioner. Endvidere er måleresultaterne tilgængelige allerede efter 10 minutters forløb, hvilket er særlig vigtigt for den kliniske diagnostik.

Når plasminogen-aktivatorer skal bestemmes i blodplasma eller urin, f.eks. når urokinase skal bestemmes i urin, er det ofte hensigtsmæssigt at udføre bestemmelsen i en pufferopløsning, som indeholder apro-tinin og/eller hirudin, da disse ikke virker hæmmende på plasminogen--aktivatorerne, men hæmmer andre, eventuelt tilstedeværende aktiverede plasmaenzymer, f.eks. thrombin, plasmin og plasma-kaliikrein, som under visse omstændigheder kan virke forstyrrende på bestemmelsen af plasminogen-aktivatorerne. Man kan f.eks. anvende en tris-imida-zol- eller glycin-puffer med en pH-værdi på 8,2 - 8,6 og en ionstyrke på 0,15 - 1,0, til hvilken der er sat 0,02 - 0,2 tryp-sin-inhibitor-enheder aprotinin og/eller 0,001 - 10 antithrombin-en-heder hirudin/ml.

149215 46 Når man vil bestemme inhibitorspejlet i legemsvæsker eller vævsekstrakter, som indeholder inhibitorer for urokinase, sætter man til legemsvæskerne eller vævsekstrakterne et afmålt overskud af urokinase, inkuberer blandingen i nogle minutter og bestemmer den resterende ikke-inhiberede urokinaseaktivitet ved tilsætning af substratet og måling af mængden af spaltningsproduktet. Af differencen mellem den anvendte urokinasemængde og den resterende ikke--inhiberede mængde urokinase beregnes den oprindeligt tilstedeværende inhibitormængde.

Det har endvidere som nævnt vist sig, at substraterne ifølge opfindelsen på grund af deres særlige konformation også er meget følsomme over for trypsin og kan spaltes katalytisk af trypsin med uventet høje hastigheder. De hidtil ukendte substrater er derfor særligt velegnede til bestemmelse af trypsin i duodenalsaft og i blod ved akut pancreatitis, hvor trypsin er kommet ud i blodbanen, men dog kun optræder i meget lav koncentration på grund af det høje blodvolumen. De tidligere til bestemmelse af trypsin anvendte kendte substrater er alt for ufølsomme til bestemmelse af sådanne lave koncentrationer.

Bestemmelsen af trypsin i duodenalsaft kan f.eks. udføres på følgende måde: I en målecuvette optages 1,79 ml tris-imidazol-puffer med en pH-værdi på 8,4 og en ionstyrke på 0,30 ved 37°C, og der i- blandes 0,01 ml duodenalsaft. Herefter blandes blandingen hurtigt -3 med 0,2 ml af en 2 x 10 M opløsning af et substrat ifølge opfindelsen. Man bestemmer den af trypsinet fra substratet i reaktions-blandingen frigjorte mængde p-nitroanilin, idet man måler ændringen af den optiske tæthed AOD/minut ved en bølgelængde på 405 nm. Mængden af det pr. minut frigjorte p-nitroanilin eller tilsvarende ændringen i den optiske tæthed er proportional med trypsinaktivi-teten. Ved anvendelse af det ifølge eksempel 10 fremstillede substrat, Na-Cbo-cyclohexylglycyl-Gly-Arg-pNA.HCl, kan man f.eks. bestemme trypsinmængder ned til under 0,01 NF-enheder trypsin/ml i prøven.

I den nedenstående tabel III er angivet den ved hjælp af substraterne ifølge opfindelsen ved konstant substratkoncentration og enzymkoncentration målte aktivitet af kvægtrypsin.

Tabel III

149215 47

Aktivitet af kvægtrypsin, målt ved hjælp af substraterne ifølge opfindelsen ved konstant substrat- og enzymkoncentration. Til sammenligning er angivet de tilsvarende med Na-Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl og Na-Bz-DL-Arg-pNA.HCl opnåede værdier.

Substratkoncentration Mængde af det pr. minut af 1 NF--4 2 x 10 M -enhed trypsin fra substraterne enzymatisk frigjort spaltningsprodukt R% i nanomol

Na-Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl 8,4 pNA

N^-Bz-DL-Arg-pNA.HC1 0,45 pNA

I 20,9 pNA

II 10,8 pNA

III 28,5 pNA

IV 19,2 pNA

V 15,9 pNA

VI 19,1 pNA

VII 25,7 pNA

VIII 14,2 pNA

IX 17,5 pNA

X 46,7 pNA

XI 20,0 pNA

XII 37,9 pNA

XIII 28,8 pNA

XIV 41,9 pNA

XV 41,3 pNA

XVI 16,4 2NA

XVII 16,8 4-MeO-2NA

XVIII 24,5 pNA

XIX 33,9 pNA

XX 28,1 pNA

XXI 35,6 pNA

48 149215 T.abel III fortsat

XXII 19,9 pNA

XXIII 24,1 pNA

XXIV 12,4 pNA

XXVI 19,9 pNA

XXVIII 15,8 pNA

XXIX 21,6 pNA

XXXI 15,0 pNA

XXXIII 19,1 pNA

XXXIV 22,4 pNA

XXXVI 18,5 pNA

XXXVIII 14,0 pNA

XXXIX 22,9 pNA

XL 25,4 pNA

XLI 24,8 pNA

XLII 22,0 pNA

XLIII 29,1 pNA

XLIV 31,2 pNA

De i tabel III angivne resultater er opnået under følgende reaktionsbetingelser: I en cuvette blandes 1,7 ml tris-imidazol-puffer med en pH-værdi på 8,4 og en ionstyrke på 0,30 ved 37°C med 0,1 ml af en vandig trypsinopløsning med en koncentration på 2 NF-enheder/ -3 ml. Til blandingen sættes 0,2 ml af en 2 x 10 M opløsning af det substrat, der skal afprøves. Derefter bestemmes den af trypsin fra substratet frigjorte p-nitroanilinmængde, idet ændringen af den optiske tæthed /\ OD/minut måles ved en bølgelængde på 405 nm.

Til bestemmelse af inhibitorer for plasminogen-aktivatorer, f.eks. af urokinaseinhibitorer, gås der f.eks. frem på den måde, at en afmålt mængde urokinase inkuberes med en urokinaseinhibitorholdig legemsvæske i nærværelse eller fraværelse af et puffersystem, den inkuberede blanding fortyndes med tris-imidazol-puffer til et rum- -3 fang på 1,8 ml, og den fortyndede blanding tilsættes 0,2 ml 2 x 10 M opløsning af et substrat ifølge opfindelsen. Ved måling af ændringen af den optiske tæthed/minut bestemmes den ikke-hæmmede uroki-naseaktivitet. Forskellen mellem den anvendte urokinasemængde og den resterende urokinaseaktivitet er et mål for den tilstedeværende inhibitormængde. Efter samme metode kan trypsininhibitorer bestem mes.

Claims

1. Tri- eller tetrapeptider eller salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrat til kvantitativ bestemmelse af plasminogen-aktivatorer, inhibitorer for disse og plasminogen-præaktivatorer samt trypsin, trypsin-inhibitorer og trypsinogen i legemsvæsker hos mennesker og pattedyr og i vævsekstrakter, kendetegnet ved, at de har den almene formel R1-NH-CH(R3)-CO-Y-Arg-R4 hvor R1 betegner hydrogen, en eventuelt i «-stilling med amino substitueret alkanoylgruppe med 2-18 carbonatomer, en phenylalkanoylgruppe, hvis alkanoyidel indeholder 2-6 carbonatomer, og hvis phenyldel eventuelt er substitueret med en aminogruppe, en eventuelt med amino eller aminomethyl substitueret cyclohexylcarbonylgruppe, en eventuelt med methyl, amino eller aminomethyl substitueret benzoylgruppe, en benzyioxycarbonylgruppe eller en methyl-, ethyl-, phenyl-, methylphenyl- eller naphthylsulfonylgruppe, R3 betegner en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en cyclohexyl- eller cyclohexylmethylgruppe, Y betegner en glycyl-eller serylgruppe, og R2 betegner en p-nitrophenylamino-, 2-naphthylamino-eller 4-methoxy-2-naphthylaminogruppe.