CH634993A5 - Process for the preparation of an agent for the prophylaxis and therapy of gastroenteritis - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immunologischen, oral applizierbaren Mittels zur Prophylaxe und Therapie der Gastro-Enteritis, insbesondere der infantilen Gastro-Enteritis, des Menschen.

Infantile Gastro-Enteritiden (Diarrhoen) des Menschen und bei Tieren sind schon immer ein schwerwiegendes Problem gewesen. Seit vielen Jahren wurde bisher vergeblich nach einem wirksamen Prophylaktikum und Therapeutikum gesucht.

1969 konnte bei Kälbern das für einen grossen Teil der Diarrhoen dieser Tiere ursächliche Agens, das Nebraska Kälber Diarrhoe Virus (NCDV), isoliert werden. 1975 wurde ebenfalls bekannt, dass die Kälber-Diarrhoe mit Kolostrum ursprünglich immuner Tiere gegen das NCDV und gegen antigenetisch wie morphologisch nicht unterscheidbare Viren verhindert werden konnte. Seit 1973 wurde in vielen Fällen der menschlichen infantilen Gastro-Enteritis ein Virus (Rotavirus) aus dem Stuhl erkrankter Kinder isoliert. Ob das isolierte Virus als Erreger der infantilen Gastro-Enteritis in Frage kommt, ist jedoch nicht bekannt.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, dass aus dem Kolostrum und/oder der Milch immunisierter Wiederkäuer erhältliche, oral applizierte Antikörper gegen Rotavirus und/ oder NCDV einen Schutz vor einer durch Rotavirus experimentell herbeigeführten Gastro-Enteritis bei Primaten bewirken. Das klinische Erscheinungsbild bei den Primaten ist sehr ähnlich den bei Menschen bekannten Gastro-Enteritiden, bei denen bislang kein infektiöses Agens gefunden werden konnte, insbesondere deijenigen, die als Winterdiarrhoe bezeichnet wird.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und Therapie der Gastro-Enteritis bei Primaten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Wiederkäuer mit Nebraska Kälber Diarrhoe Virus (NCDV) und/oder gegen serologisch verwandte Viren, im folgenden Rotavirus genannt, immunisiert und die Antikörper isoliert.

Bevorzugt werden sekretorische Antikörper der Klasse IgA, IgG und IgM. Von derartigen Antikörpern ist bekannt, dass sie als sekretorische Antikörper eine gegenüber Serum-Antikörpern längere Halbwertzeit im Darm besitzen. Solche Antikörper kommen in grösseren Mengen im Kolostrum oder Milch, femer im Darmsaft und im Speichel vor. Sie können beispielsweise aus der Milch von mit NCDV und/ oder serologisch verwandten Viren (Rotavirus) immunisierten Wiederkäuern gewonnen werden.

Antikörper können auch auf die übliche Weise durch Immunisieren von Tieren und Gewinnung von deren Seren erhalten werden.

Die in der Literatur in Verbindung mit der infantilen Gastro-Enteritis beschriebenen Viren mit den unterschiedlichen Bezeichnungen, wie Rotavirus, Orbivirus, Reo-virusähnlich, Duovirus, scheinen nach heutigem Wissen nur Synonyma eines Erregers zu sein. Möglicherweise sind sie jedoch nicht identisch und stellen nur Verwandte innerhalb einer Gruppe dar, die wir mit Rotavirus bezeichnen. Da dieser oder diese Erreger noch nicht klassifiziert sind, kann sich die Nomenklatur ändern. Antigenetisch verwandte Viren, deren Verwandtschaft noch nicht restlos geklärt ist, können in gleicher oder sehr ähnlicher Weise als Antigen dienen.

Antigengewinnung Rotavirus wird aus dem Stuhl erkrankter Kinder in der von Melnick und Wenner in Diagnostic Procédures for Viral and Rickettsial Infections, 4. Auflage, Seite 561, New York, 1969, beschriebenen Weise durch nieder- und hochtourige Zentrifugation gewonnen. Das NCDV wird in Gewebekulturen aus primären, embryonalen oder postpartalen Rindernierenzellen oder in Zellen einer permanenten Schweinenie-renzellinie (PK 15) vermehrt. Nach optimaler Vermehrung des Virus in diesen Zellen wird der infektiöse Kulturüberstand, Titer ca. IO6 - 107 ID50/ml, geerntet und dient als Ausgangsmaterial für die Immunisierung.

Zur Herstellung des inaktivierten Antigens erfolgt eine Konzentrierung der Viren mittels Ultrazentrifugation (Pelletieren bei ca. 100 000 x g) oder Ultrafiltration um den Faktor 5-1000, vorzugsweise 10-100. Die Inaktivierung kann mit Formaldehyd nach Lauffer Biochemistry of Viru-ses Pergamon Press, Oxford 1958, oder nach LoGrippo, Ann. N.Y. Acad. Sei. 83 (1960) mit Beta-Propiolacton durchgeführt werden. Andere Inaktivierungsverfahren, z. B. nach Witkor et al. Appln. Microbiol. 23 (1972), sind möglich.

Immunisierungsverfahren Weibliche Wiederkäuer werden während ihrer Trockenperiode mit einer wirksamen Dosis von IO4 bis 1010, vorzugsweise IO7 bis 108, infektiösen Dosen so (ID50) ca. 8 Wochen vor der Geburt der Frucht oral mit vermehrungsfähigem NCDV oder Rotavirus infiziert. 4 Wochen und 1 Woche vor der Geburt werden vermehrungsfähige und/oder in oben beschriebener Weise inaktivierte NCDV oder Rotavi-ren ohne oder mit Adjuvans beispielsweise in folgender Weise zum gleichen Zeitpunkt verabreicht:

Jeweils etwa 5-50 ml, vorzugsweise etwa 10 ml, vermehrungsfähiges (Titer IO4- 1010 ID 50/nil) oder inaktiviertes Antigen werden subkutan in das Lymphdrainagesystem des gesamten Euters injiziert.

Jeweils etwa 50 bis 200 ml, vorzugsweise etwa 100 ml, der gleichen Präparationen werden in jedes Euterviertel bzw.

jede Euterhälfte durch den Zitzenkanal instilliert.

Jeweils etwa 2 bis 10 ml, vorzugsweise etwa 5 ml der gleichen Antigene werden intramuskulär injiziert.

Während der Laktationsperiode werden im Abstand von mehreren, vorzugsweise etwa 4 Wochen in jedes Euterviertel bzw. jede Euterhälfte etwa 50 bis 200 ml, vorzugsweise etwa 100 ml, NCDV oder Ratovirus der oben beschriebenen Präparation durch den Zitzenkanal instilliert. Ausserdem werden im Abstand von mehreren, vorzugsweise etwa 12 Wochen etwa 5-50 ml, vorzugsweise etwa 10 ml des NCDV oder Rotavirus der gleichen Präparation intramuskulär injiziert.

Andere Immunisierungsverfahren sind möglich, z.B.

nach Pasieka et al. Can. J. Microbiol. 21:655 (1975) oder nach Watson et al. Res. Vet. Sei. 18:182 (1975).

Auch Antigenmischungen sind einsetzbar.

Gewinnung der antikörperhaltigen Gamma-Globulin-Frak-

tion aus Kolostrum und Milch der immunisierten Wiederkäuer

Die vom Tag der Geburt an gewonnene Milch (Kolostrum) wird entfettet und decaseiniert in der von Knop et al.

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Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 49:405 (1971) beschriebenen Weise.

Die Gamma-Globuline werden z. B. in der von Pasieka et al. Can. J. Microbiol. 21: 655 (1975) beschriebenen Weise durch Ammonsulfatfällung aus der Molke isoliert. Sie werden weiter durch chromatographische Methoden, z.B. nach Knop et al. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 49:405 (1971) und Knop et al. J. Infect. Dis. 130: 368 (1974) gereinigt. Alternativ können z.B. auch die von Hammer et al. Eur. J. Bio-chem. 6:443 (1968) und Pasieka et al. Can. J. Microbiol. 21: 655 (1975) beschriebenen Methoden eingesetzt werden. Anschliessend wird sterilfiltriert und auf Freisein von vermehrungsfähigen Erregern geprüft.

Derartige Antikörper gegen NCDV, Rotavirus oder deren serologische Verwandte enthaltende Gamma-Globulin-Fraktionen können zur Prophylaxe und Therapie der infantilen Gastro-Enteritis verwendet werden.

Es ist besonders vorteilhaft, das erfindungsgemäss erhaltene Mittel oral zu applizieren und im Gastro-Intestinaltrakt wirksam werden zu lassen. Die Dosierung sollte in Abhängigkeit von der Höhe des virusneutralisierenden Titers vorgenommen werden. Bei mittleren virusneutralisierenden Titern von 1:500 werden ca. 0,1-10 g, vorzugsweise 0,5-5 g, antikörperhaltige Proteinpräparationen pro Dosis verabreicht. In der Regel entspricht dies 1 -100 ml bzw. 5-50 ml einer Antikörperlösung.

Der Gamma-Globulin Präparation können magensaftneutralisierende Substanzen wie Natriumbikarbonat, Magnesiumkarbonat, oder Trägersubstanzen, wie Aluminiumhydroxyd und Proteinstabilisatoren, wie Aminosäuren oder Peptide, z.B. Glycin in arzneimittelüblicher Weise zugesetzt werden. Die galenische Zubereitung erfolgt in der für oral applizierbare, im Gastrointestinaltrakt wirksame Arzneimittel bekannten Weise.

Die Präparation kann monospezifisch angewendet werden oder zusammen in einem Gemisch mit Antikörpern gegen andere mikrobielle wie bakterielle oder andere virale Gastro-Enteritis-Erreger.

Aktivitätsbestimmung der Antikörper-Präparation

Die antivirale Aktivität wird im Virus-Neutralisations-

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test bestimmt. Es hat sich als günstig erwiesen, die Präparation auf einen virusneutralisierenden Titer von etwa 1:100 bis 1:1000, beispielsweise auf 1:320/ml, einzustellen.

5 Beispiel 1

Fünf durch Kaiserschnitt gewonnene, mutterlos gehaltene Affen der Gattung Macaca werden mit 1000ID50 Rotavirus infiziert. 1 Stunde später wurden 10 ml der oben beschriebenen Antikörper-Präparation mit einer antiviralen io Aktivität 1:320/ml mit Hilfe einer Spritze ohne Kanüle oral appliziert. Eine Kontrollgruppe von 5 Affen erhielt eine in gleicher Weise gewonnene Immunglobulin-Präparation nichtimmunisierter Wiederkäuer (Kontrollglobulin). Die mit Kontrollglobulin behandelten Affen erkrankten alle an i5 Diarrhoe, während von den mit spezifischem Immunglobulin behandelten Tieren keines erkrankte.

Beispiel 2

Eine in gleicher Weise gehaltene Gruppe von 5 Affen er-20 hielt 2 Stunden vor der Infektion mit 1000ID50 Rotavirus je Tier 10 ml der oben beschriebenen Antikörper-Präparation. Die zugehörige Kontrollgruppe von 5 Tieren erhielt zu diesem Zeitpunkt 10 ml Kontrollglobulin. Während alle Tiere, welche Kontrollglobulin erhalten hatten, an Diarrhoe er-25 krankten, zeigten alle Tiere, welche mit spezifischem Immunglobulin behandelt waren, keine Symptome einer Erkrankung.

Beispiel 3

30 10 Tiere wurden mit 1000ID 5 0 Rotavirus infiziert. Nach Ausbruch der Erkrankung wurden 5 Tiere mit je 10 ml spezifischem Immunglobulin Titer 1:320/ml oral behandelt. 5 Tiere erhielten zu diesem Zeitpunkt je 10 ml Kontrollglobulin.

35 Alle mit Kontrollglobulin behandelten Tiere erkrankten schwer. Von den mit spezifischem Immunglobulin behandelten Tieren waren 3 Tiere innerhalb von 24 Stunden frei von Symptomen, 1 Tier zeigte einen stark abgekürzten und mitigierten Krankheitsverlauf. Bei einem Tier konnte ebenso wie 40 in der Kontrollgruppe der Krankheitsverlauf nicht beein-fiusst werden.

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Claims (2)

634 993 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und Therapie der Gastro-Enteritis bei Primaten, dadurch gekennzeichnet, dass man Wiederkäuer mit Nebraska Kälber Diarrhoe Virus und/oder serologisch verwandten Viren immunisiert und die Antikörper isoliert.

2. Verahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antikörper aus der Milch der Wiederkäuer gewinnt.