NO771289L - Middel til profylaks og terapi av gastro-enteritis - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et immunologisk, oralt appliserbart middel til profylaks og terapi av gastro-enteritis, spesielt infantil gastro-enteritis hos mennesker.

Infantile gastro-enteriter (diareer) hos mennesker

og dyr har alltid vært et tungtveiende problem. I mange år har det forgjeves blitt søkt etter et virksomt profylaktikum og terapeutikum.

- I 1969 kunne det hos kalver isolere det for en

stor del av diareen hos disse dyr bevirkende stoff Nabraska kalvdiaré-virus (NCDV). I 1975 ble det likeledes kjent at kalv-diare kunne det med Kolostrum opprinnelige immune dyr hindres mot NCDV og mot antigenisk som morfologisk ikke ad-skillbare virer.

Siden 1973 ble det i mange tilfeller av menneskelig infantil gastro-enteritis isolert en virus (Rotavirus) fra av-føringen av syke barn. Om den isolerte virus kommer på tale som frembringer fra infantil gastro-enteritis, er imidlertid ikke kjent.

Overraskende er det nå funnet at fra Kolostrum og/ eller melken fra immuniserte drøvtyggere oppnåelige, oralt appli-serte antilegemer mot Rotavirus og/eller NCDV bevirker en be-skyttelse for en ved Rotavirus eksperimentelt tilveiebragt gastro-enteritis hos primater. Det kliniske bilde ved.primater er meget likt det hos mennesker av kjente gastro-enteritider, hvor det hittil ikke kunne finnes noen infektiøse stoffer, spesielt de som betegnes som vinterdiare.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig et immunologt, oralt appliserbart legemiddel til profylaks og terapi av den infantile gastro-enteritis hos primater, idet midlet erkarakterisert vedat det inneholder antilegemer mot Nebraska kalv-diare-virus (NCDV) og/eller mot serologisk beslektede virer, i det følgende kalt Rotavirus, i en .farmasøytisk vanlig tilberedning.

Det foretrekkes sekretoriske antilegemer av klassen IgA, IgG og IgM. Av slike antilegemer er det kjent at de som sekretorisk antilegeme har en overfor serum-antilegemer lengere halveringstid i tarmen. Slike antilegemer forekommer i større mengder i Kolostrum eller melk, videre i tarmsaften og i spytt. De kan eksempelvis utvinnes av melk av drøvtyggere immunisert med NCDV og/eller serologisk beslektede virer (Rotavirus).

Det kan imidlertid ifølge oppfinnelsen også anvendes antilegemer, som fåes på .vanlig måte ved immunisering av dyr og utvinning av deres sera.

De i litteraturen i forbindelse med den infantile gastroenteritis omtalte virer med de forskjellige betegnelser som Rotavirus, Orbivirus, Reo-viruslignende, Duovirus synes etter dagens kunnskaper bare å være synonyme for en frembringer. Muligens er det imidlertid ikke identiske og er bare beslektede innen en gruppe som her betegnes med Rotavirus. Da disse eller disse frembringere ennu ikke er klassifisert, kan nomenklaturen endre seg. Antigenetisk beslektede virer, hvis slektskap ennu ikke er fullstendig oppklart, kan på samme eller meget lignende måte tjene som antigener.

Antigenutvinning:

Rotavirus utvinnes fra avføringen av syke barn på den av Melnick og Wenner i Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Infections, 4. opplag, side 56l, New York, 1969 omtalte måte ved lav- og høytur-sentrifugering. NCDV formeres i vevkulturen fra primære, embryonale eller postpartale storfe-nyreceller eller i celler av en permanent svinenyrelinje ' (PK 15)-Etter optimal formering av viren i disse'celler festes det

6 7

infektiøse kulturoverstående, titer ca. 10 - 10 ID^g/ml og tjener som utgangsmaterial for immuniseringen.

Til fremstilling av det inaktiverte antigen foregår en konsentrering av virene ved hjelp av ultrasentrifugering (pelletering ved ca. 100.000 x g) eller ultrafiltrering med faktoren 5 - 1000, fortrinnsvis 10 - 100. Inaktiveringen kan foregå med formaldehyd ifølge Lauffer Biochemistry og Viruses Pergamon Press, Oxford 1958 eller ifølge LoGruppo, Ann. N.Y. Acad. Sei. 83 (1960) med betapropiolakton. Andre inaktiverings-fremgangsmåter, f.eks. ifølge Wiktor et al Appln. Microbiol. 23

(1972) er mulig.

Immuniseringsfremgangsmåte:

Hun-drøvtyggere infiseres under deres tørrperiode med en virksom dose på 10^ til IO<10>, fortrinnsvis 10<?>til 10^, infektiøse doser^Q(ID^q) ca. 8 uker før fødsel av frukten oralt med formeringsdyktige NCDV eller Rotavirus. 4 uker og 1 uke før fødselen administreres formeringsdyktige og/eller på overnevnte måte inaktiverte NCDV eller rotavirer uten ellermed adju-vans, eksempelvis på følgende måte og til samme tidspunkt: Hver gang ca. 5-50 ml, fortrinnsvis ca. 10 ml formeringsdyktig (titer 10^ - 10<1>Q ID^</>ml) eller inaktivert antigen injiseres subkutant i lymfdreneringssystemet av det samlede jur.

Hver gang ca. 50 til 200 ml, fortrinnsvis ca. 100 ml av det samme preparater instilleres i hver jur-fjerdedel resp. hver jur-halvdel gjennom spenen.

Hver gang ca. 2 til 10 ml, fortrinnsvis ca. 5 ml av samme antigen injiseres intramuskulært.

Under diegivningsperioden instilleres i avstander på flere, fortrinnsvis ca. 4 uker, i hver jur-fjerdedel resp. hver jur-halvdel ca. 50 til 200 ml, fortrinnsvis ca. 100 ml NCDV eller Rotavirus av overnevnte preparat gjennom jurkanalen. Dessuten injiseres i avstander på flere, fortrinnsvis ca. 12 uker, ca. 5 - 50 ml, fortrinnsvis ca. 10 ml, av NCDV eller Rotavirus av samme preparat intramuskulært.'

Andre immuniseringsfremgangsmåter er mulig, f.eks. ifølge Pasieka et al. Can. J. Microbiol. 21: 655 (1974) eller ifølge Watson et al. Res. Vet. Sei. 18: 182(1975).

Også antigenblandinger er anvendbare.

Utvinning av den antilegemeholdige gamma- gTobuTiri- fraksjori fra Kolostrum og melk fra immuniserte' drøvtyggere: De fra fødselsdagen av utvunnet melk (Kolostrum) avfettes og dekaseineres på den av Knop et al. Aust. J. Exp.\Biol. Med. Sei. 49: 405 (1971) omtalte måte.

Gamma-globulin isoleres f.eks. på den av Pasieka et al. Can. J. Microbiol. 21: 655 (1974) omtalte måte ved ammon-sulfatutfelling fra mysen. De renses videre ved kromatografiske metoder, f.eks. ifølge Knop et al. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 49: 405 (197D og Knop et al. J. Infect. Dis. 130: 368 (1974). Eventuelt kan det f.eks. også anvendes de metoder som er omtalt av Hammer et al. Eur. J. Biochem. 6: 443 (1968) og Pasieka et al. Can. J. Microbiol. 21: 655 (1974). Deretter stérilfil-treres og undersøkes på frihet for formeringsdyktige frembringere.

Slike antilegemer mot NCDV, Rotavirus og deres serologisk beslektede inneholdende gamma-globulin-fraksjoner er den vesentlige bestanddel av midlet ifølge oppfinnelsen til profylaks og terapi av infantil gastro-enteritis.

Det er spesielt fordelaktig å applisere midlet ifølge oppfinnelsen oralt og la det bli virksomt i fordøyelses-tarmkanalen. Doseringen bør foretas i avhengighet av størrelsen av den virusnøytraliserende titer. Ved midlere virusnøytrali-serende titere på 1 : 500 administreres ca. 0,1 - 10 g, fortrinnsvis 0,5 - 5 g antilegemeholdige proteinpreparater pr.

dose. Vanligvis tilsvarer dette 1 - 100-ml resp. 5 - 50 ml av en antilegemeoppløsning.

Gamma-globulin-preparatene kan tilsettes magesaft-nøytraliserende stoffer som natriumbikarbonat, magnesiumkarbonat eller bærestoffer som aluminiumhydroksyd eller proteinstabilisa-torer, som aminosyre eller peptider, f.eks. glycin på legemiddel-vanlig måte. Den galeniske tilberedning foregår på den måte som er kjent for oral appliserbare i magetarmkanalen virksomme lege-midler .

Preparatet kan anvendes monospesifikt, eller sammen

i en blanding med antilegemer mot andre mikrobielle som bak-terielle eller andre virale gastro-enteritis-frembringere. Aktivitetsbestemmelse av antilegeme- preparater: Den antivirale aktivitet bestemmes i virus-nøytrali-sasjonsprøve. Det har vist seg gunstig å innstille preparatet på en virusnøytraliserende titer på ca. 1 : 100 til 1 : 1000, eksempelvis på 1 : 320/ml.

Eksempel 1.

Fem aper som var'tatt ved keisersnitt og holdt

uten mor av slekten Macaca infiseres med 1000 ID^q Rotavirus.

1 timersenere ble 10 ml av overnevnte antilegemepreparat med en antiviral aktivitet 1 : 320/ml applisert oralt med en sprøyte eller kanyle. En kontrollgru-pe på 5 aper fikk efc på samme måte fremstillet immunglobulin-preparat av ikke-immuniserte drøvtyggere (kontrollglobulin), De med kontrollglobulin behandlede aper ble syke av diaré, men av de dyr som er behandlet med spesifikt immunglobulin ble ingen syke.

Claims (5)

1. Eksempel 2.

   En gruppe på fem aper som var holdt på samme måte fikk 2 timer før injeksjon med 1000 ID^ q Rotavirus pr. dyr 10 ml av ovennevnte antilegemepreparat. Den tilhørende kontrollgruppe på.5 dyr fikk på dette tidspunkt 10 ml kontrollglobulin, mens alle dyr som hadde fått kontrollglobulin ble syke av diaré,

   viste alle dyr, som var behandlet.. med spesifikt immunglobulin ingen symptomer på sykdom.

   Eksempel 3»

   10 dyr ble infisert med 1000 ID <t>0 Rotavirus.

   Etter utbrudd av sykdommen ble 5 dyr behandlet oralt' med hver 10 ml spesifikt immunglobulin titer 1 : 320/ml.. 5 dyr. fikk ved dette tidspunkt hver 10 ml kontrollglobulin.

   Alle med kontrollglobulin behandlede dyr ble meget syke. Av de dyr som var behandlet med spesifikt immunglobulin var tre dyr i løpet av 24 timer fri for symptomer, 1 dyr.viste et sterkt forkortet og mitigert sykdomsforløp. Ved et dyr.

   kunne likeledes som i kontrollgruppen sykdomsforløpet ikke på-virkes .

   Patentkrav :

   1. Middel til profylaks og terapi av gastro-enteritis hos primater, karakterisert . v„e d at det'inne- ' holder antilegemer mot Nebraska kalve-diaré-virus (NCDV) og/eller mot som Rotavirer betegnede serologisk beslektede virer i en farmasøytisk vanlig tilberedning.
2. 2. Middel ifølge krav 1, karakterisert ved at antilegemene er sekretoriske 'antilegemer mot Nebraska kalve-diaré-viæus og/eller som Rotavirer betegnede serologisk beslektede virer.
3. 3. Middel ifølge krav 1, karakterisert ved at antilegemene utvinnes fra melk av med NCDV og/eller serologisk" beslektede Rotavirer immuniserte drøvtyggere.
4. 4. Fremgangsmåte til fremstilling av et middel til profylaks og terapi av gastro-enteritis hos primater, karakterisert , ved at-man immuniserer drøvtyggere med Nebraska .kalve-diaré-virus og/eller serologisk beslektede virer, og isolerer antilegemene.
5. 5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at antilegemene utvinnes av drøvtyggernes melk.