CH637398A5 - Verfahren zur herstellung von maytansinoidverbindungen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich in erster Linie auf Maytansinoide der folgenden Formel:

CH-s

CII,

(I)

worin R einen niederen Alkylrest bedeutet, wobei diese Verbindungen durch Behandeln von Maytansinol mit einer Säure der folgenden Formel:

637398

4

II

O

worin R einen niederen Alkylrest bedeutet, in Gegenwart eines Cabodiimids erhalten werden.

In der vorliegenden Beschreibung bedeuten «D» bzw. «L» bezüglich der Maytansinoide der Formel I, dass die Aminosäure im Aminosäurerest der Maytansinoide der Formel I die D- bzw. L-Konfiguration aufweist.

Die Maytansinoide der Formel I umfassen die D-Form, die L-Form und Mischungen davon.

In den obigen Formeln I und II steht R für einen niederen Alkylrest, welcher vorzugsweise einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, wie z.B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl.

Von den Maytansinoiden der Formel I sind einige der L-Konfiguration bekannt und in «The Journal of Organic Chemistry», 42, Nr. 14, S. 2349-2357 (1977) beschrieben, nämlich jene der folgenden Tabelle:

R Maytansinoid (I)

Maytanbutin

Maytanvalin

Diese bekannten Maytansinoide der Formel I sind indessen aus Lösungsmittelextrakten einer besonderen Schrägkultur, z.B. Maytenus serrata hergestellt worden. Dieses bekannte Verfahren hat aber wegen der ausserordentlich geringen Ausbeute keine praktische Bedeutung erhalten.

Gemäss einem weiteren Ziel der vorliegenden Erfindung werden Maytansinoidverbindungen in der D-Form bezüglich des Asymmetriezentrums in der 2'-Stellung gemäss folgender Formel hergestellt:

20

25

-CHj Maytansin

(II)

5 -CH2CH3 Maytanprin jcm

-CHc

-CH2C

XH3 -CH3

1

CH3

CH3

ch3

0k /CH\ /°H 3

(Ia)

CH^O

worin R einen niederen Alkylrest darstellt.

Die vorliegende Erfindung liefert daher neue Maytansinoide der Formel Ia in der D-Form und ein wirtschaftlich interessantes Verfahren für die Herstellung von Maytansinoidverbindungen der Formel I sowohl in der L-Form als auch in der D-Form oder aber von Mischungen solcher Verbindungen.

Die Maytansinoidverbindungen der Formel I und Ia sind fungizide Mittel und überdies auch Antitumormittel.

Gemäss vorliegender Erfindung wird Maytansinol mit einer Säure der Formel II in Gegenwart eines Carbodiimids acyliert.

Als Säuren der Formel II kann man beliebige Verbindungen der Formel II in Form von L- und D-Isomeren sowie

55 von Mischungen davon verwenden. Stellt der Rest der Säure der Formel II, welcher in die Hydroxylgruppe in der 3-Stel-lung von Maytansinol eingeführt werden soll, eine optisch aktive Gruppe dar, so wird man vorzugsweise entsprechende, optisch aktive isomere Verbindungen der Formel II ver-60 wenden. Aber auch wenn eine optisch aktive Säure der Formel II verwendet wird, gibt es Fälle, in welchen man nach den zur Anwendung gelangenden Reaktionsbedingungen eine Mischung von D- und L-Maytansinoidverbindungen erhält.

65 Bezüglich des Maytansinols wird man bei der Umsetzung eine Säure der Formel II mit Vorteil in einer Menge von 1 bis 500 und vorzugsweise von 1 bis 30 Moläquivalenten und ein Carbodiimid mit Vorteil in einer Menge von 1 bis 700 und

5

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vorzugsweise von 1 bis 50 Moläquivalenten einsetzen.

Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren ist es vorteilhaft, die Umsetzung in Gegenwart eines Katalysators durchzuführen, welcher eine beliebige als Katalysator wirkende Säure oder Base sein kann, welche die Acylierung von Maytansinol zu begünstigen vermag.

Beispiele von sauren Katalysatoren sind Lewissäuren, wie z.B. wasserfreies Zinkchlorid, wasserfreies Aluminiumchlorid (AlCb), wasserfreies Ferrichlorid, Titantetrachlorid (TiCU), Stannitetrachlorid (SnCU), Antimonpentachlorid, Kobalt-III-chlorid, Cuprichlorid, Bortrifluoridätherat usw. Beispiele von anorganischen oder organischen starken Säuren sind Schwefelsäure, Perchlorsäure, Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure usw. Ferner kann man auch saure Ionenaustauschharze, wie z.B. Dowex-50 (H+), usw. verwenden. Als basische Katalysatoren kann man beispielsweise organische Aminverbindungen, wie z.B. Pyridin, a-, ß- und y-Picolin, 2,6-Lutidin, 4-Dimethylaminopyridin, Dimethylanilin, Diäthylanilin, Triäthylamin, N-Methylmor-pholin usw., Alkalimetallhalogenide, wie z.B. Kaliumfluorid, wasserfreies Lithiumjodid usw. verwenden. Ferner kommen Salze von organischen Säuren, wie z.B. Natriumacetat und dergleichen in Frage. In manchen Fällen ist wasserfreies Zinkchlorid besonders geeignet. Die Verwendung eines solchen Katalysators führt zu einer verbesserten Ausbeute an Maytansinoidverbindungen der Formel I. Der Katalysator wird in einer ausreichenden Menge verwendet, um die Acy-lierungsreaktion zu beschleunigen. So kann in manchen Fällen die geeignete Menge an Katalysator im Bereiche von 0,001 bis 10 und vorzugsweise von 0,01 bis 1 Moläquivalent, bezogen auf die Säure der Formel II, liegen.

Verwendet man einen solchen Katalysator, so kann man im allgemeinen die Menge an Säure der Formel II, vorzugsweise auf 1 bis 6 Moläquivalente, bezogen auf das Maytansinol, reduzieren.

Die erfindungsgemäss verwendeten Carbodiimide entsprechen vorzugsweise der folgenden Formel:

Ri-N=C=N-Ri worin jedes der Symbole Ri und R2 einen organischen Rest bedeutet, welcher während der Umsetzung des Maytansinols mit der Säure der Formel II die Umwandlung des Carbodi-imidteils in den entsprechenden Harnstoff ermöglicht. Demzufolge ist bei der generellen Betrachtung dieser Erfindung die tatsächliche Natur der Substituenten Ri und R2 nicht von primärer Wichtigkeit, weil es lediglich nötig ist, dass die vorhandenen Substituenten die Umwandlung der Carbodiimid-gruppe in einen Harnstoff ermöglichen. Wenngleich man hervorragende Resultate bei Verwendung von Dicyclohexyl-carbodiimid erzielt hat, können die Reste Ri und R2 auch unabhängig voneinander aliphatische und/oder aromatische Gruppen sein, welche weitere Substituenten tragen können, welche die Umwandlung der Carbodiimidfunktion in einen entsprechenden Harnstoff ermöglichen. So können beispielsweise Ri und R: unabhängig voneinander unsubstituierte oder durch Diniederalkylaminogruppen substituierte Cyclo-alkylreste, unsubstituierte oder durch Diniederalkylaminogruppen oder Morpholinogruppen substituierte niedere Alkylreste oder unsubstituierte oder durch niedere Alkylreste substituierte Phenylreste sein. Einige Beispiele von verwendbaren Cabodiimiden sind Diphenylcarbodiimid, Di-o-tolyl-carbodiimid, Di-p-tolylcarbodiimid, Di-tert.-butylcarbo-diimid usw. sowie l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-car-bodiimid, 1 -Cyclohexyl-3-(4-diäthylaminocyclohexyl)-car-bodiimid, 1 -Äthyl-3-(2-diäthylaminopropyl)-carbodiimid und 1 -Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.

Diese Umsetzung kann in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. in einem Ester, wie Äthylacetat, einem Äther, wie z.B. Diäthyläther, Dioxan, Tetrahydrofuran usw., in einem halo-genierten Kohlenwasserstoff, wie z.B. Methylenchlorid, Chloroform usw., in einem Nitrii, wie z.B. Acetonitril, in aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Benzol, Nitrome-than, Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Sul-folan usw., sowie in geeigneten Mischungen solcher Lösungsmitteln erfolgen.

Diese Umsetzung kann beispielsweise bei einer Temperatur im Bereiche zwischen Eiskühlung und Rückflusstemperatur des Reaktionssystems durchgeführt werden. Die in der obigen Weise erhaltenen Verbindungen der Formel I können nach bekannten Methoden, z.B. durch Einengen, Lösungsmittelextraktion, Chromatographie, Umkristallisierung usw., isoliert und gereinigt werden.

Die Maytansinoidverbindungen können nach dem erfindungsgemässen Verfahren ohne weiteres synthetisch und vorteilhaft hergestellt werden.

Die in der obigen Weise erhaltenen Maytansinoide der Formel I können in ähnlicher Weise angewandt werden wie Maytansin, welches eine bekannte Verbindung darstellt. So können sie beispielsweise als karzinostatische oder fungizide Mittel eingesetzt werden.

Maytansinol lässt sich nach der in der deutschen Offenlegungsschrift 2 746 209 beschriebenen Methode herstellen. Jene Herstellungsweise umfasst das Züchten eines das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes in einem Medium unter Veranlassung des genannten Stammes zur Bildung und Anreicherung des Antibiotikums C-15003 in der Kulturbrühe, die Gewinnung dieses Antibiotikums und die anschliessende Behandlung durch reduktive Hydrolyse. Daraus ergibt sich, dass die Maytansinoidverbindungen der Formel I in vorteilhafter Weise durch Anwendung des Herstellungsverfahrens für Maytansinol mittels einer reduktiven Hydrolysenreaktion des Antibiotikums C-15003 in Verbindung mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden können. Es ergibt sich auch, dass das Antibiotikum C-15003 eine der Verbindungen oder eine Mischung von zwei oder mehreren der Verbindungen darstellt, welche den genannten Maytansinoidverbindungen äquivalent sind, bei denen der Substituent in der 3-Stellung jedoch entweder

^CH3

-O-CO-CH:^^ (Antibiotikum C-15003 P-3),

-O-CO-CH2CH2CH3 (Antibiotikum C 15003 P-3') oder

^CH3

-0-C0-CH2-CH<f (Antibiotikum C-15003 P-4) -CH3

ist.

Ein Verfahren für die Herstellung von Maytansinol und dessen Derivaten ist ebenfalls in der deutschen Offenlegungsschrift 2 746 253 beschrieben.

Maytansinol lässt sich auch nach der in «Journal of the American Chemical Society» 97, Nr. 18, S. 5294-5295 (1975) beschriebenen Methode herstellen.

Die Säuren der Formel II können nach einer bekannten Methode oder durch Abänderung der bekannten Methode erhalten werden. Nachstehend findet sich eine teilweise Aufzählung solcher in der Literatur beschriebenen Herstellungsmethoden:

s

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65

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J.R. Coggings, N.L. Benoiton, Can. J. Chem. 49,1968 (1971), P. Quitt, J. Hellerback, K. Vogler, Helv. Chim. Acta, 46,327 (1963) und S.L. Portnova, et al., Zh. Obsch. Khim. 38, 428(1968).

Maytansin ist als fungizides Mittel und auch als Mittel für die Behandlung von Krebsgeschwüren bei Warmblütern, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hunden und Katzen, bekannt. Die Wirkung von Maytansin wurde beispielsweise von Kupchan et al, US-PS Nr. 3 896111, deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2241418, Biochemical Pharmacology, Bd. 24, 751-754(1975), Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 6, Nr. 5,651-652 (1974) publiziert.

Die nach der erfindungsgemässen Methode hergestellten Maytansinoidverbindungen der Formel I können in ähnlicher Weise wie Maytansin wertvoll sein. Die Maytansinoidverbindungen der Formel I lassen sich subkutan, intraperitoneal oder intravenös in geeigneten Dosierungsmengen von ungefähr 1,0 p.g/kg Körpergewicht bis ungefähr 50 ug/kg Körpergewicht pro Verabreichungsdosis zwecks Verlängerung des Überlebens von Warmblütern, wie z.B. Mäusen oder Ratten, welche an Krebsgeschwüren leiden, verabreichen. Injektionslösungen lassen sich in bekannter Weise beispielsweise durch Lösen einer Maytansinoidverbindung der Formel I in Äthanol und durch Zugabe von physiologischer Kochsalzlösung zur Äthanollösung herstellen.

Wie bereits angedeutet, besitzen die bekannten Maytansinoidverbindungen der Formel I starke hemmende Wirkungen gegen Fungi und Protozoen, so dass sie als fungizide Mittel und Äntiprotozoenmittel bestens geeignet sind.

Die Maytansinoidverbindungen der Formel I können als fungizide Mittel und Äntiprotozoenmittel mit Vorteil zur Bestimmung der bakteriellen Ökologie im Boden, in belebtem Schlamm, in tierischen Körperflüssigkeiten oder dergleichen Verwendung finden. Sollen somit aus Bodenproben wertvolle Bakterien isoliert oder die Wirkung von Bakterien unabhängig von jener von Fungi und Protozoen in Verbindung mit dem Betrieb und der Analyse von Belebtschlammsystemen, welche bei der Behandlung von Abwässern zur Anwendung gelangen, festgestellt werden, so kann man die Maytansinoidverbindungen der Formel I zur Erzielung eines selektiven Wachstums der bakteriellen Flora verwenden, ohne dass in der Probe Fungi und Protozoen gleichzeitig wachsen können. So kann man in einem typischen Beispiel eine Probe einem flüssigen oder festen Medium zugeben und dann pro ml des Mediums 0,1 ml einer 10-100 [ig/ml Lösung einer Maytansinoidverbindung der Formel I in 1% Methanol enthaltendem Wasser hinzugeben und hierauf das Medium inkubieren.

Die erfindungsgemäss anvisierten Maytansinoidverbindungen der Formel I können auch als antimikrobielle Mittel für die Behandlung von Pflanzenkrankheiten, welche durch verschiedene Mikroorganismen verursacht werden, verwendet werden.

Gemäss einer typischen Anwendungsmöglichkeit werden die Maytansinoidverbindungen der Formel I in Form einer l%igen methanolischen wässrigen Lösung, welche ungefähr 0,5 ug/ml bis ungefähr 5 ug/ml Maytansinoidverbindung der Formel I enthält, verwendet. So kann man Maytansinoidverbindungen der Formel I beispielsweise zum Bekämpfen der rötlichbraunen Blattscheidenfäule, der Brusone-Krank-heit, der Helminthosporium-Fleckenkrankheit und des Blattscheidenbrandes bei Reispflanzen anwenden.

In den folgenden Beispielen wurde für die Säulenchromatographie als Kieselgel das handelsübliche Produkt Kieselgel 60, Art 7734 von Merck, BRD, in allen Fällen verwendet, wo nichts anderes ausgesagt wird. Die Schmelzpunkte wurden auf einem Yanagimoto MP-S3-Schmelzpunktapparat (Yana-gimoto Seisakusho, Kyoto, Japan), die Ultraviolettabsorptionsspektren auf einem Hitachi ESP-3T-Aufzeichnungs-spektrophotometer, die magnetischen Kernresonanzspektren auf einem Varian EM-390 90 MHz-NMR Spektrometer und die Massenspektren auf einem JEOL JMS-OlSC-Massen-spektrometer bestimmt.

Beispiel I

In einen Rundkolben mit 50 ml Fassungsvermögen wurden 47,3 mg (0,0837 mMol) Maytansinol und 145 mg (1,0 mMol) N-Methyl-N-acetyl-L-alanin eingebracht. Nach der Zugabe von 10 ml wasserfreiem Methylenchlorid erhielt man eine homogene Lösung. Diese Lösung wurde hierauf mit 10 ml einer Lösung von 309 mg (1,5 mMol) Dicyclohexylcar-bodiimid in wasserfreiem Dichlormethan versetzt, worauf sich unmittelbar farblose Kristalle ausschieden. Unter Rühren wurde diese Suspension auf dem Ölbad bei einer Badtemperatur von 55 bis 60°C während 10 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt und die unlöslichen Bestandteile durch Filtrieren abgetrennt. Die unlöslichen Bestandteile wurden mit wenig Methylenchlorid gewaschen und die Waschwasser mit dem Filtrat vereinigt. Das vereinigte Filtrat wurde hierauf unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand über einer mit 40 g Kieselgel beschickten Säule mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 45 Vol.-Teilen zu 1 Vol.-Teil chromatographiert. Der Dicyclohexylharnstoff als vorwiegend gelöstes Material enthaltende Vorlauf wurde beiseite gestellt und bioautogra-phisch positive Fraktionen (vergleiche den nachstehend bioautographischen Test) gesammelt. Aus dem aus der Säule erhältlichen Nachlauf wurden 27 mg Maytansinol gewonnen.

Die bioautographisch wirksamen Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und in einer mit 27 g Kieselgel beschickten Säule chromatographiert, wobei man die Eluierung mit einer Mischung von Äthylacetat und mit Wasser gesättigtem Äthyl-acetat im Mischungsverhältnis von 2:1 eluierte. Auf diese Weise wurden 7,0 mg einer farblosen, bioautographisch wirksamen Verbindung isoliert. Dieses Produkt wurde mittels Dünnschichtchromatographie über einer TLC-Platte (Kieselgel 60 F254, Art 5715, Merck, BRD) in zwei Lösungsmittelsystemen aus einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9 Volumina zu 1 Volumen und aus mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als eine einzige Verbindung bestätigt.

Aufgrund der teilweise nachstehend wiedergegebenen Werte wurde die Struktur dieser Verbindung als eine Verbindung der Formel I mit R als Alkylgruppe bestätigt.

Elementaranalyse für C34H46CIN3O10:

Ber.: C 59,00; H 6,70; N 6,07 Gef.: C 58,68; H 7,02; N 6,54

Massenspektrum (in CHCh) m/e: 691 (M+, Spuren), 630 (M+-H20-HNC0), 485,470,450;

UV-Spektrum (in EtOH) max (nm): 233,243,254,282,290.

In den vorliegenden Beispielen verwendeter bioautogra-phischer Test:

Talaromyces avellanens (IFO 7721) wurde auf eine l%ige Glucosebouillonagarschrägkultur inokuliert. Am 4. Tag wurde eine der Schrägkulturen mit einem Testmedium (pH 7,1), welches aus 3,5 g/Liter Na2HP04- H2O (in destilliertem Wasser), 0,5 g KH2PO4,5,0 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Glucose und 15 g Agar bei 50°C bestand, vermischt. Jeweils 20 ml Portionen dieser Mischung wurden in Schalen (7,5x22,5 cm) verteilt und in der Kälte gelagert. Hierauf wurde ein Filtrier-

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s

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papier oder eine TLC-Platte, welche mit der Testprobe getränkt worden war, während einer bestimmten Zeitdauer dicht an die Agarplatte in jeder Schale gehalten. Nach dem Entfernen des Filterpapiers oder der Dünnschichtchromatographieplatte erfolgte die Inkubation bei 37°C, worauf die Hemmungszone gemessen wurde.

Beispiele 2 bis 9 Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt:

Lösung A: Eine Lösung von Maytansinol in wasserfreiem Methylenchlorid, welche 1 mg Maytansinol in 50 mcl der Lösung enthielt.

Lösung B: Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in wasserfreiem Methylenchlorid, welche 6 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 50 mcl der Lösung enthielt.

Lösung C: Eine Lösung von N-Acetyl-N-methyl-L-alanin in wasserfreiem Methylenchlorid, welche N-Acetyl-N-methyl-L-alanin in einer Konzentration von 3 mg/50 ml der Lösung enthielt.

Mit Hilfe einer Spritze wurden dann zuerst 50 mcl der Lösung C, hierauf 50 mcl der Lösung B und schliesslich 50 mcl der Lösung A in ein Glasrohr von ungefähr 4 mm

Beispiel Nr. Katalysator

2 Wasserfreies Zinkchlorid 15-25

3 Wasserfreies Zinkchlorid 0-5

4 Wasserfreies Aluminiumchlorid 15-25

5 Titantetrachlorid 15-25

6 Wasserfreies Ferrichlorid 15-25

7 Stannitretrachlorid 15-25

8 Bortrifluoridätherat 15-25

9 Schwefelsäure 15-25

Beispiele 10 bis 12 Zu Mischungen von jeweils 50 mcl der Lösungen C, B und A, welche in der gleichen Weise wie in den obigen Beispielen 2 bis 9 in Glasrohren erhalten worden waren, gab man 2 mg Katalysator hinzu, wobei man die Umsetzung in der gleichen

Beispiel Nr. Katalysator

10 Wasserfreies Kaliumfluorid

11 Wasserfreies Lithiumjodid

12 4-Dimethylaminopyridin

Beispiel 13

In 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurden 159 mg N-Methyl-N-propionyl-L-alanin gelöst, worauf man dieser Lösung 309 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 48 mg Maytansinol hinzugab. Dann wurde das Gemisch während 16 Stunden unter Ausschluss irgendwelcher Feuchtigkeit unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Hierauf wurde es eingeengt und die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand auf eine mit 40 g Kieselgel beschickte Säule aufgetragen. Die Entwicklung erfolgte mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 45:1 V/V und die bioautographisch positiven Fraktionen gesammelt. Dann wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand über einer mit 27 g Kieselgel beschickten Säule erneut chromatographiert, wobei man als Entwicklerlösungsmittel eine Mischung von Äthylacetat und mit Wasser gesättigtem

Durchmesser und ungefähr 14 cm Länge eingebracht. Dann wurden ungefähr 0,3 mg eines Katalysators entweder in Form eines festen Katalysators oder in Form eines zuvor mit wasserfreiem Methylenchlorid in geeigneter Weise ver-s dünnten flüssigen Katalysators hinzugegeben. Schliesslich wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von Methylenchlorid auf jeweils 200 mcl eingestellt. Das Glasrohr wurde durch Zuschmelzen in einem Abstand von ungefähr 12 cm Länge verschlossen, worauf das Rohr unter gelegentlichem io Schütteln bei der angegebenen Temperatur während 14 Stunden gehalten wurde. Hierauf wurde das Rohr geöffnet und 2 mcl Teile des Inhaltes wurden auf TLC-Platten (Kieselgel 60 F:54, Art 5715, 20 cm x 20 cm, Merck, BRD) gebracht. Nach dem Entwickeln mit einer Mischung von ls Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9 Vol.-Teilen zu 1 Vol.-Teil wurde der Maytansinfleck durch einen Shimadzu Chromatoscanner CS-910 bei einer Nachweiswellenlänge von 250 nm und einer Bezugswellenlänge von 350 nm nachgewiesen, wobei die absoluten und prozen-20 tuellen Ausbeuten an Maytansin aufgrund der zuvor erstellten Eichkurve berechnet wurden. Sofern eine Rückgewinnung von Maytansinol stattfand, wurde die Rückgewinnung gleichzeitig in ähnlicher Weise in Prozenten bestimmt.

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15

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27

5

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3

Weise wie in den Beispielen 2 bis 9 durchführte. Hierauf wurde das erhaltene Maytansin in ähnlicher Weise quantitativ bestimmt. Die Rückgewinnung von Maytansinol in Prozenten wurde gleichzeitig mitbestimmt.

Ausbeute an Maytansin (%) Maytansinol (%)

30 55

30 20

25 35

Äthylacetat im Verhältnis von 2:1 V/V verwendete. Die bioautographisch positiven Fraktionen wurden gesammelt, wobei man 5 mg einer farblosen Verbindung erhielt. Dieses ss Produkt wurde als die Verbindung der Formel I, worin der Rest R die Äthylgruppe bedeutet, nach den in Beispiel 1 gemachten Angaben identifiziert.

Massenspektrum (m/e): 644(M+-61), 485,470.

60 Beispiel 14

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 13 wurden 173 mg N-Isobutyryl-N-methyl-L-alanin, 309 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 48 mg Maytansinol in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid zur Umsetzung gebracht. Das Reaktionsge-«5 misch wurde dann in der in Beispiel 13 angegebenen Weise weiter behandelt, wobei man 3,2 mg einer farblosen Verbindung erhielt. Aufgrund des Massenspektrums wurde dieses Produkt als die Verbindung der Formel I

Reaktionstemperatur (°C) Ausbeute an Maytansin (%) Maytansinol (%)

40

637 398

mit R = -CH^

^•CfL

identifiziert.

Massenspektrum (m/e): 658 (M+-61), 485,470.

Beispiel 15

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 13 wurden 187 mg N-Methyl-N-isovaleryl-L-alanin, 309 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 48 mg Maytansinol in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid zur Umsetzung gebracht. Dann wurde das Reaktionsgemisch wie in Beispiel 13 behandelt, wobei man 2,5 mg einer farblosen Verbindung erhielt. Aufgrund des Massenspektrums wurde dieses Produkt als eine Verbindung der Formel I [R=CH2CH(CH3)2] identifiziert.

Massenspektrum (m/e): 672 (M+-61), 485,470.

Beispiel 16

Maytansinol (300 mg, 0,5315 mMol) und N-Acetyl-N-methyl-L-alanin (1,585 g, 10,62 mMol) wurden in 80 ml Dichlormethan gelöst. Dann wurde diese Lösung mit 3,285 g Dicyclohexylcarbodiimid und 72,5 mg (0,532 mMol) wasserfreiem Zinkchlorid versetzt. Hierauf wurde das Gemisch während 6 Stunden bei ca. 20°C gerührt und anschliessend während 11 Stunden bei der gleichen Temperatur stehen gelassen. Hierauf wurden 530 mg N-Acetyl-N-methyl-L-alanin, 1095 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 150 mg wasserfreies Zinkchlorid hinzugegeben. Nach Ablauf von 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat mit ungefähr 150 ml Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert und das Filtrat über einer 60 g Kieselgel aufweisenden Säule mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 40:1 Volumenteilen chromatographiert, wobei nach Beiseitestellen des Vorlaufes 25 g Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 14 bis 25 wurden vereinigt, eingeengt und erneut unter Verwendung von 65 g Kieselgel und einer Mischung von Äthylacetat und mit Wasser gesättigtem Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 2:1 Volumenteilen chromatographiert, wobei man nach dem Beiseitestellen des Vorlaufes 16 g Fraktionen sammelte. Auf diese Weise erhielt man aus den Fraktionen 25 bis 60 149,3 mg der Verbindung der Formel I (R=CH3) (als Verbindung A bezeichnet). Die aus der zweiten Chromatographie anfallenden Fraktionen 23 und 24 sowie 61 bis 100 wurden vereinigt und eingedampft, wobei man 20,5 mg einer Substanz erhielt, aus der man weitere 6,3 mg der Verbindung A dadurch gewinnen konnte,

dass man eine präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel (Kieselgel 60 F254, Art 5717, Merck, BRD) mit 10% Isopropanol in Chloroform vornahm. Die aus der zweiten Chromatographie anfallenden Fraktionen 101 bis 153 wurden vereinigt und eingeengt, wobei man 320 mg eines Produktes erhielt, aus welchem nach wiederholter Chromatographie über einer 75 g Kieselgel enthaltenden Säule mit Hilfe einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 40:1 (Volumenteile) 95,7 mg eines Iso-mers der Verbindung der Formel I (R=CH3) (als Verbindung B bezeichnet) erhielt. Die Gesamtausbeute an Verbindung A betrug 155,6 mg und jene der Verbindung B 95,7 mg.

Die Verbindung A wurde mit aus der Natur gewonnenem Maytansin durch Vergleich der folgenden Daten der Verbindung A mit jenen von natürlichem Maytansin, beschrieben in «Journal of Organic Chemistry», 42, Nr. 14,2349-2357 (1977), identifiziert.

UV-Spektrum (Xmax, EtOH) nm: 289,281,254,242(sh), 233.

NMR-Spektrum (in CDCb) S:

0,79(3 H, s), 1,27(3H, d, J=4Hz),

1,29(3H,d,J=7Hz), l,63(3H,s), 2.10(3H,s),

2,12(1 H,dd,J=3Hz und 15Hz), 2,62(1 H,dd,J= 12Hz und

15 Hz), 2,84(3 H,s), 3,02(1 H,d,J=9Hz), 3,07(1 H,d,J=13Hz),

3,18(3H,s), 3,34(3 H,s), 3,45(1 H,d,J=9Hz),

3,64(1 H,d,J=13Hz), 3,96(3H,s), 4,25(1 H,m),

4,75( 1 H,dd,J=3Hz und 12Hz), 5,37(1 H,q,J=7Hz),

5,64(1 H,dd,J=9Hz und 15Hz), 6,37(1 H,s),

6,37(1 H,dd,J= 11 Hz und 15Hz), 6,68(1 H,d,J= 11 Hz),

6,73(1 H,s), 6,80(1 H,s), 0,80-2,50(3 H), 3,90( 1 H,s).

Massenspektrum (m/e): 691,630,485,470,450,128,100,58;

[aß3 -136°±30°(c = 0,055, CHCb).

Die Verbindung A wurde in einer Mischung von Äthylacetat und Diäthyläther gelöst und diese Lösung dann in einem Eisschrank stehen gelassen, bis die Verbindung A in kristalliner Form erhalten worden ist. Dieses kristalline Material wurde hierauf einmal aus einer Mischung von Äthylacetat und Diäthyläther und hierauf zweimal aus einer Mischung von Methylenchlorid und Diäthyläther umkristallisiert, wobei man zu Kristallen der Verbindung A in Form von farblosen Platten vom Schmelzpunkt 191 bis 195°C (unter Zersetzung) erhielt.

Die Verbindung B wurde mit einem Isomer von Maytansin, welches man als D-Maytansin annahm, durch Vergleich der folgenden Daten der Verbindung B mit jenen von Maytansin identifiziert.

UV-Spektrum (/.max, EtOH) nm:

289,281,253,240(sh), 233.

NMR-Spektrum (in CDCb) 5:

0,78(3H, s), 1,26(3H, d, J=4Hz),

l,49(3H,d,J=7,5Hz), l,69(3H,s),2,15(3H,s),

2.17(1 H,dd,J=3Hz und 14Hz), 2,68(lH,dd,J= 12Hz und

14Hz), 2,82(1 H,d,J=9Hz), 3,03(3H,s), 3,15(3H,s),

3,18(1 H,d,J= 12Hz), 3,34(3H,s), 3,42( 1 H,d,J=9Hz),

3,49(lH,d,J= 12Hz), 3,98(3H,s), 4,27(1 H,m),

4,84(1 H,dd,J=3Hz und 12Hz), 5,01 ( 1 H,q,J=7Hz),

5,51(lH,s), 5,83(1 H,dd,J=9Hzund 14Hz),

6,17( 1 H,d,J = 11 Hz), 6,23( 1 H,s), 6,44( 1 H,dd,J = 11 Hz und

14Hz), 6,77(1 H,s), 6,83(lH,s), 0,80-2,30(3H).

Massenspektrum (m/e): 691,630,485,470,450,128,100,58;

[ctg -129°±30° (c = 0,055, CHCh).

Die Verbindung B wurde durch Behandeln einer Chloroformlösung der Verbindung B mit Diäthyläther zum Auskristallisieren gebracht. Die so erhaltenen Kristalle wurden zweimal aus dem gleichen Lösungsmittelsystem umkristallisiert, wobei man zu Kristallen der Verbindung B vom Schmelzpunkt 155 bis 178°C (unter allmählicher Zersetzung) erhielt.

Beispiel 17

Maytansinol (100 mg, 0,177 mMol) und N-Acetyl-N-methyl-L-alanin (522 mg, 3,59 mMol) wurden in 25 ml Dichlormethan gelöst. Dann wurde diese Lösung unter Kühlen mit einem Eis und Wasser enthaltenden Bad bei einer Temperatur von weniger als 5°C mit 1100 mg (5,38 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und 24 mg wasserfreiem Zinkchlorid versetzt. Das Gemisch wurde hierauf während 20 Stunden bei weniger als 5°C gehalten und anschliessend filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt und der Rückstand unter Verwendung von 55 g Kieselgel und einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 40:1 Volumenteilen) der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man 25 g Fraktionen sammelte. Die Fraktionen 15 bis 30 wurden vereinigt und eingedampft, wobei 147 mg eines Gemisches von Mate-

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rialien zurückblieben. Aus den Fraktionen 31 bis 220 konnte man 43 mg Maytansinol gewinnen.

Das aus 147 mg bestehende Gemisch wurde in einer zweiten Säule mittels einer Mischung von Äthylacetat und mit Wasser gesättigtem Äthylacetat (Mischungsverhältnis 2:1 Volumenteile) chromatographiert. Ein Teil des Vorlaufes wurde beseite gestellt und das Eluat hierauf in 15 g Fraktionen gesammelt, wobei man 34 mg Maytansin, 17 mg eines Gemisches von Maytansin und gewissen anderen Substanzen und 47 mg einer ein Isomer von Maytansin enthaltende Substanz erhielt. Durch präparative Dünnschichtchromatographie (PLC-Platte, Kieselgel 60 F254, Art 5717, Merck, BRD) mit einer Mischung von Methylenchlorid und Isopropanol im Mischungsverhältnis von 9:1 Volumenteilen erhielt man aus den 17 mg eines Gemisches von Maytansin und anderer Substanzen eine weitere Menge von 5,0 mg Maytansin. Die 47 mg der ein Isomer von Maytansin enthaltenden Substanz wurden in einer 60 g Kieselgel enthaltenden Säule mit einer Mischung von Chloroform und Äthanol im Mischungsverhältnis von 40:1 weiter chromatographiert, wobei man 20,0 mg des Isomers von Maytansin erhielt. Die Gesamtausbeuten an Maytansin und an Isomeren von Maytansin betrugen 39 mg bzw. 20 mg.

Das nach den obigen Angaben erhaltene Maytansin sowie dessen Isomer besassen die gleichen UV-, NMR- und Massenspektren wie gemäss Beispiel 16.

Beispiel 18

Maytansinol (100 mg, 0,177 mMol), N-Methyl-N-pro-pionyl-L-alanin (84,5 mg, 0,531 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid ( 164 mg, 0,796 mMol) wurden in 15 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Dabei bildete sich unmittelbar eine Suspension unter Bildung eines weissen Niederschlages. In diese Suspension wurden hierauf ungefähr 24 mg (0,176 mMol) wasserfreies Zinkchlorid bei Zimmertemperatur eingerührt. Nach 1 stündigem Rühren bei dergleichen Temperatur gab man diesem Gemisch 84,5 mg N-Methyl-N-pro-pionyl-L-alanin, 164 mg Dicyclohexylcarbodiimid Und ungefähr 24 mg wasserfreies Zinkchlorid hinzu. Nach der Zugabe von 10 ml Dichlormethan wurde das Gemisch während weiteren 110 Minuten gerührt.

Hierauf wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um eine kleine Menge an unlöslichem Material zu entfernen. Das Filtrat wurde mit Dichlormethan auf ein Volumen von ungefähr 100 ml verdünnt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und hierauf filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und mit wenig Äthylacetat gewaschen. Das Filtrat und die Waschwasser wurden vereinigt und in einer Säule, welche mit 65 g Kieselgel beschickt war, unter Zuhilfenahme von Äthylacetat und mit Wasser gesättigtem Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 2:1 Vol.-Teilen chromatographiert und nach dem Beseitigen des Vorlaufes wurden 15 g Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 7 bis 31 wurden vereinigt und eingedampft, wobei man 66 mg der Verbindung der Formel I (R=C2Hs) (als Verbindung C bezeichnet) erhielt. Aus den Fraktionen 40 bis 97 erhielt man 58 mg eines Isomers der Verbindung der Formel I (R=C2Hs) (Verbindung D).

Die Verbindung C wurde mit dem in der Natur vorkommenden Maytanprin durch Vergleich der magnetischen Kernresonanz- und Massenspektren der ersteren Verbindung mit jenen der letzteren Verbindung, welche in der Literatur beschrieben ist, identifiziert.

NMR-Spektrum (in CDCb) 8:

0,80(3H,s), l,10(3H,t,J=7Hz), l,27(3H,d,J=4Hz),

1,29(3 H,d,J=7Hz), 1,64(3 H,s), 2,15(1 H,dd, J = 14Hz und

3 Hz), 2,33(2H,m), 2,61 ( 1 H,dd,J= 14Hz und 12Hz), 2,82(3H,s), 3,01(1 H,d,J=9Hz), 3,18(3H,s), 3,33(3H,s), 3,48(1 H,d,J=9Hz), ~3,60(lH,br), 3,65(1 H,d,J=13Hz), 3,96(3 H,s), 4,26( 1 H,m), 4,76( 1 H,dd, J = 12Hz und 3 Hz), 5,40(1 H,q,J=7Hz), 5,66(lH,dd,J=15Hzund9Hz), 6,30( 1 H,br.s), 6,40( 1 H,dd,J= 15Hz und 11 Hz),

6,65(1 H,d,J= 1.5Hz), 6,74(1 H,d,J= 11 Hz),

6,80(1 H,d,J= 1.5Hz), 0,8-2.5(3H), 3,09(1 H,d,J=13Hz). Massenspektrum (m/e): 644,485,470,450,142.

Eine Lösung der Verbindung C lieferte in einer kleinen Menge Äthylacetat Kristalle der Verbindung C, sofern man die Lösung bei Zimmertemperatur stehen Hess. Die Kristalle wurden gesammelt und aus einer Mischung von Dichlormethan und Diäthyläther umkristallisiert, wobei man zu Kristallen der Verbindung C in Form von farblosen Nadeln vom Schmelzpunkt 185 bis 189°C (unter leichter Zersetzung) gelangte.

Die Verbindung D wurde mit einem Isomer von Maytanprin, welches als D-Maytanprin betrachtet wurde, durch Vergleich der folgenden Daten der Verbindung D mit jenen von Maytanprin identifiziert.

NMR-Spektrum (in CDCb) Ô:

0,86(3H,s), l,13(3H,t,J=7Hz), l,26(3H,d,J=4Hz), 1,49(3H,d,J=7Hz), 1,69(3H,s), 2,17(1 H,dd,J= 15Hz und 3Hz), 2,40(2H,q,J=7Hz), 2,67(1 H,dd,J= 15Hz und 12Hz), 2,81(lH,d,J=9Hz), 3,01(3H,s), 3,15(3H,s), 3,16(lH,d,J=13Hz), 3,33(3H,s), 3,44(1 H,d,J=9Hz), 3,50(1 H,d,J= 13Hz), 3,97(3H,s), 4,28(lH,m), 4,88(1 H,dd,J=12Hzund 3Hz), 5,09(lH,q,J=7Hz), 5,84(1 H,dd,J = 14Hz und 9Hz), 6,20( 1 H,d, J = 11 Hz), 6,25(1 H,br.s), 6,44( 1 H,dd, J = 14Hz und 11 Hz),

6,79(1 H,d,J= 1,5Hz), 6,84(1 H,d,J = 1,5Hz), -4,96(1 H,s), 0,8-2,2(3H).

Massenspektrum (m/e): 705,644,485,470,450,142,114.

Eine Lösung der Verbindung D in einer kleinen Menge Äthylacetats lieferte Kristalle der Verbindung D, welche aus einer Mischung von Dichlormethan und Diäthyläther umkristallisiert wurden. Auf diese Weise gelangte man zu Kristallen der Verbindung D in Form von farblosen Nadeln vom Schmelzpunkt 192 bis 197°C (Zersetzung).

Beispiel 19

100 mg (0,177 mMol) Maytansinol, 92 mg (0,532 mMol) N-Isobutyryl-N-methyl-L-alanin und 164 mg (0,796 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden in 15 ml trockenem Dichlormethan gelöst. In diese Lösung wurden unter Kühlen mit Hilfe eines Eis-Wasser-Bades 24 mg wasserfreies Zink-chlorid eingerührt und das Gemisch hierauf unter Eiskühlung während einer halben Stunde gerührt. Hierauf wurde das Eis-Wasser-Bad entfernt und das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur, d.h. auf ca. 20°C, erwärmen gelassen. Nach einer Stunde wurden 92 mg N-Isobutyryl-N-methyl-L-alanin, 164 mg Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 24 mg wasserfreies Zinkchlorid zusammen mit 10 ml trockenem Dichlormethan hinzugegeben. Nach weiteren 45 Minuten wurden weitere 31 mg N-Isobutyryl-N-methyl-L-alanin, 55 mg Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 24 mg wasserfreies Zinkchlorid hinzugegeben und das Reaktionsgemisch während weiteren 45 Minuten gerührt. Die gesamte Reaktionsdauer betrug 3 Stunden. Hierauf wurde das so erhaltene Reaktionsgemisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 17 aufgearbeitet und das erhaltene Material über 65 g Kieselgel chromatographiert, wobei man als Eluiermittel eine Mischung von Äthylacetat und mit Wasser gesättigtem Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 2:1 Vol.-Teilen chromato-

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graphiert, wobei man wie in Beispiel 17 jeweils 15 g Fraktionen sammelte. Die Fraktionen 8 bis 22 wurden vereinigt und das Lösungsmittel verdampft, wobei man 70,5 mg der Verbindung der Formel I [R=CH(CH3)2], nachstehend als Verbindung E bezeichnet, erhielt. Die Fraktionen 27 bis 55 lieferten nach dem Vereinigen und dem Verdampfen des Lösungsmittels 57,5 mg eines Isomers der Verbindung der Formel I [R=CH(CH3)2] (nachstehend Verbindung F bezeichnet).

Die Verbindung E wurde mit natürlichem Maytanbutin durch Vergleich der folgenden Daten der Verbindung E mit jenen von natürlichem Maytanbutin, beschrieben in der Literatur, gemäss Beispiel 16 identifiziert.

NMR-Spektrum (in CDCb) 8:

0,80(3H,s), l,09(6H,t,J=7Hz), l,28(3H,d,J=4Hz), 1,28(3H,d,J=6Hz), 1,64(3H,s), 2,13(1 H,dd,J= 14Hz und 3 Hz), 2,61 ( 1 H,dd, J = 14Hz und 12Hz), 2,81 (0,63 H,s), 2,87(2,37H,s),-2,85(1 H,m), 2,99(1 H,d,J=9Hz), 3,06(1 H,d,J= 13Hz), 3,16(3H,s), 3,36(3H,s),

3,49( 1 H,d, J=9Hz), 3,68(1 H,d,J=13Hz), -3,80(1 H,br.), 3,96(3H,s), 4,27(1 H,m), 4,75(1 H,dd,J= 12Hz und 3Hz), 5,43(1 H,q,J=7Hz), 5,66(1 H,dd,J= 15Hz und 9Hz), 6,36(1 H,br.s), 6,42(1 H,dd,J=15Hz und 11Hz),

6,65(1 H,d,J = 1,5Hz), 6,79(1 H,d,J=1,5 Hz),

6,80(1 H,d,J= 11 Hz), 0,7-2,1 (3H).

Massenspektrum (m/e): 719,658,485,470,450,156.

Eine Lösung der Verbindung E in einer kleinen Menge Äthylacetat lieferte Kristalle, welche aus einer Mischung von Dichlormethan und Diäthyläther umkristallisiert wurden. Dabei erhielt man Kristalle der Verbindung E in Form von farblosen Nadeln vom Schmelzpunkt 185 bis 187°C (unter Zersetzung).

Die Verbindung F wurde mit einem Isomer von Maytanbutin, welches als D-Maytanbutin betrachtet worden ist, durch Vergleich der folgenden Daten der Verbindung F mit jenen von Maytanbutin identifiziert.

NMR-Spektrum (in CDCb) 8:

0,86(3H,s), 1,13(6H,d,J=6Hz), l,27(lH,d,J=4Hz),

1,49(3 H ,d, J=7 Hz), 2,17(1 H,dd,J=15Hz und 3Hz), 2,66( 1 H,dd,J = 15Hz und 12Hz), 2,80(1 H,d,J=9Hz), —2,90(lH,m), 3,05(3H,s), 3,15(3H,s), 3,18(3H,d,J=13Hz), 3,33(3 H,s), 3,42(1 H,d,J=9Hz), 3,50(1 H,d,J=13Hz), 3,98(3H,s), 4,29(1 H,m), 4,90(1 H,dd,J=12Hz und 3Hz), 5,08(1 H,q,J=7Hz), 3,13(lH,s), 5,84(lH,dd,J=14Hz9Hz), 6,20(1 H,d,J= 11Hz), 6,25(1 H,br.s), 6,44(lH,dd,J= 14Hz und 11Hz), 6,78(1 H,d,J=l,5Hz), 6,84(lH,d,J=l,5Hz), 0,75-2,5(3H).

Massenspektrum (m/e): 719,658,485,470,450,156.

Eine Lösung der Verbindung F in einer kleinen Menge einer Mischung von Äthylacetat und Diäthyläther lieferte Kristalle, welche aus einer Mischung von Dichlormethan und Diäthyläther umkristallisiert wurden, wobei man Kristalle der Verbindung F in Form von farblosen Nadeln vom Schmelzpunkt 195 bis 198°C (unter Zersetzung) erhielt.

Beispiel 20

100,5 mg (0,1779 mMol) Maytansinol wurden wie in Beispiel 17 bei Zimmertemperatur, d.h. bei ca. 20°C, zuerst mit 99,5 mg (0,532 mMol) N-Isovaleryl-N-methyl-L-alanin, 165 mg (0,801 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 24 mg wasserfreiem Zinkchlorid in 15 ml trockenem Dichlormethan während 1 Stunde und hierauf während einer weiteren Stunde mit 67 mg (0,358 mMol) N-Isovaleryl-N-methyl-L-alanin, 110 mg (0,534 mMol) Dicyclohexylcarbo-

10

diimid und ungefähr 24 mg wasserfreiem Zinkchlorid in 10 ml trockenem Dichlormethan behandelt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 17 aufgearbeitet. Das so erhaltene rohe Produkt wurde s über einer 65 g Kieselgel enthaltenden Säule mittels Äthylacetat chromatographiert, wobei man 15 g Fraktionen nach dem Beiseitelegen eines Vorlaufs sammelte. Die Fraktionen 17 bis 29 wurden vereinigt und das Lösungsmittel verdampft, wobei man 60 mg einer Verbindung der Formel I io [R=CH2CH(CH3)2], nachstehend als Verbindung G bezeichnet, erhielt. Die Fraktionen 33 bis 75 lieferten nach dem Zusammenbringen und dem Verdampfen des Lösungsmittels 57 g eines Isomers der Verbindung der Formel I [R=CH2CH(CH3)2] (nachstehend als Verbindung H is bezeichnet).

Die Verbindung G wurde mit natürlichem Maytanvalin durch Vergleich der magnetischen Kernresonanz- und Massenspektren der Verbindung G mit jenen von Maytanvalin identifiziert.

20

NMR-Spektrum (in CDCb) 8:

0,79(3H,s), 0,91(3H,d,J=6Hz), 0,95(3H,d,J=6Hz), I,27(3H,d,J=6Hz), l,30(3H,d,J=7Hz), l,64(3H,s), 2,13(2H,d,J=7Hz), 2,15(1 H,dd,J= 14Hz und 3Hz), 25 2,60(lH,dd,J=14Hzund 11 Hz), 2,83(3H,s),

3,00(lH,d,J=9Hz), 3,07(lH,d,J=13Hz), 3,17(3H,s), 3,34(3 H,s), 3,47(1 H,d,J=9Hz), 3,59(1 H,br.), 3,65(1 H,d,J=13Hz), 3,95(3H,s), 4,27(lH,m), 4,74(1 H,dd,J=12Hz3Hz), 5,35(1 H,q,J=7Hz), 30 5,64(lH,dd,J=15Hzund9Hz),6,28(1 H,br.s),

6,39(1 H,dd,J = 15Hz 11Hz), 6,67(1 H,d,J=2Hz),

6,69(1 H,d,J = 11 Hz), 6,79(1 H,d,J=2Hz), 0,7-2,0(3H). Massenspektrum (m/e): 733,672,485,470,450,170.

35 Die Verbindung H wurde mit einem Isomer von Maytanvalin, welches als D-Maytanvalin betrachtet worden ist, durch Vergleich der folgenden Daten der Verbindung H mit jenen von Maytanvalin identifiziert.

40 NMR-Spektrum (in CDCb) 8:

0,89(3H,s), 0,93(3H,d,J=6Hz), 0,96(3H,d,J=6Hz), 1,26(3H,d,J=4Hz), l,49(3H,d,J=7Hz), l,69(3H,s), 2,66(1 H,dd,J= 15Hz und 12Hz), 3,02(3H,s), 3,12(3H,s), 3,18( 1 H,d,J = 13Hz), 3,32(3H,s), 3,42( 1 H,d,J=9Hz), 45 3,50(lH,d,J= 13Hz), 3,96(3H,s),4,29(lH,m),

4,92( 1 H,dd,J = 11 Hz und 3 Hz), 5,00( 1 H,q,J=7Hz), 5,05(1 H,br.), 5,78(1 H,dd,J= 15Hz und 9 Hz),

6,17(1 H,d,J = 11 Hz), 6,43(1 H,dd,J= 15Hz und 11 Hz), 6,77(1 H,d,J = 1,5Hz), 6,83(lH,d,J=l,5Hz), 0,8-2,5(7H), so 6,24(1 H,s).

Massenspektrum (m/e): 733,672,485,470,45Ó, 170.

Beispiel 21

Maytansinol (100,0 mg, 0,177 mMol), N-Acetyl-N-methyl-55 DL-alanin (64,5 mg, 0,443 mMol, 2,5 Mol äquivalente) und Dicyclohexylcarbodiimid (109,5 mg, 0,532 mMol, 3,0 Moläquivalente) wurden in 20 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Diese Lösung wurde dann unter Rühren bei Zimmertemperatur mit ungefähr 24 mg (0,177 mMol, 1,0 Moläquiva-«o lent) wasserfreiem Zinkchlorid versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei der gleichen Temperatur gab man 51,5 mg (0,354 mMol, 2,4 Moläquivalente) N-Acetyl-N-methyl-DL-alanin und ungefähr 24 mg ( 1,0 Moläquivalent) wasserfreies Zinkchlorid hinzu. Dann wurde das Reaktionsgemisch wäh-65 rend einer Stunde gerührt. Hierauf wurde es mit 80 ml Dichlormethan und 20 ml Wasser versetzt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und hierauf filtriert. Das Filtrat wurde zur

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Trockene eingedampft und der Rückstand mit 3 ml Äthylacetat versetzt. Das unlösliche Material wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde eingeengt und in einer mit 60 g Kieselgel beschickten Säule mit Hilfe von Äthylacetat chromatographiert. Die Fraktionen, welche einen Dünnschichtchromatographiefleck aufwiesen, welche den Verbindungen A bzw. B entsprachen, wurden vereinigt und das Lösungsmittel verdampft. Auf diese Weise erhielt man 60 mg der Verbindung A bzw. 60 mg der Verbindung B. Sowohl die in dieser Weise erhaltene Verbindung A (Maytansin) als auch die so erhaltene Verbindung B (vermutlich D-Maytansin) wurden mit den Produkten, welche man gemäss Beispiel 16 erhielt, durch Vergleich des magnetischen Kernresonanzspektrums identifiziert.

Rf-Werte von Maytansinoidverbindungen der Formel I bei der Dünnschichtchromatographie auf einer TLC-Platte (Art 5715, Merck, BRD).

Lösungsmittel Rf-Werte Mit Wasser gesättigtes

Verbindung Nr. CHCb/Methanol = 9/1 Äthylacetat

(V/V)

A

0,28

0,15

B

0,28

0,05

C

0,32

0,24

D

0,37

0,18

E

0,35

0,29

F

0,42

0,19

G

0,39

0,35

H

0,48

0,24

(Maytansinol)

0,11

0,16

Bezugsbeispiel 1 In 600 ml Methanol wurden 53,5 g (0,52 mMol) N-Methyl-L-alanin suspendiert, worauf man unter Rühren und unter Eiskühlung 75 g trockenes Chlorwasserstoffgas darin auflöste. Die Suspension des Ausgangsmaterials wurde mit zunehmender Reaktionsdauer klarer und ging beim Rühren über Nacht in eine homogene Lösung über. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 85 g (0,8 Mol) Orthoameisensäure-methylester versetzt und das Gemisch während 24 Stunden bei Zimertemperatur stehen gelassen. Die kleinen Mengen an unlöslichen Materialien wurden abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Auf diese Weise erhielt man ein festes Produkt, bestehend aus dem N-Methyl-L-alanin-methylester-hydrochlorid.

NMR-Spektrum (DMSO-da) 8:

l,50(3H,d,J=7Hz), 2,60(3H,m; nach Zugabe von Deuteriumoxid, s), 3,75(3H,s), 4,12(lH,m; nach Zugabe von Deuteriumoxid, q, J=7Hz), 9,83(2H,br.).

Bezugsbeispiel 2 In 300 ml Chloroform wurden 33,7 g (0,22 Mol) N-Methyl-L-alanin-methylester-hydrochlorid gelöst und dann die Lösung mit 65 ml Essigsäureanhydrid und 110 ml Triäthyl-amin versetzt. Dann wurde das Gemisch während 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen und nach dem Zersetzen des überschüssigen Essigsäureanhydrids mittels Wasser wurde die Lösung durch Zugabe von Natriumbicar-bonat neutral gestellt. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht fünfmal mit jeweils 120 ml Äthylacetat extrahiert. Die Chloroform- und Äthylacetat-schichten wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der braungefärbte, ölige Rückstand wurde in Chloroform gelöst und mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und anschliessend unter vermindertem Druck eingeengt. Auf diese Weise erhielt man 31,8 g N-Acetyl-N-methyl-L-alanin-methylester.

NMR-Spektrum(CDCb) 5:

l,38(3H,d,J=7Hz), 2,12(3H,s), 2,97(3H,s), 3,70(3H,s), 5,23(lH,q,J=7Hz).

Der so erhaltene Ester wurde in einer Mischung von 100 ml Methanol und 170 ml einer wässrigen ln-Natriumhydroxyd-lösung gelöst und die Lösung während 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck entfernt und die alkalische wässrige Lösung mit Chloroform extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mittels konzentrierter Salzsäure unter Eiskühlung auf einen pH-Wert von 1 eingestellt und fünfmal mit jeweils 140 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene, feste, weisse Material wurde aus einer Mischung von Äthylacetat und Hexan umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man 8,1 g farbloser Nadeln, bestehend aus N-Acetyl-N-methyl-L-alanin.

Elementaranalyse für CöHi iNCb:

Ber.: C 49,64: H 7,64; N 9,65 Gef.: C 49,54; H 7,66; N 9,40

[aß5 -58,5° (c=l, DMF); -74,3° (c=l, H2O).

Schmelzpunkt 121 bis 122°C.

NMR-Spektrum (CDCb) 8:

l,42(t,J=7Hz), und l,50(t,J=7Hz), total 3H; 2,12(3H,s), 2,88(s) und 2,98(s), total 3H; 4,53(q,J=7Hz) und 5,25(q,J=7Hz),total IH; 11,38(1 H,s).

Bezugsbeispiel 3 In 150 ml Chloroform wurden 28 g (0,18 Mol) N-Methyl-L-alanin-methylester-hydrochlorid gelöst und diese Lösung dann mit 27 g (0,21 Mol) Propionsäureanhydrid und 33 ml Triäthylamin versetzt. Dann wurde das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach der Zugabe von 100 ml Wasser wurde das Reaktionsgemisch während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Hierauf versetzte man mit 600 ml Äthylacetat und wusch die organische Schicht mit wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und anschliessend mit Wasser, worauf man über wasserfreiem Natriumsulfat trocknete. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Auf diese Weise erhielt man den N-Methyl-N-propionyl-L-alanin-methylesterin Form eines gelben Öls.

NMR-Spektrum (CDCb) 8:

l,15(3H,t,J=7Hz), 1,40(3H,d,J=7Hz), 2,40(2H,q,J=7Hz), 2,93(3H,s), 3,70(3H,s), 5,27(lH,q,J=7Hz).

Der so erhaltene Methylester wurde in 50 ml einer Mischung von Methanol und 200 ml einer wässrigen

1 n-Natriumhydroxydlösung gelöst und die Lösung während

2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wurde das Methanol unter vermindertem Druck entfernt und die verbleibende wässrige Lösung mit Chloroform extrahiert. Die wässrige Lösung wurde mittels konzentrierter Salzsäure unter Eiskühlung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und dann viermal mit jeweils 150 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und das verbliebene gelbe Öl in Äthylacetat gelöst.

Nach Zugabe von Hexan schieden sich farblose Prismen aus. Diese Kristalle wurden aus einer Mischung von Äthylacetat s

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und Hexan umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man 14,7 g farblose Prismen, bestehend aus N-Methyl-N-pro-pionyl-L-alanin.

Elementaranalyse für C7H13NO3:

Ber.: C 52,81; H 8,23; N 8,80 Gef.: C 52,77; H 8,55; N 8,81

[aß5 —70,2° (c=l, H2O).

Schmelzpunkt 108 bis 110°C.

NMR-Spektrum (DMSO-dô) 5:

l,00(3H,t,J=7Hz), l,28(3H,d,J=7Hz),2,33(2H,q,J=7Hz), 2,88(3H,s), 4,97(1 H,q,J=7Hz), 12,0(lH,br.).

Bezugsbeispiel 4 26 g (0,17 Mol) N-Methyl-L-alanin-methylesterhydro-chlorid und 25 g (0,23 Mol) Isobutyrylchlorid wurden in 200 ml Chloroform gelöst. Dann wurden 80 ml Triäthylamin tropfenweise innerhalb von 50 Minuten unter Eiskühlung dieser Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde hierauf während einer weiteren Stunde unter Eiskühlung und dann während 1V2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurden weitere 10 ml Triäthylamin dem Reaktionsgemisch hinzugegeben. Anschliessend wurde mit 50 ml Wasser versetzt und das Gemisch eine gewisse Zeitlang gerührt. Nach der Zugabe von 400 ml Äthylacetat wurde das Reaktionsgemisch zuerst mit Wasser, dann mit einer wässrigen Natrium-hydrogencarbonatlösung und schliesslich mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei man den N-Isobutyryl-N-methyl-L-alaninme-thylester als rotes Öl erhielt.

NMR-Spektrum (CDCb) S:

1,13(6H,d,J=7Hz), l,42(3H,d,J=7Hz),2,87(lH,m), 2,98(3H,s), 3,70(3H,s), 5,20( 1 H,q,J =7Hz).

Dieser Ester wurde mit 170 ml einer wässrigen 1 n-Na-triumhydroxydlösung in 100 ml Methanol hydrolysiert und hierauf in der oben beschriebenen Weise nachbehandelt. Auf diese Weise erhielt man 18,1 g farblose Prismen, bestehend aus N-Isobutyryl-N-methyl-L-alanin.

Elementaranalyse für CsHisNCb:

Ber.: C 55,47; H 8,73; N 8,09 Gef.: C 55,44; H 8,86; N 8,06 [aß5 -68,7°(c=l,H20).

Schmelzpunkt 117 bis 118°C.

NMR-Spektrum (DMSO-dó) 5:

1,00(6Hd,J=7Hz), l,28(3H,d,J=7Hz), 2,87(lH,m), 2,93(3H,s), 4,93(1 H,q,J=7Hz), 12,5(lH,br.).

Bezugsbeispiel 5 26 g (0,17 Mol) N-Methyl-L-alanin-methylesterhydro-chlorid und 25 g (0,21 Mol) Isovalerylchlorid wurden in 200 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde hierauf tropfenweise innerhalb von 30 Minuten unter Eiskühlung mit 70 ml Triäthylamin versetzt. Dann wurde das Gemisch während 3 V2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend mit 20 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wurde hierauf während 20 Minuten gerührt und viermal mit jeweils 100 ml Äthylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde anschliessend unter vermindertem Druck entfernt, worauf man den N-Methyl-N-isovaleryl-L-alaninmethylester als braungefärbtes Öl erhielt.

NMR-Spektrum (CDCb) 5:

0,98(6H,d,J=6Hz), l,40(3H,d,J=7Hz), l,0-l,6(lH,m), 2,26(2H,d,J=3Hz), 2,97(3H,s), 3,70(3H,s), 5,24(1 H,q,J=7Hz).

s

Dieser Ester wurde in einer Mischung von 100 ml Methanol und 180 ml einer wässrigen ln-Natriumhydroxydlö-sung gelöst und das Hydrolysatgemisch in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei man 17,1 g farblose Flocken, 10 bestehend aus N-Methyl-N-isovaleryl-L-alanin erhielt.

Elementaranalyse für C9H17NO3:

Ber.: C 57,73; H 9,15; N 7,48 15 Gef.: C 57,85; H 9,35; N 7,33

[aß5 —66,4° (c= 1, H2O).

Schmelzpunkt 88 bis 89°C.

NMR-Spektrum (CDCb) 8:

20 0,95(6H,d,J=7,5Hz), l,0-l,2(lH,m), l,42(3H,d,J=7Hz), 2,27(2H,m), 2,88(s) und 2,97(s), total 3H; 5,27(1 H,q,J=7Hz), 11,60(1 H,s).

Bezugsbeispiel 6 25 Eine Kultur des das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Mikroorganismus (hinterlegt unter Nr. IFO 13726; FERM-P 3992; ATCC 31281) in einer Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-schrägkultur wurde zum Ariimpfen eines konischen 200 ml-Kolbens, welcher 40 ml eines Impfkulturmediums (pH 7,0) 30 enthielt, das aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1% rohem Sojabohnenmehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat bestand, verwendet. Der inokulierte Kolben wurde während 48 Stunden bei 28°C mit Hilfe einer rotierenden Schüttelvor-35 richtung inkubiert, wobei man zu einer Impfkultur gelangte.

0,5 ml der so erhaltenen Impfkultur wurden in einen konischen 200 ml-Kolben eingebracht, welcher 40 ml eines Fermentationsmediums (pH 7,0) enthielt, das sich aus 5% Dex-tran, 3% Maisquellflüssigkeit, 0,1% Polypepton und 0,5% 40 Calciumcarbonat zusammensetzte. Dieser inokulierte Kolben wurde dann während 90 Stunden bei 28°C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung inkubiert.

Die entstandene Brühe wurde unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus und dem 45 Antibiotikum C-15003 P-3 als Standardmaterial durch Verdünnung mit Flüssigkeit getestet. Der Produktionstiter ergab einen Wert von 25 ,ug/ml.

Bezugsbeispiel 7 so 10ml der gemäss Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Impfkultur wurden in einen Kolben mit 2 Liter Fassungsvermögen eingebracht, welcher 500 ml des Impfkulturmediums enthielt. Die Inkubation erfolgte während 48 Stunden bei 28°C mit Hilfe einer rotierenden Schüttelvorrichtung. 500 ml dieser 55 Kultur wurden dann in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 50 Liter eingebracht, welcher 30 Liter des Impfkulturmediums enthielt. Die Züchtung erfolgte bei 28°C, einer Belüftung von 30 Liter/Minute, 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) und einem inneren 60 Druck von 1 kg/cm2 und dies während 48 Stunden. Die erhaltene Impfkultur wurde zum Animpfen eines rostfreien Stahltanks mit 20 Liter Fassungsvermögen benützt, welcher 100 Liter eines ähnlichen Fermentationsmediums, wie jenes gemäss Bezugsbeispiel 1 enthielt, verwendet, wobei das 65 Transferverhältnis 10% betrug. Die Züchtung erfolgte während 90 Stunden bei 28°C, 100 Liter/Minute Belüftung, 200 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) und 1 kg/cm2 innerem Druck. Die entstandene Brühe ergab bei der Bestimmung

13

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nach der gleichen Testmethode wie im Bezugsbeispiel 1 einen Produktionstiter von 25 (ig/ml.

Bezugsbeispiel 8 95 Liter der gemäss Bezugsbeispiel 7 erhaltenen Kulturbrühe wurden mit 2 kg Hyflosupercel (Johnes Manville Products, USA) versetzt, worauf man gründlich rührte. Das Gemisch wurde dann auf einer Filterpresse filtriert, wobei man 85 Liter Filtrat und 32 kg feuchte Zellen erhielt. 85 Liter des Filtrâtes wurden mit 30 Liter Äthylacetat unter Rühren extrahiert. Dieses Vorgehen wurde wiederholt. Die Äthylace-tatschichten wurden dann vereinigt, zweimal mit jeweils 30 Liter Wasser gewaschen, durch Zugabe von 500 g wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf eine Menge von 200 ml eingeengt. Dann wurde Petroläther hinzugegeben, worauf der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen wurde. Auf diese Weise erhielt man 53 g des rohen Produktes I, welches mit 100 ml Äthylacetat gerührt wurde. Die unlöslichen Bestandteile wurden hernach ab filtriert. Das Filtrat wurde mit 10 g Kieselgel (Merck, BRD, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt und das Äthylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben in eine mit Kieselgel (40 ml) beschickte Säule eingeführt. Die Eluierungen erfolgten mit 500 ml n-Hexan, 500 ml einer Mischung von n-Hexan und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 3:1, 500 ml einer Mischung von n-Hexan und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 1:1, 500 ml einer Mischung von n-Hexan und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 1:3, 500 ml Äthylacetat und 1 Liter einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 50:1. Das Eluat wurde in 100 ml-Fraktionen gesammelt. Jeweils 1 ml jeder Fraktion wurde zur Trockne eingeengt. Nach der Zugabe von 0,1 ml Äthylacetat wurden Flecken in Abständen von 2,5 cm vom unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, BRD, Kieselgel 60 F254, 0,25 mm 20x20) aufgetragen. Die Entwicklung erfolgte mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 19:1 über eine Distanz von ungefähr 17 cm. Nach dem Entwickeln erfolgte der Nachweis mit Ultraviolettlicht. Die Fraktionen in der Nähe von Rf 0,6 bis 0,65, die absorbierten (2537 Â), d.h. die Fraktionen Nr. 23 bis Nr. 28, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf ungefähr 20 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit 150 ml Petroläther versetzt, wobei man 15g des rohen Produktes II erhielt.

Bezugsbeispiel 9 Zu 32 kg feuchten Zellen, wie sie gemäss Bezugsbeispiel 8 erhalten worden sind, gab man 50 Liter Wasser, enthaltend 70% Aceton, hinzu und extrahierte während 3 Stunden unter Rühren. Der Extrakt wurde auf einer Filterpresse filtriert. Eine weitere Extraktion erfolgte unter Verwendung von 50 Liter Wasser, enthaltend 70% Aceton, wobei der Extrakt in ähnlicher Weise filtriert wurde. Die Filtrate wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons eingeengt. Die erhaltene wässrige Lösung wurde durch eine Säule von 5 Liter Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei) geleitet, worauf man die Säule mit 20 Liter Wasser und 50% Methanol enthaltendem Wasser wusch. Die Eluierung erfolgte mit 90% Methanol enthaltendem Wasser. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 3 Liter eingeengt und dieses Konzentrat mit 3 Liter Wasser und 3 Liter Äthylacetat geschüttelt. Dieser Arbeitsgang wurde wiederholt. Die Äthylacetat-schichten wurden vereinigt, mit Wasser gespült, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen. Auf diese

Weise erhielt man 28 g eines rohen Produktes, das man in ähnlicher Weise wie im Bezugsbeispiel 8 unter Verwendung einer Säule von Kieselgel reinigte. Auf diese Weise erhielt man 8,0 g des rohen Produktes II.

Bezugsbeispiel 10

In 10 ml Äthylacetat wurden 1,5 g des nach dem obig'en Bezugsbeispiel 8 erhaltenen rohen Produktes II gelöst und die Lösung mit 4 g Kieselgel (Merck, BRD, 0,5-0,2 mm) gründlich gerührt. Das Äthylacetat wurde hierauf unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in eine mit 300 ml Kieselgel beschickte Säule eingebracht und die Säule hierauf mit 500 ml Chloroform gewaschen, wobei die Eluierung mit 500 ml einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 50:1, 500 ml einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 20:1 und 500 ml einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 10:1 durchführte. Das Eluat wurde in 25 ml Fraktionen gesammelt. 0,5 ml einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit 0,05 ml Äthylacetat versetzt. Dieses Konzentrat, als Probe gedacht, wurde über Kieselgel der Dünnschichtchromatographie unterworfen, wobei man als Entwicklerlösungsmittel eine Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 einsetzte. Die Fraktionen Nr. 39 und Nr. 40, welche bei 2537 A absorbierten, bei Rf 0,50 bis 0,60 wurden gesammelt und hierauf unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit 2 ml Äthylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen. Auf diese Weise erhielt man 150 mg Kristalle des Antibiotikums C-15003.

150 mg dieses kristallinen Antibiotikums C-15003 wurden in 15 ml Methanol gelöst. In dieser Lösung wurden hierauf 300 mg Natriumchlorid und 15 ml Wasser gelöst. Dann wurden 200 ml Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei) in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,8 cm eingetragen und die Säule mit 60 ml Wasser, welches 50% Methanol und überdies 5% Natriumchlorid enthielt, äquilibriert. Die nach den obigen Angaben erhaltene Probenlösung wurde durch die Säule geleitet und nach dem Durchleiten von 300 ml Wasser, welches 60% Methanol und 5% Natriumchlorid enthielt, erfolgte eine Gradienten-Eluierung zwischen 1,5 Liter 60% Methanol enthaltendem Wasser, welches 5% Natriumchlorid enthielt, und 1,5 Liter 95% Methanol enthaltendem Wasser. Das Eluat wurde in 15 ml-Fraktionen gesammelt und mittels Kieselgel-Dünnschichtchromatographie entwickelt und nachgewiesen. C-15003 P-3 fand sich in den Fraktionen Nr. 145 bis Nr. 153; C-15003 P-3' und P-4 in den Fraktionen Nr. 167 bis Nr. 180; und C-15003 P-4 in den Fraktionen Nr. 185 bis Nr. 190. Jede Gruppe der Fraktionen wurde gesammelt, eingeengt und durch Zugabe von 50 ml Wasser und 100 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter eingebracht und geschüttelt, worauf die wässrige Schicht abgetrennt wurde. Nach zweimaligem Waschen mit jeweils 50 ml Wasser wurde die Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Beim Stehenlassen schieden sich Kristalle aus. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen und getrocknet.

C-15003 P-3 70 mg

C-15003 P-3' und P-4 18 mg

C-15003 P-4 15 mg

18 mg Mischkristalle aus C-15003 P-3' und C-15003 P-4 wurden in 0,3 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung in einem Abstand von 2,5 cm von der unteren Kante einer jeden von drei Kieselgel-Glasplatten (Merck, BRD, Kieselgel 60 F254, 0,25 mm 20x20 cm) linear appliziert. Die Chromatogramme

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wurden mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 19:1 entwickelt. Nach der Entwicklung über eine Distanz von ungefähr 18 cm wurden die Rf 0,63 (P-4) und Rf 0,65 (P-3 ') Zonen abgekratzt und unabhängig voneinander zweimal mit wenig Wasser enthaltendem Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und dann stehen gelassen. Auf diese Weise erhielt man 10 mg C-15003 P-4 und 3 mg C-15003 P-3 ' aus Rf 0,68 bzw. Rf 0,65.

Bezugsbeispiel 11 In 1 ml Tetrahydrofuran wurden 15 mg der aus dem Antibiotikum C-15003 bestehenden Kristalle, welche gemäss Bezugsbeispiel 10 erhalten worden waren, gelöst und die Lösung auf -5°C gekühlt. Dann wurde mit 12 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt und das Gemisch während 2 Stunden stehen gelassen. Hierauf wurden 0,5 ml l%ige Schwefelsäure in Wasser hinzugegeben und das Reaktionsgemisch mit 2 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Die präparative Dünnschichtchromatographie erfolgte über Kieselgel mittels einer Mischung von Äthylacetat ünd Methanol im Mischungsverhältnis von 19:1 und die absorbierende Zone in der Nähe von Rf 0,25 bis 0,3 wurde abgekratzt, mit wenig Wasser enthaltendem Äthylacetat extrahiert, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem s Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Die entstandenen Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 10 mg Maytansinol, Schmelzpunkt 174°C.

io Elementaranalyse für C28H37QN2O8:

Ber.: C 59,52; H 6,60; N 4,96; Cl 6,27 Gef.: C 59,65; H 6,58; N 5,02; Cl 6,21

15 IR: 1715,1670,1580 (cm-1).

UV (nm): 232(32750), 244(Schulter, 30850), 252(31650), 281(5750), 288(5700).

Die Eigenschaften dieses Produktes stimmen mit jenen für 20 Maytansinol überein.

Die Ausbeuten und Reaktionsbedingungen, wie z.B. Temperaturen, Zeitdauer usw., wie sie in den obigen Beispielen und Bezugsbeispielen erwähnt worden sind, lassen sich durch Wiederholung von Versuchsproben verbessern.

B

Claims (14)

1. 637398 2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Maytansinoidverbindungen der folgenden allgemeinen Formel:

   •R

   (I)

   worin R einen niederen Alkylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man Maytansinol mit einer Säure der folgenden allgemeinen Formel:

   HsC

   (II)

   worin R einen niederen Alkylrest darstellt, in Gegenwart eines Carbodiimids behandelt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R den Methylrest bedeutet.
3. 3

   637398

   CH,

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Maytansinoidverbindung Maytansin ist.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure die L-Konfiguration aufweist.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Carbodiimid Dicyclohexylcarbodiimid ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in Gegenwart eines Katalysators arbeitet, welcher die Acylierung von Maytansinol zu erleichtern vermag.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,

   3s dass man als Katalysator einen sauren oder einen basischen Katalysator einsetzt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Katalysator eine Lewissäure, eine starke organische Säure, eine starke anorganische Säure, ein saures

   40 Ionenaustauschharz, ein organisches Amin, ein Alkalimetall-halogenid oder ein Salz einer organischen Säure einsetzt.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Katalysator wasserfreies Zinkchlorid, wasserfreies Aluminiumchlorid, wasserfreies Ferrichlorid, Titante-

   45 trachlorid, Stannitetrachlorid, Antimonpentachlorid, Kobalt-III-chlorid, Cuprichlorid, Bortrifluoridätherat, Schwefelsäure, Perchlorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure, Pyridin, a-, ß- oder so y-Picolin, 2,6-Lutidin, 4-Dimethylaminopyridin, Dimethyl-anilin, Diäthylanilin, Triäthylamin, N-Methylmorpholin, Kaliumfluorid, wasserfreies Lithiumjodid oder Natrium-acetat einsetzt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, ss dass der Katalysator wasserfreies Zinkchlorid ist.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure in einer Menge von 1 bis 30 Moläquivalenten, bezogen auf das Maytansinol, verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, «o dass die Säure in einer Menge von 1 bis 6 Moläquivalenten,

    bezogen auf das Maytansinol, verwendet wird.
13. 13. Ein Maytansinoid in der D-Form bezüglich des Asymmetriezentrums in der 2' -Stellung mit folgender allgemeiner Formel:
14. 14. Eine Verbindung nach Anspruch 13, worin R den Methylrest bedeutet.