CH637528A5 - Verfahren zur gewinnung von oelhaltigen hochgereinigten phosphatidylcholinen. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Gewinnung von ölhaltigen hochgereinigten Phosphatidylcholinen mit einem hohen Gehalt an essentiellen Fettsäuren durch Extrahieren von ölhaltigen Rohphosphatiden mit organischen Lösungsmitteln und Adsorption an Aluminiumoxid und Herauslösen des Phospha-tidylcholins mit Alkohol, dadurch gekennzeichnet, dass das ölhaltige Rohphosphatid mit einem niederen Alkohol mit 1 bis 3 C-Atomen extrahiert und der erhaltene ölhaltige Phos-phatidextrakt unmittelbar mit dem Aluminiumoxid behandelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Aluminiumoxid in Form einer Aluminiumoxydsäule verwendet.

Aus der deutschen Patentschrift 1 617 679 ist ein Verfahren zur Gewinnung von hochgereinigtem Phosphatidyl-cholin mit hohem Gehalt an essentiellen Fettsäuren aus pflanzlichen Lecithinen durch Adsorption der Phosphatide an Aluminiumoxid und Extrahieren mit Alkohol bekannt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die ölhaltigen Rohphosphatide in Essigester oder einem dichlorierten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen bzw. Mischungen dieser Lösungsmittel gelöst werden, wobei das Lösungsmittel bis zu 6 Vol.-% Alkohol enthalten kann und die Lösung dann mit mindestens der 5fachen Menge Aluminiumoxid, bezogen auf den Gehalt an Rohphosphatid, unter Rühren behandelt wird, worauf man vom abgetrennten Aluminiumoxid das hochgereinigte Phosphatidylcholin mit Alkohol herauslöst. Gemäss der deutschen Patentschrift 1 617 680 wird die Lösung der ölhaltigen Rohphosphatide auf eine Aluminiumoxidsäule aufgegeben und das chemisch reine Phosphatidylcholin mit Alkohol vom Adsorbens gelöst. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass es nicht erforderlich ist, die ölhaltigen Rohphosphatide mit Essigester oder dichlorierten Kohlenwasserstoffen zu behandeln, sondern dass man das Rohphosphatid auch mit niederen Alkoholen mit 1 bis 3 C-Atomen extrahieren kann, worauf dieser Extrakt dann unmittelbar mit dem Aluminiumoxid behandelt und dann das adsorbierte Phosphatid wie bei den Verfahren der oben genannten Patentschriften mit Alkohol wieder vom Aluminiumoxid herausgelöst wird.

Aus der schweizerischen Patentschrift 361 088 und der US-Patentschrift 2 945 869 sind bereits Reinigungsverfahren zur Gewinnung von Sojaphosphatidfraktionen bekannt geworden, die als Emulgatoren für intravenös zu applizierende Fettemulsionen Verwendung finden sollen. Hierbei werden alkoholische Lösungen von vorher entölten Rohphosphatiden mit A1203, MgO bzw. Aktivkohle behandelt, um diese Lösungen an Kephalin zu verarmen und vor allem weitgehend von den inosithaltigen Phosphatiden zu befreien, die bei einer intravenösen Applikation an der Katze eine Blutdrucksenkung hervorrufen.

Dieses Verfahren erfordert aber immer vorher eine Ent-ölung der handelsüblichen Rohphosphatide, dann erst werden die alkoholischen Lösungen hergestellt, die - ganz gleich mit welchem Adsorbens behandelt - immer nur eine Verarmung an Kephalin möglich machen. Eine weitergehende oder gar eine völlige Kephalinentfernung kann mit diesem Verfahren nicht erreicht werden.

Aus der eigenen deutschen Patentschrift 1 053 299 ist ferner ein Verfahren zur Gewinnung von colaminphosphor-säurediglyceridesterfreien natürlichen Cholinphosphorsäure-

diglyceridestern durch Säulenchromatographie bekannt, wobei als Adsorbens unter anderem auch Aluminiumoxid verwendet wird. Auch bei diesem Verfahren wird ein alkoholischer Extrakt des vorher entölten Rohphosphatids verwendet, wobei diese vorherige EntÖlung durch wiederholtes Extrahieren mit Aceton erreicht wird.

Bei den Verfahren der deutschen Patentschrift 1 617 679 und der DE-PS 1 617 680 werden ölhaltige Rohphosphatid-gemische ohne vorhergehende EntÖlung in Essigester oder einem chlorierten Kohlenwasserstoff gelöst und diese Lösungen mit Aluminiumoxid behandelt. Hierbei tritt zunächst eine EntÖlung der Rohphosphatide ein, während die gesamten Phosphatide am Adsorbens bleiben. Im Anschluss daran kann das Phosphatidylcholin durch Behandlung des Aluminiumoxids mit Alkohol selektiv herausgelöst werden. Auch bei dieser Verfahrensweise werden hochgereinigte ölfreie Phosphatidylcholine erhalten.

Demgegenüber werden nach dem erfindungsgemässen Verfahren die Phosphatidylcholine mit einem hohen Gehalt an essentiellen Fettsäuren im Molekül zusammen mit dem im Ausgangsphosphatid vorhandenen Pflanzenöl erhalten. Denn es hat sich in der Praxis gezeigt, dass es sehr oft notwendig ist, ölige Lösungen von hochgereinigten Phosphatidylcholinen herzustellen. Das gilt vor allem für eine Anwendung auf pharmazeutischem Gebiet, wenn es darum geht, hochgereinigte Phosphatidylcholine einer oralen Applizierung zugänglich zu machen, beispielsweise in der Form von Gelatinekapseln. Neuere Resorptionsstudien mit radioaktiv markiertem Phosphatidylcholin haben nämlich gezeigt, dass bei oraler Applikation einer ölhaltigen Darreichungsform von Phosphatidylcholin mit vorwiegend mehrfach ungesättigten Fettsäuren die Resorption gegenüber einer wasserhaltigen Präparation um ein Mehrfaches gesteigert werden kann.

Als vorzügliches Ölmedium erweist sich hierbei das mit den Phosphatiden stets vergesellschaftete natürliche Pflanzenöl, wie Sonnenblumen- oder Sojaöl, vorzugsweise im Gemisch mit Mono- und Diglyceriden, die aus den gleichen Ölen hergestellt wurden. Auf diese Weise wird es möglich, unmittelbar flüssige, d.h. giessbare Phosphatidylcholin-Fraktionen zu erhalten, die auch für andere Anwendungen, beispielsweise auf dem Gebiet der Kosmetik und Diätetik, häufig von grossem Nutzen sind.

Nach dem heutigen Stand der Technik geht die Herstellung einer fliessfähigen öligen Lösung von hochgereinigtem Phosphatidylcholin, die für eine Abfüllung in Gelatinekapseln geeignet ist, so vor sich, dass man ein - wie nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1 617 679 gewonnenes - ölfreies Phosphatidylcholin wieder mit dem bei der Reinigung erhaltenen natürlichen Pflanzenöl oder einem anderen Speiseöl versetzt, gegebenenfalls unter Zusatz von Monogly-ceriden oder freien Fettsäuren. Das bedeutet aber, dass man zum Zwecke der Entfernung des Kephalins und des Inosit-phosphatids zunächst das den Phosphatidgemischen noch anhaftende Öl vor oder während des Adsorptionsvorganges am A1203 entfernen muss.

Die vorbekannten Verfahren, sowohl das nach der deutschen Patentschrift 1 053 299 als auch die nach dem Hauptpatent bzw. 1. Zusatzpatent sind neben einer gewissen Aufwendigkeit noch mit zusätzlichen Nachteilen behaftet. Im ersten Falle kommt es während der EntÖlung der handelsüblichen Rohphosphatide mit Aceton stets zur Bildung von kleinen Mengen Mesityloxid, das chemisch durch Zusammenlagerung von zwei Molekülen Aceton entsteht und wegen seiner Toxizität und seines charakteristischen Eigengeruches auch noch in kleinsten Mengen recht störend wirkt; im zweiten Falle entstehen bei der chromatographischen Fraktionierung von Öl und Phospholipid stets Lösungsmittelgemische,

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die vor der Wiederverwendung einer fraktionierten Destillation unterzogen werden müssen.

Bei einer praktischen Durchführung des erfindungsge-mässen Verfahrens werden die handelsüblichen, noch ca. 20 bis 40% Öl enthaltenden Rohlecithine zunächst bei Temperaturen bis zu 50 °C mit Methanol, Äthanol oder Propa-nol extrahiert, wobei die bei Abkühlung des Gemisches sich bildenden 2 Phasen durch Dekantieren voneinander getrennt werden. Die alkoholreiche Oberphase wird dann mit dem Aluminiumoxid entweder unter Rühren oder durch Passieren einer mit dem Adsorbens gefüllten Chromatographiesäule behandelt. Beim Eluieren mit dem Alkohol resultiert ein ölhaltiges kephalin- und inositphosphatidfreies Phosphatidylcholin mit einem hohen Gehalt an essentiellen Fettsäuren.

Es war nicht vorhersehbar, dass - entgegen dem Stand der Technik - eine ölhaltige alkoholische Phosphatidlösung ohne weitere Vorbehandlung für eine chromatographische Auftrennung an Aluminiumoxid geeignet ist, wobei der hohe Ölgehalt der Lösung die Adsorption der sauren Phosphatide in keiner Weise beeinflusst. Dieser Befund ist um so erstaunlicher, wenn man die geringe Löslichkeit von Öl in Alkohol in Betracht zieht, die erwartungsgemäss während des Kontaktes mit dem Aluminiumoxid zu einer Abscheidung des Öles von der Phosphatidphase und damit zu einer Blok-kierung der aktiven Zentren des Adsorbens führen sollte. Auch war anzunehmen, dass Adsorption des Phosphatidyl-cholins aus der alkoholischen Lösung nicht in ausreichendem Masse stattfindet, da bei den vorbekannten Verfahren mit diesem Lösungsmittel eluiert wurde.

Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendeten ölhaltigen alkoholischen Extrakte können durch einmalige oder wiederholte Behandlung der Rohphosphatide mit Alkohol bei Temperaturen bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels zweckmässigerweise bei 20 bis 50 °C erhalten werden. Die Trennung des dabei anfallenden Phasengemisches kann durch Dekantieren oder Zentrifugie-ren erfolgen. Nach dem Rühren der alkoholischen Oberphase mit Aluminiumoxid kann das von der Lösung abgetrennte Adsorbens dann mit Äthanol einige Minuten gerührt und anschliessend im Dekanter getrennt werden. Das Auswaschen mit wenig Äthanol kann noch einmal wiederholt werden und das dann die unerwünschten Begleitlipide enthaltende Aluminiumoxid wird entweder verworfen oder aufgearbeitet. Im Falle der Benutzung einer Chromatographiesäule zur Abtrennung der sauren Phospholipide werden die ölhaltigen Phosphatidylcholin-Konzentrate durch Eluieren der Säule mit Alkohol, zweckmässigerweise auch mit Äthylalkohol, erhalten. Dabei kann man, falls erforderlich, durch Fraktionieren des aus der Säule auslaufenden Eluates noch gegebenenfalls eine Reduzierung des Ölgehaltes in der Phos-phatidylcholin-Fraktion erreichen.

In beiden Fällen, sowohl nach dem Rühren mit Aluminiumoxid als auch nach der Säulenchromatographie, werden die verfahrensgemäss erhaltenen alkoholischen Lösungen -gegebenenfalls nach Filtration mit einer kleinen Menge Celi-te als Filterhilfe - vorteilhaft im Vakuum unter dem Schutz eines inerten Gases vom Lösungsmittel befreit. Dabei fällt eine hochreine ölhaltige Fraktion von natürlichem Phosphatidylcholin an, die kephalinfrei oder stark verarmt ist, mit einem Gehalt an essentiellen Fettsäuren von 66 bis über 70%.

Für die Extraktion der ölhaltigen Rohphosphatide und zur Durchführung des erfindungsgemässen chromatographischen Verfahrens werden die niedrigen Alkohole mit 1 bis 3 C-Atomen verwendet, vorzugsweise Äthalalkohol, auch im Gemisch mit geringen Mengen Wasser bei einem Gehalt von

85 bis 96% Alkohol, wobei die letztere Konzentration als handelsübliche besonders vorteilhaft ist.

Als Adsorbens können basische und neutrale Aluminiumoxide, vorzugsweise aber basische der Altivitätsstufe 1-3 und nach Brockmann standardisierte Aluminiumoxide verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren macht es nun möglich, ölhaltige Phosphatidfraktionen durch eine einfache Behandlung mit Aluminiumoxid entweder auf einer Chromatographiesäule oder durch Rühren unter Erhalten der Ölphase vom Kephalin und Inositphosphatid zu befreien und ölhaltige Phosphatidylcholin-Fraktionen mit einem hohen Gehalt an essentiellen Fettsäuren in nur einem Verfahrensschritt herzustellen.

Die Produkte des erfindungsgemässen Verfahrens besitzen infolge ihres hohen Phosphatidylcholin-Anteils mehr als 90% der Phosphatid-Fraktion - bei einem Gehalt von über 70% an essentiellen Fettsäuren im Rahmen der Gesamtfettsäuren, bei oraler Applikation schon in niedrigen Dosierungen von 2 g pro Tag therapeutisch bei vielen Krankheitsbildern wie Arteriosklerose, Diabetes oder Hyperlipidämien eine wertvolle Stoffwechselwirksamkeit, die beispielsweise auf der Senkung krankhaft erhöhter Blutfettwerte beruht.

Die erfindungsgemäss aus üblichen Rohphosphatiden gewonnenen hochgereinigten ölhaltigen Phosphatidylcholin-Fraktionen zeigen folgende typische analytische Zusammensetzung:

Jodzahl 95-105

Ölgehalt 15-30%

Gesamtphosphor 2,4-2,75%

Cholin 9,5-10,8%

Phosphor : Cholin-Molverhältnis 0,996%

Die gaschromatographische Analyse der Fettsäuren zeigt folgende Durchschnittswerte:

a) b)

erfindungsgemässe ölhaltige entölte

Phosphatidylcholin-Fraktion Phosphatidyl-

aus Sojaphosphatid aus cholin-Fraktion

Sonnenblumen-Sojaphosphatid Sonnenblumen

C16

13,7%

9,8%

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C«

3,0%

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Ci8:,

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£-18:2

63,5%

72,2%

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Cl8:3

6,8%

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6,2%

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Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand einiger Beispiele noch näher erläutert:

Beispiel 1

a) Herstellung der ölhaltigen äthanolischen Sonnen-blumenphosphatidlösung. 1 kg Sonnenblumenrohphos-phatid mit einem Ölgehalt von 35% wird mit 51 Äthanol 1 Stunde in einer Stickstoffatmosphäre bei 40 °C gerührt. Nach 1 stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird die spezifisch leichte äthanolreiche Oberphase im Scheiderichter von der viskosen Unterphase abgetrennt.

b) Behandlung mit À1203

1,51 der nach a) gewonnenen Oberphase mit einem Substanzgehalt von 75 g und 30 g Sonnenblumenöl werden mit 300 g A1203 2,5 Stunden bei Zimmertemperatur unter N2-Schutz kräftig gerührt. Nach dem Absitzen des Adsorbens wird die Äthanollösung abdekantiert und das A1203 2 x mit je 150 ml Äthanol nachgewaschen. Die vereinigten Äthanollösungen werden nach Einrühren von 1 g Celite als Filterhilfe abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum unter Stick5

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stofF bei einer Badtemperatur von 40 °C abdestilliert. Es resultieren 45 g einer zähflüssigen, ölhaltigen Phosphatidyl-cholin-Fraktion, die praktisch kephalinfrei ist und folgende Zusammensetzung aufweist:

Ölgehalt 30% s

Phosphatidylcholin-Gehalt 64%

Beispiel 2

11 einer wie unter Beispiel 1 a beschrieben aus Sojaboh-nenrohphosphatid durch Äthanolextraktion hergestellten io Oberphase mit einem Substanzgehalt von 53 g, die 27% Sojaöl enthält, wird mit 280 g A1203 4 Stunden in einer Inertgasatmosphäre kräftig gerührt. Nach dem Absitzen des Adsorbens wird die Äthanollösung abgetrennt, das A1203 2 x mit je 150 ml Äthanol nachgewaschen und die vereinigten is äthanolischen Extrakte, gegebenenfalls unter Zusatz von Ce-lite, klarfiltriert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter Stickstoffschutz resultieren 33 g einer weichplastischen, gelbgefärbten, kephalinfreien Phosphati-dylcholin-Fraktion, die durch Zusatz von Öl oder Partial- 20 glyceriden mit über 50% ungesättigten Fettsäuren in eine giessbare Form überführt werden kann und folgende Zusammensetzung aufweist:

Sojaöl 25%

Phosphatidylcholin-Gehalt 68% 25

Beispiel 3

1,31 einer 4,l%igen äthanolischen Sojaphosphatidlösung mit einem Ölgehalt von 28% - wie sie als Oberphase bei der Äthanolextraktion von ölhaltigem Sojabohnenrohphospha- 30

tid bei 25 °C entsteht - werden unter N2-Schutz auf eine Chromatographie-Säule von 31 mm Durchmesser und 400 mm Höhe aufgegeben, die mit einer Aufschlämmung von 280 g A1203 in Äthanol gefüllt ist. Nach dem Durchlaufen der Lösung wird das Adsorbens noch mit 350 ml Alkohol nachgewaschen. Die vereinigten Äthanolextrakte werden unter Inertgasschutz im Vakuum bei 40 °C Badtemperatur vom Lösungsmittel befreit. Es resultieren 35 g (68%) einer völlig kephalinfreien hochgereinigten Phosphatidylcholin-Fraktion mit einem Ölgehalt von 29% und einem Gehalt an Phosphatidylcholin von 70%).

Beispiel 4

400 g Sojabohnenrohphosphatid werden 2 x mit je 1000 ml Methanol 30 Min. bei 40 °C extrahiert. Die vereinigten Methanolextrakte weisen nach Abkühlung auf Zimmertemperatur einen Trockengehalt von 9% auf, der Ölgehalt beträgt 12% und der Gehaltan Phosphatidylcholin 33%.

11 dieser methanolischen Lösung wird unter dem Schutz eines inerten Gases auf eine Chromatographiesäule gegeben, die mit einer Aufschlämmung von 500 g Aluminiumoxid gefüllt ist. Nach dem Durchlaufen der Lösung wird das Adsorbens auf der Säule noch mit 700 ml Methanol nachgewaschen. Die vereinigten Methanol-Eluate werden im Vakuum unter Inertgasschutz bei 40 °C eingedampft. Es resultieren 55 g eines gelben plastischen Produktes, das völlig kephalinfrei ist, mit einem Ölgehalt von 30% und 66% Phosphatidylcholin. Nach Zusatz von Mono-Diglyceriden mit einem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren von mehr als 50% entsteht ein giessbares, öliges Phosphatidylcholin-Konzentrat.

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