CH640640A5 - Process for the determination of antigens and/or antibodies - Google Patents

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CH640640A5
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antigen
antibody
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CH143379A
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Masanobu Sawai
Tadamitsu Sudo
Shogo Enomoto
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Mitsubishi Chem Ind
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern durch Fixieren des Antikörpers und/ oder des Antigens an unlöslichen Trägerteilchen mit sehr geringen Teilchendurchmessern, wodurch die unlöslichen Trägerteilchen sensibilisiert werden, Umsetzen der sensibilisierten Trägerteilchen mit dem entsprechenden Antigen, Antikörper oder einer Mischung davon und Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung.
Es besteht ein ständiges Bedürfnis für ein Verfahren zur schnellen und genauen qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise von Antigenen und Antikörpern, die in extrem geringen Konzentrationen vorliegen. Es besteht weiterhin ein starkes Bedürfnis dafür, die Anwesenheit von Drogen oder Arzneimitteln in Körperflüssigkeiten festzustellen. Weiterhin ist es für die medizinische Diagnose häufig wichtig, über die Anwesenheit von verschiedenen Substanzen Bescheid zu wissen, die auf natürlichem Wege in dem Körper synthetisiert werden oder in den Körper eingeführt worden sind.
Bislang ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene halbquantitativ dadurch nachzuweisen, dass man Latexteilchen, an die man einen Antikörper oder ein Antigen fixiert hat, mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper auf einer Glasplatte umzusetzen und die Agglutination visuell zu beobachten.
In den letzten Jahren ist in den folgenden Veröffentlichungen vorgeschlagen worden, Antigene und Antikörper unter Verwendung der oben erwähnten Latexteilchen quantitativ zu bestimmen, indem man einen Antikörper oder ein Antigen an den Latexteilchen fixiert, den auf dem Träger vorliegenden Antikörper oder das auf dem Träger vorliegende Antigen mit dem entsprechenden zu bestimmenden Antigen oder Antikörper umsetzt, um die Latexteilchen zu agglutinie-ren oder zusammenzuballen und die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex' mit Hilfe von sichtbarem Licht zu messen, um das Antigen oder den Antikörper unter Ausnützung des Agglutinationsphänomens des als Reagens verwendeten Latex' zu bestimmen:
A) Croatica Chemica Acta, 42 (1970) 457-466 und
B) European Journal of Biochemistry, Vol. 20, Nr. 4 (1971) 558-560.
Da die Methode gemäss dem obigen Vorschlag die Messung der Geschwindigkeit der Trübungsabnahme dazu benützt, das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen, ist es erforderlich, einen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten Latex in extrem geringer Konzentration, die beispielsweise im Bereich von 0,007 bis 0,028% liegt, zu verwenden, die Reaktion des Latex' und des Antigens oder des Antikörpers in einem stationären Zustand durchzuführen, irgendwelche Verunreinigungen, die die Trübung der Probe beeinträchtigen könnten, zu entfernen und ähnliche Massnahmen zu ergreifen. Als Ergebnis davon ist die oben erwähnte Methode nachteilig dadurch, dass die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion unvermeidbar vermindert wird, dass sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit für die Bestimmung von Antigenen und Antikörpern ungenügend sind und dass die Abtrennung von Verunreinigungen häufig extrem komplizierte Massnahmen erforderlich macht. Demzufolge ist es schwierig, die obige Methode zur Bestimmung von Antigenen, wie Fibrinogen (Fg), Humanchoriongonadotropin (hCG) oder ähnlichen Materialien anzuwenden, da sie komplizierte Verfahrensweisen für die Herstellung der Reagenzien erforderlich macht und es schwierig ist, reproduzierbare Agglutinationsreaktionen zu erreichen, wenn die zu untersuchenden Materialien in Blut oder Urin vorliegen, das bzw. der verschiedene andere
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Substanzen enthalten, die die Reaktion beeinträchtigen können.
In
C) Immunochemistry, Vol. 12 (1975) 349-351 ist bereits vorgeschlagen worden, Antikörper und Antigene quantitativ dadurch zu bestimmen, dass man die oben erwähnten agglutinierten Latexteilchen mit einem Laserstrahl bestrahlt und die Änderung der Breite der Spektrallinien des gebeugten Lichts des Laserstrahls misst, um die mittlere Diffusionskonstante (D) zu bestimmen, die einen Hinweis auf die Brownsche Bewegung der agglutinierten Teilchen gibt, die ihrerseits umgekehrt proportional ist der Grösse der agglutinierten Teilchen. Da bei dieser Methode der mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierte Latex in einer extrem niedrigen Konzentration, die beispielsweise lediglich 0,001% beträgt, verwendet wird, wird die Geschwindigkeit der Anti-gen-Antikörper-Reaktion vermindert, so dass sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit dieser Methode zu wünschen übrig lassen. Weiterhin besitzt diese Methode den Nachteil, dass komplizierte Berechnungen unter Anwendung von Spektrumanalysenmethoden erforderlich sind, was komplizierte Massnahmen notwendig macht, und dass irgendwelche in der Probe vorhandenen Verunreinigungen vor der Messung entfernt werden müssen. Demzufolge hat sich auch diese Methode in der Praxis nicht durchsetzen können. In der oben angegebenen Druckschrift C ist weiterhin angegeben, dass die Bestimmung mit Hilfe der Trübungsmessmethode, die in der Literaturstelle A angegeben ist, extrem ungenaue Ergebnisse liefert (siehe Fig. 2 auf Seite 350 dieser Veröffentlichung).
Demzufolge ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin zu sehen, ein Verfahren anzugeben, mit der Antikörper und/oder Antigene in einer zu untersuchenden Probe mit hoher Präzision und mit guter Reproduzierbarkeit schnell bestimmt werden können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zum schnellen Nachweis der Tatsache, ob die Konzentration eines Antikörpers oder eines Antigens in einer Probe oberhalb oder unterhalb eines bestimmten Wertes liegt, und dies unter Verwendung einer extrem geringen Menge der Probe.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Bestimmung extrem geringer Mengen eines Antigens und/oder eines Antikörpers, die bislang praktisch nur durch den Radioimmuntest (Radioimmunoassay, RIA) bestimmt werden konnten, mit einer Präzision, die der bei dem Radioimmuntest erreichten entspricht oder besser ist, und dies wesentlich schneller und sicherer.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen anzugeben, das nicht nur zur Bestimmung von multivalenten oder polyfunktionellen Antigenen, sondern auch von unvollständigen Antigenen, beispielsweise von Haptenen, geeignet ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern und/oder Antigenen anzugeben, bei denen nicht nur die Agglutination der Antikörper und/oder Antigene ausgenützt wird, sondern auch deren die Agglutination inhibierende Reaktion.
Diese Aufgabe und diese Ziele werden nun erfindungsge-mäss dadurch gelöst, dass man ein Antigen und/oder einen Antikörper in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um vorliegt, umsetzt, die erhaltene Reaktionsmischung mit einer Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 [im, die mindestens 1,1 mal länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt und die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung misst, wobei bei der Messung der Extinktion die Bestrahlung jedoch nicht mit Strahlung einer Wellenlänge, welche mindestens l,5mal länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, erfolgt.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann besonders zweckmässig mit Hilfe einer weiter unten beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden.
Die Erfindung sei im folgenden näher anhand der beigefügten Zeichnungen erläutert.
In den Zeichnungen zeigen
Fig. 1 das Absorptionsspektrum von Wasser unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im, das in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 1 mm aufgenommen wurde;
Fig. 2 eine Kurve, die die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von dem Teilchendurchmesser des Polystyrollatex' wiedergibt;
Fig. 3 eine Kurve, die die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Reaktionszeit einer Antigen-Antikörper-Reaktion verdeutlicht ;
Fig. 4 ein schematisches Diagramm, das den Grundaufbau der erwähnten Vorrichtung wiedergibt;
Fig. 5 eine perspektivische Ansicht einer Absorptionszelle, die sowohl für Proben als auch für Kontrollproben oder Blindproben geeignet ist;
Fig. 6 eine schematische Darstellung einer Rühreinrichtung, die mit Vorteil verwendet werden kann;
Fig. 7 eine Eichkurve der prozentualen Absorption bei einer Wellenlänge von 1,2 um, die unter Verwendung von Stan-dard-Fibrinogen-Lösungen (Standard-Fg-Lösungen) und Antifibrinogen- Polystyrollatexteilchen (Anti-Fg-Polystyrolla-texteilchen) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,481 (im ermittelt wurde;
Fig. 8 eine Eichkurve der prozentualen Absorption, die bei einer Wellenlänge von 1,2 (im unter Verwendung von Antifibrinogen-Siliciumdioxidteilchen (Anti-Fg-Silicium-dioxidteilchen) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,32 (im und einer Reihe von Standard-Fibrinogen-Lösungen ermittelt wurde;
Fig. 9 eine Eichkurve für die Zeit, die bis zum Erreichen einer Asorption von 68,4% bei einer Wellenlänge von 1,2 Jim erforderlich ist, wenn man ein Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens (Anti-Fg-sensibilisiertes Latexreagens) mit jeder der Standard-Fibrinogen-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen umsetzt;
Fig. 10 eine Eichkurve der prozentualen Absorption, die bei einer Wellenlänge von 1,2 (im aufgenommen wurde, nachdem Oxytocin-Antiserum mit jeder der unterschiedliche Konzentrationen aufweisenden Standard-Oxytocin-Lösungen umgesetzt und dann die Reaktionsmischung mit Latexteilchen versetzt wurde, die mit Oxytocin sensibilisiert worden sind; (in Fig. 10 steht der Ausdruck «AD» auf der Ordinate für die prozentuale Absorption bei einer Konzentration von Null der Standard-Oxytocin-Lösung minus der prozentualen Absorption bei der angegebenen Konzentration der gleichen Lösung).
Fig. 11 eine Eichkurve der prozentualen Absorption, die bei einer Wellenlänge von 1,0 (im aufgezeichnet wurde, nachdem man Antihumanchoriongonadotropin-Serum mit jeder der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen mit unterschiedlicher Konzentration umgesetzt hat und dann die Reaktionsmischung mit Humanchoriongonadotropin-sensibi-lisierten Latexteilchen versetzt hat;
Fig. 12 eine Kurve, die die Änderung der Nachweisempfindlichkeit in Abhängigkeit von der Konzentration des Anti-fibrinogen-sensibilisierten Polystryrollatex' wiedergibt;
Fig. 13 eine Eichkurve der Extinktion bei 0,9 (im, die dadurch ermittelt wurde, dass man ein Antifibrinogen-sensi-
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Fig. 14 eine Eichkurve der Extinktion bei 1,10 [im, die man durch Umsetzen eines Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexreagens' mit jeder der Standard-Human-choriongonadotropin-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt hat.
In der Fig. 4 stehen die Bezugsziffer 1 für die Lichtquelle, die Bezugsziffer 2 für ein Filter, die Bezugsziffer 3 für die Probenzelle, die Bezugsziffer 4 für die Vergleichszelle, die Bezugsziffem 5 und 6 für Photozellen, die Bezugsziffer 7 für einen Verstärker und die Bezugsziffer 8 für eine Aufzeichnungseinrichtung.
Wie bereits erwähnt, zeigt die vorbekannte Methode, bei der das Ausmass der Agglutination, die dadurch bewirkt wird, dass man Antikörper- oder Antigen-sensibilisierte Latexteilchen mit einer ein Antigen oder einen Antikörper enthaltenden Probe in Kontakt bringt, über die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex' bestimmt wird, verschiedene Nachteile, wie eine geringe Genauigkeit und eine schlechtere Produzierbarkeit, da die Reaktion in einem stationären Zustand unter Verwendung eines extrem stark verdünnten Latex' durchgeführt werden muss. Weiterhin ist es bei diesem vorbekannten Verfahren erforderlich, zunächst jegliche Verunreinigungen aus der Probe zu entfernen, die die Trübung beeinflussen könnten.
Es ist ersichtlich, dass, wenn man ein Antigen und/oder einen Antikörper mit grosser Genauigkeit und guter Reproduzierbarkeit bestimmen will, man ein unlösliches Trägermaterial, beispielsweise Latexteilchen, das mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisiert ist, mit einer möglichst hohen Konzentration mit der zu behandelnden Probe in Kontakt bringen sollte, die das Antigen und/oder den Antikörper enthält, das bzw. der mit dem auf dem Träger vorliegenden Antikörper oder Antigen zu reagieren vermag, um hierdurch die verursachte Antigen-Antikörper-Reaktion zu beschleunigen, wobei diese Reaktion wünschenswerterweise unter Bewegung der Reaktionsmischung und nicht in stationärem oder unbewegtem Zustand durchgeführt werden sollte.
Es wurde nunmehr gefunden, dass man bei der Durchführung einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einem Antikörper oder einem Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, und einem in einer Probe enthaltenen entsprechenden Antigen oder Antikörper bei einer möglichst hohen Konzentration des Latex' unter nichtstationären oder nichtruhenden Bedingungen und zum gleichzeitigen quantitativen Nachweis des Ausmasses, in dem diese Reaktion abgelaufen ist, man besonders vorteilhafte Ergebnisse erzielt, wenn man:
1. ein unlösliches Trägermaterial mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 jim verwendet,
2. die Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 um, welche Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,1 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt und
3. die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung misst.
Der Grund hierfür ist darin zu sehen, dass das Ausmass der Antigen-Antikörper-Reaktion in Gegenwart der sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen in sehr guter Korrelation zu der Intensität des von der Mischung durchgelassenen Lichtes steht. Es ist ersichtlich, dass das Ausmass der Antigen-Antikörper-Reaktion auch der Menge (oder der Konzentration) des Antikörpers und/oder des Antigens in der Probe proportional ist, vorausgesetzt, dass die Reaktion unter bestimmten Bedingungen durchgeführt wird. Daher ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren die schnelle Bestimmung eines Antikörpers und/oder eines Antigens in einer Probe mit extrem hoher Genauigkeit mit Hilfe einer Methode, die sich von den herkömmlichen Methoden erheblich unterscheidet, bei denen die Trübung oder mit mittlere Diffusionskonstante bestimmt werden.
Die Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 Jim, die angewandt wird, liegt im nahen Infrarotbereich oder in einem Bereich des sichtbaren Lichtes, der sich an den Bereich des nahen Infrarots anschliesst. Vorzugsweise wendet man eine Strahlung an, deren Wellenlänge im nahen Infrarotbereich von 0,8 bis 1,8 um und insbesondere im Bereich von 0,9 bis 1,4 um liegt.
Zur Untersuchung von Molekülstrukturen oder Eigenschaften der Moleküle ist es bereits bekannt, Spektralanalysen durchzuführen, bei denen man Strahlung mit einer im Infrarotbereich liegenden Wellenlänge von mindestens 2,5 um oder Strahlung mit einer im ultravioletten Bereich liegenden Wellenlänge von nicht mehr als 0,4 (im verwendet. Die Strahlung des nahen Infrarotbereichs oder des sich daran anschliessenden sichtbaren Bereichs, die angewandt wird und das der Vereinfachung halber im folgenden als «Strahlung des nahen Infrarotbereiches» bezeichnet wird, ist bislang nur begrenzt angewandt worden und hat nur geringes Interesse gefunden.
Es wurde nunmehr festgestellt, dass die oben erwähnte Strahlung des nahen Infrarotbereiches besonders geeignet ist, da es gut durch wässrige Medien, wie Wasser, wässrige Lösungen oder dergleichen, die im allgemeinen die Grundmedien von Antigene und Antikörper enthaltenden Proben darstellen, wie Wasser, Sera, Urin, Salzlösungen usw. sowie die Grundmedien der oben erwähnten Latizes, hindurchdringt, wobei insbesondere die Strahlung des nahen Infrarotbereiches mit Wellenlängen von 0,8 bis 1,4 um und von 1,53 bis 1,88 (im von wässrigen Medien nur in geringem Ausmass absorbiert wird. Es hat sich ferner gezeigt, dass, wenn man die durch Umsetzen der oben angesprochenen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 (im und vorzugsweise von 0,1 bis 1 (im mit einem Antigen und/oder Antikörper in einer Probe der unter Bildung der Agglutination erhaltene Reaktionsmischung mit einer Strahlung in dem oben angesprochenen nahen Infrarotbereich, dessen Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,1 und vorzugsweise von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt, die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung sehr genau dem bei der Antigen-Antikörper-Reaktion erreichten Agglutinationsgrad entspricht. Wie bereits erwähnt, wird bei der Messung der Extinktion nicht mit einer Strahlung einer Wellenlänge bestrahlt, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen.
Der hierin verwendete Ausdruck «prozentuale Absorption» ist durch die nachstehende Gleichung 1 definiert:
S = x 100 (%) (1)
worin S für die prozentuale Absorption, Io für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle das gleiche System wie die Reaktionsmischung enthält, mit dem Unterschied, dass das zu bestimmende Antigen und/oder der zu bestimmende Antikörper nicht enthalten sind, und I für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle die
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Reaktionsmischung enthält, stehen. Wie aus der obigen Definition ersichtlich ist, kann man die hierin angesprochene prozentuale Absorption auch als Prozentsatz des abgeschwächten oder nicht durchgelassenen Lichtes betrachten. Da die prozentuale Absorption der Extinktion (A), die mit Hilfe 5 eines üblichen Spektrophotometers, wie es beispielsweise in der Infrarotspektrometrie verwendet wird, gemessen werden kann, kann man die prozentuale Absorption der Bequemlichkeit halber auch über die Extinktion ausdrücken.
In der Infrarotspektrometrie ist die Extinktion (A) durch 10 die folgende Gleichung definiert:
A = log -y- (2)l5
worin Io und I die bezüglich der Gleichung 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.
Demzufolge ist es möglich, Antigene und Antikörper 20 durch Messen entweder der durch die Gleichung 1 definierten prozentualen Absorption oder der durch die Gleichung 2 definierten Extinktion zu bestimmen. In beiden Fällen stimmen die erhaltenen Ergebnisse hinreichend gut miteinander überein, vorausgesetzt, dass die Messung mit der erforderli- 25 chen Sorgfalt durchgeführt wird.
Kurz betreffen die oben angesprochene prozentuale Absorption (S) oder die oben angesprochene Extinktion (A) das relative Verhältnis von Io:I. Wenn das Grundmedium der Probe ein transparentes flüssiges Medium ist, kann man den 30 Wert von Io unter Verwendung lediglich der Suspension durchführen, die die Antikörper- oder Antigen-sensiblisier-ten unlöslichen Trägerteilchen enthält, welche Suspension beispielsweise mit Wasser auf die gleiche Konzentration wie die der Mischung verdünnt sein kann. 33
Beispielsweise ist in der Fig. 1 durch Auftragen der Wellenlänge des Lichtes auf der Abszisse und der prozentualen Transmission des Lichtes auf der Ordinate das prozentuale Transmissionsspektrum einer Wasserschicht mit einer Dicke von 1 mm in dem Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 |-im 40 dargestellt. Aus der Fig. 1 ist zu ersehen, dass Strahlung mit Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 1,4 um Wasser, dass das für Latizes und Proben weitestgehend verwendete Grundmedium darstellt, praktisch ohne merkliche Absorption durchdringt und dass Licht mit einer Wellenlänge von 1,53 bis 1,88 45 (im Wasser ebenfalls im wesentlichen durchdringt, so dass man Licht mit einer Wellenlänge innerhalb dieser Bereiche bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwenden kann. Weiterhin ist aus der Fig. 1 zu erkennen, dass Strahlung mit Wellenlängen im Bereich von 2,1 bis 2,35 (im für Wasser eine Trans- 50 mission im Bereich von 20% zeigt, so dass man Strahlung mit solchen Wellenlängen auch in Kombination mit einem hochempfindlichen Photometer verwenden kann, wenngleich dies nicht bevorzugt ist.
Die Fig. 2 verdeutlicht die Beziehung zwischen der 33
Extinktion eines Polystyrollatex' (mit einem Feststoffgehalt von 1 Gew.-%), die auf der Ordinate aufgetragen ist, und der Wellenlänge des Lichts, die in (im auf der Abszisse aufgetragen ist, wenn man die Bestimmung in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm durchführt. In der Fig. 2 gibt die 60 Kurve A die Änderung der Extinktion eines Polystyrollatex' wieder, dessen Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,481 um aufweisen, während die Kurve B für einen Pyrolstyrollatex steht, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,804 (im beträgt. Zur Bestimmung der Extink- 03 tion wird der Latex zur Vereinfachung der Messung verdünnt, wonach der durch Multiplizieren des beobachteten Extinktionswertes mit dem Verdünnungsfaktor ermittelte Wert als
Extinktion des Latex' bezeichnet wird.
Aus der Fig. 2 ist zu ersehen, dass die Extinktion des Latex' bei einer Wellenlänge von weniger als 0,6 (im in signifikantem Masse zunimmt, so dass es ziemlich schwierig ist, die Änderung der prozentualen Absorption einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung unter Verwendung von Licht mit einer solchen Wellenlänge zu messen, während bei der Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 |im und insbesondere von mindestens 1 (im die Extinktion des Latex' also solchem relativ gering ist, so dass Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 (im und vorzugsweise von mindestens 1 um für die oben angesprochene Messung der prozentualen Absorption einer solchen Reaktionsmischung geeignet ist.
Vergleicht man die in der Fig. 2 dargestellte Kurve A mit der dort gezeigten Kurve B, so ist festzustellen, dass die Extinktion des Polystyrollatex' mit zunehmendem durchschnittlichem Durchmesser der Polystyrolteilchen zunimmt. Demzufolge ist ersichtlich, dass Latexteilchen mit einem extrem grossen durchschnittlichen Durchmesser für das erfin-dungsgemässe Verfahren nicht geeignet sind. Von der Inhaberin wurde gefunden, dass die geeigneten unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 |im aufweisen müssen und dass Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 1 (im und vorzugsweise von 0,2 bis 0,8 (im geeignet sind.
Die Fig. 3 gibt die Beziehung zwischen der Änderung der prozentualen Absorption einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung, die auf der Ordinate aufgetragen ist, und der Wellenlänge des Lichtes, die in (im auf der Abszisse aufgetragen ist, bei verschiedenen Reaktionszeiten wieder, wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion in der in Beispiel 1 angegebenen Weise durchgeführt wird, mit dem Unterschied, dass man einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 (im einsetzt. Die in der Fig. 3 dargestellten Kurven C, D und E stehen für die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung, nachdem die Antigen-Antikörper-Reaktion während 3,10 bzw. 20 Minuten durchgeführt worden ist.
Die Fig. 3 lässt erkennen, dass, wenn man die Extinktion der Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge von weniger als 0,6 (im bestimmt, im Wellenlängenbereich von etwa 0,6 bis 0,4 (im der Ablauf der Reaktion (das heisst die Reaktionszeit) nicht der prozentualen Absorption entspricht und dass in einem Wellenlängenbereich von nicht mehr als etwa 0,4 (im die Extinktion sich mit dem Fortschreiten der Reaktion nicht merklich ändert. Andererseits zeigt bei Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von mindestens etwa 0,75 (im die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung eine signifikant gute Korrelation mit der Reaktionszeit oder dem Fortschritt der Reaktion. Die in den Kurven C, D und E der Fig. 3 gestrichelt angegebenen Bereiche deuten daraufhin, dass in diesen Wellenlängenbereichen die prozentuale Absorption selbst bei Anwendung einer erhöhten Schlitzbreite nicht genau gemessen werden kann, da die Absorption des Wassers in diesen Bereichen wesentlich höher ist.
Wie aus dem weiter unten angegebenen Beispiel 4 zu ersehen ist, erzielt man bei der Verwendung eines Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 (im eine gute Korrelation zwischen der prozentualen Absorption der Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung und der Konzentration des Antigens, wenn man Licht mit einer Wellenlänge verwendet, die um einen Faktor von mindestens etwa 1,1 länger ist als der durchschnittliche Teilchendurchmesser, das heisst Licht mit einer Wellenlänge von etwa 1,2 (im, vorausgesetzt, dass die Konzentration des Antigens in der Probe nicht grösser ist als 0,6 (ig/ml (0,6 x 10-6 g/ml). In die-
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sera Fall kann daher die quantitative Bestimmung durch Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 um oder mehr durchgeführt werden.
Wenn man Latexteilchen mit einem relativ geringen durchschnittlichen Durchmesser verwendet, ist es vorteilhaft, wie es aus der Fig. 3 zu ersehen ist, Strahlung des nahen Infrarotbereiches mit einer Wellenlänge im Bereich von etwa 0,8 bis 1,4 (im und vorzugsweise 1 bis 1,4 jj.m, welche Wellenlänge mindestens um den Faktor 2 grösser ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, zu verwenden.
Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung ist es erwünscht, eine Reaktionsmischung aus einem Trägermaterial spezifischer Teilchengrösse, auf dem ein Antikörper oder ein Antigen vorliegt und einem Antigen oder einem Antikörper oder einer Mischung davon in einer Probenlösung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 [im zu bestrahlen, um zunächst einen Wellenlängenbereich zu ermitteln, in dem eine quantitative Korrelation zwischen der Konzentration des Antigens, des Antikörpers oder der Mischung davon (einschliesslich des Reaktionsprodukts) in der Probenlösung und der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung besteht, und anschliessend die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption mit Licht mit einer innerhalb dieses Wellenlängenbereiches liegenden spezifischen Wellenlänge zu bewirken.
Der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen liegt vorteilhafterweise im Bereich von 0,1 bis 1,0 um, noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 (im und am bevorzugtesten im Bereich von 0,3 bis 0,6 (im. Die Wellenlänge der verwendeten Strahlung liegt vorzugsweise im Bereich von 0,6 bis 1,4 (im, bevorzugter im Bereich von 0,8 bis 1,4 um und am bevorzugtesten im Bereich von 1 bis 1,4 (im.
Verwenden kann man als unlösliche Trägerteilchen Mikroteilchen aus organischen Polymeren, die im wesentlichen in dem bei der erfindungsgemässen Bestimmung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind und die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches besitzen, beispielsweise Latizes von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copo-lymere, die man durch Emulsionspolymerisation erhält; dispergiate Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus prodigiosus, Rickettsia, Zellmembranfragmente usw.; sowie Mikroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid und feinpulverisierte Mineralien, Metalle und dergleichen.
Um das Trägermaterial zu sensibilisieren, kann man den Antikörper oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem Trägermaterial adsorbieren oder fixieren.
Antikörper bestehen aus Proteinen, während Antigene aus einem Vertreter einer Gruppe von verschiedenartigen Substanzen bestehen, wie beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und dergleichen. Es wurde bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, um diese Antikörper oder Antigene, insbesondere Antikörper, auf unlöslichen Trägerteilchen zu fixieren.
Wenn ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten, an unlöslichen Trägermaterialien fixiert werden soll, ist es von Vorteil, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe eines Kupplungsmittels, und anschliessend das Antigen chemisch an dem modifizierten Trägermaterial zu adsorbieren.
Wenn das Trägermaterial ein Latex einer hochmolekularen Substanz ist, die eine funktionelle Gruppe, wie eine Sulfo-gruppe, eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine davon abgeleitete Gruppe aufweist, kann man ein Antigen oder einen Antikörper direkt chemisch an diesem Latex adsorbieren.
Als erfindungsgemäss verwendetes flüssiges Medium ist Wasser am bevorzugtesten, wenngleich man auch eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel verwenden kann. Geeignete mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel schliessen Alkohole, wie Methanol, Äthanol usw., und Ketone, wie Aceton, ein.
Im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren, bei denen die Trübung bestimmt oder die mittlere Diffusionskonstante mit Hilfe eines Laserstrahls gemessen wird, ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren Bedingungen, bei denen die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen in möglichst aktiver Weise mit dem entsprechenden Antigen und/oder Antikörper reagieren können.
Zu diesem Zweck kann man die unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise die Latexteilchen, die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisiert worden sind (und die im folgenden als «sensibilisierte Trägerteilchen» bezeichnet werden), in Form einer Suspension verwenden, die eine Konzentration von nicht weniger als 0,05 GeW.-%, bevorzugter eine Konzentration im Bereich von 0,05 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter eine Konzentration von 0,2 bis 0,6 Gew.-% aufweist. Wenn die Konzentration der sensibilisierten Trägerteilchen zu hoch ist, wird, wie es aus der Fig. 2 zu ersehen ist, die Durchlässigkeit der Suspension derart vermindert, dass die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption erschwert wird. Innerhalb des Konzentrationsbereiches, in dem die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption möglich ist, sind jedoch höhere Konzentrationen der sensibilisierten Trägerteilchen in der Suspension bevorzugt, da es hierdurch möglich wird, die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung der Antigene und der Antikörper zu steigern.
Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden werden die sensibilisierten Trägerteilchen und die das Antigen und/ oder den Antikörper enthaltende Probe unter nichtstationären Bedingungen, das heisst nicht unter Stehenlassen, umgesetzt. Zu diesem Zweck kann man die Reaktion mit Vorteil unter Bewegen der Reaktionsmischung durchführen. Da die Reaktion im allgemeinen in einer dünnen oder schmalen Zelle durchgeführt wird, erreicht man das Bewegen der Reaktionsmischung bequemerweise zum Beispiel'dadurch, dass man einen Stab vertikal oder transversal durch die Zelle führt. Natürlich kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe ausserhalb der Zelle während einer bestimmten Zeitdauer unter vorbestimmten Bedingungen umsetzen und dann die Reaktionsmischung zur Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption in die Zelle einbringen. Um die Reaktionsbedingungen jedoch bei sämtlichen Messungen reproduzierbar zu halten, insbesondere hinsichtlich der Reaktionszeit, kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe unter vorbestimmten, nichtstationären Bedingungen in einer in ein Spektrophotometer eingebrachten Zelle umsetzen, so dass eine genauere Bestimmung durch Messen der Extinktion oder der prozentualen Absorption möglich wird, indem man die Extinktion oder die prozentuale Absorption unmittelbar nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit misst, oder indem man die Zeit bestimmt, die notwendig ist, bis die Extinktion oder die prozentuale Absorption einen vorher bestimmten Wert erreicht, währenddem man die Reaktion unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen fortsetzt. In dieser Weise wird es erfindungsgemäss nicht nur möglich, die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers und einer Probe zu bestimmen, die bislang nur visuell in halbquantitativer Weise beobachtet werden konnte, sondern es wird auch die Bestimmung eines
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Antigens und/oder eines Antikörpers in Spurenmengen möglich, wie es bislang nur mit Hilfe des Radioimmuntests (RIA) möglich war, und dies mit einer Präzision, die gleich oder besser ist als die des Radioimmuntests.
Im allgemeinen wird aus einer Standardprobe, die eine definierte Menge des gleichen Antigens und/oder des Antikörpers enthält, zunächst eine Reihe von verdünnten Standardproben hergestellt, indem man die Standardprobe unter Anwendung verschiedener Faktoren verdünnt. Dann wird jede der verdünnten und unverdünnten Standardproben unter vorbestimmten Bedingungen mit unlöslichen Trägerteilchen, die mit einer definierten Menge eines entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibilisiert worden sind, umgesetzt, wonach man die Extinktion oder die prozentuale Absorption einer jeden Reaktionsmischung bestimmt, um eine Eichkurve für die bestimmte Kombination aus dem Antigen und/oder dem Antikörper und den sensibilisierten Trägerteilchen zu erstellen, die die Beziehung zwischen der Menge (der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobe und der Extinktion oder der prozentualen Absorption wiedergibt (diese Art von Eichkurve wird nachfolgend der Einfachheit halber als «Eichkurve A» bezeichnet. Anschliessend wird die zu bestimmende unbekannte Probe mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen, die für die Erstellung der Eichkurve verwendet wurden, unter den gleichen Bedingungen, wie sie auch für die Erstellung der Eichkurve angewandt wurden, umgesetzt, wonach die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung gemessen wird. Dann kann man die Menge (oder die Konzentration) des Antigens und/oder des Antikörpers in der unbekannten Probe ermitteln, indem man den in dieser Weise ermittelten Wert der Extinktion oder der prozentualen Absorption mit der Eichkurve A vergleicht.
Alternativ kann man bei der oben beschriebenen Ermittlung der Eichkurve eine andere Art von Eichkurve ermitteln, die die Beziehung zwischen der Menge (oder der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobe und der Reaktionszeit wiedergibt, die bis zum Erreichen eines vorbestimmten Wertes der Extinktion oder der prozentualen Absorption erforderlich ist (welche Eichkurve nachfolgend als «Eichkurve B» bezeichnet wird). Auch in diesem Fall wird eine unbekannte Probe unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie auch für die Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden, mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen umgesetzt, wonach die Menge (oder die Konzentration) des Antigens und/oder des Antikörpers in der unbekannten Probe ermittelt werden kann, indem man die Zeit feststellt, die dazu erforderlich ist, den vorbestimmten Wert der Extinktion oder der prozentualen Absorption zu erreichen.
Somit kann man erfindungsgemäss die Menge oder die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe dadurch bestimmen, dass man entweder
A) die Extinktion oder die prozentuale Absorption der unbekannten Probe misst (wobei man zu Eichzwecken die Eichkurve A verwendet) oder
B) die Reaktionsgeschwindigkeit oder die bis um Erreichen eines bestimmten Wertes der Extinktion oder der prozentualen Absorption erforderliche Reaktionszeit bestimmt (wobei man in diesem Fall zum Eichen die Eichkurve B verwendet).
Wie bereits beschrieben, ist die oben angesprochene Methode A als Bestimmungssystem mit sehr grosser Präzision nicht nur dann geeignet, wenn die Konzentration eines Antigens oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe relativ hoch ist, sondern auch dann, wenn diese Konzentration derart gering ist, dass sie bislang nur mit Hilfe des Radioimmuntests (RIA) bestimmt werden konnte. Andererseits ist die obige Methode B, gemäss der die Reaktionsgeschwindigkeit gemessen wird, dazu geeignet, eine relativ grosse Menge (oder Konzentration) eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe zu bestimmen, und ist dadurch besonders vorteilhaft, dass die Messung ziemlich einfach ist.
Wie sich gezeigt hat, besitzt die oben angesprochene Eichkurve A eine schwache S-Form statt einer geraden Linie, was jedoch auf die Präzision der Bestimmung keinen nachteiligen Einfluss hat. Der Grund dafür, dass die Eichkurve S-förmig ist, wie es oben beschrieben wurde, scheint offenbar der zu sein, dass die Reaktionsgeschwindigkeit die Form der Kurve bei niedrigeren Konzentrationen des Antigens und/oder des Antikörpers beeinflusst, während bei höheren Konzentrationen eine Sättigung der aktiven Stellen des Trägermaterials eintritt. Es ist natürlich möglich, den linearen Abschnitt der S-förmigen Kurve zu vergrössern, indem man die Bedingungen bei der Ermittlung der Eichkurve entsprechend auswählt und lediglich diesen Bereich zur Bestimmung der unbekannten Proben heranzieht.
Es ist von Vorteil, wenn die zur Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung verwendete Zelle eine Dicke besitzt, die geringer ist als die einer Zelle, wie sie für die Analyse eines Spektrums im sichtbaren Bereich angewandt wird, so dass Zellen mit einer Dicke im Bereich von 0,5 bis 10 mm und insbesondere von 1 bis 5 mm bevorzugt sind.
Zur Durchführung einer äusserst empfindlichen Bestimmung von Spurenmengen eines Antigens oder eines Antikörpers, die bislang mit Hilfe des Radioimmuntests (RIA) ermittelt wurden, ist es besonders vorteilhaft:
a) ein Antigen oder einen Antikörper mit einer möglichst hohen Gleichgewichtskonstanten einzusetzen,
b) Latexteilchen insbesondere mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 bis 0,8 (im zu verwenden, deren Teilchengrössenverteilung möglichst eng ist,
c) die Extinktion oder die prozentuale Absorption mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,0 bis 1,4 um zu messen,
d) eine relativ lange Reaktionszeit anzuwenden, die beispielsweise im Bereich vonl bis 3 Stunden liegt, und e) die Konzentration des sensibilisierten Latexträgermaterials zu erhöhen, vorausgesetzt, dass sich die Extinktion oder die prozentuale Absorption bei dieser Konzentration messen lässt.
Wenn man auf der anderen Seite durch Messen der Reaktionsgeschwindigkeit (unter Verwendung der Eichkurve B) eine unbekannte Probe in relativ kurzer Zeit genau bestimmen will, ist es von Vorteil:
f) Latexteilchen zu verwenden, die einen relativ grossen durchschnittlichen Durchmesser besitzen,
g) die Konzentration der Trägerteilchen in dem Latex zu erhöhen, vorausgesetzt, dass die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption bei dieser Konzentration möglich ist und h) eine relativ kurze Reaktionszeit anzuwenden, die beispielsweise im Bereich von 5 Sekunden bis 10 Minuten und vorzugsweise im Bereich von 10 Sekunden bis 3 Minuten liegt.
Wenn man in diesem Fall die Zeit, die zum Erreichen eines vorbestimmten Wertes der Extinktion oder der prozentualen Absorption erforderlich ist, auf der Ordinate und die Konzentration auf der Abszisse aufträgt, und zwar jeweils im logarithmischen Massstab, erhält man die Eichkurve B in Form einer vorteilhaften geraden Linie.
Die Erfindung wurde oben bezüglich der Bestimmung eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Probe beschrieben, die darauf beruht, dass man das durch Inkontaktbringen des Antigens und/oder des Antikörpers in der Probe mit sen-
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sibilisierten Trägerteilchen verursachte Latex-Agglutinationsphänomen (das heisst das LA-System) anwendet. Das erfin-dungsgemässe Verfahren ist auch für die Bestimmung einer Probe geeignet, bei der die inhibierende Wirkung gegen die oben erwähnte Agglutination das Prinzip der Messung ist (das heisst dass man ein Ll-System anwendet).
Unvollständige Antigene, wie beispielsweise Haptene, kann man dadurch bestimmen, dass man das erfindungsge-mässe Verfahren nach dem Ll-System anwendet. In diesem Fall kann man beispielsweise ein Antigen auf den erfindungs-gemäss verwendeten unlöslichen Trägerteilchen fixieren, die sensibilisierten Trägerteilchen in einer kompetitiven Reaktion mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers, der mit einem Antigen einer vorbestimmten Konzentration, das heisst einer Standard-Antigen-Lösung, umgesetzt worden ist, umsetzen und die Extinktion oder die prozentuale Absorption der erhaltenen Reaktionsmischung messen. Diese Massnahmen werden bei verschiedenen Konzentrationen der Standard-Antigen-Lösungen wiederholt, um die Eichkurve C zu ermitteln. Anschliessend wird eine unbekannte Probe mit dem gleichen Antikörper bestimmter Konzentration umgesetzt, worauf die erhaltene Reaktionsmischung mit dem sensibilisierten Trägermaterial umgesetzt wird. Diese Reaktionen sollten unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie bei der Ermittlung der Eichkurve C angewandt wurden. Dann misst man die Extinktion oder die prozentuale Absorption der letztendlich mit den sensibilisierten Trägerteilchen erhaltenen Reaktionsmischung und vergleicht den Wert zur Ermittlung der Menge (oder der Konzentration) des Antigens in der unbekannten Probe mit der Eichkurve C.
Somit gelingt die quantitative Bestimmung einer grossen Vielzahl von Antigenen und/oder Antikörpern, beispielsweise
1. bei der Blutuntersuchung von Patienten oder Blutspendern, was für Notmassnahmen unerlässlich ist; beispielsweise kann man die Blutgruppensubstanzen, das Au- oder HB-Antigen oder andere Verunreinigungen im Blut oder Fibrin/ Fibrinogen-Abbauprodukte (FDP) bestimmen, was sich in jüngster Zeit als nützlich erwiesen hat bei der Überwachung der Genesung von Patienten mit Nierenplantation oder mit Nierenversagen;
2. zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin (hCG), das eine wichtige Rolle spielt bei der Schwangerschaftsdiagnose oder bei der Überwachung der Genesung von Chorionepitheliomen ;
3. zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin oder von Östriolglucuronid, das ein Stoffwechselprodukt des Folli-kelhormons darstellt, im Urin, welche Bestimmung für die Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung ist;
4. zur Bestimmung von Oxytocin im Blut, von welcher Substanz man annimmt, dass sie Uteruskontraktionen verursacht;
5. zur Bestimmung bestimmter Nebennierenrindenhor-mone, wie Corticoiden und Aldosteron oder adrenocortico-tropen Hormonen (ACTH);
6. zur Bestimmung des Insulins bei Diabetikern oder zur Bestimmung des Follikel-stimulierenden Hormons, des luteinisierenden Hormons, von Östrogenen, des Gelbkörperhormons usw.;
7. zur Bestimmung von Gastrin oder Sekretin, bei dem es sich um ein Magen-Darm-Hormon handelt;
8. zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antikörpers in Körperflüssigkeiten von Patienten, die an einer Allergie, an Syphillis, hämolytischer Streptokokzidiose, Röteln, Autoimmunkrankheiten, wie Collagenose und anderen Infektionskrankheiten und dergleichen leiden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann natürlich auch zur qualitativen oder halbquantitativen Bestimmung dieser
Antigene und/oder Antikörper angewandt werden.
Die eingangs erwähnte, für die Durchführung des Verfahrens besonders zweckmässige Vorrichtung umfasst:
a) unlösliche Trägerteilchen, auf denen ein Antikörper oder ein Antigen vorliegt bzw. fixiert ist, welche Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um aufweisen;
b) eine Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 10 mm zur Aufnahme der durch Umsetzen des auf dem unlöslichen Trägermaterial vorliegenden Antikörpers oder Antigens mit einem entsprechenden Antigen und/oder Antikörper in einem flüssigen Medium erhaltenen Reaktionsmischung; und c) ein Photometer zum Messen der Extinktion oder der prozentualen Absorption, das mit einer Bestrahlungseinrichtung ausgerüstet ist, die dazu geeignet ist, Licht mit einer bestimmten Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 jim abzugeben.
Die Messvorrichtung kann neben den Vorrichtungsmerkmalen a), b) und c) einen ähnlichen Aufbau aufweisen wie herkömmliche Photometervorrichtungen.
Wie aus der Fig. 4 zu erkennen ist, umfasst der Grundaufbau der Vorrichtung eine Bestrahlungseinrichtung mit einer Lichtquelle 1 und einem Filter oder Prisma 2; eine Probenzelle 3 für die Aufnahme der Probe der zu bestimmenden Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung und eine Vergleichszelle oder Referenzzelle 4 zur Aufnahme einer zur Kompensation dienenden Blindprobe; Photozellen 5 und 6 zur Messung des durch die entsprechenden Zellen hindurchtretenden Lichtes unter Bildung von elektrischen Signalen; einen Verstärker 7 zum Verstärken der elektrischen Signale und eine Anzeige- oder Aufzeichnungseinrichtung 8 zur Anzeige oder Aufzeichnung der verstärkten elektrischen Signale.
Die Lichtquelle 1 kann eine übliche Wolframlampe sein, deren Licht mit Hilfe des Filters oder Prismas 2 monochro-matisiert wird, um eine Strahlung mit einer spezifischen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 um, vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,8 um und noch bevorzugter im Bereich von 0,9 bis 1,4 jj.ni zu bilden, der durch die Zellen 4 und 5 geführt wird. Beispielsweise kann man ein Interferenzfilter, das eine Wellenlänge von 1200 ± 50 mp.m ergibt, als Filter verwenden, oder man kann als Prisma ein Quarzprisma oder ein Glasprisma einsetzen.
Das in dieser Weise monochroamtisierte Licht wird mit Hilfe eines Schlitzes oder einer Linse gebündelt, bevor es durch die Probenzelle 3 und die Vergleichszelle 4 geführt wird. Die Probenzelle 3 und die Vergleichszelle 4 können aus durchsichtigem Glas oder einem durchsichtigen synthetischen Harz (beispielsweise einem Acrylharz) bestehen und können einen schachtelartigen Aufbau mit rechteckigem oder länglichem Querschnitt besitzen (wie es in der Fig. 5 dargestellt ist). Die lichtdurchlässigen Fenster besitzen für Licht mit Wellenlängen von 0,6 bis 2,4 Jim vorzugsweise eine Transmission von mindestens 30% und vorzugsweise von 80% oder mehr.
Als Photozellen 5 und 6 kann man mit Vorteil Bleisulfid-Photoleiterelemente verwenden. Die in dieser Weise durch die Photozellen gebildeten elektrischen Signale können mit Hilfe des Verstärkers 7 in üblicher Weise verstärkt und in der Anzeige- bzw. Aufzeichnungsvorrichtung 8 visuell angezeigt oder aufgezeichnet werden.
Wenn man einen Zeitmechanismus in die Anzeige- oder Aufzeichnungs-Einrichtung 8 einbaut, ist es möglich, die Extinktion oder die prozentuale Absorption automatisch nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit zu messen, oder die Zeit zu bestimmen, die erforderlich ist, dass die Extinktion einen vorbestimmten Wert erreicht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probenzelle 3 mit einer Bewegungseinrichtung versehen, beispielsweise mit einem in der Zelle bewegbaren Mischstab.
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Die Fig. 6 gibt eine bevorzugte Ausführungsform des Bewegungsmechanismus' zur Bewegung der Mischung 9 aus einer Probe und sensibilisierten Trägerteilchen (beispielsweise sensibilisiertem Latex) wieder, die in der Probenzelle 3 vorliegt.
Wie aus der Fig. 6 zu erkennen ist, kann man zur Bewegung der Mischung 9 in der Zelle 3 den L-förmigen Mischstab 11 auf- und abwärts bewegen, indem man die T-förmige Verbindungsstange 14 auf- und abbewegt, wobei die Verbindungsstange 14 über ihre obere flache Platte 14' mit einer sich drehenden Scheibe 12 im Eingriff steht, die von einer Exzenterwelle 13 angetrieben wird. Mit der Bezugsziffer 17 ist ein Lichtabschirmungsdeckel bezeichnet, durch den die Verbindungsstange 14 über ein Rohr 15 geführt ist, das an und in dem Deckel 17 befestigt ist. Die Verbindungsstange 14 wird durch die Drehung der Exzenterscheibe 12 nach unten gedrückt und dann durch die Ausdehnungskraft der Feder 16, die zwischen dem Deckel 17 und der oberen flachen Platte 14 der Verbindungsstange 14 angeordnet ist, wieder nach oben bewegt.
Wenn die in der Fig. 4 gezeigte Probenzelle 3 den Aufbau besitzt, wie er beispielsweise in der Fig. 6 wiedergegeben ist, kann man die Zelle 3 ins Dunkle, das von dem Sonnenlicht abgeschirmt ist, einbringen und eine Mischung aus einer zu bestimmenden Probe und sensibilisierten Trägerteilchen (einem sensibilisierten Latex) in der Zelle 3 mit Hilfe des L-förmigen Mischstabes 11 durchmischen, währenddem die Zelle mit Licht einér ausgewählten Wellenlänge innerhalb des nahen Infrarotbereiches bestrahlt wird, so dass es möglich ist, die Mischung zu bewegen, ohne den Lichtstrahl zu unterbrechen. Somit kann man durch die Anwendung der oben beschriebenen Vorrichtung die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und den sensibilisierten Trägerteilchen beschleunigen, währenddem die Reaktion unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen abläuft, wobei es weiterhin möglich ist, die Reaktion unmittelbar nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit zu unterbrechen oder genau die Reaktionszeit abzulesen, die abgelaufen ist, bis die Extinktion oder die prozentuale Absorption einen vorbestimmten Wert erreicht hat.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisierten Latexreagens' (Antifibrinogen-Latexreagens, Anti-Fg-Latexreagens)
Zu 10 ml einer Lösung von Antihumanfibrinogen-Antikörpern (Anti-Fg-Antikörper) (mit einer Konzentration von 2 mg/ml) in einem Glycinpuffer gibt man 1 ml eines Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 (im (der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist und von der Firma Dow Chemical Co. erhältlich ist), rührt die Mischung bei Raumtemperatur während 30 Minuten durch, erwärmt auf 40 °C, rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur und zentrifugiert unter Kühlen auf 2 bis 4°C während 50 Minuten (bei 12000 min-1). Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab und suspendiert die Antifibrinogen-Antikörper-sensibilisierten Latexteilchen in einer Rinderserumalbuminlösung (mit einer Konzentration von 0,2 Gew.-%) unter Bildung eines Antifibrinogen-sensibili-sierten Latexreagens', das die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.
2. Aufnahme einer Eichkurve
Man beschickt ein Kunststoffreagenzglas (mit einem inneren Durchmesser von 7 mm und einer Länge von 70 mm) mit einem aliquoten Anteil von 0,1 ml des gemäss Abschnitt bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens' und 0,3 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung (Standard-Fg-Lösung) (in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält), die Fibrinogen in der in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Konzentration enthält, und schüttelt die Mischung während 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung mit 200 Schüttelvorgängen pro Minute, um die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen zu lassen. Unmittelbar darauf wird die in dem Reagenzglas enthaltene Reaktionsmischung in eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm überführt, wonach man die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 |im mit Hilfe eines automatischen Spektrophotographen bestimmt (Hitachi Ltd., Model EPS-3), wozu man als Vergleichslösung eine Suspension von 0,1 ml des Antifibrinogen-Latexreagens' verwendet, das mit 0,3 ml der isotonischen Natriumchloridlösung verdünnt worden ist, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält. Die Messung wird mit jeder Standard-Fibrinogenlösung zweimal durchgeführt, und die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I
Konzentration der
Prozentuale Absorption bei
1,2 [im
Standard-Fibrinogenlösung Erste
Zweite
Mittelwert
(Hg/ml)
Messung
Messung
0,1
53,9
56,6
55,3
0,2
85,4
83,4
84,4
0,3
91,7
93,2
92,5
0,4
95,3
95,3
95,3
0,5
96,0
96,3
96,2
Wenn man die obigen Werte graphisch aufträgt, und zwar die Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung auf der Abszisse und den Mittelwert der prozentualen Absorption bei 1,2 (im (der Wellenlänge des angewandten Lichtes) auf der Ordinate, so erhält man die in der Fig. 7 dargestellte Eichkurve.
3. Quantitative Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben
Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut, Urin oder der Flüssigkeit aus dem Brustkorb (aus dem Brustfellraum) und trennt Serum oder Plasma davon ab, wenn es sich bei der Probe um eine Blutprobe handelt. Dann behandelt man einen aliquoten Anteil von 0,3 ml der Probe oder der verdünnten Probe mit 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 gebildeten Anti-Fibrinogen-Latexreagens' in der in dem Abschnitt 2 angegebenen Verfahrensweise, wonach man in der in Abschnitt 2 beschriebenen Weise die prozentuale Absorption misst. Unter Verwendung der gemäss Abschnitt 2 ermittelten Eichkurve liest man die dem Wert der prozentualen Absorption entsprechende Fibrinogen-Konzentration ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt.
Zu Vergleichszwecken sind in der nachstehenden Tabelle II auch die Werte angegeben, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S.M. Ratkey et al. Brit. J. Haematol. 30 (1975) 145-149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku (Clinical Science), Vol. 12 (1976) 507; und Fujimaki, Ike-matsu, Takeuchi und Kato, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology), 21 (1973), 973) ermittelt hat.
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Tabelle II
Unbekannte Probe
Patient Material Nr.
Verdün- Gemessene nungsfaktor prozentuale Absorption
Fibrinogenkonzentration in der unbekannten Probe (ug/ml)
erfindungsge- RIAMethode Objektträgerme-mässes thode
Verfahren
1
Urin x2
82,7
0,402
0,359
0,5
2
Urin x 16
93,1
5,178
5,117
8,0
3
Urin xl
94,1
0,347
0,368
0,5
4
Urin xl
18,7
0,021
0,024
weniger als 0,5
5
Urin xl
2,5
0,003
0,006
weniger als 0,5
6
Urin xl
33,1
0,042
0,037
weniger als 0,5
7
Urin xl
13,0
0,016
0,011
weniger als 0,5
8
Urin xl
32,5
0,041
0,008
weniger als 0,5
9
Urin xl
4,5
0,005
0,007
weniger als 0,5
10
Urin xl
36,8
0,048
0,072
weniger als 0,5
11
Serum x 10
51,0
0,760
0,800
1,0
12
Serum x 10
53,2
0,812
0,863
0,9
13
Serum x 10
69,8
1,317
1,335
1,25
14
Serum x 10
55,1
0,858
0,892
1,0
15
Fibrinogen-freies Plasma x 10
71,8
1,400
1,520
2,0
16
kanzeröse
Brustfellraum-
flüssigkeit x640
93,8
217,12
197,4
320
Aus den obigen Ergebnissen ist zu ersehen, dass die mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ermittelte Fibrinogenkonzentration in signifikanter Weise mit den Werten übereinstimmt, die man nach der Radioimmuntest-Methode erzielt, die als die genaueste der herkömmlichen Bestimmungsmethoden gilt. Der Korrelationskoeffizient zwischen dem erfindungsgemässen Verfahren und der RIA-Methode beträgt 0,909 oder mehr.
Beispiel 2
Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man ein Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens (Anti-Fg-sensibilisiertes Latexreagens) (das 1 Gew.-% Latexteilchen enthält) mit dem Unterschied, dass man einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 jj.m verwendet (der von der Firma Dow Chemical Co. erhältlich ist und einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist).
Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von 0,1 ml des in dieser Weise gebildeten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens' mit 0,3 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung (die 0,5 ug/ml Fibrinogen enthält) und schüttelt während 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 250 Schüttelvorgängen pro Minute, um die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen zu lassen. Anschliessend bestimmt man die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 p,m in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Zur Bestätigung der Reproduzierbarkeit der Messung wiederholt man die Massnahmen drei weitere Male. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben.
Weiterhin wiederholt man die obige Messmethode mit dem Unterschied, dass man anstelle der Standard-Fibrino-gen-Lösungen Seren verwendet, die man aus von Patienten gewonnenen Blutproben isoliert hat. Man wiederholt dabei die gleiche Bestimmungsmethode viermal an verschiedenen Tagen, um die Reproduzierbarkeit der Bestimmung der Körperflüssigkeit zu bestätigen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle III angegeben.
Tabelle III
Messung, Nr.
Prozentuale Absorption
Standard-Fibrinogen-
Serum
Lösung
1
73,8
49,1
2
72,8
47,5
3
72,6
50,5
4
71,5
48,3
Durchschnittswert
72,9 ±1,3
49,05 ±1,55
Varianzkoeffizient
1,8%
3,4%
Wie aus den in der obigen Tabelle III angegebenen Werten zu ersehen ist, ist das erfmdungsgemässe Verfahren her-45 vorragend reproduzierbar sowohl bei der Bestimmung der Standard-Fibrinogen-Lösungsproben als auch bei der Bestimmung von tatsächlichen Proben von Körperflüssigkeiten (Serum).
so Beispiel 3
Zu 5 ml einer Glycinpufferlösung gibt man 100 mg Siliciumdioxid in Form von Mikroteilchen (die man in der Weise hergestellt hat, wie es in Beispiel 1 der JA-OS 120497/75 beschrieben ist) mit einem durchschnittlichen Teilchendurch-55 messer von 0,32 Jim (obwohl 15% dieser Teilchen einen Durchmesser von 0,5 |xm oder mehr aufweisen) und unterzieht die Mischung während 1 Stunde Ultraschallschwingungen mit einer Frequenz von 28 kHz, um eine Suspension der Siliciumdioxid-Mikroteilchen zu erreichen. Dann bereitet 60 man nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise ein Antifibrinogen-Antikörper-sensibilisiertes Siliciumdioxid-Suspensions-Reagens, mit dem Unterschied, dass man anstelle des in Beispiel 1, Abschnitt 1, verwendeten Polystyrollatex' mit einer Teilchengrösse von 0,481 |j.m die in der „5 oben beschriebenen Weise hergestellte Suspension der Siliciumdioxid-Mikroteilchen verwendet und dass man eine Rin-derserumalbuminlösung mit einer anderen Konzentration (0,05 Gew.-%) verwendet.
11
640 640
Dann bestimmt man unter Verwendung des Antifibrino-gen-sensibilisierten Siliciumdioxid-Suspensionsreagens' die prozentuale Absorption von Standaard-Fibrinogen-Lösungen in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV
Konzentration der
Standard-Fibrinogen-Lösung
(Ug/ml)
Prozentuale Absorption bei 1,2 Um
0,2
6,2
0,4
25,1
0,6
48,3
0,8
65,3
1,0
76,7
Wie in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschrieben, bildet man durch Auftragen der obigen Werte eine Eichkurve, die in der Fig. 8 dargestellt ist. Aus der Fig. 8 ist zu ersehen, dass eine deutliche geradlinige Beziehung zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der prozentualen Absorption besteht, wenn die Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung grösser als 0,4 \ig/ml ist.
Dann unterwirft man unbekannte Proben (Urin, Serum und Brustfellraumflüssigkeit) der in Beispiel 1, Abschnitt 3, beschriebenen Bestimmungsmethode, um unter Anwendung der in der obigen Weise ermittelten Eichkurve den Fibrino-gengehalt der unbekannten Proben zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengestellt.
Tabelle V
Unbekannte Probe Fibrinogenkonzentra-
tion in der unbekannten Probe (Ug/ml)
Patient Material Verdün- Gemes- erfindungs- RIA-Nr. nungsfaktor sene -gemässes Methode prozen- Verfahren tuale Absorption
1
Urin xl
25,0
0,400
0,359
2
Urin x 10
38,3
5,000
5,117
3
Urin xl
22,4
0,380
0,368
4
Serum xl
63,7
0,770
0,700
5
Serum xl
67,6
0,830
0,892
6
kanzeröse x400
38,4
200
197,4
Brustfell-raumflüs-sigkeit
Beispiel 4
Man bestimmt die prozentuale Absorption bei Wellenlängen des angewandtenn Lichtes von 1,2 und 1,7 um nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1 und 2, beschriebenen Weise mit dem Unterschied, dass man anstelle des Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 [im (Dow Chemical Co.) einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 um (Dow Chemical Co., mit einem Feststoffgehalt von 10 Gew.-%) und eine anderer Konzentration des Rinderserumalbumins (0,1 Gew.-%) anwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VI angegeben.
Tabelle VI
Konzentration der Standard- Prozentuale Absorption bei Fibrinogen-Lösung (ug/ml) 1,2 um 1,7 (im
0,2
25,4
17,4
0,4
44,7
38,1
0,6
61,9
64,7
0,8
59,1
74,4
1,0
44,7
76,1
Aus den in der obigen Tabelle VI angegebenen Ergebnissen ist zu erkennen, dass eine deutliche Korrelation zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der prozentualen Absorption besteht, wenn die Wellenlänge des angewandten Lichtes um einen Faktor von mehr als 2 länger ist als der durchschnittlichen Durchmesser der festen Trägerteilchen (der Polystyrollatexteilchen).
Beispiel 5
Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man ein mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, dass man anstelle des Antihumanfibrinogen-Antikörpers Antihumanchoriongonadotropin-Antikörper (Anti-hCG) verwendet und den Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 (xm durch einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 (im (Dow Chemical Co.) ersetzt. Unter Verwendung des in dieser Weise erhaltenen Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexreagens' misst man die prozentuale Absorption nach der in Beispiel 1, Abschnitt 2, angegebenen Weise unter Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 (im, mit dem Unterschied, dass man anstelle der Standard-Fibrinogen-Lösungen Standard-Humanchoriongonadotro-pin-Lösungen verwendet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII angegeben.
Tabelle VII
Konzentration der
Standard-Humanchoriongonadotro-
pin-Lösung
(Internationale Einheiten/ml)
Prozentuale Absorption bei 1,2 (im
0,1
10,5
0,2
25,9
0,3
32,1
0,4
45,2
0,5
56,3
0,7
76,6
1,0
89,3
Unter Anwendung der obigen Zahlenwerte ermittelt man in der oben beschriebenen Weise eine Eichkurve. Andererseits gewinnt man von verschiedenen Patienten Urinproben, die man zur Bestimmung des im Urin vorhandenen Human-choriongonadotropins verwendet, wozu man nach der in Beispiel 1, Abschnitt 3, beschriebenen Weise vorgeht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII angegeben.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ü5
640 640
12
Tabelle Vili
Tabelle X
Unbekannte Probe
Patient Nr.
Material
Verdünnungsfaktor
Gemessene prozentuale Absorption
Humanchoriongona-dotropin-Konzentra-tion in der unbekannten Probe (Internationale Einheiten/ml) Erfindungs- RIA-gemässes Methode Verfahren
Unbekannte Probe
1
Urin xl
60,2
0,564
0,482
2
Urin xl
92,4
0,966
1,120
3
Urin xl
88,9
0,944
0,857
4
Urin xl
89,8
0,952
0,925
Tabelle IX
Patient Material Nr.
Verdünnungsfaktor
Zeit bis zum
Erreichen einer prozentualen Absorption von 68,4% (s)
Fibrinogen-Konzentra-tion in der unbekannten Probe (Ug/ml) Erfindungs- RIA-gemässes Methode Verfahren
Beispiel 6
Man beschickt eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 ml, die mit einem L-förmigen Rührstab ausgerüstet ist, mit 0,1 ml des gemäss Beispiel 2 bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens' und 0,3 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung der in der nachstehenden Tabelle IX angegebenen Konzentration und überwacht die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 |im nach der in Beispiel 1, Abschnitt 2, angegebenen Verfahrensweise kontinuierlich, um die Zeit abzulesen, die dazu erforderlich ist, dass die prozentuale Absorption einen Wert von 68,4% erreicht, währenddem man den Rührstab mit einer definierten Geschwindigkeit von 200 Vibrationen pro Minute auf- und abbewegt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX angegeben.
20
25
30
35
1
Urin x 1
9,2
4,5
5,117
2
kanzeröse x 50
11
195
197,4
Brustfell
raumflüs
sigkeit
3
Serum x 1
25
2,1
2,210
4
Serum x 1
20
2,5
2,302
5
Serum x 1
3,8
8,6
9,020
6
Serum x 1
12
3,7
3,723
Konzentration der
Standard-Fibrinogen-Lösung
(mg/ml)
Zeit bis zum Erreichen einer prozentualen Absorption von 68,4% (s)
2
26,9
4
11,3
6
6,4
8
4,7
10
2,9
Die obigen Werte trägt man auf doppelt logarithmischem Papier auf, wobei man die Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung auf der Abszisse und die Zeit bis zum Erreichen einer prozentualen Absorption von 68,4% auf der Ordinate aufträgt. In dieser Weise erhält man eine Eichkurve, die, wie aus der Fig. 9 zu erkennen ist, eine gerade Linie darstellt.
Man beschickt dann eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm, die mit einem L-förmigen Rührstab ausgerüstet ist, mit 0,3 ml einer unbekannten Probe (Urin, Serum oder Brustfellraumflüssigkeit), die man einem Patienten abgenommen hat, und 0,1 ml des oben erwähnten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens' und misst in der oben beschriebenen Weise unter Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 um die Zeit, die erforderlich ist, dass die prozentuale Absorption einen Wert von 68,4% erreicht, worauf man den Wert der Fibrinogen-Konzentration, die dieser Zeitdauer entspricht, von der in der obigen Weise ermittelten Eichkurve abliest. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle X angegeben.
Beispiel 7
1. Herstellung eines Oxytocin-sensibilisierten Latexreagens'
Man vermischt 1,0 ml einer Oxytocin-Lösung mit einer Konzentration von 220 Internationalen Einheiten pro Milliliter in einer wässrigen 0,1 n Essigsäurelösung mit 0,5 ml eines Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 (im (Dow Chemical Co., der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist) und rührt die Mischung während 2 Stunden bei Raumtemperatur, wonach man sie während 20 Minuten unter Kühlen auf 2 bis 4°C (bei 12000 min-1) zentrifugiert. Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab, wonach man die gewonnenen Oxytocinsensibilisierten Latexteilchen in 4 ml einer Äthylendiaminte-traessigsäure-Glycin-Pufferlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, suspendiert, um ein Oxytocin-sensibili-siertes Latexreagens zu bilden, das die Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.
2. Bestimmung der optimalen Konzentration von Oxytocin-Antiserum
Man vermischt einen aliquoten Anteil von 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 bereiteten Oxytocin-sensibilisierten Latexreagens mit 0,1 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung und 0,2 ml Oxytocin-Antiserum, das man mit einer isotonischen Natriumchloridlösung um den in der nachstehenden Tabelle XI angegebenen Faktor verdünnt hat. Dann schüttelt man die Mischung auf einer sich hin- und herbewegenden Schütteleinrichtung, die bei 200 SchüttelVorgängen pro Minute betrieben wird, während 12 Minuten und °5 bestimmt dann die prozentuale Absorption bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 um in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XI angegeben.
45
50
55
60
13
640 640
Tabelle XI
Verdünnungsfaktor des
Prozentuale Absorption bei 1,2
Oxytocin-Antiserums
(im
X20
93,3
x30
75,9
x40
59,5
x50
52,8
x80
39,7
x 100
31,1
Aus den obigen Zahlenwerten ist erkennbar, dass die optimale Konzentration des Oxytocin-Antiserums bei einem Verdünnungsfaktor von etwa 30 liegt. 15
3. Ermittlung einer Eichkurve
Man beschickt ein Kunststoffreagenzglas mit 0,2 ml einer Lösung, die man durch Verdünnen des in Abschnitt 2 verwendeten Oxytocin-Antiserums mit einem Faktor von 30 erhalten 20 hat, und 0,1 ml einer Standard-Oxytocin-Lösung (in 0,ln wässriger Essigsäure) mit der in der nachstehenden Tabelle XII angegebenen Konzentration und mischt gut durch. Nachdem man die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen hat, gibt man 0,1 ml des gemäss 25 Abschnitt 1 bereiteten Oxytocin-sensibilisierten Latexreagens' in das Reagenzglas und schüttelt die erhaltene Mischung während 12 Minuten auf einer hin- und herbewegten Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Die in dieser Weise erhaltene Flüssigkeit überführt man in eine 30 Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm und misst die prozentuale Absorption bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 jxm in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XII angegeben.
35
Tabelle XII
Konzentration der Standard-Oxytocin-Lösung (Internationale Einheiten/ml)
Prozentuale Absorption bei 1,2 (xm
A D !
40
2000 1500 1000 500 300 0
59,8
64.5
67.1
70.2 71,8
73.6
13,8 9,1 6,5 3,8 1,8
* (prozentuale Absorption bei einer Konzentration der Standard-Oxytocin-Lösung von 0) minus (prozentuale Absorption bei der angegebenen Konzentration)
Wenn man die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte graphisch aufträgt, und zwar die Konzentration der Standard-Oxytocin-Lösung auf der Abszisse und den ÀD-Wert auf der Ordinate, so erhält man eine lineare Beziehung, wie aus der Fig. 10 zu ersehen ist.
Unter Anwendung der in dieser Weise ermittelten Eichkurve ist es möglich, die Bestimmung von Oxytocin in dem Serum von schwangeren Frauen zu erreichen.
Beispiel 8
1. Bereitung eines Humanchoriongonadotropin-sensibilisier-ten Latexreagens'
In 5 ml einer 0,05n Chlorwasserstoffsäure löst man 7900 Internationale Einheiten/ml Humanchoriongonadotropin (hCG) und hydrolysiert das Material während 1 Stunde bei
80 °C. Nachdem man die Lösung dialysiert und durch Absaugen filtriert hat, löst man das hydrolysierte Humanchoriongonadotropin in 2 ml einer 0,05m Boratpufferlösung (mit einem pH-Wert von 8,7) und verdünnt auf ein Gesamtvolumen von 10 ml.
Dann gibt man einenaliquoten Anteil von 5 ml einer zwei-prozentigen Lösung eines Polystyrollatex' (der Firma Dow Chemical Co., der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist) mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 (im nach und nach unter Rühren zu der Lösung des hydrolysierten Humanchoriongonadotropins. Die erhaltenen Humanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexteilchen werden während 20 Minuten bei 13000 min-1 zentrifugiert, wonach die ausgefällten sensibilisierten Latexteilchen abgetrennt und in 10 ml einer 0,2prozentigen Rinderserumalbu-minlösung in der Boratpufferlösung suspendiert werden. Die Suspension wird dann zentrifugiert, worauf der Niederschlag durch Zentrifugieren mit der Boratpufferlösung gewaschen und schliesslich in 10 ml der Pufferlösung suspendiert wird, so dass man ein Humanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens erhält, das 1 Gew.-% Latexteilchen enthält.
2. Ermittlung einer Eichkurve
Die optimale Konzentration (die in diesem Fall einem Verdünnungsfaktor von 300 entspricht) des Antihumancho-riongonadotropin-Serums wird in der in Beispiel 7, Abschnitt 2, beschriebenen Weise ermittelt. Dann beschickt man ein Kunststoffreagenzglas mit 0,2 ml einer Antihumanchoriongo-nadotropin-Serumlösung, die man durch Verdünnen des Serums mit einer isotonischen Natriumchloridlösung um einen Faktor von 300 erhalten hat, und mit 0,1 ml einer Stan-dard-Humanchoriongonadotropin-Lösung mit der in der nachstehenden Tabelle XIII angegebenen Konzentration und schüttelt während 10 Minuten. Anschliessend gibt man 0,1 ml des in Abschnitt 1 bereiteten Humanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexreagens' zu und schüttelt die Mischung während 10 Minuten auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Die erhaltene Flüssigkeit wird in eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm überführt, wonach man die prozentuale Absorption bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,0 (im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise misst. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XIII zusammengestellt.
45
50
55
Tabelle XIII
Konzentration der
Prozentuale Absorption bei 1,0
Standard-Humanchoriongonado-
p.m tropin-Lösung
(Internationale Einheiten/ml)
10
27,6
1
37,0
0,1
46,4
Wenn man die obigen Zahlenwerte graphisch aufträgt, 60 und zwar den Logarithmus der Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung auf der Abszisse und die prozentuale Absorption auf der Ordinate, so erhält man eine Eichkurve, die, wie inder Fig. 11 dargestellt ist, in den Konzentrationsbereichen, in denen die Messung tatsächlich »5 ausgeführt wird, einen geradlinigen Verlauf zeigt.
Somit ist es möglich, unter Verwendung dieser Eichkurve Humanchoriongonadotropin im Serum von an Chorionepi-theliomen leidenden Patienten zu bestimmen.
640 640
14
Beispiel 9
In einem Kunststoffreagenzglas vermischt man 0,1 ml des gemäss Beispiel 1, Abschnitt 1, bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens' (mit einem durchschnittlichen Durchmesser der Polystyrollatexteilchen von 0,481 um und einem Gehalt der sensibilisierten Latexteilchen von 1 Gew.-%) und 0,3 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung (die man durch Auflösen in einer 0,5 Gew.-% Rinderserumalbumin enthaltenden isotonischen Natriumchloridlösung gebildet hat) mit der in der nachstehenden Tabelle XIV angegebenen Konzentration, mischt gut durch und schüttelt dann während 3 Stunden auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Anschliessend bestimmt man die prozentuale Absorption bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 (im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XIV angegeben.
Tabelle XIV
Konzentration der
Standard-Fibrinogen-Lösung
(ng/ml)
Prozentuale Absorption bei 1,2 (im
10
11,5
20
25,0
40
52,6
60
71,2
80
80,8
100
84,3
Wenn man auf der Grundlage der obigen Zahlenwerte eine Eichkurve erstellt, so findet man eine eindeutige Korrelation zwischen der Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung und der prozentualen Absorption. Somit ist es erfin-dungsgemäss möglich, extrem geringe Fibrinogenmengen im Bereich von Nanogramm/ml zu bestimmen und dies mit einer Empfindlichkeit, die vergleichbar ist der Radioimmuntestmethode (RIA-Methode).
Beispiel 10
Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man Antifibrinogen-sensibilisierte Latexreagenzien, die die Antifibrinogen-sensibilisierten Latexteilchen in Konzentrationen von 0,75 Gew.-%, 1,0 Gew.-% bzw. 2,0 Gew.-% enthalten, mit dem Unterschied, dass man einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,35 [im verwendet. Für jedes der in dieser Weise bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagenzien ermittelt man nach der in Beispiel 1, Abschnitt 2, angegebenen Verfahrensweise (bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 Jim und einer Schüttelzeit von 10 Minuten) eine Eichkurve. Diese Eichkurven sind in der Fig. 12 dargestellt, in der die Kurven a, b und c die Standardkurven wiedergeben, die Konzentrationen der Antifibrinogen-sensibili-sierten Latexteilchen von 0,75 Gew.-%, 1,0 Gew.-% bzw. 2,0 Gew.-% aufweisen. Wie aus der Fig. 12 ersichtlich ist, nimmt die Nachweisempfindlichkeit für Fibrinogen mit der Konzentration der sensibilisierten Latexteilchen in dem Antifibrino-gen-sensibilisierten Latexreagens zu.
Beispiel 11
Man bereitet nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise ein Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens (mit einer Konzentration der Altexteilchen von 0,5 Gew.-%) mit dem Unterschied, dass man einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 )im verwendet.
Man vermischt einen aliquoten Anteil von 0,2 ml des in dieser Weise bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens' mit jeweils 0,2 ml Standard-Fibrinogen-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle XV angegeben sind, überführt die Mischung in eine rechteckige Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm und rührt während des Ablaufs der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem L-förmigen Rührstab, der mit 160 Hüben pro Minuten auf- und abbewegt wird. Nach 3 Minuten misst man die Extinktion der Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge von 0,9 Jim. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XV zusammengestellt.
Tabelle XV
Konzentration der Extinktion nach 3 Minuten
Standard-Fibrinogen-Lösung
(P-g/ml)
0,625
0,006
0,125
0,011
0,25
0,034
0,50
0,041
1,0
0,081
2,0
0,130
Trägt man diese Zahlenwerte graphisch auf, und zwar die Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung auf der Abszisse und die Extinktion nach 3 Minuten auf der Ordinate, so ergibt sich eine deutliche lineare Beziehung, wie es aus der Fig. 13 zu erkennen ist.
Beispiel 12
Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Verfahrensweise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotro-pin-sensibilisiertes Latexreagens (das 0,3 Gew.-% Latexteilchen enthält) mit dem Unterschied, dass man die Antihuman-fibrinogen-Antikörper durch Antihumanchoriongonadotro-pin-Antikörper (Anti-hCG) ersetzt und anstelle des Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 (im einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,09 (xm (Dow Chemical Co.) verwendet.
Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von 0,2 ml des erhaltenen Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisier-ten Latexreagens' gut mit jeweils 0,2 ml Standard-Humancho-riongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle XVI angegeben sind, überführt die Mischung in eine rechteckige Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm und rührt die Mischung während des Ablaufs der Antigen-Antikörper-Reaktion in der Zelle mit einem L-förmigen Rührstab, der mit einer Geschwindigkeit von 160 Hüben pro Minute auf- und abbewegt wird. Genau nach 2 Minuten misst man die Extinktion der Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,10 um. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XVI angegeben.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
o5
15
Tabelle XVI
640 640
Konzentration der
Standard-Humanchoriongonado-
tropin-Lösung
(Internationale Einheiten/ml)
Extinktion nach 2 Minuten
0,0625
0,018
0,125
0,023
0,25
0,035
0,5
0,050
1,0
0,075
Wenn man die obigen Zahlenwerte auf doppelt logarithmischem Papier aufträgt, und zwar die Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung auf der
15 Abszisse und die Extinktion nach 2 Minuten auf der Ordinate, so erhält man eine Eichkurve, die, wie aus der Fig. 14 zu ersehen ist, geradlinig verläuft.
G
6 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

640 640
1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Antigen und/oder einen Antikörper in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 |im vorliegt,
umsetzt, die erhaltene Reaktionsmischung mit einer Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im, die mindestens 1,1 mal länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt und die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung misst, wobei bei der Messung der Extinktion die Bestrahlung jedoch nicht mit Strahlung einer Wellenlänge, welche mindestens 1,5 mal länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 p,m verwendet.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerteilchen aus einem feinen Pulver aus einer organischen hochmolekularen Substanz oder einer anorganischen Substanz bestehen, die in dem flüssigen Medium unlöslich ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von 0,8 bis 1,8 um verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von 0,9 bis 1,4 [im anwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Messung der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung angewandte Strahlung eine Wellenlänge aufweist, die mindestens um den Faktor 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktionsmischung mit Strahlung einer geeigneten Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 [im bestrahlt, um zunächst den Wellenlängenbereich zu ermitteln, in dem eine bestimmte Korrelation zwischen der Konzentration des Antigens oder des Antikörpers oder der Mischung davon, einschliesslich des daraus gebildeten Reaktionsprodukts, in der Probenlösung und der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung besteht und die Extinktion oder die prozentuale Absorption durch Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Strahlung einer Wellenlänge aus diesem Bereich misst.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Trägermaterials in der Reaktionsmischung 0,05 bis 1 Gew.-% beträgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Trägermaterials in der Reaktionsmischung 0,2 bis 0,6 Gew.-% beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst ein Antigen oder einen Antikörper zu einer Probenlösung, die den zu bestimmenden Antikörper oder das zu bestimmende Antigen enthält, zugibt und damit umsetzt und anschliessend eine Suspension der unlöslichen Trägerteilchen, auf denen ein bestimmtes Antigen oder ein bestimmter Antikörper vorliegt, zugibt und mit der bei der ersten Reaktion gebildeten Reaktionsmischung umsetzt.
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