CH647871A5 - Reactif de lysat d'amibocytes de limule. - Google Patents
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Description
Cette invention concerne un lysat d'amibocytes de limule (ci-après appelé parfois LAL ou lysat) permettant de déterminer la présence d'endotoxines ainsi que l'utilisation de ce réactif LAL.
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Comme on le sait bien, l'essai LAL qui permet de détecter les en-dotoxines est peut-être l'essai le plus pratique et le plus sensible pour déterminer les endotoxines. Les méthodes d'essai commerciales font appel à un lysat d'amibocytes de l'hémolymphe de limule obtenue à partir de l'espèce de crabes appelés limules. Ce lysat est combiné avec des cations divalents appropriés, des tampons appropriés et d'autres ingrédients pour former un réactif LAL. Ce réactif réagit ensuite avec l'endotoxine, pendant l'essai, en formant un gel. Les fabricants de réactifs LAL éprouvent souvent des difficultés pour produire un lysat ayant la sensibilité voulue pour détecter l'endotoxine. La sensibilité d'une préparation à l'autre est également variable. Ces problèmes sont attribués au moins en partie à la présence d'une substance inhibitrice de l'endotoxine, non définie et endogène, dans le lysat (ci-après appelée parfois l'inhibiteur).
On ne sait pas grand-chose de la nature de l'inhibiteur ou de son rôle in vivo chez le crabe limule. Des études par électrophorèse indiquent que l'inhibiteur est une lipoprotéine de haut poids moléculaire. Il peut fonctionner dans l'amibocyte en maîtrisant le mécanisme de défense de la coagulation. Il est également plausible que l'inhibiteur soit un composant de membrane libéré pendant la lyse des cellules. L'incertitude quant au rôle et quant à l'origine de l'inhibiteur est compliquée par le fait que le mécanisme de l'inhibition est mal élucidé. L'inhibiteur bloque probablement la réaction enzymati-que d'une manière ou d'une autre, soit par association avec l'enzyme elle-même, soit par association avec l'endotoxine, soit encore par association avec les deux. Comme certaines autres protéiases de la sérine, on pense que l'enzyme qui favorise la coagulation forme un complexe avec le calcium et le glycérophospholipide. L'endotoxine elle-même est lipoïdale; par conséquent, un inhibiteur à caractère li-poprotéinique serait tout à fait compatible avec l'un ou l'autre composant.
Le fait que l'inhibiteur soit une lipoprotéine est prouvé par sa sensibilité au chloroforme. Comme décrit dans le brevet U.S. N° 4107077, la sensibilité du LAL se trouve sensiblement améliorée quand on traite le lysat par un solvant organique tel que le chloroforme pour faire précipiter l'inhibiteur du lysat. On recueille ensuite la phase aqueuse et on la traite pour préparer le réactif LAL.
Jusqu'à présent, le mode opératoire d'extraction par solvant susmentionné constituait le moyen le plus rapide pour améliorer la sensibilité du LAL. Malheureusement, cette méthode présente plusieurs inconvénients. Comme il est absolument nécessaire que l'absence d'endotoxines soit assurée tout au long de la production du lysat, un mode d'extraction délicat et une centrifugation ultérieure augmentent les risques de perte de produit. Comme indiqué dans le brevet susmentionné, le traitement par solvant réduit la stabilité du lysat, au point qu'il faut achever rapidement la production à basse température. De plus, le précipité séparé du lysat par le traitement par solvant contient une quantité considérable de coagulogène, la protéine de coagulation requise. Le maintien d'une teneur suffisante en protéines est un impéïatif d'une bonne gélification pendant l'essai de l'endotoxine. Evidemment, dans ces dernières circonstances, la maîtrise de la sensibilité du réactif est difficile. Le chloroforme, qui est le solvant utilisé avec le plus de succès, est bien connu pour ses effets indésirables chez l'homme. La santé et la sécurité du personnel de production sont, par conséquent, un souci raisonnable. Il est évident qu'un LAL qui évite ces inconvénients et qui améliore pourtant la sensibilité dans la mesure voulue constituerait un perfectionnement de la technique.
C'est par conséquent un objet de la présente invention d'améliorer de manière simple et rapide la sensibilité du LAL.
Conformément à cette invention, il est procuré un réactif tel que défini dans la revendication 1.
Il y a certains critères minimaux qui peuvent délimiter les caractéristiques d'augmentation de la sensibilité du LAL, c'est-à-dire que les agents d'augmentation de la sensibilité du LAL qui sont utilisables selon l'invention devraient posséder: a) l'aptitude à accroître la sensibilité du lysat jusqu'à une sensibilité appropriée, par exemple en la multipliant au moins par deux, b) l'aptitude à résister à une dépy-
rogénation, c'est-à-dire à une élimination ou à une destruction de l'endotoxine, par ultrafiltration ou par traitement acide à un pH inférieur à 5 ou par traitement basique à un pH supérieur à 8, c) l'aptitude à être stérilisés, par exemple par traitement à l'autoclave, par exemple à une température égale ou supérieure à 121° C sous une pression de 1,05 kg/cm2 pendant 15 min, d) l'aptitude à former des solutions aqueuses d'environ 2% (poids/volume) à 25° C, e) l'aptitude à fonctionner dans l'intervalle de pH de 6,0 environ à 9 environ, f) l'aptitude à être compatibles avec des tampons et d'autres ingrédients utilisés dans le réactif LAL, et g) l'aptitude à être compatibles par rapport au LAL et à sa réaction avec les endotoxines.
Ces agents d'augmentation de la sensibilité comprennent des surfactifs amphotères qui possèdent un groupement anionique et un groupement cationique dans leur structure. Des exemples en sont les sulfobétaïnes représentées par la formule suivante:
O R2
II I
(R5-C-HN)„-R4-N®-R1-S03e (A)
I I rs y dans laquelle:
R! est un radical alkylène ayant de 1 à 4 atomes de carbone, Y est a) l'hydrogène, 2) un radical alkyle inférieur éventuellement substitué, contenant par exemple de 1 à 4 atomes de carbone, tel que les radicaux méthyle, éthyle, propyle, ou 3) un radical hydroxyalkyle inférieur,
R2 et R3 sont choisi tous deux parmi les radicaux alkyle inférieur éventuellement substitués contenant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical hydroxyalkyle inférieur, tels que par exemple les radicaux méthyle, éthyle, propyle, hydroxyéthyle, hydroxyméthyle, hydroxypropyle, etc.,
n = 0 ou 1,
quand n = 0, R4 est un radical alkyle éventuellement substitué, contenant de 8 à 18 atomes de carbone,
quand n = 1, R4 est un radical alkylène ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et
R5 est un radical alkyle éventuellement substitué, contenant de 8 à 18 atomes de carbone.
Il doit aller de soi que le terme alkylène, dans le sens où il est utilisé ici, englobe aussi bien les radicaux polyméthylène que d'autres radicaux aliphatiques saturés divalents, et qu'il peut ainsi y avoir une ramification dans la liaison fournie par le radical alkylène. L'adjectif inférieur signifie un radical qui contient de 1 à 4 atomes de carbone.
Les sulfobétaïnes que l'on emploie dans les compositions selon la présente invention sont connues dans la technique et ont été décrites comme étant des surfactifs ampholytes. La préparation de tels composés est décrite, par exemple, par G.W. Fernley dans le «Journal of American Oil Chemists Society», janvier 1978 (vol. 55), pp. 98-103, et par R. Ernst dans le brevet U.S. N° 3280179, ce dernier brevet étant incorporé ici à titre de référence.
Dans les sulfobétaïnes que l'on préfère comme surfactifs, R2 et R3 sont, dans la structure ci-dessus, des radicaux méthyle. Il est également préférable que Rj soit un radical propylène.
Un type de surfactif sulfobétaïne qui peut être employé possède la structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 0 et R4 est un radical alkyle ayant d'environ 8 à 18 atomes de carbone, de préférence un radical alkyle à chaîne droite. Pour ces surfactifs sulfobétaïnes, une source commode du composant R4 est un alcool gras de suif qui se compose d'un mélange de composés ayant des longueurs de chaîne différentes, avec une composition type qui est d'environ 66% de C18, 30% de C16 et 4% de C14 et autres. Une autre source commode est la fraction médiane d'alcools gras de coprah distillé, qui se compose elle aussi d'un mélange de composés ayant des longueurs de chaîne différentes, une composition type comprenant environ 66% de C12, 23% de C14, 9% de C16 et 2% de C10.
s
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Des surfactifs sulfobétaïnes spécifiques répondant à la structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 0 sont indiqués dans le brevet U.S. N° 3539521 qui est incorporé ici à titre de référence. Un surfac-tif de ce type que l'on préfère tout particulièrement est le N-tétradécyl-N,N'-diméthyl-3-ammonio-l-propanesulfonate commer- ' cialisé par la société Calbiochem-Behring Corporation sous la marque déposée Zwittergent 3-14.
Un autre type de surfactif sulfobétaïne que l'on peut employer possède la structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 1 et R4 est un radical alkylène ayant d'environ 1 à environ 6 atomes de carbone. Dans ces sulfobétaïnes dans lesquelles n est égal à 1, R5 est un radical alkyle ayant d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone. Il est préférable que R5 soit à chaîne droite. Comme déjà exposé, des sources commodes de radicaux alkyle ayant d'environ 10 à environ 18 atomes de carbone sont l'alcool gras de suif et l'alcool gras de coprah.
Des surfactifs sulfobétaïnes spécifiques répondant à la structure ci-dessus dans laquelle n est égal à 1 sont indiqués dans le brevet U.S. N° 3280179 déjà mentionné.
Les sulfobétaïnes que l'on préfère tout particulièrement comme surfactifs pour les compositions selon la présente invention sont les 3-(N,N-diméthyl-N-acylamidopropylammonio)-2-hydroxypropane-1-sulfonates dans lesquels le radical acyle dérivé d'un alcool gras de suif ou d'un alcool gras de coprah, l'alcool gras de coprah ayant la préférence. Il serait reconnu par l'homme du métier que, dans la préparation normale de ces dérivés d'alcools gras de suif ou de coprah, il se formerait un mélange de sulfobétaïnes avec des longueurs variables de chaînes carbonées pour les radicaux acyle. Comme déjà exposé, ces alcool gras contiennent, pour la majeure partie, des longueurs de chaînes carbonées qui donneront des radicaux acyle ayant le nombre voulu d'atomes de carbone, c'est-à-dire d'environ 8 à environ 18 atomes de carbone. Ainsi, ces mélanges obtenus à partir d'alcools gras de suif ou de coprah sont utilisables pour former le surfactif sulfobétaïne dans les compositions selon la présente invention. Une substance de ce type que l'on préfère tout particulièrement utiliser dans la composition selon la présente invention est la N-cocoamidopropyl-N,N-diméthyl-N-2-hydroxypropylsulfobétaïne, dont un exemple est la Lonzaine CS, commercialisée par la société Lonza Inc., Fair Lawn, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique, et dont un autre exemple est le Varion CAS commercialisé par la société Sherex Chemical Company, Inc.
D'autres surfactifs amphotères comprennent les acides amino-carboxyliques portant une longue chaîne alkylique sur l'atome d'azote, qui sont illustrés par la formule:
R5-N-R,-COOM (B)
I I
y y'
les acides iminodicarboxyliques portant une longue chaîne alkylique sur l'atome d'azote qui sont illustrés par la formule:
R5N(R!-COOM)2 (C)
I
y et les alkyl- ou aminobétaïnes à longue chaîne sur l'atome d'azote qui sont illustrées par la formule:
O R2
II I
(Rs-C-HN)„-R4-N©-R1-COO© (D)
I I r3 y formules dans lesquelles R,, R2, R3, R4, y et n ont les mêmes définitions que dans la formule A ci-dessus, M est un atome d'hydrogène, de sodium ou de potassium ou un radical ammonium quaternaire, et y' a la même définition que y dans la formule A. y et y' peuvent être identiques ou différents. Des exemples de détergents amphotères spécifiques sont l'acide N-alkyl-ß-aminopropionique, l'acide N-alkyl-ß-iminodipropionique, et la N-alkyI-N,N-diméthyl-
glycine; le radical alkyle peut être, par exemple, celui qui dérive de l'alcool gras de coprah, de l'alcool laurylique, de l'alcool myristy-lique (ou d'un mélange d'alcools laurylique et myristylique), de l'alcool de suif hydrogéné, de l'alcool cétylique, dé l'alcool stéary-5 lique ou d'un mélange de ces mêmes alcools. Les acides aminopro-pionique et iminodipropionique substitués sont souvent fournis sous la forme de sels de sodium ou d'autres sels, qui peuvent de même être utilisés dans la pratique de l'invention. Des exemples spécifiques comprennent la cocobétaïne vendue par la société Witco Chemical io Corporation sous le nom Emcol CC 37-18; la cocoamidopropyl-bétaïne vendue par la société Lonza Inc. et par la société Sherex Chemical Company sous les noms respectifs Lonzaine CO et Varion CADG; le N-coco-ß-aminopropionate de sodium vendu par la société Henkel Corporation sous le nom Deriphat 151 ; le N-lauryl-15 ß-iminodipropionate disodique vendu par la société Henkel Corporation sous le nom Deriphat 160, et le N-suif-ß-iminodipropionate disodique vendu par la société Henkel Corporation sous le nom Deriphat 154.
Des exemples d'autres détergents amphotères sont les imidazoli-20 nés grasses telles que celles que l'on obtient en faisant réagir un acide gras à chaîne longue (ayant par exemple de 10 à 20 atomes de carbone) avec la diéthylènetriamine et les acides monohalocarboxyli-ques ayant de 2 à 6 atomes de carbone, par exemple la l-coco-5-hydroxyéthyl-5-carboxyméthylimidazoline.
25 Des exemples spécifiques comprennent la coco-imidazoline commercialisée sous le nom Amphoterge K-2 par la société Lonza Inc., la dicarboxyimidazoline caprique commercialisée sous le nom Amphoterge KJ2 par la société Lonza Inc., et la dicarboxyimidazoline de coprah mélangée avec des surfactifs sulfatés, commercialisée sous 3° le nom Amphoterge 2 WAS MOD par la société Lonza Inc.
D'autres exemples d'agents d'augmentation de la sensibilité comprennent les surfactifs synthétiques anioniques, généralement décrits comme étant les composés qui contiennent des groupements hydrophile et lipophile dans leur structure moléculaire et qui s'ionisent 35 dans un milieu aqueux en donnant des anions contenant et le groupement lipophile et le groupement hydrophile. Les alkylarylsulfo-nates, les alcanesulfates et les alkylphénols sulfatés oxyéthylés sont des exemples illustratifs du type anionique de composés tensio-actifs.
40 Les alkylarylsulfonates forment une catégorie d'agents tensio-actifs anioniques synthétiques qui sont représentés par la formule générale:
(R6)n1-(Y)Ar-(S03M)n2 (E)
45 dans laquelle Rö est un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée ayant de 8 à 24 atomes de carbone; n! vaut de 1 à 3; n2 vaut 1 ou 2; Ar est un radical phényle ou naphtyle, et Y et M ont les mêmes définitions que dans la formule B ci-dessus. R6 peut, par exemple, être un radical méthyle, éthyle, hexyle, octyle, isooctyle, nonyle, décyle, 50 dodécyle, tétradécyle, octadécyle, etc.
Des composés illustratifs des alkylarylsulfonates comprennent le dodécylbenzènesulfonate de sodium, le décylbenzènesulfonate de sodium, le méthyldodécylbenzènesulfonate d'ammonium, le dodécylbenzènesulfonate d'ammonium, l'octadécylbenzènesulfonate de 55 sodium, le nonylbenzènesulfonate de sodium, le dodécylnaphtalène-sulfonate de sodium, l'heptadécylbenzènesulfonate de sodium, l'eicosylnaphtalènesulfonate de potassium, l'undécylnaphtalène-sulfonate d'éthylamine et le docosylnaphtalènesulfonate de sodium.
Les alkylsulfates forment une catégorie d'agents tensio-actifs œ anioniques synthétiques qui sont représentés par la formule générale:
Rs0S03M (F)
dans laquelle Rs et M ont les mêmes définitions que dans la formule B ci-dessus.
65 Des composés représentatifs de la catégorie des alkylsulfates de surfactifs anioniques comprennent l'octadécylsulfate de sodium, l'hexadécylsulfate de sodium, le dodécylsulfate de sodium, le nonyl-sulfate de sodium, le décylsulfate d'ammonium, le tétradécylsulfate
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de potassium, l'octylsulfate de diéthanolamine, l'octadécylsulfate de triéthanolamine et le nonylsulfate d'ammonium.
Des agents tensio-actifs cationiques peuvent également être utilisés comme agents d'augmentation de la sensibilité du LAL. Ces agents sont les composés tensio-actifs qui contiennent un groupement hydrophobe organique et un groupement solubilisant cationi-que. Des groupes solubilisants cationiques types sont les groupements amine et quaternaires. De tels agents tensio-actifs cationiques sont représentés par la formule générale suivante:
.N i +
R, - C | (G)
\ • CH_
dans laquelle R5, Y et Y' ont les mêmes définitions que dans la formule C ci-dessus. Un exemple en est le produit Quaternary O commercialisé par la société Ciba-Geigy Corporation.
D'autres exemples d'agents d'augmentation de la sensibilité du LAL comprennent des composés tensio-actifs non ioniques qui peuvent grosso modo être décrits comme des composés qui ne s'ionisent pas, mais qui acquièrent des caractéristiques hydrophiles à partir d'une chaîne latérale oxygénée telle que le radical polyoxy-éthylène, et dont la partie lipophile de la molécule peut provenir d'acides, de phénols, d'alcools, d'amides ou d'amines gras. On prépare habituellement ces composés en faisant réagir un oxyde d'al-kylène tel que l'oxyde d'éthylène, l'oxyde de butylène, l'oxyde de propylène, etc., avec un acide gras, un alcool à chaîne droite ou ramifiée contenant un ou plusieurs groupements hydroxyle, un phénol, un thiophénol, un amide ou une amine, pour former des polyoxy-alkylèneglycoéthers et -esters, des polyoxyalkylènealkylphénols, des polyoxyalkylènethiophênols, des polyoxyalkylènamides, etc. Il est généralement préférable de faire réagir d'environ 3 à environ 30, ou mieux de 10 à 30 mol d'oxyde d'alkylène par mole de l'acide, de l'alcool, du phénol, du thiophénol, de l'amide ou de l'amine gras.
Sont représentatifs de ces surfactifs non ioniques les produits obtenus à partir de la réaction d'un oxyde d'alkylène avec un alcool aliphatique ayant de 8 à 18 atomes de carbone, par exemple l'alcool octylique, nonylique, décylique, octadécylique, dodécylique, tétradé-cylique, etc. ; avec un monoester d'alcool hexahydrique, dont le groupement ester contient de 10 à 20 atomes de carbone, par exemple le monolaurate de sorbitanne, le monooléate de sorbitanne ou le monopalmitate de sorbitanne; avec un alkylphénol dont le radical alkyle contient entre 4 et 20 atomes de carbone, par exemple le radical butyle, dibutyle, amyle, octyle, dodécyle, tétradécyle, etc., ou avec une alkylamine dont le radical alkyle contient entre 1 et 8 atomes de carbone.
Des composés représentatifs des surfactifs non ioniques synthétiques comprennent les produits obtenus par condensation de l'oxyde d'éthylène ou de l'oxyde de propylène avec l'un des produits suivants: propylèneglycol, éthylènediamine, diéthylèneglycol, dodécyl-phénol, nonylphénol, alcool tétradécylique, N-octadécyldiéthanol-amide, N-dodécylmonoéthanolamide, monooléate de polyoxy-éthylène-(20)-sorbitanne vendu sous le nom Tween 80, et le mololau-rate de polyoxyéthylène-(20)-sorbitanne vendu sous le nom Tween 20.
D'autres surfactifs non ioniques comprennent des oxydes d'amines tertiaires à longue chaîne correspondant à la formule générale suivante:
R5R7R8N -» O (H)
dans laquelle R5 a la même définition que dans la formule A ci-dessus, et R, et Rs sont chacun un radical méthyle ou éthyle. La flèche présente dans la formule est une représentation traditionnelle d'une liaison semi-polaire. Des exemples d'oxydes d'amines convenant pour la présente invention comprennent l'oxyde de diméthyl-dodécylamine, l'oxyde de diméthyloctylamine, l'oxyde de diméthyl-
décylamine, l'oxyde de diméthyltridécylamine, l'oxyde de diméthyl-hexadécylamine.
Le LAL peut être préparé par des modes opératoires connus dans la technique, par exemple par le mode opératoire décrit dans le brevet britannique N° 1522127, qui est incorporé ici à titre de référence.
Par exemple, on recueille l'hémolymphe de spécimens sains de Limulus polyphemus dans une solution saline d'anticoagulant, comme décrit généralement par Levin et Bang, «Clottable Protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endo-toxin», in: «Thromb. Diath. Haemorrh.», 19,186-197 (1968). On recueille les amibocytes et on les lave avec la solution saline d'anticoagulant, l'amibocyte étant séparé de l'anticoagulant par centrifu-gation.
On met les amibocytes séparés en suspension dans de l'eau et on complète la rupture osmotique des cellules par agitation mécanique. On sépare les débris cellulaires du lysat par centrifugation, et on rassemble les fractions du lysat et on les conserve à 0-4° C.
Pour former le réactif LAL, on tamponne généralement les fractions de LAL susmensionnées dans un intervalle de pH convenable, par exemple de 5,5 à 8,5, de préférence de 6,5 à 7,5, au moyen d'un tampon approprié, par exemple le tris(hydroxyméthyl)amino-méthane, le maléate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, l'acide 1,4-pipérazinediéthanesulfonique, l'acide morpholinopropanesulfo-nique, l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique, la triéthanolamine, l'imidazole et le tris(hydroxyméthyl)imidazole. On peut ensuite répartir le réactif LAL entre des fioles à sérum, contenant par exemple 1,2 ou 5,2 ml de solution, puis le lyophiliser. Normalement, après la lyophilisation, on ferme hermétiquement les fioles et on les réfrigère (1 à 5° C).
Normalement, conformément à cette invention, on traite le LAL en ajoutant l'agent d'augmentation de la sensibilité du lysat au LAL après que le LAL a été séparé des débris cellulaires d'amibocytes. Habituellement, on l'ajoute pendant ou au moment de la préparation du réactif LAL, par exemple en même temps que le tampon et les autres ingrédients.
On augmente encore la sensibilité du réactif LAL vis-à-vis de l'endotoxine en ajoutant de faibles concentrations de cations divalents et monovalents. Les ions calcium et manganèse sont les ions divalents préférés, mais on peut faire appel à d'autres ions alcalino-terreux tels que les ions magnésium et strontium, ou à d'autres ions divalents. Les ions magnésium et strontium sont également des ions divalents préférés. Les ions sodium sont les ions monovalents préférés, mais on peut faire appel à d'autres ions monovalents, notamment les ions de métaux alcalins tels que les ions lithium. Les chlorures (CaCl2, NaCl, etc.) constituent des sources commodes de ces ions ajoutés, mais on peut utiliser d'autres sels. On ajoute de préférence ces électrolytes en quantités propres à augmenter la sensibilité vis-à-vis de l'endotoxine, par exemple pour le cation divalent (Ca+2 par exemple), la concentration sera comprise entre 0,0001 et 0,4 mol/1 et, pour le cation monovalent (Na+ par exemple), la concentration sera comprise entre 0,01 et 0,4 mol/1.
Le réactif LAL peut également contenir des adjuvants classiques tels que les stabilisateurs, y compris le lactose. Ces adjuvants, lorsqu'ils sont utilisés, sont ajoutés en petites quantités suffisantes pour conférer les qualités souhaitées, mais sans compromettre les propriétés voulues des réactifs LAL.
Toutes les opérations précédentes sont menées dans des conditions de traitement du lysat, c'est-à-dire telles que le produit final soit stérile et dépourvu d'endotoxines. Les méthodes qui permettent d'assurer l'absence d'endotoxines sont connues dans la pratique. Par exemple, on peut débarrasser des endotoxines les additifs minéraux (CaCl2, NaCl, etc.) en chauffant les sels secs à 250° C pendant au moins 120 min. Les aditifs organiques, en raison de leurs points de fusion, par exemple, doivent d'ordinaire être dissous, être rendus acides (ph < 5) ou alcalins (ph > 9), et la solution doit être traitée en autoclave à 121° C pendant 30 à 60 min ou davantage pour détruire les endotoxines éventuellement présentes.
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Normalement, le lysat contenu dans le réactif selon l'invention est présent en une quantité permettant de déterminer la présence d'endotoxines, par exemple en une quantité suffisante pour permettre la détermination de la présence d'endotoxines dans un essai ultérieur au LAL pour la présence d'endotoxines, et généralement il s'agit d'une quantité qui permettra de détecter d'environ 0,007 à environ 0,5 ng/ml, de préférence d'environ 0,007 à environ • 0,050 ng/ml d'endotoxines de référence EC-2 de la Food and Drug Administration. On peut lyophiliser le réactif LAL susmentionné, ce qui est préférable.
Conformément à cette invention, on peut utiliser le réactif LAL pour déterminer la présence d'endotoxines dans des conditions propres à une telle détermination, selon le mode opératoire habituel, tel que décrit par exemple dans le brevet britannique N° 1522127, ainsi que dans les exemples ci-après.
Les exemples suivants illustrent l'invention; toutes les parties sont données en poids/volume, sauf indication contraire.
Préparation du lysat de limule
On a préparé le lysat de limule par modification d'un mode opératoire décrit à l'origine par Levin et Bang [«Thromb. Diath. Hae-morrh.», 19,186 (1969)]. On a péché des crabes limules, Limuluspo-lyphemus, dans l'océan Atlantique au voisinage de la ville de Beau-fort (Caroline du Nord). On a prélevé l'hémolymphe (500 ml environ) par ponction cardiaque à l'aide d'une aiguille de calibre 16, et on l'a recueillie dans une bouteille de centrifugation en verre de 11 exempte d'endotoxines, qui contenait 500 ml de N-éthylmaléimide à 0,125% dans une solution saline à 3% dépourvue d'endotoxines, réchauffée à 42° C. On a réchauffé la bouteille de centrifugation contenant la solution d'hémolymphe et d'anticoagulant à 42° C pendant 8 min, puis on l'a centrifugée à 150 g pendant 10 min. On a fait décanter le plasma surnageant et on a remis en suspension la boulette d'amibocytes dans la solution d'anticoagulant. On a à nouveau mis les cellules sous forme de boulette par centrifugation comme précédemment. On a remis les cellules tassées en suspension dans une solution saline à 0,9%, dépourvue de substances pyrogènes, et on les a transférées dans un tube de centrifugation en matière plastique de 50 ml dépyrogéné. On a à nouveau centrifugé les cellules lavées à 150 g. Après avoir fait décanter la solution saline, on a rompu les amibocytes tassés en leur ajoutant de l'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, à raison de 7 ml d'eau pour 3 ml de cellules tassées. Après mélange dans un dispositif tourbillon pendant 10 à 15 s, on a conservé les cellules lysées pendant 24 h à 1-5° C. On a fait sédimenter les débris cellulaires par centrifugation à 1500 g pendant 15 min environ. On a fait décanter le lysat et on l'a conservé à 0-4° C. On a jeté les débris cellulaires.
Préparation de solutions étalons d'endotoxines
On a préparé, dans de l'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, des solutions étalons du lot EC-2 de l'endotoxine étalon de référence de la FDA. La reconstitution de 1 jxg d'endo-toxine fournie dans une fiole avec 10 ml d'eau a donné une concentration initiale de 0,1 |ig/ml. On a secoué la fiole sur un dispositif de secouage à va-et-vient pendant 1 h. On a préparé des dilutions en série pour obtenir les concentrations d'endotoxines suivantes: 10 ng/ml, 1 ng/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,25 pg/ml, 15,6 pg/ml et 7,8 pg/ml. Une fois préparées, on a conservé les solutions d'endotoxines pendant 48 h, puis on les a jetées. D'autres étalons d'endotoxines utilisés étaient des solutions du lot N° 1 d'endotoxines de référence FDA provenant de Klebsiella pneumoniae, du lot 071857 d'endotoxines Escherichia coli (Difco), et une reformulation du lot EC-2 de référence préparé dans le laboratoire de la titulaire. Les solutions étalons d'endotoxines préparées à partir du lot 071857 d'endotoxines d'E. coli avaient les concentrations suivantes: 6,25; 12,5; 50; 75; 100; 150 et 200 pg/ml.
Méthode d'essai du lysat
On'a préparé des dilutions de lysat de 25 à 70% dans un tampon 0,1M à pH 7,0 qui était habituellement le tris, c'est-à-dire le tris-(hydroxyméthyl)aminométhane. D'autres tampons utilisés comprenaient l'imidazole, le trisimidazole, la triéthanolamine, le trisma-léate, l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthanesuIfonique (HEPES), l'acide 1,4-pipérazinediéthanesulfonique (PIPES) et l'acide morpholinopropanesulfonique (MOPS).
Pour déterminer la sensibilité du lysat, on a combiné 0,1 ml de chacune des dilutions d'endotoxine avec 0,1 ml de lysat dans des tubes en verre à bouchon fileté de 10 x 75 mm, dépyrogénés, et on les a fait incuber pendant 1 h à 37° C. On a déterminé les résultats en retournant doucement chaque tube de 180°. Un caillot qui restait intact après ce retournement indiquait un essai positif à l'endotoxine.
Préparation et dépyrogénation de solutions de surfactifs
On a préparé des stocks de solutions d'agents d'augmentation de la sensibilité du LAL, à des concentrations atteignant jusqu'à 10% d'ingrédients actifs en solution aqueuse (poids/volume). Le plus souvent, la concentration préparée était de 1% (poids/volume). Bien que le mode opératoire variât quant à la quantité d'un agent à l'autre, on dissolvait une quantité suffisante de substance dans 50 ml de solution aqueuse pour obtenir la concentration voulue après dilution à 100 ml. La solution contenait également 7,5 ml de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,05M (c'est-à-dire le produit Trizma Base, Sigma Chemical Company), et 1 ml de soude 2N pour donner un pH final supérieur ou égal à 11. On conservait l'agent contenu dans la solution alcaline pendant 12 h ou plus à 0-4° C pour assurer une dépyrogénation complète. Après avoir ajusté la solution à pH 8 environ, on la traitait en autoclave à une température égale ou supérieure à 121°C sous 1,05 kg/cm2 pendant 15 min ou plus. On ajustait finalement le pH à 7,0 ± 0,5. On calculait la concentration de l'agent et on ajustait la dilution de façon à obtenir la concentration finale voulue. On dépyrogénait les agents labiles sous l'effet des bases fortes en les traitant par un acide et en substituant respectivement à la soude et au produit Trizma Base de l'acide chlorhydrique et le tampon tris.
Addition d'agents au lysat
On a ajouté au lysat, pendant la dilution avec le tampon, des solutions d'agents préparées comme décrit ci-dessus. La quantité ajoutée variait avec l'agent utilisé, mais l'intervalle de concentration de tous les agents essayés était de 0,001 à 1,0% (poids/volume) de concentration finale dans la solution de lysat. L'ordre d'addition des composants ne modifiait pas la sensibilité résultante du lysat.
Exemple I:
On a dépyrogéné, comme décrit ci-dessus, l'agent d'augmentation de la sensibilité du LAL, le Zwittergent 3-14, le N,N-diméthyl-3-ammonio-l-propanesulfonate, une sulfobétaïne vendue par Cal-biochem-Behring Corporation, et on l'a dilué à une concentration finale de 1 % (poids/volume). On a préparé un lot de lysat 9CZC sous la forme d'une dilution à 50% avec un tampon de trismaléate 0,1 M à pH 7,0. On a procédé à l'addition de l'agent d'augmentation de sensibilité de façon à obtenir une concentration finale dans le lysat de 0,005, 0,01,0,02, 0,05, 0,075 et 0,10% (poids/volume). Un échantillon témoin contenait de l'eau dépourvue de substances pyrogènes à la place du surfactif. On a conservé les dilutions de lysat pendant une nuit à 0-4° C et on les a essayées le lendemain avec une série de dilutions d'endotoxines EC spécialement formulées (désignées par les initiales EC). Les résultats (tableau I) indiquent à la fois l'intervalle de concentration effectif de l'agent d'augmentation de sensibilité et l'augmentation totale de la sensibilité du lysat vis-à-vis de l'endotoxine, par rapport au lysat témoin.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7 647 871
Tableau I Tableau II
Echantillon
Agent d'augmentation de sensibilité (%)
Sensibilité* du lysat
Témoin
0
500
LAL + agent d'augmentation
de sensibilité
0,005
1000,0
0,01
500,0
0,02
31,2
0,05
10000,0
0,075
10000,0
0,10
10000,0
5
10
15
Endotoxine
Echantillon
Sensibilité* du lysat
E. coli 071857
Témoin
75,0
Agent d'augmentation de la sensibilité du LAL
25,0
EC-2 de référence FDA
Témoin
500,0
Agent d'augmentation de la sensibilité du LAL
62,5
K. pneumoniae de FDA
Témoin
1000,0
Agent d'augmentation de la sensibilité du LAL
125,0
* Exprimée comme la plus faible concentration d'endotoxine (en picogrammes par millilitre) qui donne un essai de coagulation positif.
Exemple II:
On a préparé des solutions étalons d'endotoxine pour l'endotoxine E. coli 071857, l'endotoxine EC-2 de référence FDA, et le lot N° 1 de référence FDA de K. pneumoniae. On a dilué le lysat avec du tampon tris 0,1 M à pH 7,0 et on lui a ajouté la solution de l'agent d'augmentation de sensibilité, le Zwittergent 3-14, de façon à obtenir une dilution de lysat de 30% contenant 0,02% de Zwittergent 3-14 (poids/volume). On a remplacé l'agent par de l'eau dans l'échantillon témoin. On a procédé à l'essai du lysat avec chaque série de dilutions d'endotoxine.
* Exprimée comme la plus faible concentration d'endotoxine (en picogrammes par millilitre) qui donne un essai de coagulation positif.
Exemple III:
On étudié vingt-deux agents d'augmentation de la sensibilité du LAL disponibles dans le commerce pour déterminer leurs effets sur la sensibilité du lysat à l'endotoxine. On a préparé des solutions de chacun et on les a ajoutées au lot 9FI de lysat à des concentrations 25 finales échelonnées entre 0,001 et 0,20% (poids/volume). On a ensuite essayé des échantillons de lysat avec l'endotoxine EC de FDA reformulée (EC). Dans le tableau III, les agents sont énumérés dans l'ordre d'efficacité décroissante. La concentration la plus efficace essayée dans le lysat, ainsi que la sensibilité correspondante du 30 lysat, sont indiquées. La sensibilité du lysat témoin (dilution de 50%) ne contenant aucun agent est également indiquée.
20
Tableau III
Marque ou appellation
Source
Surfactif
Concentration
Sensibilité3
commerciale efficace (%)
du lysat
Zwittergent 3-14
Calbiochem-Behring
Amphotère
0,02
15,6
Varion CADG
Sherex Chemical Company, Inc.
Amphotère
0,02
15,6
Lonzaine CO
Lonza Inc.
Amphotère
0,02
15,6
Lonzaine CS
Lonza Inc.
Amphotère
0,02
15,6
Varion CAS
Sherex Chemical Company, Inc.
Amphotère
0,02
31,2
Emcol CC38-17
Witco Chemical Corporation
Amphotère
0,02
31,2
Deriphat 151
Henkel Inc., USA
Amphotèreb
0,01
31,2
Bina ,Coba 3001
Ciba-Geigy Corporation
Cationique
0,01
31,2
Barlox 12
Lonza Inc.
Non ionique
0,01
31,2
Quaternary 0
Ciba-Geigy Corporation
Cationique
0,002
31,2
Polystep B-5
Stepan Chemical Company
Anionique
0,001
31,2
Tween 80
ICI Americas Inc.
Non ionique
0,20
62,5
Amphoterge K-2
Lonza Inc.
Amphotère
0,02
62,5
Lodyne S-100
Ciba-Geigy Corporation
Amphotère
0,02
62,5
Deriphat 154
Henkel Inc., USA
Amphotèreb
0,002
62,5
Polystep A-15
Stepan Chemical Company
Anionique
0,002
62,5
Amphoterge KJ-2
Lonza Inc.
Amphotère
0,001
62,5
Deriphat 160
Henkel Inc., USA
Amphotèreb
0,02
62,5
Polystep A-17
Stepan Chemical Company
Anionique
0,001
62,5
Amphoterge WAS
Lonza Inc.
Amphotère
0,001
125,0
Dianol RSX
Quaker Chemical Corporation
Anionique
0,02
250,0
Tween 20
ICI Americas Inc.
Non ionique
0,002
250,0
Lysat témoin
—
—
—
125,0
a Exprimée comme la plus faible concentration d'endotoxine (en picogrammes par millilitre) qui donne un essai de coagulation positif. "ApH 7, c'est la forme anionique qui prédomine.
647 871
8
Exemple IV:
Pour vérifier si la sensibilité accrue observée dans le lysat traité par l'agent d'augmentation de la sensibilité se conservait pendant la lyophilisation, on a préparé une dilution de 30% de lysat dans du tampon tris 0,05M, avec et sans Zwittergent 3-14 à 0,02% (concentration finale dans le lysat). On a introduit 1,2 ml de solution de lysat dans des fioles à sérum ayant chacune une capacité de 10 ml. On a congelé des échantillons à —35° C et on les a lyophilisés sous un vide de 50 jx avec un temps de séchage de 32 h environ. On a fermé hermétiquement les fioles avec des bouchons en caoutchouc fendus et des bouchons métalliques. On a reconstitué le lysat lyophilisé avec 1,2 ml d'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, puis on l'a essayé avec le lot EC-2 d'endotoxine de référence FDA. Le lysat témoin dépourvu d'agent d'augmentation de sensibilité avait une sensibilité de 62,5 pg/ml. En présence de l'agent d'augmentation de sensibilité, la sensibilité du lysat se trouvait multipliée par deux et était égale à 31,2 pg/ml.
Exemple V:
On a préparé un lot ODH correspondant à la récolte d'une journée de lysat de limule, vieux d'une semaine, sous la forme d'une dilution à 40% dans un tampon de maléate de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,05M à pH 7,0, contenant aux concentrations finales du CaCl2 0,06M et du MnCl2 0,01M, ainsi que du Zwittergent 3-14 à 0,03%. On a introduit des fractions de 1,2 ml de cette solution dans des fioles de 8 ml et on les a congelées à —45° C, puis on les a lyophilisées sous un vide de 50 |i avec un temps de séchage de 28 h environ. On a fermé hermétiquement les fioles avec des bouchons en caoutchouc fendus et on les a fermées avec des bouchons filetés en matière plastique. On a reconstitué le lysat lyophilisé avec 1,2 ml d'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, et 5 on l'a essayé avec le lot EC-2 d'endotoxine de référence FDA. La sensibilité du lysat lyophilisé traité par l'agent d'augmentation de sensibilité était de 62 pg/ml. Une dilution témoin à 40% de LAL sans agent d'augmentation de sensibilité, essayée avant lyophilisation, avait une sensibilité de 1 ng/ml.
10
Exemple VI:
On a combiné des récoltes d'une journée de lysat de limule ayant une sensibilité égale ou supérieure à 500 pg/ml d'endotoxine 1CF d'jE. coli, et on les a préparées sous la forme d'une dilution à 40% 15 dans un tampon de maléate de tris(hydroxyméthyl)aminomêthane 0,022M à pH 7,0, contenant aux concentrations finales du MgCl2 0,02M, du SrCl2 0,01M, du CaCl2 0,01M ainsi que 0,025% de Zwit-tergent 3-14. On a introduit cette solution, en fractions de 1,2 ml et de 5,2 ml, dans des fioles de 10 ml, et on l'a congelée à — 50° C. On a 20 lyophilisé les échantillons sous un vide de 100 |i avec un temps de séchage de 72 h environ. On a reconstitué le produit lyophilisé avec 1,2 ou 5,2 ml d'eau pour injection dépourvue de substances pyrogènes, suivant le volume de départ de lysat. Quand on a essayé avec de l'endotoxine 1CF de E. coli après lyophilisation, on a constaté que la 25 sensibilité du lysat lyophilisé traité par l'agent d'augmentation de sensibilité, pour les deux tailles d'échantillon, était de 25 pg/ml, contre une sensibilité témoin de 500 pg/ml.
R
Claims (10)
- 6478712REVENDICATIONS1. Réactif de lysat d'amibocytes de limule permettant de déterminer la présence d'endotoxines, comprenant une dispersion aqueuse tamponnée d'un lysat d'amibocytes de limule en une quantité propre à déterminer la présence d'endotoxines, ayant une sensibilité améliorée à l'endotoxine, et une quantité suffisante d'un agent d'augmentation de sensibilité du lysat ayant des caractéristiques d'augmentation de la sensibilité du lysat, ledit agent d'augmentation de sensibilité du lysat étant choisi dans le groupe comprenant:I) les surfactifs amphotères ayant les formules suivantes:dans laquelle:Rs, Y et Y' ont les mêmes définitions que ci-dessus, et IV) les surfactifs non ioniques ayant la formule suivante:OR2(Rs — C—nh)n—R4—n® —Ri —s03eI I r3 y rs—n—ri-coomY Y'RsN(R1-COOM)2 IY(a)(B)20(c)OR,25(rs —C—NH)n—r4—N© —Rj—cooeR3(d)(r<i)ni• (Y)Ar • (S03M)n2rsoso3m(e)(f)dans lesquelles:R5, Y et M ont les mêmes définitions que ci-dessus;R6 est un radical alkyle de 8 à 24 atomes de carbone;n! est un nombre entier de 1 à 3 ;n2 est égal à 1 ou 2, etAr est un radical phényle ou naphtyle;III) les surfactifs cationiques ayant la formule suivante:(h)dans lesquelles:Rj est un radical alkylène ayant de 1 à 4 atomes de carbone; Y et Y' sont chacun: 1) un taome d'hydrogène, 2) un radical alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué, ou 3) un radical hydroxyalkyle correspondant;R2 et R3 sont chacun: 1) un radical alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué, ou 2) un radical hydroxyalkyle 35 correspondant:n est égal à 0 ou 1 et, lorsque n est égal à 0,R4 est un radical alkyle contenant de 8 à 18 atomes de carbone éventuellement substitué et, lorsque n est égal à 1,R4 est un radical alkylène ayant de 1 à 6 atomes de carbone; 40 R5 est un radical alkyle contenant de 8 à 18 atomes de carbone éventuellement substitué, etM est un atome d'hydrogène, de sodium ou de potassium ou un radical ammonium quaternaire;II) les surfactifs ayant les formules suivantes : 45R5R7RsN —» O dans laquelle:R5 a la même définition que ci-dessus;R7 et R8 sont chacun un radical méthyle ou éthyle, ainsi que les surfactifs non ioniques choisis dans le groupe comprenent les produits de la condensation de 10 à 30 mol d'oxyde d'éthylène avec le monoester d'un alcool hexahydrique contenant 6 atomes de carbone, le groupement ester contenant de 10 à 20 atomes de carbone.
- 2. Réactif selon la revendication 1, dans lequel il y a en outre les cations Na+, Mn+ + et Ca+ + en quantités propres à augmenter la sensibilité du lysat.
- 3. Réactif selon la revendication 1, dans lequel il y a en outre les cations Na+, Sr+ +, Ca+ + et Mg+ + en quantités propres à augmenter la sensibilité du lysat et dans lequel le lysat est présent de préférence en une quantité suffisante pour permettre la détection de 0,007 à 0,050 ng/ml d'endoxine étalon EC-2 de référence de la Food and Drug Administration.
- 4. Réactif selon l'une des revendications 2 ou 3, dans lequel l'agent d'augmentation de la sensibilité est choisi dans le groupe des surfactifs amphotères représentés par la formule A de la revendication 1 et est présent de préférence à une concentration de 0,01 à 0,05% (poids/volume).
- 5. Réactif selon la revendication 4, dans lequel n est égal à 0, R4 est le radical tétradécyle, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle, et R! forme un radical triméthylène ou dans lequel n estégal à 1, R4 est un radical triméthylène, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle, et R, forme un groupement de formule—CH,—CH—CH,—.oh50
- 6. Réactif selon la revendication 4, dans lequel l'agent d'augmentation de la sensibilité est choisi dans le groupe des surfactifs amphotères représentés par la formule D de la revendication 1 et est présent de préférence à une concentration de 0,01 à 0,05% (poids/ volume).
- 7. Réactif selon la revendication 5, dans lequel n est égal à 1, R4 est un radical propylène, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle, et R, forme un radical méthylène ou dans lequel n est égalIYà 0, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle et R! forme un radicalRr méthylène.
- 8. Réactif selon la revendication 6, dans lequel n est égal à 0, R2 et R3 sont chacun un radical méthyle et Rj forme un radical méthyl-55 ène. IY
- 9. Utilisation du réactif selon la revendication 1 pour déterminer la présence d'endotoxines.
- 10. Utilisation selon la revendication 9 d'un réactif selon l'une 60 des revendications 2 à 7.(g)
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