NL8103113A - Verbetering in de werkwijze voor het bereiden van een limuluslysaat. - Google Patents
Verbetering in de werkwijze voor het bereiden van een limuluslysaat. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8103113A NL8103113A NL8103113A NL8103113A NL8103113A NL 8103113 A NL8103113 A NL 8103113A NL 8103113 A NL8103113 A NL 8103113A NL 8103113 A NL8103113 A NL 8103113A NL 8103113 A NL8103113 A NL 8103113A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- lysate
- reagent
- endotoxin
- group
- formula
- Prior art date
Links
- 239000006166 lysate Substances 0.000 title claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 241000239218 Limulus Species 0.000 title claims description 14
- 230000006872 improvement Effects 0.000 title claims description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 59
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 42
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 42
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 24
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 19
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 18
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 13
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 claims description 8
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 7
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 4
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- BFVQTKQTUCQRPI-YYEZTRBPSA-N LPS with O-antigen Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)O4)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)OC([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)COC2[C@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]([C@@H](O)CO)O2)O)OC([C@H]1O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCCN)[C@@H]([C@@H](O)CO)OC([C@H]1O)O[C@H]1[C@H](O[C@]2(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@]3(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OCCN)C3)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C2)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C[C@](O[C@@H]1[C@@H](O)CO)(OC[C@H]1O[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O2)O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@H]([C@@H]1OP(O)(O)=O)OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O BFVQTKQTUCQRPI-YYEZTRBPSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 claims description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims 7
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 claims 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 2
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 claims 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 claims 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 claims 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 claims 1
- -1 hydroxypropyl Chemical group 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 8
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 5
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 4
- HLZKNKRTKFSKGZ-UHFFFAOYSA-N tetradecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCO HLZKNKRTKFSKGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XYYUAOIALFMRGY-UHFFFAOYSA-N 3-[2-carboxyethyl(dodecyl)amino]propanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCN(CCC(O)=O)CCC(O)=O XYYUAOIALFMRGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTMWOUBCEZXSHN-BTJKTKAUSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;(z)-but-2-enedioic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)\C=C/C(O)=O HTMWOUBCEZXSHN-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 2
- TXPKUUXHNFRBPS-UHFFFAOYSA-N 3-(2-carboxyethylamino)propanoic acid Chemical class OC(=O)CCNCCC(O)=O TXPKUUXHNFRBPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RRRHSSRMQAVLCO-UHFFFAOYSA-N 4,5-dihydro-1h-imidazole-4,5-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1NC=NC1C(O)=O RRRHSSRMQAVLCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- LMTSQIZQTFBYRL-UHFFFAOYSA-N n'-octadecylethane-1,2-diamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCCN LMTSQIZQTFBYRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229910001427 strontium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUPGQJHSSFSKLQ-ODZAUARKSA-N (z)-but-2-enedioic acid;methane Chemical compound C.OC(=O)\C=C/C(O)=O BUPGQJHSSFSKLQ-ODZAUARKSA-N 0.000 description 1
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GODZNYBQGNSJJN-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethane-1,2-diol Chemical compound NC(O)CO GODZNYBQGNSJJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOHZKUSWWGUUNR-UHFFFAOYSA-N 2-(4,5-dihydroimidazol-1-yl)ethanol Chemical compound OCCN1CCN=C1 GOHZKUSWWGUUNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYEJMVLDXAUOPN-UHFFFAOYSA-N 2-dodecylphenol Chemical compound CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1O CYEJMVLDXAUOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYJNVSAUBGJVLV-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylazaniumyl)propane-1-sulfonate Chemical compound CN(C)CCCS(O)(=O)=O GYJNVSAUBGJVLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N Lithium ion Chemical compound [Li+] HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N Nonylphenol Natural products CCCCCCCCCC1=CC=C(O)C=C1 IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000882917 Penaeus paulensis Hemolymph clottable protein Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N Sorbitan monopalmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N 0.000 description 1
- VBIIFPGSPJYLRR-UHFFFAOYSA-M Stearyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C VBIIFPGSPJYLRR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOUUIFSIQMVYKP-UHFFFAOYSA-N Tetradecanoyl acetate Natural products CCCCCCCCCCCCCCOC(C)=O IOUUIFSIQMVYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFZPTPZMISZREH-UHFFFAOYSA-N [2,4-bis(hydroxymethyl)-1h-imidazol-5-yl]methanol Chemical compound OCC1=NC(CO)=C(CO)N1 IFZPTPZMISZREH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000005277 alkyl imino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- KTYVHLCLTPLSGC-UHFFFAOYSA-N amino propanoate Chemical compound CCC(=O)ON KTYVHLCLTPLSGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPDKMELSVLIAOG-UHFFFAOYSA-N azanium;decyl sulfate Chemical compound N.CCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O VPDKMELSVLIAOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229940096386 coconut alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- ZRKZFNZPJKEWPC-UHFFFAOYSA-N decylamine-N,N-dimethyl-N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] ZRKZFNZPJKEWPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N dodecyl benzenesulfonate;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCCOS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N dodecyldimethylamine N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000012525 endotoxin sample Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- RXHDXDIEHWVFOC-UHFFFAOYSA-M ethyl-dimethyl-octadecylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC RXHDXDIEHWVFOC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910001416 lithium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940043348 myristyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- QIBKKTQVKFEWCH-UHFFFAOYSA-N n'-tetradecylethane-1,2-diamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCNCCN QIBKKTQVKFEWCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBOBFGGLRNWLIL-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylhexadecan-1-amine oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] IBOBFGGLRNWLIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSVIRMFSJVHWJV-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyloctan-1-amine oxide Chemical compound CCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] RSVIRMFSJVHWJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHXSGTCOHZCUKB-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyltridecan-1-amine oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] VHXSGTCOHZCUKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N nonylphenol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=CC=C1O SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZQYCOCAFPQWBL-UHFFFAOYSA-N octadecyl sulfate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O DZQYCOCAFPQWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000006259 organic additive Substances 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- DQFWABVCOIFBPO-UHFFFAOYSA-M potassium;tetradecyl sulfate Chemical compound [K+].CCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DQFWABVCOIFBPO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940080264 sodium dodecylbenzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M sodium;octadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 235000011071 sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001570 sorbitan monopalmitate Substances 0.000 description 1
- 229940031953 sorbitan monopalmitate Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
* .. « w VO 2053
Betr.: Verbetering in de werkwijze voor het bereiden van een Limulus-* lysaat.
De uitvinding betreft een -werkwijze voor het verbeteren van de gevoeligheid van Limulus -amoebocyte—Iysaat (hieronder veelal aangeduid als LAL of lysaat) voor endotoxine, een verbeterd LAL reagens en het gebruik van een dergelijk LA1 reagens.
5 Als bekend is, is de LAL proef voor het aantonen van endotoxinen de meest practische en gevoelige proef voor het bepalen van endotoxinen. Fractische bepalingen gebruiken amoebocyte-lysaat uit Limulus hemolymfe, verkregen uit bepaalde krabben. Dit lysaat wordt gecombineerd met passende tweewaardige kationen, geschikte buffers en andere bestanddelen 10 waardoor een LAL reagens wordt gevormd. Dit reagens reageert vervolgens met endotoxine tijdens de proef tot een gel. Producenten van LAL — reagentia ondervinden vaak moeilijkheden bij het produceren van een lysaat met de gewenste gevoeligheid voor het aantonen van endotoxine.
De gevoeligheid van preparaat tot preparaat is eveneens verschillend.
15 Deze problemen worden tenminste ten dele geweten aan de aanwezigheid van een endogene, ongedefinieerde endotaxine-remstof in het lysaat (hieronder veelal aangeduid als remstof).
¥einig is bekend omtrent de aard van de remstof of zijn in vivo rol in de betreffende krab. Sleetroforetische onderzoekingen duiden 20 erop, dat de remstof een lipoprotexne met hoog molecuulgewicht is.
Deze kan in de amoebocyte de taak hebben het coagulatie-verdedigings-mechanisme te regelen. Dat de remstof een membraancamponent kan zijn, die vrijkomt bij een cellysissis eveneens mogelijk. De onzekerheid omtrent de rol en de herkomst van de remstof wordt onderstreept door het 25 feit, dat het mechanisme van de remming nog onduidelijk is. De remstof blokkeert mogelijk de enzymatische reactie, hetzij door associatie met het enzym zelf of met het endotoxine of beide. Evenals enige andere serine-proteasen wordt het pro-klontvormende enzym vermoed een complex te vormen met calcium en glycerofosfolipide. Endotoxine zelf 30 is lipoidaal, een remstof met lipoprotelnekarakter zou dus sterk canpatibel zijn met beide componenten.
Dat de remstof een lipoprotexne is wordt ondersteund door zijn gevoeligheid voor chloroform. Als beschreven in Amerikaans octrooischrift h.lOT.OTT wordt de gevoeligheid van LAL aanmerkelijk verbeterd wanneer 8103 113 ί 4 -2- het lysaat wordt behandeld met een organisch oplosmiddels, zoals chloroform ^waardoor de remstof uit het lysaat wordt neergeslagen. De waterfase wordt dan vervolgens gewonnen en verwerkt tot een LAL-reagens.
Tegenwoordig is de bovenweergegeven oplosmiddelextractie de snel-5 ste methode voor het verbeteren van de LAL-gevoeligheid. Ongelukkigerwijze heeft deze methode diverse nadelen. Vanwege de absolute eis dat endotoxine-vrij e voorwaarden gedurende de gehele lysaatproduktie moeten worden gehandhaafd, verhoogt een ingewikkelde extractiepro-eedure en een daaropvolgende centrifugeringsbehandeling de waarschijn-10 lijkheid omtrent falen van het produkt. Als gezegd in het octrooi- schrift verlaagt de oplosmiddèlbehandeling de lysaatstabiliteit, zodat de produktie snel en in de koude moet verlopen. Ook bevat het neerslag, verwijderd uit het lysaat door de oplosmiddelbehandeling^aanmerkelijke hoeveelheden coagulogeen, het benodigde stollingsproteïne. Handhaving 15 van een passend eiwitgehalte is een eis voor een goede gelvorming.
tijdens de endotoxineproef. Kennelijk is onder de laatste omstandigheden een regeling van de reagensgevoeligheid moeilijk. Chloroform, het meest gebruikte oplosmidde^is bekend, vanwege zijn. ongewenste effekten op de mens. De gezondheid en de veiligheid van het productiepersoneel 2.0 komen daarom enigszins" in gevaar. Het is duidelijk, dat een procédé dat de genoemde nadelen vermijdt en de gevoeligheid in de gewenste mate verbetert een duidelijke verbetering zal vormen.
De uitvinding betreft derhalve een verbeterde werkwijze voor een eenvoudige en snelle verbetering van de gevoeligheid van LAL.
25 Volgens de uitvinding verkrijgt men een werkwijze voor het be handelen onder lysaat behandelende voorwaarden van LAL met verlaagde gevoeligheid voor endotoxine door de aanwezigheid van een endogene remstof,met een verhogende hoeveelheid van een lysaatgevoeligheid verhogend middel waardoor de remstof geheel of gedeeltelijk wordt 30 geneutraliseerd, en daarmede de LAL gevoeligheid voor endotoxine wordt verhoogd.
Er bestaan bepaalde minimale criteria, volgens welk men de LAL-gevoeligheid verhogende eigenschappen kan omschrijven, d.w.z. de LAL-gevoeligheid verhogende middelen volgens de uitvinding moeten bezitten 35 a) het vermogen de lysaatgevoeligheid tot een passende gevoeligheid 8103 113 # · -3- te verhogen, b.v. tot het dubbele of meer, b) het vermogen depyroge-nering te weerstaan, d.w.z. verwijdering of vernietiging van endo-toxine, door ultrafiltratie of een zuurbehandeling bij een pH beneden 5 of een basebehaadeling boven pH 8, c) het vermogen te worden gesteri-5 liseerd, b.v. door 15 minuten verhitten bij 2 at en 121°C, d) het vermogen waterige oplossingen van ca. 2% bij 25°C te vormen,, e) het vermogen, binnen het pH-traje.ct van ca. 6,0 tot. 9 te functioneren, f) het vermogen verenigbaar te. zijn met buffers en andere bestanddelen in het LAL reagens en g) het vermogen verenigbaar te zijn met LAL 10 en bij zijn reactie met endotoxinen.
Dergelijke versterkende middelen cmvatten amfotere oppervlakte-actieve middelen die zowel een anionogene als kationogene groep in hun structuur bezitten. Voorbeelden zijn de sulfobetaïnen met de formule A van het formuleblad, waarin R1 een alkyleengroep met l-k 15 koolstofatcmen, Y een niet storende chemisch geschikte substituent is in de vorm van (l) waterstof, (2) al of niet gesubstitueerd alkyl, b.v. met 1-h koolstofatcmen, zoals methyl, ethyl, propyl of hydroxyl enz.; R^ en R^ gesubstitueerde of niet gesubstitueerde alkylgroepen met 1-k koolstofatcmen, b.v. methyl, ethyl, propyl, hydroxyethyl, 20 hydroxymethyl, hydroxypropyl enz., n is 0 of 1, indien n=0, R^ al of niet gesubstitueerd alkyl , b.v. met 8-18 koolstofatomen, en indien n=l, R^ een alkyleengroep met 1-6 koolstofatcmen, en R^ al of niet gesubstitueerd alkyl, b.v. met 8-18 koolstofatcmen voorstellen.
De uitdrukking "alkyleen" cravat polymethyleengroepen en andere 25 tweewaardige, verzadigde alifatische groepen die recht of vertakt kunnen zijn.
De onderhavige sulfobetaïnen zijn op zichzelf bekend en beschreven als; zwitterion-bevochtigingsmiddelen.
De bereiding van dit soort verbindingen is b.v. beschreven door 30 Fernley in de J.Am. Oil Chemists Soc., £5., blz. 98-103 van januari 1978 en in Amerikaans octrooischrift 3.280.179·
Bij voorkeurs-sulfobetaïnen hebben Rg en R^ Ie betekenis van methyl. Tevens is R1 bij voorkeur propyleen.
Een type sulfobetaïnen, dat kan worden gebruikt heeft een 35 structuur, waarin n=Q is en R^ een alkylgroep met 8-18 koolstofatcmen, 8103113 * % -k- bij voorkeur met een rechte keten. Voor deze sulfobetaxnen is een gunstige bron voor de R^-component een talgvetalcoho 1 bestaande uit een mengsel van diverse ketenlengten, b.v. ca. 66% C^g, 30# en \1 en andere. Een andere geschikte bron is de middenfractie van 5 gedestilleerde kokosnaot-vetalcohol, die. bestaat uit een mengsel' van diverse ketenlengten met b.v.· ca. 66% C.^» 9% en 2% C^q.
Specifieke sulfobetaxnen met de bovenweergegeven structuur, waarin n is 0, zijn weergegeven in Amerikaans octrooischrift . 3.539.521. Een middel van dit type dat bijzondere voorkeur verdient 10 is E-tetradecyl-ïï,I-dimethyl-3-ammonio-1 -propaansulfonaat ,dat in de handel wordt gebracht door Calbiochem-Behring Corporation onder het merk ZW1TTERGENT 3-1¾.
Een ander type sulfobetaxnen, die kunnen worden gebruikt, be- « zitten de bovenweergegeven structuur waarbij n=-jJ en R^ is een alkyleen-15 groep met 1-6 koolstof atomen. In deze sulfobetaxnen, waarin n gelijk is aan 1, is R^ een alkylgroep met 8-l8 koolstof atomen. Bij voorkeur is Rcj rechtketenvormig. Als eerder gezegd zijn geschikte bronnen voor dit soort alkylgroepen met 10-18 koolstofatomen talgvetalcohol en kokosnoot-vetalcohol.
20 Specifieke sulfobetaxnen met de structuur waarin n is 1, zijn eerder genoemd in Amerikaans octrooischrift 3-280.179·
Sulfobetaxnen met bijzondere voorkeur in preparaten volgens de uitvinding zijn 3-(E,N-dimethyl-ïï-acylamidopropylammonio)-2-hydroxypropaan-l-sulfonaten, waarin de acylgroep is afgeleid van talgvet-25 alcohol of kokosnootv et alcohol, waarbij kokos noo tve t ale oho 1 de voorkeur verdient. Deskundigen zullen onderkennen,, dat bij. de normale bereiding van deze derivaten van talg- of kokosnootvetalcoholen, een mengsel van sulfobetaxnen met wisselende koolstofketenlengten voor de acylgroepen zullen ontstaan. Als eerder gezegd, bevatten deze vetalcoholen voor 30 het grootste gedeelte koolstofketenlengten die acylgroepen opleveren met het gewenste aantal koolstofatomen, d.w.z. tussen 8 en 18 koolstofatomen. Zo zijn de mengsels verkregen uit talg- of kokosnootvetalcoholen bruikbaar voor het verschaffen van de passende sulfobetaxnen voor de onderhavige preparaten. Een materiaal met bijzondere voorkeur voor toe-35 passing in het onderhavige preparaat is N-kokosamidopropyl-ÏT,U-di- 810 3 113 ê · -5- methyl-H-2-hydroxypropylsulfobetaxne, b.v. LOHZAIIïE CS, van Lonza,
Ine., een ander voor "beeld is VARION CAS van Slier ex Chemical Company*.
Andere amfotere oppervlakteactieve middelen omvatten de N-langketen-vormige alkylaminocarbonzuren met de formule B, de H-langketenvormige 5 alkyliminodicarbonzuren met de formule C en de IT-langketenvozmige alkyl- of amidobetaxnen met de formule D, waarin R£, Rg, ^ en n de "boven weergegeven betékenis "bezitten, M waterstof of een zout-voraend metaal is en Y’ de zelfde betékenis bezit als Y in formule A.
Y en Y’ kunnen gelijk of verschillend zijn. Voorbeelden voor specifieke 10 amfotere middelen zijn N-alkyl-beta-aminopropionzuur, fl-alkyl-beta-iminodipropionzuur en N-alkyl-N,ÏÏHiimethylglycine; de alkylgroep kan b.v. zijn afgeleid van kokosvetalcohol, laurylalcohol, myristyl-alcohol (of een lauryl-myristylmengsel), gehydrogeneerde talgalcohol, cetylalcohol, stearylalcohol of mengsèls van dit soort alcoholen. De 15 gesubstitueerde aminopropion- en iminodipropionzuren worden vaak in de vorm van de natrium-of andere zoutvormen verkocht, die eveneens bij de uitvinding kunnen worden toegepast. Specifieke voorbeelden omvatten cocobetaïne van Witco Chemical Corporation met de naam JMCOL CC 37-18; kokosamidopropylbetaxne van Lonza Ine. en Sherex Chemical Company onder 20 de namen LONZAHTE CO en VARIOÏÏ CADQ; natrium N-koko s -beta-amino- propionaat van Henkel met de naam DERIPHAT 151; dinatrium N-lauryl-"beta-iminodipropionaat van Henkel Corporation onder de naam DERIPHAT ΐβθ en dinatrium ïï-talg-beta-iminodipropionaat van Hehkel Corporation met de naam DERIPHAT 15^.
25 Voorbeelden van andere amfotere middelen zijn de vetimiddzolinen zoals verkregen door een reactie van een langketenvormig vetzuur (b.v. met 10-20 koolstofatemen) met diëthyleentriamine en monohalogeen-earbonzuren met 2-6 koolstofatomen, b.v. l-kokos-5-hydroxyethyl-5~ carboxy-methylimidazoline.
30 Specifieke voorbeelden omvatten kokosimidazoline met de naam AMPH0- TERGE K-2 van Lonza Ine., caprinedicarboxyimidazoline; AMPEOTERGE KJ2 van Lonza en kokosdicarboxyimidazoline gemengd met gesulfateerde be-vochtigingsmiddelen onder de naam AMPHOTERGE 2 WAS MOD van Lonza,
Ine.
35 Andere voorbeelden van verbeterende middelen omvatten anion- 8103113 9 % -6- synthetische oppervlaktemiddelen, gewoonlijk verbindingen met hydrofiele en lipofiele groepen in hun molecuulstructuur, welke in een waterig'medium ioniseren tot anionen met zowel een lipofiele als een hydrofiele groep. De alkylarylsulfonaten, de alkaansulfaten en ge- 5 sulfateerde geoxethyleerde alkylfenolen zijn illustratief voor het aniontype van dit soort oppervlakteactieve middelen..
De alkylarylsulfonaten zijn een klasse van synthetische anionactieve middelen, welke kunnen worden weergegeven door de formule E, waarin Rg een rechte of vertakte koolwaterstofgroep met 10 1-2 U koolstof at omen, tenminste een Rg met tenminste 8 koolstof atomen, n^ is 1-3, n2 is 1-2, Ar een fenyl- of een naftylgroep voorstellen en Y en M dezelfde betekenis bezitten als bij formule B. Rg kan b.v. methyl, ethyl, hexyl, octyl,, tetraoctyl, isoöctyl, nonyl, decyl, dodecyl, octadecyl en dergelijke wezen.
15 . Verbindingen illustratief voor de alkylarylsulfonaten omvatten natriumdodecylbenzeensulfonaat, natriumdecylbenzeensulfonaat, ammo-niummethyldod ecylben zeensulfonaat, ammoniumdodecylbenzeensulf onaat, natriumoctadecylbenzeensulfonaat, natriurnnonylbenzeensulfonaat, natriumdodecylnaftaleensulfonaat, natriumhetadecylbenzeensulfonaat, 20 kaliumeicosylnaftaleensulfonaat, ethylamineundecylnaftaleensulfonaat en natriumdocosylnaftaleensulfonaat.
De alkylsulfaten zijn een klasse van synthetische anionactieve middelen met de algemene formule F, waarin R^ en M de betekenis weergegeven bij formule B bezitten.
25 Verbindingen illustratief voor alkylsulfaten omvatten natrium- octadecylsulfaat, natriumh exadecyIsulfaat, natriumdodecylsulfaat, natriumnonylsulfaat, ammoniumdecylsulfaat, kaliumtetradecylsulfaat, diëthanolaminoöcty Isulf aat., triëthanolamineöctadecylsulfaat en ammoniumnony Isulf aat.
30 De gesulfateerde geoxethyleerde alkylfenolen zijn een klasse van synthetische anionactieve middelen met de formule G, waarin A zuurstof, zwavel, een carbonamidogroep, een thiocarbonamidegroep, een carboxylgroep of een thiocarboxylestergroep, z 3-8 en R^ en M de betekenis bij formule B voorstellen.
35 Verbindingen illustratief voor de gesulfateerde geoxethyleerde 8103113 · -7- alkylfenolen zijn ammoniumnonylf enoxy-i.tetr aet hyleenoxy sulfaat, natriumdodecylfenoxytri ëthyleenoxysulfaat, ethanolaminedecylfenoxy-tetraethyleenoxysulfaat en kaliumoc tylfenoxytri ëthyle enoxy sulfaat.
Andere voorbeelden van LAL versterkende middelen omvatten non-5 ionogene oppervlakteactieve middelen, die ruim kunnen worden beschreven als verbindingen die niet iononiseren maar hydrofiele eigenschappen verkrijgen van een geoxygeneerde zijketen, zoals polyoxyethyleen en waarvan, het lipofiele deel van het molecuul afkomstig kan zijn van vetzuren, fenol, alcoholen, amiden of aminen. De verbindingen 10 worden gewoonlijk bereid door een reactie van een alkyleenoxyde, zoals ethyleenoxyde, butyleenoxyde, propyleenoxyde e.d. met vetzuren, rechte of vertakte alcoholen met een of meer hydroxylgroepen, fenolen, thiofenolen, amiden en aminenjwelke polyoxyalkyleenglycoëthers en esters, polyoxyalkyleenalkylfenolen, polyoxyalkyleenthiofenolen, 15 polyoxyalkyleenamiden e.d. vormen. Gewoonlijk wordt bij voorkeur ca. 3 tot 30, liefst 10 tot 30 mol alkyleenoxyde per mol vetzuur, alcohol, fenol, thiofenyl, amide of amine cmgezet.
Illustratief voor dit soort nonionogene middelen zijn de pro-dukten verkregen uit een reactie van alkyleenoxyden met een alifatische 20 alcohol met 8-18 koolstofatomen, zoals octyl, nonyl, decyl, octadecyl, dodecyl, tetradecyl e.d.; met monoësters van hexa-alcoholen, waarvan de estergroep 10-20 koolstofatomen telt, zoals sorbitanmonolauraat, sorbitanmonoöleaat en sorbitanmonopalmitaat; met een alkylfenol, waarin de alkylgroep U-20 koolstofatomen telt, zoals butyl, dibutyl, amyl, 25 octyl, dodecyl, tetradecyl e.d.; en met een alkylamine, waarin de alkylgroep 1-8 koolstofatomen telt.
Verbindingen die illustratief zijn voor synthetische nonionogene middelen omvatten de produkten verkregen uit een condensatie van . .
ethyleenoxyde of propyleenoxyde met de volgende stoffen: propyleen-30 glycol, ethyleendiamine, diëthyleenglycol, dodecylfenol, nonylfenol, tetradecylalcohol, N-octadecyldiëthanolamide, U-dodecylmonoëthanol-amide, polyoxyethyleen-(20)-sorbitanmonoöleaat (TWEEN- 8θ) en polyoxyethyleen -(20 )-sorbitanmonolauraat (TWEEN- 20).
Andere nonionogene middelen omvatten langketenvormige tertiaire 35 amineoxyden met de formule H, waarin R,- dezelfde betekenis bezit als 81 03 113 f t \ -8- bij formule A en R^ en Rg methyl of ethyl voorstellen. De pijl in de formule is een gebruikelijke weergave van een semi-polaire binding. Voorbeelden van aminoxyden die geschikt zijn voor de uitvinding omvatten dimethyldodecylaminoxyde., dimethyloctylaminoxyde, dimethyldecylamin-5 oxyde, dimethyltridecylaminoxyde en dimethylhexadecylaminoxyde.
Kationactieve middelen kunnen eveneens worden gebruikt als LAL-versterkende middelen. Dergelijke middelen zijn oppervlakte-actieve stoffen met een hydrofobe organische groep en een kationogene oplosbaarmakende groep. Karakteristieke kationogene oplosbaarmakende 10 groepen zijn amine-en quaternaire groepen. Dergelijke kationogene oppervlakteactieve middelen kunnen worden weergegeven door de formule I van het formuleblad, waarin R^, Y en Y’ de betekenis bij formule C bezitten. Een voorbeeld is QUATERNARY 0 van Ciba-Geigy.
Andere voorbeelden van geschikte synthetische kationogene 15 middelen omvatten de diaminen, zoals die met de formule J , waarin
Rp een alkylgroep met. ca. 12-22 koolstofatomen» zoals N-2-aminoethyl-stearylamine en ïï-2-aminoëthyImyristylamine voorstelt; amide-houdende aminen zoals die met de formule K, zoals N-2-aminoethylstearylamide en N-aminoethylmyristylamide; quaternaire ammoniumverbindingen, · waarbij 20 een van de groepen gebonden aan het stikstofatoom èen alkylgroep is met 1-3 koolstofatomen, waarbij 1-3 alkylgroepen inerte substituenten kunnen bevatten, zoals fenylgroepen en waarin een anion aanwezig is, zoals een halogeen, acetaat,, methylsulfaat enz. Karakteristieke quaternaire ammoniumverbindingen zijn ethyl-dimethylstearylammoniumchloride, 25 benzyldimethyl-stearylammoniumchloride, benzyldimethylstearylammonium-chloride, trimethylstearylammoniumchloride, trimethylcetylammonium-bromide, dimethylethyldilaurylammoniumchloride, dimethylpropylmyristyl-ammoniumchloride en de overeenkomstige methosulfaten en acetaten.
·. Andere geschikte kationogene middelen zijn die met de formule L 30 · van het formuleblad, waarin R^ de betekenis heeft als bij formule A
en elke a een getal is van 1 tot 15· Een voorbeeld is het polyethyleen-glycolamine van gehydrogeneerde talg, waarin R^ het talgradicaal is en a+a een gemiddelde waarde bezit van 5. Een dergelijk materiaal wordt verkocht door Ciba-Geigy onder de naam BIM COBA 3001.
35 Als gezegd wordt het lysaat versterkend middel in versterkende 8103113 -9- hoeveelheden gebruikt, d.w.z. voldoende voor het geheel of gedeeltelijk neutraliseren van de endogene endotoxineremstof in het lysaat. Meestal bedraagt deze hoeveelheid 0,001 tot 1 gev.%, liefst 0,01- 0,5 gew.$ berekend op het totale volume van het lysaat. Veelal zullen grotere 5 hoeveelheden van een versterkend middel het vermogen van LAL storen om tijdens de proef met endotoxine te reageren.
LAL kan worden bereid volgens de methoden die b.v. zijn beschreven in het Britse octrooischrift 1.522.127« B.v. wordt de hemolymfe van gezonde exemplaren van Limulus 10 nolyphemus opgevangen in een anti-coagulerende fysiologische zoutoplossing, die b.v. is beschreven door Levin en Bang in "Clottable Protein ·-in Limulus? Its Localization and Kinetics of Its Coagulation by Endotoxin", Thrarnb. Diath. Saemorrh. 1£, 186-197 (l968). De amoebocyten worden opgevangen en gewassen met de anticoagulerende zoutoplossing, 15 waarmee de amoebocyte door centrifugeren van het anticoagulant wordt gescheiden.
De geïsoleerde amoebocyten worden vervolgens in water gesuspendeerd en de osmotische verbreking van de cellen vervolledigd door mechanisch roeren. De celstukjes wordt uit het lysaat door centrifu-20 geren verwijderd en de lysaatfracties samengevoegd en bij 0-H°C opgeslagen.
Ter vorming van het LAL reagens worden de bovengenoemde LAL
fracties gewoonlijk gebuffered op een passend pH-traject, b.v. 5,5-8,5, liefst 6,5-7,5 met behulp van een passende buffer, zoals tris(hydroxy- 25 methylJaminomethaan, tris(hydroxymethyl)amincmethaanmaleaat, l,U-pipera- zinediëthaansulfonzuur, morfolinopropaansulfonzuur, N-2-hydroxyethyl- piperazine-Nf-2~ethaansulfonzuur, triëthanolamine, imidazool en tris (hydroxymethyl )-imidazool. Vervolgens kan het LAL reagens worden • - 3 onderverdeeld in serumkolfjes, die b.v. 1,2 tot 5,2 cm van de oplossing 30 bevatten en vervolgens worden gelyofiliseerd. Normaal worden na deze lyofilisatie de flesjes verzegeld en bij 1-5°C opgeslagen.
Gewoonlijk wordt volgens de uitvinding het LAL behandeld door toevoeging van de gevoeligheidsverhogende fractor.nadat het LAL is gescheiden van de amoebocyte celstukjes. Meestal wordt de stof toegevoegd 35 voor of tijdens het bereiden van het LAL reagens, b.v. gelijktijdig met 8103113
« V
-10- de buffer en andere 'bestanddelen.
De gevoeligheid van het LAL reagens jegens endotoxine vordt verder verhoogd door toevoeging van lage concentraties aan twee- en eenwaardige kationen. Calcium-en mangaanionen zijn de voorkeurs-twee-5 waardige ionen, hoewel andere aaMalkaliionen, zoals magnesium- en strontiumionen alsmede andere tweewaardige ionen kannen worden gebruikt. Magnesium- en strontiumionen verdienen eveneens een zekere voorkeur. Uatriumionen zijn de voorkeurs-eenwaardige ionen, hoewel andere eenwaardige ionen, speciaal alkali-ionen, zoals lithiumionen, . 10 kunnen worden gebruikt. De chloriden (CaClg, NaCI, enz.) zijn gebruikelijke bronnen voor deze ionen, hoewel ook andere zouten kunnen worden toegepast. Bij. voorkeur worden deze electrolyten toegevoegd in endotoxinegevoeligheids-verhogende hoeveelheden, b.v. voor het +2 divalente kation (b.v. Ca ), zal dè concentratie liggen tussen 15 0,0001 en 0,4 molair en voor het eerwaardige kation (b.v. Na ) zal de concentratie ongeveer 0,01-0,4 molair bedragen.
Het LAL reagens kan tevens gebruikelijke hulpstoffen en stabilisatoren, zoals lactose, bevatten. Deze hulpstoffen worden bij toepassing toegevoegd in ondergeschikte hoeveelheden maar voldoende 20 om het beoogde doel te bereiken zonder dat de gewenste eigenschappen van het LAL reagens schade ondervinden.
Al deze handelingen worden uitgevoerd onder lysaat-behandelde voorwaarden zodat het eindprodukt steriel is en vrij van endotoxine. Methoden voor het garanderen van vrijheid van endotoxinen zijn bekend.
25 B.v. kunnen anorganische toeslagstoffen (CaCl2, NaCl enz.) endotoxine-vrij worden gemaakt door de droge zouten op 250°C en wel gedurende tenminste 120 minuten te verhitten. Organische toeslagstoffen moeten vanwege hun smeltpunten gewoonlijk worden opgelost, zuur worden gemaakt (pH^j) of alkalisch worden gemaakt (pH) 9) waarna de verkregen oplossing 30 30-60 minuten of meer bij 121°C moet worden geautoclaveerd cm eventuele endotoxinen te vernietigen.
Een verder aspect van de uitvinding betreft een LAL reagens met als essentiele onderdelen een waterige dispersie van LAL, een LAL gevoeligheidsverhogend middel als boven beschreven in een lysaat 35 versterkende hoeveelheid en een passende buffer,eveneens boven beschreven.
8103113 t * -11-
Eventueel kunnen de bovenbeschreven monovalente en divalente kationen in dit preparaat worden verwerkt om de gevoeligheid van het lysaat verder te verhogen.
Gewoonlijk is het lysaat in het onderhavige reagens in een endo-5 toxine "bepalende hoeveelheid aanwezig, d.w.z. een hoeveelheid die voldoende is cm endotoxine hij een hieropvolgende LAL proef op endo-toxinenfaan te tonen, gewoonlijk is dit een hoeveelheid, die ca.
O O
0,007 tot 0,5 ng/em , liefst ca. 0,007 tot 0,05 ng/cm FDA Reference Endotoxinen'. EC-2 aantoont. Het hovengenoemde LAL reagens kan worden 10 gelyofiliseerd, hetgeen de voorkeur verdient.
Volgens de uitvinding kan het LAL reagens worden gebruikt voor het bepalen van endotoxine onder endotoxine bepalende voorwaarden volgens de gebruikelijke procedure, als beschreven in Brits octrooi-schrift 1.522.127.
15 De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.
Alle delen zijn in gewicht /volume weergegeven, tenzij anders gezegd.
Bereiding van Limulus lysaat.
Limulus lysaat werd bereid door modificatie van de procedure beschreven door Levin en Bang (Thramb. Diath. Haemorrh. 1£, 186 (1969)· 20 De krab Limulus nolynhemus uit de Atlantische Oceaan werd van zijn
O
hemolymfe (ca. 500 cm ) ontdaan door een hartpunctie met een naald, waarbij deze hemolymfe werd opgevangen in een endotoxinevrije glazen
•O
centrifugehouder van 1 liter, waarin 500 cnr 0,125$ H-ethylmaleïmide in endotoxinevrije 10$'s zoutoplossing aanwezig was, en die was verwarmd 25 op h2°C. De centrifugehouder met hemolymfe-anticoagulansoplossing werd 8 minuten op 1*2°C gehouden en daarna 10 minuten bij 150 x g gecentrifugeerd. De bovenstaande plasmaoplossing werd afgeschonken en de amoebocyte pellet hersuspendeerd in anticoagulansoplossing. De cellen werden opnieuw afgecentrifugeerd. De opeengepakte cellen werden ver- - - 30 volgens hersuspendeerd in 0,9$ pyrogeenvrije zoutoplossing en overge- 3 bracht xn een gedepyrogeniseerde 50 cm centrxfugebuis van plastic.
De gewassen cellen werden opnieuw bij 150 x g gecentrifugeerd. Ha decanteren van de zoutoplossing werden de opeengepakte amoebocyten verbroken door toevoeging van pyrogeenvrij injectiewater in een hoe-• 3 3 35 veelheid van 7 cm water op 3 cm opeengepakte cellen. Ha mengen op een 8103 113 -12- •vortex gedurende 10-15 seconden werden de ge lyseerde cellen 2b uren - " bij 1-5°C opgeslagen. De celstukjes werden door bij 1500 x g te centrifugeren gedurende ca. 15 minuten gesedimenteerd. Het aldus verkregen lysaat werd af geschonken en bij 0-^°C opgeslagen. De cel-5 stukjes werden weggeworpen.
Bereiding van -standaard-endotoxineoplos singen.
Standaardoplossingen van de Food and Drug Administration reference standaard endotoxine Lot EC-2 werden bereid in pyrogeenvrij water voor injectie.
3 10 Reconstitute van 1 jug endotoxine in een flesje met 10 cm 3 water resulteerde in een initiële concentratie van 0,1 ng/cm .
Het flesje werd 1 uur op een schudmachine geschud. Serieverdunningen werden bereid ter bereiding van de volgende endotoxineconcentraties: lOnm/cm^, lng/cm^, 500pg/cm^, 250pg/cm^, 125pg/cm^, 62,5og/cm^, 15 31,25pg/cm\ 3 3 15,6pg/cm en 7,8pg/cm . Eenmaal bereid werden deze endotoxine-oplossingen tot 1+8 uur opgeslagen en daarna weggeworpen. Andere endo-toxinestandaarden 'die gebruikt werden waren oplossingen van FDA Reference Endotoxine Lot Ho. 1 uit Klebsiella pneumoniae .Escherichia coli endo-20 toxine Lot 0T185T (Difco) en een reformulering van reference Lot EC-2, bereid in ona.·: laboratorium. Endotoxinestandaardoplossingen bereid uit E. coli Lot 0T185T endotoxine hadden de volgende coneen-
O
traties: 6,25, 12, 5, 50, 75» 100, 150 en 200 pg/cm .
Lysaat proefprocedure
25 Lysaatverdunningen van 25 tot JQ% werden bereid in een 0,1 M
buffer met pH 7,0 die gewoonlijk tris was, t.w. tris(hydroxymethyl) aminamethaan. Andere toe te passen buffers omvatten imidazool, tris-imidazool, triethanolamine, trismaleaat, N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaansulfonzuur (HEPES), 1,U-piperazinediëthaansulfonzuur (PIPES), 30 en morfolinopropaansulfonzuur (MOPS).
3
Ter bepaling van de gevoeligheid van het lysaat werd 0,1 cm 3 van elk van de endotoxmeoplossingen gecombineerd met 0,1 cm lysaat in gedepyrogeniseerde 10x75mm schroefdop-glazen-buizen en 1 uur bij 37°C geïncubeerd. De resultaten werden bepaald door elke buis voorzichtig 35 l80° om te keren. Een klont die in tact bleef na deze omkering 8103111 i m -13- duidt op een positieve endotoxineproef.
Bereiding en depyrogenisatie van oplossingen van opperirlakteactieve middelen._
Opslag LAL gevoeligheidsverhogende oplossingen werden bereid 5 in concentraties tot 10$ actieve stof in waterige oplossing. Meestal verden concentraties bereid van 1$. Hoewel de procedure in hoeveelheden van middel tot middel varieerde, verd genoeg materiaal opgelost in 50 cm waterige oplossing om de gewenste concentratie te verkrijgen 3 . 3
bij verdunning op 100 cm . De oplossing bevatte tevens 7»5 cm 0,05 M
10 tris(hydroxymethyl)amincniethaan (TRIZMA BASE van Sigma Chemical Co.) en 1 cm^ 2 N NaOH tot een uiteindelijke pH^ll. Het middel in de basische oplossing werd 12 uur of meer bij Q-k°C opgeslagen om een volledige depyrogenisatie te garanderen. Nadat de oplossing op ca. pH 8 was gebracht werd deze 15 minuten of langer bij ca. 121°C geauto-15 claveerd. De pH werd uxteindelijk op 7,0 + 0,5 gebracht. De concentratie van het middel werd berekend en de verdunning geregeld op de uiteindelijk gewenste concentratie. Base-gevoelige middelen worden gedepyrogeniseerd door een zuurbehandeling, waarbij HC1 en tris-buffer worden gebruikt i.p.v. natronloog en TRIZMA BASE.
20 Toevoeging van de middelen aan het lysaat.
Middeloplossingen^bereid als bovenbeschreven^werden tijdens de verdunning met buffer aan het lysaat toegevoegd. De hoeveelheid varieerde naargelang van het gebruikte middel maar de concentratie van alle onderzochte middelen lag tussen 0,001 en 1,0$ berekend op de 25 uiteindelijke concentratie in de lysaatoplossing. De volgorde van toevoeging van. de bestanddelen wijzigde niets aan de resulterende lysaatgevoeligheid.
Voorbeeld I
Het LAJL gevoeligheids ver sterkende middel, ZWÜHEERGENT Ui 30 3-1^, N,N-dimethyl-3-ammonio-l-propaansulfonaat, een sulfobetaïne van Calbiochem-Behring Corporation, werd als boven beschreven gedepyrogeniseerd en verdund tot een uiteindelijke concentratie van 1 gev.$. Lysaat lot 9CZC werd bereid als een 50$'s verdunning met 0,1 M trismaleaatbuffer pH 7»0. Toevoeging van het versterkende middel 35 vond plaats tot een uiteindelijke concentratie in het lysaat van 8103 113
* V
-14- 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075 en 0,1 gev.%. Een controlemonster bevatte· pyrogeenvrij vat er i.p.v. het oppervlakteactieve middel. De lysaatverdunningen ver den een nacht hij Q-L°C opgeslagen en de volgende . dag onderzocht met een speciaal geformuleerde EC endotoxiriereeks 5 verdunningen (aangeduid,EC). De resultaten zijn. veergegeven in tahel A en geven zovel, het effectieve concentratietraject voor het versterkende middel aan als de totale versterking in lysaatgevoeligheid jegens endo-toxine vergeleken met het controlelysaat.
'Tahel A
10 _^__
Monster versterkend middel(%) lysaatgevoeligheid x
Controle 0 500 LAL plus 0,005 1,000.0 15 versterkend middel 0,01 500.0 0,02 31,2 0,05 10,000.0 0,075 10,000.0 0,10 10,000.0 20 ______ γ 3 ·
Uitgedrukt als de laagste endotoxineconcentratie in pg/cm die nog een positieve klontproef oplevert.
Voorbeeld II
Standaard endotoxineoplossingen verden hereid uit E.coli 25 endotoxine 071857, FDA Reference Endotoxin EC-2 en K. -pneumoniae FDA reference Lot. Ho. 1. Het lysaat verd verdund met 0,1 M tris buffer pH 7,0 en met versterkend middel ZWITTERGEHT 3-1^, en vel tot een 30% lysaatverdunning met daarin Q,02% ZWITTERGENT 3-1^·
Het middel verd hij het controlemonster door vat er vervangen. De 30 lysaatproef verd uitgevoerd met elke endotoxine-verdunningsreeks.
8103113 -15- c ?
Tabel B
Endotoxine monster Lysaatge- voeligheid E. ooli Controle LAL 75,0 versterkend middel 25,0 5 FDA Reference EC-2 controle 500,0 . LAL versterkend, middel 62,5 FDA K. pneumonia controle LAL 1,000.0 versterkend middel 125.0
Uitgedrukt in de laagste endotoxineconcentratie (pg/cnr) die nog 10 een positieve klontproef oplevert.
Voorbeeld III
22 commercieel verkrijgbare LAL versterkende middelen werden onderzocht op hun effecten op de lysaatgevoeligheid «jegens endotoxine. Oplossingen van elke stof werden bereid en toegevoegd aan lysaat. Lot 15 9FI tot uiteindelijke concentraties tussen 0,001 en 0,20 gew.%. Lysaatmonsters werden vervolgens beproef met gereformuleerd PDA EC endotoxine (EC). In tabel C zijn de middelen weergegeven in volgorde van aflopend effect. De meest effectieve concentraties beproefd in het lysaat en de overeenkomende lysaatgevoeligheden zijn weerge-20 geven. De gevoeligheid van het controlelysaat (50$ verdunning) zonder enig middel is eveneens weergegeven.
8103 113 -16- Φ ÖO ·
+3¾ 'vQ'-OVO'^O 01 <M 0J OJ CM CU CM ΙΛ IA ΙΛ ΙΛ IA ΙΛ IA
Cfl*H ηΛΛΛΛηοηηΛ·'"·'·'*' '' ·* ·'
Cfl Η ΙΛ ΙΛ ΪΛ IA rl ri Η Η Η Η H W W W W W W Μ
Μ φ HHHHcncncOCnenCOCOVOVOOOVOVOVO
<1)
φ ".Ö ’ Cl rl ^ OJ OJ rH
f> CÖ OJOJOJOJOJOJHHHOOOOJCUOOOOJ
Sm ooooooooooocmoooooo 4pJ ,ρ ft A (\ A fl Λ Λ Λ Λ Λ ΛΛΛΛΛΛΛΛ +3¾¾¾. οοοοοοοοοοοοοοοοοο ο φ φ ο
Vi Ö Vi Ο m cj ö Ö ü ö Φ
Η Φ Φ Φ ö Φ S
φ αΜΜΜΜΜΜΦΦΦΦ&Ο^^^^^^ γη φφφφφφφ&ο00&οφοφφφφφφ crj φφφφφφφοοοωαΦΦΦδΟΦΦ
•Η +3+J+3+3+3-P+3CCSJOO-P+3-PO+3-P
ο g OOOOOOOOOOÖ-HOQOÖOO
• ,C -C Λ ,C ,ö Λ Λ ·Η ·Η ·Η Ο Ο J3 ,C ,C ΟΛΛ Η'ϋ g -g ·η § *£ |§|§ « I ^ OÖÜOJS 05 * “ » Ρ • · Ο ο S Ö _ Η Η Ö Ο Λ Λ ·Η
c ö ce g c ö SS
cfl cd Μ Ο Ο ώ 0-0 ft ft Ο ·Η ·Η ft ·Η ft
s gft -ρ -ρ ë +2 " S
!jO Ο Ο Μ <ö cd Ο οΟ CO ΟΟ Μ Μ Ο Μ Ο •Η Ο Ο Ο Ο Ο ΜΗ Η «Jft ft Η Cl ft < η Si
Λ cd cd H CQ Μ M '«I Η Μ CO cfl CQ
Φ o o cd ó o θα o ED o Ed O ·Η ·Η Ο Ο Ο ·Η Μ , Ο ·Η |e ö ·η · g Cfl · g · a g§.*Ssoi>j*i>3(ua»|>>aa-a o § jflUO,ftSötiüObDi*H0bDSJ3Oö
M .COfiCOJflH'HÖ-HOMÖ-HHO ÖH
,2 O Η Η & ΦΗΦ ΦΗ Φ Η
OM M HO OöS^CDHfi.H
•rt Φ cd cd Φ O Φ 1 Cfl I cd cd I Φ cd cd Φ PMNNMOJdCÖNCdft NCÖJdftN^ HOCCO-PÖPC-OaHÖPCOCÖ Cfl ,C O O iÖ 'ri J Ή O ·Η P> O 0·ΗΦ+3 O φ
OCQfti-JCCIÏSiSUi-JOCOHHlOIxicaHK
Η OJ
cry c— Ö '"l 1Λ jl
HHO O LTN bflO-=CHWO
t+300CQ LtACn l OLP.1 'O
CÖO OCQCOH >> W Φ Η Η < Φ H
cfl Φ *3 «sj CO cfl OJ M bO 1 bD ,
C Μ Ο Φ ΦΟΟ+JrOH cfl ftO M CQ -P ft Μ -P
S M Sfi OcflO jfl Φ CO Φ cd Φ Φ cd H ' Φ Ö -Η -P Ö Λ Ο W Μ Η +3 φ Λ Η H ,0 Φ +5 O cfl cfl Ο H ft OOWCOCftcnOft
tfl +3 ·γΙ N ·Ρ O ·<-! cfl H +3 r*» Φ rö "rt p> (C
c •HMCCMO MÖMöHgjft'ÖMHftM
cfl ί^cflOOcflgφ·r^cS:dO>SOΦOHΦ 8103 113 r * -IT- -ρ u IA o o o o <u A ft Λ Λ A p (Μ ΙΑ ο ο in <υ \ο (Μ tn ia w ι-ι Η CM CM Η ft I Ο i I 0) I ο 1 b I ft 1 +2 ι Ρ } 5 I Λ! ι ω Η Η CM CM ί > Ο Ο Ο Ο I <0 Ο Ο Ο Ο I ·Η ft ft ft ft I 4-3
Ο Ο Ο Ο I *cH
I ca 1 δ I - ft I ft I ft ft I 60 ft ft ft I o ft ft ft <U I ft
ft 0 <U 60 I
M ft 60 Ο I <U
O -P O ft I *H
ft O ft O I
O Ο ·Η I
•rt ft -H ft « Jp
ft g ft O I CO
3 3 ai ft I 8 I o j ft 1 ft ο I ^
•Η I
43 I <U
f>, cd ! *H
ft ft -H
CÖ Ο ! Co
ft ft i U
8 p +2 Ο Ο 1 ft ο ο·ι <o
CJ I O
Η H ft I ft * cd cd η ι op ο ο I o ft •rl *H CD 1 4) 0 e ε «a j ö > <u · φ ο ι *rj cj u ·η i M ft ë ft o ft j o ft H ft I 43 ft ft ft 8 I o g) cd <d <v < ι >d g ftcq^dlöö <υ c π η ι <u o 43 o ft ο ι ·η [fl ri ff Η I <U ft 43 cd m - - m ft ft cd H 43 ft ft 0) -ft ft 0 ft
CQ -P ft *H
H < a) *ri 8
ft f— Js cd O
ft H CQ 43 Ό
Cd I >s Ad 43 <; ui η h ft t- 60 CQ ft _ 60 ft ft ffi O ft 'O® H ft ft CM Η (U ft O 43 43 Η O 60 fc. ca O O ft ft 4J ·ο ft >» ft C <0 43 ft i-4 ft Cd ft Ö EDft > οε·Η>ο
PhSöSo ftft 8103 113 * N* -18-
Voorbeeld TV
Om te bepalen, dat de verhoogde gevoeligheid waargenomen hij een lysaat behandeld met versterkend middel ook bij lyofilisatie werd behouden, werd een 30$' s verdunning van lysaat in 0,05 M tris-5 buffer met en zonder 0,02$ ZWITTERGENT 3-1^ (uiteindelijke concen-tratie in het lysaat) bereid. De lysaatoplossing (l,2 cm; werd verdeeld. in elk van 10 cm^ flesjes. Deze monsters werden bij -35°C bevroren en onder een vacuum van 50 p. gelyofiliseerd. gedurende een droogtijd van ca. 32 uren.. De flesjes werden verzegeld met rubber 10 stoppen en metalen kapjes. Het. gevriesdroogde lysaat werd gerecon-stitueerd met 1,2 cm pyrogeenvrij water voor injectie en vervolgens onderzocht met FDA Reference Endotoxin lot EC-2. Ret controlelysaat zonder versterkend middel had een gevoeligheid van 62,5 pg/cm .
Bij aanwezigheid, van een versterkend middel werd de gevoeligheid van o 15 het lysaat verdubbeld en wel t.ot 31,2 pg/cm .
Voorbeeld V
Limulus lysaat lot 0DH van ongeveer 1 week oud werd bereid als een 1*0$'s verdunning in 0,05 M tris(hydroxymethyl)aminomethaanmaleaat buffer met pH 7,0 met daarin uiteindelijke concentraties van 0,06 M 20 CaClp en 0,01 M MnCl2 alsmede 0,03$ ZWITTERGENT™ 3-1^. Deze oplossing werd verdeeld als 1,2 cm3 porties in 8 cnr5 flesjes en bij -^5°C bevroren waarna onder een 50 μ vacuum gedurende ca. 28 uren werd ge-lyofiliseerd. De flesjes werden gesloten met rubber stopjes en van plastic schroefkapjes voorzien. De gevriesdroogde lysaten werden ge-25 reconstitueerd met telkens 1,2 cm pyrogeenvrij water voor injectie en onderzocht met FDA Reference Endotoxin lot EC-2. De gevoeligheid van met versterkend middel behandelde gelyofiliseerde lysaten bedroeg 62 3 pg/cm . Een controle Uo$'s verdunning van LAL zonder versterkend middel onderzocht voor lyofilisatie had een gevoeligheid van 1 ng/crn^.
30 Voorbeeld VI
Limulus lysaathoeveelheden met een gevoeligheid gelijk of
O
meer dan 500 pg/cm E. coli endotoxin 1CP werden bereid in de vorm van een k0%'s verdunning in 0,025 M tris (hydroxymethyl)aminomethaan-maleaatbuffer met pH 7,0 met daarin in uiteindelijke concentraties 35 0,02 M MgClg, 0,01 M SrClg, 0,01 M CaCl2 en 0,025$ ZWITTERGERNT 3-lk.
8103113 -19- 3 3
Deze oplossing werd in porties van 1,2 cm en 5 >2 cm af gevuld xn flesjes van 10 cm"3 en tij -50°C bevroren. De monsters werden onder 100 μ vacuum gelyofiliseerd gedurende ca. 72 uren. Het gelyofiliseerde 3 3 produkt werd gereconstitueerd met resp. 1,2 cm of 5»2 cm pyrogeen- 5 vrij water voor injectie afhankelijk van het uitgangsvolume van het lysaat. Bij een proef met E. coli 'endotoxine 1CF na de lyofilisatie bedroeg de. gevoeligheid van de met versterkend middel behandelde gelyofiliseerde lysaten voor beide monstergrootten 25 pg/cm verge- 3 * leken met een controlegevoeligheid van 500 pg/cm .
8103113
Claims (24)
1. Werkwijze voor het behandelen onder lysaatbehandelendé voorwaarden van een Lamulus amoebocytelysaat met een veiminderde gevoeligheid voor endotoxine door de aanwezigheid van een endogene lysaatremstof^met een versterkende hoeveelheid van een lysaatgevoeligheids-versterkend 5 middel met lysaatgevoeligheids-verhogende eigenschappen door gehele of gedeeltelijke neutralisatie van de genoemde lysaatremstof, waardoor de lysaatgevoeligheid voor entoxine wordt verhoogd, met het kenmerk, dat het lysaatversterkende. middel wordt geselecteerd uit de groep bestaande uit 10 (i) amfotere oppervlakte-actieve middelen met de formules A, B, C of D, waarin een alkyleengroep met 1-¾ koolstof atomen, Y en Yr waterstof, alkyl of hydroxyalkyl, R^ en R^ alkyl of hydroxyalkyl» n 0 of 1, waarbij indien n is 0, R^ alkyl met ca. 8-18 koolstof at omen, indien n is 1^R^ een alkyleengroep met 1-6 koolstof at omen, R^ alkyl met ca. 15 8-18 koolstof atomen, en M waterstof, natrium, kalium, of ammonium voorstellen, (II) anionactievemMdelen met de formules E of F van. het formuleblad, waarin R^, Y en M de bovenweergegeven betekenis bezitten, Rg een alkylgroep met 8-2¾ koolstof atomen, n^ 1 t/m. 3, :ng 1 t/m 2, 20 en Ar fenyl of naftyl voorstellen, (III) kationactieve middelen met de formule I, waarin R^, Y en Y' de bovenweergegeven betekenis bezitten en (IV) noniónogene actieve middelen met de formule H, waarin R^ de bovenweergegeven betekenis bezit en R^ en Rg elk methyl of ethyl 25 voorstellen, alsmede de nonionogene oppervlakteactieve middelen bestaande uit de groep van de condensatieprodukten van ca.10-30 mol ethyleenoxyde met een monoëster van een zeswaardige alcohol met 6 koolstof atomen en een estergroep met 10-20 koolstofatomen. 2. , ’ Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het ver-30 sterkend middel wordt gekozen uit de groep van de amfotere middelen met de formule A.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het versterkende middel aanwezig is in een hoeveelheid van 0,01-0,05 gew.%. U. Werkwijze volgens conclusie 3, waarin n is 0, R^ is tetradecyl,. 35 R^ en R^ elk methyl en 3^ ; trimethyleenvoorstellen. 8103 113 •f1 ^ -21-
5· Werkwijze volgens conclusie 3, waarin η 1, R^ trimethyleen, Sg en R^ elk methyl en R^ is -CHg-CHOÏÏ-CHg voorstellen.
6. Werkwijze volgens^conclusie 1, met het kenmerk, dat het versterkend middel wordt geselecteerd uit de groep van de amfotere mid-5 delen met de formule D volgens conclusie 1.
7· Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het versterkend middel aanwezig is in een hoeveelheid van 0,01-0,05 gew.%.
8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin n is 1, R^ is propyleen, R2 en R^ elk methyl en R^ methyleen voorstellen. 10 9· Werkwijze volgeSs conclusie 7, waarin n is 0, Rg en R^ elk methyl en R. methyleen voorstellen.
10. Een Llmulus amoehocyte lysaatreagens voor het bepalen van endotoxine, bestaande uit een gebufferde waterige dispersie van Limulus amoebocyte lysaat aanwezig in een endotoxine bepalende 15 hoeveelheid met een verbeterde gevoeligheid jegens endotoxine 5en een versterkende hoeveelheid van een lysaat-gevoeligheid versterkend middel met lysaat-gevoeligheid versterkende eigenschappen , met het kenmerk, dat het lysaat versterkende middel wordt geselecteerd uit de groep bestaande uit 20 (I) amfotere middelen met de formules A, B, C of D, waarin de symbolen de in conclusie 1 weergegeven betekenis bezitten, (il) anionactieve middelen met de formules E of F, waarbij de symbolen de weergegeven betekenis bezitten, (III) kationactieve middelen met de formule I, waarin de symbolen 25 de weergegeven betekenis bezitten, (IV) nonionogene oppervlakteactieve middelen met de formule H, waarin de symbolen de weergegeven betekenis bezitten, alsmede een nonionogeen actief middel in de vorm van een condensatieprodukt van 10-30 mol ethyleenoxyde met een monoëster van een zeswaardige alcohol met 6 30 koolstof atanen waarbij de estergroep 10-20 koolstof atomen telt.
11. Reagens volgens conclusie 10, met het kenmerk,ddt daarin boven- ^ -f—f- dien aanwezig zijn de kationen Na , Mn en Ca in een lysaatge-voeligheidverhogende hoeveelheid.
12. Reagens volgens conclusie 11, waarbij het lysaat aanwezig is 2 35 in een hoeveelheid ter aantoning van ca. 0,007 tot ca. 0,05 ng/cm 8103113 * -22- PDA reference endotoxin EC-2.
13. Reagens volgens conclusie 12, waarbij het versterkend middel wordt geselecteerd uit de groep van de amfotere middelen met de formule A. 5 1¼. Reagens volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat n is 0, R^ is tetradecyl, Rg en R_ zijn elk methyl en R^ trimethyleen y voorstellen.
15. Reagens volgens conclusie 13, waarin n is 1, R^ is trimethyleen, Rg en R^ elk methyl en R^ is -CHg-CHOH-Cïïg.
16. Reagens volgens^conclusie 12, met het kenmerk, dat het ver sterkende middel wordt geselecteerd uit de. groep van de amfotere middelen met de formule D.
17. Reagens volgens conclusie 16, waarin n is. 1, R^ is propyleen, Rp en R_ elk methyl en R. methyleen voorstellen.
18. Reagens volgens"7 conclusie 16, waarin n is 1, Rg en R^ elk methyl en R^ methyleen voorstellen.
19. Reagens volgens conclusie IQ, met het kenmerk,, dat het is ge-lyofiliseerd.
20. Bij een werkwijze voor het bepalen van endotoxine onder endo-20 toxine bepalende voorwaarden waarbij het endotoxine wordt omgezet met een Limulus amoebocyte lysaatreagens, de verbetering dat een Limulus amoebocyte lysaatreagens volgens conclusie 10 wordt gebruikt.
21. Reagens volgens conclusie 10, waarbij bovendien de kationen Ha , Sr , Ca en Mg in lysaat gevoeligheidverhogende hoeveelheden 25 aanwezig zijn.
22. Reagens volgens conclusie 21, waarbij het lysaat aanwezig is O in een hoeveelheid ter aantoning van ca. 0,007-0,.05 ng/cm PDA reference endotoxin EC-2. '
23. Reagens volgens conclusie 22, waarbij het versterkende middel 30 wordt 'geselecteerd uit de groep van de amfotere middelen met de formule A. 2k. Reagens volgens conclusie 23, waarbij n is 0, R^ is tetradecyl, Rp en R, elk methyl en B. trimethyleen voorstellen. έ -> y1
25. Reagens volgens conclusie 23, waarin n is 1, R^ is trimethyl- 35 een, R^ en R, elk methyl en R^ CHg-CHOH-CHp voorstellen. 6 7 8103115 -23-
26. Reagens volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat het versterkende middel wordt geselecteerd uit de groep van de amfotere middelen met de formule D.
27. Reagens volgens conclusie 26, met het kenmerk, dat n is 1,
5 R^ is propyleen, Rg en R^ elk methyl en R^ methyleen voorstellen.
28. Reagens volgens conclusie 26, vaaÊin n is 0, Rg en R^ methyl en R. methyleen voorstellen. 7 8103113 V V "A H f2 B (R5“C-HN)n-R4 N® - Ri - S03~ R5 - N - R-[_ - COOM R3 Ϊ i C 0 RsN^-COOM), π 1¾ f 2 (R5 - c - HN)n - R4 - - Ri - coo k3 y E F (R5)n]_* (Y)Ar· (S03M)n2 R5OSO3M G r5-jQ>_ A - [CH2CH20]z - CH2CH2 - 0S02M « H 1 N Ί + Κ5Κ7Κ8Ν·*° '^CH R3 - c I 2 \n^CH2 L y Y' J R9NHC2HiiNH2 R5CONHC2H/|NH3 L (CH2CH20)aH r5 “ N ^—^.(CH2GH20)aH Mallinckrodtj Inc. __ 8103113
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16345680A | 1980-06-27 | 1980-06-27 | |
| US16345680 | 1980-06-27 | ||
| US06/254,233 US4322217A (en) | 1980-06-27 | 1981-04-14 | Process for preparing Limulus lysate |
| US25423381 | 1981-04-14 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8103113A true NL8103113A (nl) | 1982-01-18 |
| NL192139B NL192139B (nl) | 1996-10-01 |
| NL192139C NL192139C (nl) | 1997-02-04 |
Family
ID=26859656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8103113A NL8103113A (nl) | 1980-06-27 | 1981-06-26 | Verbetering in de werkwijze voor het bereiden van een limuluslysaat. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4322217A (nl) |
| AU (1) | AU545395B2 (nl) |
| CH (1) | CH647871A5 (nl) |
| DE (1) | DE3125181A1 (nl) |
| FR (1) | FR2485740A1 (nl) |
| GB (1) | GB2080524B (nl) |
| IT (1) | IT1211070B (nl) |
| NL (1) | NL8103113A (nl) |
| SE (1) | SE447029B (nl) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8827557D0 (en) * | 1988-11-25 | 1988-12-29 | Radiometer Corporate Dev Ltd | Process for handling horseshoe crab amoebocyte lysate |
| US5002015A (en) * | 1988-12-09 | 1991-03-26 | Aerotrace Hydraulics, Inc. | Submerged treadmill system for exercising animals |
| ATE148230T1 (de) * | 1989-10-30 | 1997-02-15 | Biowhittaker Inc | Kinetische bestimmungsmethode für endotoxin unter verwendung von limulus-amoebocyten-lysat und chromogenem substrat |
| JP2957251B2 (ja) * | 1990-09-28 | 1999-10-04 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの測定法 |
| EP0549102B1 (en) * | 1991-12-25 | 1996-07-03 | Maruha Corporation | Beta-glucans detection reagents and methods of detecting beta-glucans |
| JP2737514B2 (ja) * | 1992-01-24 | 1998-04-08 | 和光純薬工業株式会社 | エンドトキシン測定用試料の前処理方法 |
| CA2112776C (en) * | 1993-01-21 | 2002-11-12 | Masakazu Tsuchiya | Process for inhibiting activity of endotoxin |
| JP3242733B2 (ja) * | 1993-02-26 | 2001-12-25 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシン特異的測定剤 |
| JP3429036B2 (ja) * | 1993-09-30 | 2003-07-22 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの特異的測定剤 |
| US5716834A (en) * | 1994-08-19 | 1998-02-10 | National University Of Singapore | Cloned factor C cDNA of the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda and purification of factor C proenzyme |
| US5637474A (en) * | 1994-10-31 | 1997-06-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for measuring amount of endotoxin or (1→3)-β-D-glucan by kinetic turbidimetric method |
| US6270982B1 (en) * | 1997-10-09 | 2001-08-07 | Charles River Laboratories | Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins |
| US6849426B2 (en) * | 2001-06-28 | 2005-02-01 | Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. | Methods and reagents for detecting endotoxin |
| US7547285B2 (en) * | 2003-02-14 | 2009-06-16 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Device and method for collection of exhaled alveolar breath condensate |
| AU2003300356A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-22 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Disposable hand-held device for collection of exhaled breath condensate |
| US7828741B2 (en) * | 2002-12-20 | 2010-11-09 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Utilizing lipopolysaccharide in exhaled breath condensate to diagnose gram negative pneumonia |
| ATE452986T1 (de) | 2003-03-17 | 2010-01-15 | Charles River Lab Inc | Methoden und zusammensetzungen für den nachweis mikrobieller verunreinigungen |
| US20050026239A1 (en) * | 2003-04-18 | 2005-02-03 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Kit for detecting endotoxin in aqueous solutions |
| US20050048655A1 (en) * | 2003-04-18 | 2005-03-03 | Novitsky Thomas J. | Kit for detecting endotoxin |
| JP2008522640A (ja) * | 2004-12-02 | 2008-07-03 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | グラム陽性菌夾雑物の検出および／または定量化のための方法ならびに組成物 |
| EP1836492B1 (en) | 2005-01-13 | 2008-12-31 | Charles River Laboratories, Inc. | Method for classifying a microorganism in a biological sample |
| US20090286692A1 (en) * | 2008-04-15 | 2009-11-19 | Wainwright Norman R | Cartridge and Method for Sample Analysis |
| EP2147981A1 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-27 | Biotype AG | Kit and method for evaluating detection properties in amplification reactions |
| JP5437660B2 (ja) | 2009-02-19 | 2014-03-12 | 興和株式会社 | コアギュロゲン原料及びその製造方法、それを用いた生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| MY155541A (en) * | 2010-10-29 | 2015-10-30 | Universiti Malaysia Terengganu | Process for the preparation of amoebocyte lysate from the haemolymph of the horseshoe crab |
| CU24073B1 (es) | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem | COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS |
| JP7044222B2 (ja) | 2016-08-03 | 2022-03-30 | ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド | 実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセートを使用してエンドトキシンを検出する方法 |
| US12158471B2 (en) | 2022-02-11 | 2024-12-03 | Charles River Laboratories, Inc. | Recombinant amebocyte lysate and uses thereof |
| KR20260021702A (ko) | 2023-06-05 | 2026-02-13 | 찰스리버레보레토리스,인코포레이티드 | 재조합 아메보사이트 응고 인자 및 그의 용도 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3280179A (en) * | 1961-03-16 | 1966-10-18 | Textilana Corp | Processes for producing acyclic surfactant sulfobetaines |
| US3368978A (en) * | 1964-12-28 | 1968-02-13 | Monsanto Co | Builder compositions and detergent compositions using same |
| US3539521A (en) * | 1965-05-03 | 1970-11-10 | Procter & Gamble | Detergent composition |
| US3915805A (en) * | 1970-05-25 | 1975-10-28 | Univ Johns Hopkins | Quantitative detection of endotoxin in biological fluids |
| US3954663A (en) * | 1972-12-18 | 1976-05-04 | Teikoku Horinine Mfg. Co. Ltd. | Process for the preparation of Limulina lysate |
| US4096091A (en) * | 1974-07-17 | 1978-06-20 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Limulus lysate having improved capacity to precipitate in the presence of low endotoxin concentrations, and reconstituting solutions therefor |
| US3944391A (en) | 1974-12-27 | 1976-03-16 | Preventive Systems, Inc. | In vitro process for detecting endotoxin in a biological fluid |
| US4107077A (en) * | 1975-07-14 | 1978-08-15 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Limulus lysate of improved sensitivity and preparing the same |
| US4038029A (en) * | 1976-01-20 | 1977-07-26 | Worthington Biochemical Corporation | Limulus lysate turbidity test for pyrogens |
| GB1522127A (en) | 1976-07-23 | 1978-08-23 | Mallinckrodt Inc | Limulus amebocyte lysate reagent compositions |
| GB2019563B (en) | 1978-04-20 | 1982-07-28 | Harvard College | Assay of gram-negative bacteria |
| DE2927103A1 (de) * | 1978-10-06 | 1980-04-17 | Baxter Travenol Lab | Optisches verfahren zur bestimmung von endotoxin |
| US4273557A (en) * | 1980-03-31 | 1981-06-16 | Mallinckrodt, Inc. | Limulus lysate procedure for determining endotoxins |
-
1981
- 1981-04-14 US US06/254,233 patent/US4322217A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-06-23 GB GB8119357A patent/GB2080524B/en not_active Expired
- 1981-06-26 CH CH4249/81A patent/CH647871A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-06-26 IT IT8122595A patent/IT1211070B/it active
- 1981-06-26 SE SE8104016A patent/SE447029B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-06-26 AU AU72321/81A patent/AU545395B2/en not_active Expired
- 1981-06-26 DE DE19813125181 patent/DE3125181A1/de active Granted
- 1981-06-26 NL NL8103113A patent/NL8103113A/nl not_active IP Right Cessation
- 1981-06-26 FR FR8112598A patent/FR2485740A1/fr active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2485740A1 (fr) | 1981-12-31 |
| DE3125181A1 (de) | 1982-03-04 |
| NL192139B (nl) | 1996-10-01 |
| IT1211070B (it) | 1989-09-29 |
| AU7232181A (en) | 1982-01-07 |
| GB2080524B (en) | 1984-04-18 |
| CH647871A5 (fr) | 1985-02-15 |
| DE3125181C2 (nl) | 1991-09-05 |
| GB2080524A (en) | 1982-02-03 |
| NL192139C (nl) | 1997-02-04 |
| AU545395B2 (en) | 1985-07-11 |
| SE447029B (sv) | 1986-10-20 |
| IT8122595A0 (it) | 1981-06-26 |
| US4322217A (en) | 1982-03-30 |
| FR2485740B1 (nl) | 1985-05-24 |
| SE8104016L (sv) | 1981-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8103113A (nl) | Verbetering in de werkwijze voor het bereiden van een limuluslysaat. | |
| Coughlin et al. | Quantitation of metal cations bound to membranes and extracted lipopolysaccharide of Escherichia coli | |
| Eifler et al. | Cytotoxin ClyA from Escherichia coli assembles to a 13-meric pore independent of its redox-state | |
| Castro et al. | Enhanced performance of polymer-polymer aqueous two-phase systems using ionic liquids as adjuvants towards the purification of recombinant proteins | |
| Synge | The kinetics of low temperature acid hydrolysis of gramicidin and of some related dipeptides | |
| EP2755992B1 (en) | Plasma protein fractionation by sequential polyacid precipitation | |
| Yamada et al. | Interaction between Major Outer Membrane Protein (O‐8) and Lipopolysaccharide in Escherichia coli K12 | |
| EP0967995B1 (en) | Composition comprising immunoglobulin | |
| Collins et al. | Experimental evidence for condensation reactions between sugars and proteins in carbonate skeletons | |
| KR920002934B1 (ko) | 내변성 단백질 수용액의 제조방법 | |
| EP0245433A1 (en) | Major iron-regulated protein of neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine | |
| Pooley et al. | Dissociation of an autolytic enzyme-cell wall complex by treatment with unusually high concentrations of salt | |
| US4029766A (en) | Protective antigen from pertussis, process for its preparation and products containing this antigen | |
| JP4741178B2 (ja) | Ｖｉｉｉ因子：ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物およびそれに関連する方法 | |
| AU630446B2 (en) | Cholesterol removal from eggs, dairy products and other aqueous emulsions | |
| JPS5914452B2 (ja) | インジウム−１１１オキシン錯体組成物 | |
| CA1159754A (en) | Process for preparing limulus lysate | |
| DK153124B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af et stabilt toerpraeparat af et alkalimetalsalt af dehydroepiandrosteronsulfat, som er beregnet til parenteral administration | |
| Talbot et al. | Effect of the state of association of melittin and phospholipids on their reciprocal binding | |
| EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
| US4118379A (en) | Amidated immune globulins and process for preparing them | |
| AU729536B2 (en) | A process for purifying apolipoproteins and a composition for use in the process | |
| Walz et al. | Purification and properties of chicken prothrombin | |
| DiMarchi et al. | Structural significance of the amino-terminal residues of sperm whale myoglobin | |
| EP0154432B1 (en) | Modified urokinase composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: WHITTAKER CORPORATION |
|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: BIOWHITTAKER, INC. |
|
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Free format text: 20010626 |