CH648328A5 - Bisglucosylmoranolin-derivat sowie diese verbindung enthaltende arzneimittel. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Bisglucosylmoranolin-Derivat der folgenden Formel oh Hq oh

-oh ch2oh 'ch2oh

&

&

ho

OH

HO OH

oh

(I)

das als Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes mellitus geprägte hemmende Wirkung gegen die Erhöhung des Blutverwendet wird. Es wurden ausgedehnte Studien durchge- 65 zuckers hat, falls im Blut zuviel Zucker enthalten ist. Die führt, umd ein sicheres und wirksames Arzneimittel für Dia- genannte Verbindung stellt ein nützliches Arzneimittel dar. betes mellitus zu entwickeln und es wurde gefunden, dass das Moranolin der nachfolgenden Formel II Bisglucosylmoranolin-Derivat der Strukturformel 1 eine aus-

3

648 328

HQ) /~QH H0 \_)T-H (II)

ho wurde von Mori Cortex (so-haku-hi) isoliert und stellt ein rohes Arzneimittel natürlichen Ursprungs dar (cf. Yagi, et al: Nippon Nogei Kagaku Kaishi, Band 50, Seite 571,1976 sowie japanische Offenlegungsschrift Sho-52-83 951).

ch2oh

Später gelang es, die Verbindung der Formel II durch Fermentation unter Verwendung von Microorganismen der Gattung Streptomyces (cf. japanische Offenlegungsschrift Sho-54-84 094) herzustellen.

s Obwohl Moranolin selbst eine hemmende Wirkung gegen die Blutzuckerzunahme, wenn Blut zuviel Zucker aufweist, besitzt und ein nützliches Arzneimittel für die Bekämpfung von Diabetes mellitus darstellt, wurde versucht, bessere Moranolin-Derivate zu finden und man entwickelte io 4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin und 4-(alpha-D-Glucoxyl)-N-niederalkylmoranolin der nachfolgenden Formel

çh-oh r

(iii)

worin R Wasserstoff oder Niederalkyl bedeutet. Diese Verbindungen sind in einer Patentanmeldung beschrieben (cf. japanische Patentanmeldungen Sho-54-159 417 und Sho-55-76 838).

Die Untersuchungen wurden mit neuartigen Verbindungen, nämlich 4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin-Deri-vaten durchgeführt, und als Resultat fand man das neue Moranolin-Derivat der Formel 1, das eine bedeutend bessere Wirkung als 4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin und 4-(aIpha-D-Glucosyl)-N-niederalkylmoranolin aufweist.

Die getestete Verbindung wurde oral zusammen mit 2 g/kg Sucrose einer Gruppe (jede Gruppe enthält 4 Stück) männlicher Ratten des Stammes SD verabreicht. Die Ratten waren

5 Wochen alt und das Körpergewicht betrug 100-120 g. Man sammelte in konstanten Zeitintervallen das Blut aus der Schwanzader, bis 180 Minuten nach der Verabreichung ver-25 gangen waren und man bestimmte dann den Blutzuckerspiegel. Anschliessend wurde die Fläche (AAUC) unterhalb der Kurve der Blutzuckerzunahme, bezogen auf die Zeit, gemessen. Für den Fall, dass nur Wasser verabreicht wurde, definierte man die erhaltene Fläche mit «basal» und wenn 30 nur Sucrose verabreicht wurde, so definierte man diese Fläche mit «Kontrolle». Das Hemmungsverhältnis gegen die Zunahme des Blutzuckers in der Gruppe, welcher die Testverbindung verabreicht wurde, wird durch die folgende Gleichung berechnet:

Hemmungs-Verhältnis =

(AAUC der Kontrolle) - (AAUC der Testgruppe) (AAUC der Kontrolle)+(AAUC der Testgruppe)

x 100

Das weiter oben berechnete Hemmungsverhältnis ist in der 40 worin X Halogen bedeutet, wird mit 4-(alpha-D-Glucosyl)-

nachfolgenden Tabelle angegeben.

Tabelle

Name der Verbindung

Dose

Verhältnis

Moranolin

10 mg/kg

10%

4-(alpha-D-Glucosyl)- moranolin

10

44%

4-(alpha-D-Glucosyl)-N-methyl-

moranolin

5

56%

Verbindung der Formel I

1

65%

Die Verbindung der Formel 1 ist eine neue Substanz, welches bis jetzt noch nicht in der Literatur beschrieben wurde. Sie kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen wird man wie folgt vorgehen: Ein aktiviertes Derivat einer Bisallylalkohol-artigen Substanz von Benzol, wiez. B. bis (3-Haologen-l-propenyl)benzol der folgenden Formel

(iv)

moranolin der nachfolgenden Formel V in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylsulfoxid, in Gegenwart eines Mittels, das Säure entfernt, wie z. B. Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, umgesetzt.

45

50

55

ch2oh

H/h-—OvH

chjoh h hj n'

H (v)

4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin kann durch Kupplung von Moranolin mit alpha-Cyclodextrin in Gegenwart von Cyclodextrin-glucosyltransferase hergestellt werden. Dann wird das Reaktionsprodukt, nämlich Oligoglucosyl-mora-65 nolin, mit Glucoamylase umgesetzt, nachdem es an einem stark sauren Ionenaustauscherharz absorbiert war (cf. japanische Patentanmeldung Sho-55-131 949). Der Reaktionsverlauf wird nachfolgend dargestellt

648 328

4

ch2oh/h h oh alpha-Cyclodextrin

Cyclodextrin-glucosyl-transferase

OH^H

50W x 2(H+)^ Glucoamylase

Oligoglucosylmoralin (n ist o oder eine ganze Zahl)

ch2oh 3 Ci— OH

ch2oh/ h

(v)

Eine Herstellungsmethode zum Erhalt der erfindungsge-mässen Verbindung wird nachfolgend näher beschrieben.

Beispiel

(1) Synthese von Benzol- 1,4-bisallychlorid Vinylmagnesiumbromid, hergestellt aus 60 g Vinylbromid und 14 g metallischem Magnesium, wurde in Tetrahydro-furan gelöst, wobei man eine Lösung von etwa 200 ml erhielt. Nach dem Rühren wurde eine Lösung von 25 g Terephthalal-dehyd in 200 ml Tetrahydrofuran tropfenweise während 30 Minuten hinzugegeben. Nachdem die Zugabe vollständig war, rührte man die Reaktionsmischung noch 30 Minuten lang unter Rückfluss. Nach dem Abkühlen gab man unter Eiskühlung eine kleine Menge Wasser zu der Reaktionsmischung, so dass sich das Produkt zersetzte. Man gab Ethyl-acetat zu dem Reaktionsprodukt, entfernte unlösliche Stoffe, die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert, wobei man 21 g eines hellgelben öligen Reaktionsproduktes erhielt. Das Produkt wurde in 250 ml Ethylacetat gelöst, man gab 30 g Thionylchlorid tropfenweise unter Rühren hinzu und erhitzte anschliessend 2 Stunden lang an Rückfluss. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft und die restliche kristalline Substanz wurde aus einer geringen Menge Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 15,8 g Benzol-1,4-bisallylchlorid mit einem Schmelzpunkt von 124-129°C erhielt.

(2) Herstellung von 4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin (a) Kultur von Bacillus macerans

In einen Erlenmeyer-Kolben von 500 ml Inhalt gab man 150 ml einer Kulturbrühe (pH-Wert = 7), die aus 1% Maiseinweichflüssigkeit, 1% löslicher Stärke, 0,5% Ammoniumsulfat und 0,5% Kalziumcarbonat bestand und man sterilisierte unter Erhitzen auf eine Temperatur von 120°C 15 Minuten lang. Drei Platinösen von Bacillus macerans, IFO 3490

Stamm, gewachsen auf einem Schrägmedium, das aus 1% Pepton, 0,5% Hefe, 0,3% Glucose, 1,5% Glycerin, 0,3% Natri-3s umchlorid, 0,1% Leberpulver («OXOID», registrierter Handelsname für neutralisiertes Leber-Digest) und 1,5% Agar bestand, wurde beimpft und 3 Tage lang bei einer Temperatur von 37°C kultiviert. Die Kulturlösung (300 ml) wurde in einem Krug-Fermentationsgefäss (15 Liter Inhalt), das 40 9 Liter der gleichen Medium-Zusammensetzung enthielt, beimpft und 3 Tage lang bei einer Temperatur von 37°C kultiviert, wobei genügend belüftet und gerührt wurde und man erhielt 130-150 Einheiten (die Definition der Einheit ist nachfolgend angegeben) einer Enzymlösung, die nach dem 45 Zentrifugieren als überstehende Flüssigkeit vorlag.

(b) Einheit der Cyclodextrin-glycosyl-transferase-Aktivität.

so Lösliche Stärke (0,7% von Nakaray Kagaku Co.; für biologische Untersuchungen) wurde in einem 0,05 molaren Ace-tatpuffer (pH 5,5) gelöst und diese Lösung verwendete man als Substratlösung. Zu 950 jxl des Substrates gab man 50 u.1 der Enzymlösung, diese Mischung wurde dann 10 Minuten 55 lang bei einer Temperatur von 40°C umgesetzt und man beendete die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml 0,5 normaler Essigsäure. 100 [i.1 der Reaktionslösung wurden herausgenommen und 3 ml Wasser sowie 0,8 ml einer Jodlösung, worin das Jod auf solche Weise gelöst war, um eine 0,25 60 molare Kaliumjodidlösung 0,01 molar zu machen, wurden hinzugegeben. Diese Mischung wurde gerührt und die Absorptionsfähigkeit (At) wurde bei 660 nm gemessen. In ähnlicher Weise wurden 100 (il der Lösung, zu welcher 50 jj.1 Wasser und 0,5 ml 0,5 normaler Essigsäure zu 950 jj.1 der Sub-65 stratlösung hinzugegeben waren, herausgenommen, man gab Jodlösung dazu und die Absorptionsfähigkeit (Ar) wurde bei 660 nm gemessen. Zu diesem Zeitpunkt wird eine Einheit durch die folgende Gleichung ausgedrückt.

5

648 328

Eine Einheit = ^R. x 100 x 2 Ar und diese entspricht der Aktivität, worin 1 ml der Enzymlösung eine 1 %ige Abnahme in Bezug auf Absorptionsfähigkeit 5 innerhalb einer Minute bei 40°C verursacht.

(c) Herstellung der rohen Enzymlösung

Eine kultivierte Lösung von Bacillus macerans IFO 3490 wurde zentrifugiert und man entfernte die überstehende Flüs- io sigkeit. Diese wurde lyophilisiert und anschliessend in einer geringen Menge Wasser gelöst. Auf diese Weise erhielt man die konzentrierte Enzymlösung. Diese wurde bei einer Temperatur von 5°C gegen destilliertes Wasser dialysiert und die innere Lösung, aus welcher niedrigmolekulare Substanzen is entfernt worden waren, wurde als rohe Enzymlösung verwendet.

(d) Reaktion und Behandlung

Man löste 6,5 g Moranolin in einer geringen Menge 20

Wasser auf und man stellte den pH-Wert der Lösung mit 3-normaler Chlorwasserstoffsäure auf 5,7 ein. Nach der Einstellung des pH-Wertes betrug das Volumen 32,5 ml. 26 g alpha-Cyclodextrin wurden in 1300 ml einer rohen Cyclodex-trin-glycosyltransferase-Enzymlösung (460 Einheiten/ml) 25 aufgelöst, man gab eine wässrige Lösung von Moranolin hinzu und die Mischung wurde auf einen pH-Wert von 5,67 eingestellt. Diese Mischung wurde 3 Tage lang bei einer Temperatur von 39°C geschüttelt und man führte darin die Reaktion aus. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, man gab 30 die überstehende Flüssigkeit durch eine Kolonne (Volumen des Harzes: 50 ml) Dowex 50 W x 2 (H+) auf solche Weise,

dass die darin enthaltenen basischen Substanzen absorbiert wurden. Dann wurde gut mit Wasser gewaschen, man suspendierte das Harz in 1200 ml Wasser, 120 mg alpha-1,4- 35 Glucanglucohydrase (etwa 22 Einheiten/mg) abstammend von Rhizopus niveus wurden hinzugefügt, die Mischung wurde bei einer Temperatur von 40°C inkubiert und man verfolgte den Reaktionsverlauf durch eine periodische Abnahme von Proben, gefolgt von der quantitativen Bestimmung von 40

Glucose, die sich während der Reaktion bildete. Es wurde festgestellt, dass die Glucosemenge nach der Reaktion schnell zunahm, und während einer Reaktionsdauer von 5 Stunden wurden 89% festgestellt, bezogen auf die maximal mögliche Menge. Die Reaktion wurde weiter fortgeführt und nach 25 Stunden wurde die Reaktion gestoppt. Nach beendeter Reaktion sammelte man das Harz durch Filtration, es wurde gut mit Wasser gewaschen, mit 0,5 normalem Ammoniakwasser eluiert, das Eluat wurde im Vakuum zur Trockne konzentriert, man löste das erhaltene Pulver in einer geringen Wassermenge, gab es durch eine Kolonne (12 cm x 30 cm) «Sephadex G-15», die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und durch Einfrieren getrocknet, wobei man 5,8 g 4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin, Schmelzpunkt 138-148°C [a]o = 121,6° (Wasser) erhielt.

(3) Synthese der Verbindung der Formel I

1 g 4-(alpha-D-Glucosyl)-moranolin und 1 gNatrium-bicarbonat wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid bei einer Temperatur von 22-24°C gelöst und man gab eine Lösung von 380 mg Benzol-1,4-bisallylchlorid in 15 ml Dimethylsulfoxid unter Rühren tropfenweise während 60 Minuten hinzu. Die Mischung wurde noch 4 Stunden lang bei 22-25°C gerührt. Anschliessend trennte man die unlöslichen Substanzen durch Filtration ab, das Filtrat wurde mit 300 ml Wasser verdünnt, mit Chloroform gewaschen und durch eine Kolonne von Dowex 50 W x 2 (H+) (20 ml) gegeben. Nachdem die Kolonne gut mit Wasser ausgewaschen worden war, wurde mit 0,2%igem ammoniakalischem Wasser eluiert und anschliessend eluierte man das gewünschte Produkt mit wäss-rigem Methanol, welches 5% ammoniakalisches Wasser enthielt. Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft und man kristallisierte die erhaltenen Kristalle aus 80%igem Methanol, wobei man 300 mg der Verbindung der Formel I erhielt. Schmelzpunkt 169-173°C, [a]«6 = -28,0° (Wasser).

Elementaranalyse CaeHseOisN: • 2H3O:

berechnet C 51,52%, H 7,15%, N 3,24%;

gefunden: C 51,42%, H 7,20%, N 3,33%.

B

Claims (3)

1. 648328 2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Ein Bisglucosylmoranolin-Derivat der Formel

   <£'

   ho ch2oh ch2oh

   (I)

   o-

   óh ho oh

   OH
2. 2. Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes mellitus, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff eine Verbindung der Formel oh ho ph
3. .,.o*

   -oh ch2oh 'ch2oii (I)

   ho oh enthält.