DE3143761C2

DE3143761C2 - Bis-glukosylmoranolinderivat und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE3143761C2
Application number: DE3143761A
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Aoyagi; Hiroshi Nagaokakyo Enomoto; Yoji Otsu Ezure; Kiyotaka Kyoto Konno; Shigeaki Maruo; Shingo Kyoto Matsumura; Nobutoshi Ojima; Yoshiaki Uji Yoshikuni
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1980-12-01
Filing date: 1981-11-04
Publication date: 1983-05-11
Also published as: FR2495160A1; JPS5793997A; DE3143761A1; KR830006281A; KR850000318B1; GB2088365B; FR2495160B1; CH648328A5; IT8149705A0; US4363802A; IT1172071B; JPS6055078B2; GB2088365A

Abstract

Es wird das Bis-glukosylmoranolinderivat der Formel (I) und seine Herstellung beschrieben. Da das Derivat gegenüber den bisher bekannten Diabetes mellitus-Mitteln eine erheblich verbesserte Wirkung hat, wird auch seine Verwendung als den Blutzuckerspiegelanstieg unterdrückendes Mittel beschrieben.

Description

Ο —

OH OH OH (Γ)

2. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 neben üblichen Füll- and Trägerstoffen.

Die Erfindung betrifft ein Bis-glukosylmoranolinderivat der Formel

OH X)H OH X)H

CH₂OH CH₂OH

CH = CH-Cf \— CH = CH

HO -

das ein Wirkstoff gegen Diabetes mellitus ist.

Im Rahmen der Erfindung waren intensive Studien auf die Entwicklung eines sicheren und wirksamen Heilmittels gegen Diabetes mellitus gerichtet, wobei festgestellt wurde, daß das Bis-giukosylmoranolinderivat der Formel (I) eine beachtliche inhibitorische Wirkung gegenüber dem Blutzuckeranstieg bei Zuckerbelastung aufweist und somit ein nützliches Arzneimittel darstellt.

Moranolin der Formel

OH .CH₂OH

HO

M)

OH

ist schon aus Mori Cortex isoliert worden, das ein Roharzneimittel natürlicher Herkunft ist (vgl. Yagi et al., Nippon Nogei Kagaku Kaishi, Vol. 50, Seite 571, 1976, und japanische Patentanmeldung Sho-52-83951). Später wurde dann die Gewinnung der Substanz (II) durch Fermentierung unter Anwendung von Mikroorganismen der Art Streptomyces erforscht (vgl. japanische Patentanmeldung Sho-54-84094).

Obwohl Mofanolin selbst schon eine inhibitorische Wirkung gegen den Blutzuckerspiegelanstieg bei Zukkerbelastung aufweist und ein nützliches Heilmittel für Diabetes mellitus ist, war die Forschung darauf gcrichtet, noch wirksamere Moranolinderivate zu ermitteln und zu erzeugen, und man fand 4-(ar-D-Glukosyl)-moranolin und 4-(a-D-Glukosyl)-N-niederalkylmoranolin der folgenden Formel

H OH

(BT)

in der R ein WasserstofTatom oder eine Methyl-, Äthyloder Propylgruppe ist (vgl. DE-OS 30 46 184).

Sodann wurden die Forschungen erfindungsgemäß auf einen neuen Typ von 4-(ff-D-Glukosyl)-moranolinderivaten gerichtet, und als Ergebnis gelangte man erfindungsgemäß zu dem Derivat der Formel (I), das noch weit wirksamer ist als 4-(ff-D-Glukosyl)-moranolin und 4-(a-D-Glukosyl)-N-methylmoranolin.

Inhibitoriscbe Wirkung gegenüber dem Blutzuckerspiegelanstieg;

Die zu prüfenden Verbindungen wurden zusammen mit 2 g/kg Saccharose peroral an eine Gruppe von männlichen Ratten vom SD-Stamm (5 Wochen alt, Körpergewicht 100 bis 120 g) gegeben, wobei jede Gruppe aus vier Tieren bestand. In konstanten Zeitintervallen wurde von Beginn der Verabreichung an 180 Minuten lang Blut von der Schwanzvene entnommen, und der Blutzuckerspiegelanstieg wurde bestimmt. Dann wurde die Fläche (AAUC) unter der Zeit-Blutzuckerspiegelanstieg-Kurve gemessen. Wenn die bei alleiniger Gabe von Wasser erhaltene Fläche als »Grundgruppe« und die bei alleiniger Gabe von Saccharose erhaltene Fläche als »Vergleichsgruppe« angesetzt wild, wird das Inhibitionsverhältnis gegenüber dem Bluizuckerspiegelanstieg bei der Gruppe, die die Testverbindung erhalten hat, nach der folgenden Gleichung berechnet:

ι uu·.· um. · (Λ AUC Vergleichsgruppe) - (A AUC Testgruppe)

Inhibitionsverhaltnis = —-————ψ-r-r— ;— -

(A AUC Vergleichsgruppe) - (A /ii/CGrundgruppe)

X 100

Die jeweils errechneten Inhibitionsverhältnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Name der Verbindung

Dosis

Verhältnis

Moranolin
4-(a-D-GlukosyI)-moranoIin

4-(a-D-GlukosyI)-N-methylmoranolin

Verbindung (I)

100 mg/kg 19%

10 mg/kg 44%

5 mg/kg 56%

1 n.g/kg 65%

Die Verbindung (I) ist neu. Sie kann auf verschiedene Weise synthetisiert werden. Am besten geht man so vor, daß man ein aktiviertes Bis-allylalkoholderivat des Benzols, wie beispielsweise Bis(3-halogen-l-propenyl)benzol der Formel

(IV)

in der X ein Halogenatom ist, mit 4-(ar-D-Glukosyl)-moranolin der folgenden Formel (V) in einem Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, in Gegenwart eines Säureakzeptors, wie Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, umsetzt.

CH₂OH

HO

OH

H OH

(V)

4-(ff-D-Glukosyl)-moranolin kann durch Kupplung von Moranolin mit a-Cyclodextrin in Gegenwart von Cyclodextringlukosyltransferase und anschließende Umsetzung des erhaltenen Oligoglukosylmoranolins mit Glukoamylase nach Adsorbieren an ein stark saures Ionenaustauscherharz erhalten werden (vgl. DE-OS 30 46 184).

Reaktionsschema: CH₂OH

H OH

g-CycIodextrin

Cyclodextringlukosyltransferase

	CH	jOH	-O-	CH₂OH „ rl	H
	I			/
	^/Η	"«Η
*-ο—Κ*	^OH	H/L	-f\OH H/A
	V	-r	>—r
	H	OH	H OH

Oligogluwosylmoranolin (n = O oder ganze ZahJ)

CH₂OH

Dowex· ^5OWX2^

Glukoamylase Ηθ\?^Η

H OH

CH₂OH

η Λ ^{N H}

H OH

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung wird anhand eines Beispiels nachstehend im einzelnen erläutert.

Beispiel
I. Synthese von Benzol-M-bis-allylchlorid

Aus 60 g Vinylbromid und 14 g metallischem Magnesium hergestelltes Vinylmagnesiumbromid wurde in Tetrahydrofuran (nachstehend abgekürzt THF) gelöst, wobei 200 ml Lösung erhalten wurden. Unter Rühren wurde eine Lösung von 25 g Terephthalaldehyd in 200 ml THF während eines Zeitraums von 30 Minuten zugetropft. Danach wurde die Reaktionslösung unter weiterem Rühren 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten. Wach Abkühlen wurde unter EiskühJung eine kleine Menge Wasser zugegeben, um das Produkt zu ersetzen. Das Reaktionsprodukt wurde mit Äthylacetat versetzt, die unlöslichen Bestandteile wurden entfernt, die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen und eingeengt, wobei 21 g eines blaßgelben und öligen Reaktionsproduktes erhalten wurde. Dieses wurde in 250 ml Äthylacetat gelöst, 30 g Thionylchlorid wurden unter Rühren zugetropft, und danach wurde zwei Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, und der erhaltene kristalline -Rückstand wurde aus einer kleinen Menge Äthylacetat umkristallisiert, wobei 15,8 g Benzol-l,4-bis-dlylchlorid vom Fp. 124-129°C erhalten wurden.

II. Herstellung von 4-(a-D-Glukosyl)-morano]in
a) Kultur von Bacillus macerans

In einen 500-ml-Erlenmeyerkolben wurden 150 ml einer Kulturbrühe (pH 7) gegeben, die 1% KorneinweicbJauge (corn steep liquor), I % lösliche Stärke, 0,5 % Ammoniumsulfat und 0,5 % Calciumuarbonat enthielt, und durch 15 Minuten langes Erhitzen bei 120⁰C sterilisiert. Es wurde mit drei Platinösen von Bacillus macerans (TFO 3490-Stamm), der auf einer 1 % Pepton, 0,5 % Hefe, 0,3 % Glukose, 1,5 % Glycerin, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1% Leberpulver (OXOID, Warenzeichen für neutralsisiertes Leber-digest) und 1,5 % Agar enthaltenden Schrägkultur gewachsen war, geimpft und 3 Tage lang bei 37°C kultiviert. Die Kulturlösung (300 ml) wurde in einen 15-1-Schüttelfermentierer inokuliert, der mit 91 desselben Kulturgemisches beschickt war, und 3 Tage lang unter ausreichendem Belüften und Rühren bei 37°C kultiviert, wobei etwa 130 bis 150 Einheiten Enzymlösung (Definition für Einheiten folgt nachstehend) a's überstehende Flüssigkeit nach Zentrifugieren erhalten wurden.

b) Einheit der Cyclodextringlukosyltfänsfefäse-Aktivität

Lösliche Stärke (0,7 %, Erzeugnis von Nakarai Kzgaku Co. für biochemische Untersuchungen) wurde in 0,05 m Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst und als Substratlösung verwendet. Zu 950 μΐ des Substrats wurden 50 μ I Enzymlösung zugesetzt, das Ganze wurde 10 Minuten

lang bei 40⁰C umgesetzt, und die Reaktion wurde durch ZuMtz von 0,5 ml 0,5 η Essigsäure abgebrochen. 100 μΐ der Reaktionslösung wurden entnommen, und 3 ml Wasser und 0,8 ml einer Jodlösung, für deren Bereitung Jod bis zu einer Konzentration von 0,01 m in 0,25 m KJ-Lösung gelöst worden war, wurden zugegeben, und das ganze Gemisch wurde gerührt und die Absorbanz (A_T) bei 660 nm gemessen. In gleicher Weise wurden 100 μΐ einer Lösung, bei der 50 μΙ Wasser und 0,5 ml 0,5 η Essigsäure zu 950 μΐ der entnommenen Substratlösung zugesetzt worden waren, mit Jodlösung versetzt und die Absorbanz (A*) bei 660 nm gemessen. Eine Einheit wird nun durch die Gleichung

1 Einheit =

X 100 X 2

repräsentiert. Dies entspricht der Aktivität, wo 1 ml der Enzymlösung einen l%igen Abfall der Absorbanz innp.rhajh vnn 1 Minute hei 4O°C. verursacht.

c) Bereitung der Rohenzymlösung

Die kultivierte Lösung von Bacillus macerans IFO 3490 wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde abgenommen. Diese wurde lyophilisiert, :■"> dann in einer kleinen Menge Wasser gelöst, und eine eingeengte Enzymlösung wurde erhalten. Diese wurde bei 5°C gegen desiiliiertes Wasser gründlich dialysiert, und die innere Lösung, aus der die niedermolekularen Substanzen entfernt wurden, wurde als Rohenzym- s» lösung verwendet.

d) Umsetzung und Behandlung

Dann wurden 6,5 g Moranolin in einer kleinen Menge Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 3 η Salzsäure η auf einen pH-Wert von 5,7 eingestellt. Danach betrug das Volumen 32,5 ml. «»-Cyclodextrin (26 g) wurde in 1300 ml roher Cyclodextringlukosyltransferase-Enzymlösung (460 Einheiten/ml) gelöst, eine wäßrige Moranolinlösung wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde ■> auf einen pH-Wert von 5,67 eingestellt Dieses wurde drei Tage lang bei 39°C geschüttelt, wobei die Reaktion ablief. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule geschickt (Harzvolumen 50 ml, Dowex· 50Wx 2(H*)), ■ so daß die basischen Substanzen daran adsorbiert wurden. Nachdem gründlich mit Wasser gewaschen worden war, wurde das Harz in 1200 ml Wasser suspendiert, 120 ms <r-l,4-Glukanglukohydru« (etwa 22 Einheiten/ mg), erhalten von Rhizopus niveus, wurden rujesetzt, und das Gemisch wurde bei 4O⁰C inkubiert, und das Portschreiten der Reaktion wurde anhand von intermittierend entnommenen Proben verfolgt, wonach die während der Reaktion gebildete Glukose quantitativ bestimmt wurde. Es wurde festgestellt, daß die Glukosemenge nach der Umsetzung rapid zunahm. Nach

ίο 53tündiger Reaktionsdauer wurde die Reaktion abgestoppt Nach der Umsetzung wurde das Harz abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 η Ammoniakwasser eluiert, das Eluat wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und durch eine Sephadex i G-15-Säule (12 cm φ X 30 cm) geschickt. Die gewünsch ten Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei 5,8 g 4 (ii-D-Glukosyl)-moranolin vom Fp. 138-48°C erhalten wurd'.n. [a)^! _B' 121,6° (Wasser).

III. Synthese der Verbindung (I)

1 g 4-(<r-D-Glukosyl)-moranolin und 1 g Natriumbicarbonat wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid (nachstehend abgekürzt DMSO) bei 22 bis 24°C gelöst, und eine unter Rühren bereitete Lösung von 380 mg Benzol-l,4-bis-allylchlorid in 15 ml DMSO wurde während 60 Minutin zugetropft. Das Gemisch wurde weitere 4 Stunden bei 22 bis 25°C gerührt Dann wurden unlösliche Bestandteile abfiltriert, das Filtrat wurde mit 300 ml Wasser verdünnt, mit Chloroform gewaschen und durch eine Säule (Dowex* 50 W X 2(H®), 20 ml) geschickt. Nachdem die Säule gründlich mit Wasser gewaschen worden war, wurde mit 0,2% Ammoniakwasser eluiert, und dann wurde das gewünschte Produkt mit 5% Ammoniakwasser enthaltendem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum bis zur Trockene eingedampft, und die erhaltenen Kristalle wurden aus 80%igem Methanol umkristallisiert, wobei 300 mg der Verbindung (I) vom Fp. 169-173°C erhalten wurden. [a)?_u = -28,0° (Wasser).

Elementaranalyse für C₃₆H₅₆Oi₈N₂ · 2H₂O:

Berechnet: C = 51,52% H = 7,15% N = 3,24% Gefunden: C = 51,42% H = 7,20% N = 333%.

Claims

Patentanspruch:

1, Bis-glukosylmoranolinderivat der Formel

OH IDH OH OH

HO--

CH₂OH

CH=
CH₂

CH₂OH CH₂OH