DE3634496C2

DE3634496C2 - Glukosylmoranolinderivate und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE3634496C2
Application number: DE3634496A
Authority: DE
Inventors: Makoto Sugiyama; Yoji Ezure; Yoshiaki Yoshikuni; Takayuki Ozaki; Nobutoshi Ojima
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1985-10-12
Filing date: 1986-10-09
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2006-10-10
Also published as: GB2181729A; GB8623513D0; DE3634496A1; FR2591600B1; IT1214726B; US4859767A; IT8648535A0; ES2002207A6; GB2181729B; FR2591600A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen gemäß Anspruch 1 der folgenden allgemeinen Formel (I)

wobei R eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren Hydroxyl gruppen ist, welche eine inhibitorische Wirkung auf den Anstieg des Blutzuckerspiegels haben, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen gemäß Anspruch 2.

Moranolin hat die folgende chemische Struktur

und hat sich als äußerst nützliches Arzneimittel mit therapeutischer Wirkung gegen Diabetes mellitus erwiesen.

Moranolin wurde zuerst aus Cortex Mori (einer orientalischen Rohdroge) (vgl. Yagi et al., Nippon Nogei Kagaku Kaisha, Band 50, Seite 571, 1976; japanische Patentveröffentlichung 52/83951) isoliert, und später wurde herausgefunden, daß man es durch Fermentierung unter Verwendung von dem Stamm Strepto myces zugehörigen Mikroorganismen herstellen kann (vgl. japa nische Patentveröffentlichung 54/84094).

Erfindungsgemäß wurden eine Reihe von Untersuchungen angestellt, um noch leistungsfähigere Antidiabetesmittel zu finden, und es wurden zahlreiche Derivate dieser Verbindungen synthetisiert. Im Verlauf dieser Studien wurde eine Reihe von Verbindungen hergestellt, bei denen R¹ in der allgemeinen Formel (I) Wasser stoff oder eine niedere Alkylgruppe ist, und die entsprechenden Patentanmeldungen wurden getätigt (vgl. japanische geprüfte Veröffentlichung 24798/85 und andere).

Aus der DE-A-30 46 184 sind Glukosylmoranolinderivate bekannt, die am Stickstoff durch Methyl-, Ethyl- und Propylreste substituiert sind, und die eine ausgezeichnete Wirkung auf die Steuerung des Anstiegs des Blutzuckerspiegels haben können.

Aus Derwent 70955B/39 sind Moranolinderivate bekannt, deren Stickstoffatome durch einen Hydroxyalkylrest substituiert sind und die eine antihyperglycämische Wirkung besitzen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Verbindungen mit stärkerer inhibitorischer Wirkung gegen den Anstieg des Blutzuckerspiegels bei geringerer Toxizität durch weitere Untersuchung der Nützlichkeit von solchen Moranolin derivaten als therapeutische Mittel gegen Diabetes mellitus.

Im Rahmen der Erfindung wurden gründliche Studien zwecks Lösung der vorstehenden Aufgabe durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß die Verbindungen gemäß der vorstehenden allgemeinen Formel (I) den genannten Anforderungen genügen, was zu der vorliegenden Erfindung geführt hat.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind neu und in der ein schlägigen Literatur bisher nicht erwähnt.

Das charakteristische Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindun gen ist, daß die Alkylgruppe, die an das Stickstoffatom des Ringes gebunden ist, einen oder mehrere Hydroxylgruppen substituenten enthält.

Es kann sich hierbei um einen oder mehrere Hydroxylgruppen handeln, und obwohl hinsichtlich der Anzahl keine Beschränkung besteht, sind 1 bis 4 Hydroxylgruppen zu bevorzugen.

Die Alkylgruppe muß nicht geradkettig sein, sondern sie kann auch verzweigt sein. Der Fall, daß die Alkylgruppe nicht durch eine oder mehrere Hydroxylgruppen substituiert ist, fällt nicht unter den Bereich der Erfindung.

Einige typische Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind nachfolgend angeführt, obwohl dies keinerlei Einschrän kung des Erfindungsbereiches bedeutet.
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin;
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxypropyl)moranolin;
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(3-hydroxypropyl)moranolin; und
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind basische Substanzen, die folglich mit verschiedenen Säuren Salze bilden können. Wenn diese Salze pharmakologisch verträglich sind, fallen sie natür lich ebenfalls unter den Bereich der Erfindung.

Die Verbindungen nach der Erfindung können unter Anwendung von in der organischen Chemie gut bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise durch Behandeln von 4-O-α-D-Glukopyranosyl moranolin mit Amin oder Epoxid auf übliche Weise.

Beispielsweise können sie in hohen Ausbeuten durch Umsetzen von 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin mit einem Epoxid in einem inerten Lösungsmittel synthetisiert werden. Die Alkylierung von 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin mit β-Halogenhydrinen in einem polaren Lösungsmittel ergibt ebenfalls in vorteilhafter Weise die angestrebten Verbindungen. Weiterhin ist es möglich, ein Verfahren anzuwenden, bei dem α-Halogenketon alkyliert und das erhaltene Keton anschließend reduziert wird, um die Hydroxylgruppe zu erhalten.

Eine alternative Methode zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist in Anspruch 5 offenbart, bei der spezifische Enzyme angewendet werden. Für die Durchführung dieser alterna tiven Methode wird das als Ausgangsstoff verwendete N-substi tuierte Moranolin in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, und unter Kontrolle des pH-Wertes werden α-Cyclodextrin oder lösliche Stärke zugesetzt. Dazu wird dann das Enzym Cyclo dextringlukosyltransferase zugegeben, woraufhin die Glukosy lierung des N-substituierten Moranolins vollzogen wird. Das Enzym kann ein durch Mikroorganismen erzeugtes sein. Nach der Umsetzung kann das Produkt beispielsweise durch Säulenchromato graphie isoliert werden. Die Reaktionslösung kann bei der anschließenden Umsetzung verwendet werden.

Zu der Lösung des erhaltenen oligoglukosyl-N-substituierten Moranolins wird Glukoamylase zugesetzt unter Einstellung des für die Durchführung der Umsetzung geeigneten pH-Wertes. Es kann hierbei handelsübliche Glukoamylase eingesetzt werden. Nach der Umsetzung kann das angestrebte Produkt beispielsweise durch Säulenchromatographie isoliert werden. Die gewünschte Verbindung kann durch gebräuchliche säulenchromatographische Techniken, wie mit Sephadex®G-15, gereinigt werden.

Die inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen gegen den Anstieg des Blutzuckerspiegels wurde anhand der nachfolgenden Tests gesichert.

An vier männliche Beagle-Hunde (26 Monate alt; Körpergewicht 11-14 kg) wurden unter Verwendung einer Sonde peroral 2 g/kg Stärke (lösliche Stärke) gegeben, und die inhibitorische Wirkung der gleichzeitig gegebenen erfindungsgemäßen Verbindung gegen den Anstieg des Blutzucker spiegels wurde getestet. 20 g Stärke wurde in 100 ml Wasser durch Erhitzen gelöst, und 10 ml dieser Lösung pro 1 kg Körper gewicht wurden verabreicht. Aus der Arterie des vorderen und mittleren Teils der Vorderpfote wurde in bestimmten Zeitinter vallen Blut abgenommen, und zum Bestimmen des Blutzuckerspiegels wurden 25 µl des Blutes in einem YS-1-Glukoanalysator (Modell 23A) gegeben. Die Gruppe, an die lediglich Stärke verabreicht worden war, und die, an die nur Wasser gegeben worden war (10 ml/kg Körpergewicht), wurden als Vergleichs- bzw. Grundgruppe bezeichnet, und die Testverbin dung wurde an die Tiere in Dosen von 1, 3 und 10 mg/kg zusammen mit Stärke gegeben. Während des Tests wurden vier Beagles bei kon stanter Temperatur (23 ± 2°C) und konstanter Feuchte (55 ± 5°C) bei einem Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 12 Stunden gehalten, und am Abend wurden pro Tag 300 g Hundefutter (CD-1) gegeben. Die Ergebnisse von vier Bei spielen jeder Testgruppe sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die darin genannten Werte sind
(Durchschnittswert) ± (Standardabweichung)

Aus den Ergebnisse wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine inhibitorische Wirkung gegen den Anstieg des Blutzuckerspiegels aufweisen.

Als die erfindungsgemäßen Verbindungen (Beispiele 1 und 2) zum Ermitteln der Toxizität in einer Dosis von 5 g/kg peroral an Mäuse gegeben wurden, trat in keinem Fall der Tod ein. Als die erfindungsgemäßen Verbindungen (Beispiele 1 und 2) in einer Dosis von 400 mg/kg an fünf aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal an Ratten gegeben wurden, waren keine Anomalien des klinischen Zustandes, der biochemischen Werte des Serums und überhaupt der hämatologischen Werte zu beobachten. Somit ist die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen äußerst niedrig.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Arzneimittel für Lebewesen einschließlich den Menschen ohne Zusätze oder als eine pharmazeutische Zubereitung gegeben werden, die beispielsweise 0,1 bis 99,5%, vorzugsweise 0,5 bis 90%, der Verbindung in einem pharmazeutisch verträglichen nicht toxischen und inerten Trägerstoff enthält.

Als Trägerstoff können ein oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Hilfsmittel für pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden. Die pharmazeu tische Zubereitung wird vorzugsweise in Form einer dosierbaren Einheit verabreicht. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können durch den Mund, durch das Gewebe, von lokalen Bereichen aus (z. B. durch die Haut) oder durch das Rektum verabreicht werden. Selbstverständlich werden jeweils die für das Darreichungsverfahren geeigneten Formen gewählt. Beispielsweise ist die orale Gabe besonders vorteilhaft.

Die Dosis als Heilmittel gegen Diabetes mellitus wird vorzugs weise unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten (z. B. Alter und Körpergewicht), des Verabreichungsweges, der Art und des Ausmaßes der Erkrankung u. dgl. eingestellt. Üblicherweise ist es angebracht, daß die tägliche Dosis im Bereich von 10 bis 2000 mg, vorzugsweise 100 bis 600 mg, liegt. In einigen Fällen ist eine geringere Dosis ausreichend, während in anderen Fällen eine höhere Dosis erforderlich sein kann. Es kann auch vorteil haft sein, die tägliche dem Patienten zu gebende Dosis auf mehrere Gaben aufzuteilen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, die die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen betreffen, näher erläutert.

Beispiel 1A

4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin (10 g) wurden in 150 ml heißem Dimethylsulfoxid gelöst und mit 16 g Kaliumcarbonat versetzt. 18 g Ethylenbromhydrin wurden unter Rühren zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 100 bis 110°C umgesetzt. Nach der Umsetzung wurden unlösliche Bestandteile von dem Gemisch abfiltriert, dann wurden 150 ml Wasser zugesetzt, und das Gemisch wurde sanft gerührt. Dann wurde es durch 300 ml eines stark sauren Ionenaustauschharzes (Dowex® 50W × 2 (H⁺)) geschickt, so daß die gewünschte Verbindung darin adsorbiert wurde. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert, das Eluat im Vakuum eingeengt, dann mit Aktivkohle behandelt und bis zur Trockne im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Aceton aufgenommen, und die in Aceton löslichen Bestandteile wurden verworfen. Die aceton unlöslichen Bestandteile wurden in einer geeigneten Menge heißem Wasser gelöst und aus Ethanol umkristallisiert. Die Kristalle wurden abfiltriert und nochmals aus Ethanol umkristallisiert, wobei 6,0 g des Endproduktes, d. h. 4-O-α-D-Glukopyranosyl- N-(2-hydroxyethyl)moranolin erhalten wurden. Fp. 98-101°C. [α] = +76,7° (1%, Wasser)

Beispiel 1B

Die Herstellung derselben Verbindung wie in Beispiel 1A wird hier unter Verwendung von Enzymen beschrieben, d. h. durch das alternative Verfahren gemäß Anspruch 5.

Kultur von Bacillus mascerans

100 ml einer Kulturflüssigkeit (pH 7), die 1% Korneinweich flüssigkeit, 1% lösliche Stärke, 0,5% Ammoniumsulfat und 0,5%, Calciumcarbonat enthielt, wurde in einen 500-ml-Erlen meyerkolben gegeben und zum Sterilisieren 15 Minuten lang auf 120°C erhitzt. Drei Platinschlingen voll Bacillus mascerans vom IFO 3490-Stamm, das vollständig auf einem Schrägmedium von 1% Pepton, 0,5% Hefe, 0,3% Glukose, 1,5% Glycerin, 0,3% Natriumchlorid, 2,5% Leberpulver (OXOID®) und 1,5% Agar gewachsen war, wurden darauf geimpft und 3 Tage lang einer Schüttelkultur bei 37°C unterzogen. Die Kultur flüssigkeit (600 ml) wurde in einem 30-Liter-Schüttelfermentieren auf 18 solche Medien derselben Zusammensetzung geimpft und 3 Tage lang bei 37°C bei voller Belüftung und Rühren kultiviert wobei eine Enzymlösung von 130 bis 150 Einheiten als überste hende Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren erhalten wurde.

Einheit der Aktivität der Cyclodextringlukosyltransferase

In 0,5 m Acetatpuffer (pH 5,5) wurden 0,7% lösliche Stärke (für biochemische Untersuchungen) zur Gewinnung einer Substratlösung gelöst. Zu 950 µl dieser Substratlösung wurden 50 µl Enzymlösung zugesetzt das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 40°C umgesetzt, und die Reaktion wurde durch Zusatz von 0,5 ml 0,5 n Essigsäure abge stoppt. Nach der Umsetzung wurden 100 µl der Reaktionslösung entnommen, und 3 ml Wasser und 0,8 ml Jodlösung (in 0,25 m Kaliumjodidlösung wurde bis zu einer Konzentration von 0,01 m Jod zugesetzt) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und die Extinktion bei 660 nm gemessen (ein AT-Wert). In gleicher Weise wurden zu 950 µl der Substratlösung 50 µl Wasser und 0,5 ml 0,5 n Essigsäure zugegeben, und 100 µl des erhaltenen Gemisches wurden mit der Jodlösung behandelt und die Extinktion bei 660 nm gemessen (ein AR-Wert).

1 Einheit = [(AR - AT)/AR] × 100 × 2

Diese Einheit bedeutet eine Aktivität, die eine Verminderung von 1% Extinktion der Enzymlösung bei 40°C während 1 Minute hervorruft.

Gewinnung der Rohenzymlösung

Die Kulturflüssigkeit von B. mascerans IFO 3490 wird zentri fugiert, wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird. Diese wurde lyophilisiert, in einer kleinen Menge Wasser gelöst, und eine konzentrierte Enzymlösung wurde erhalten. Diese wurde gründlich bei 5°C in Wasser dialysiert, und die von niedermolekularen Substanzen freie innere Lösung wurde als Enzymlösung verwendet. Erforderlichenfalls wurde sie lyophili siert und das erhaltene Pulver verwendet.

5 g N-(2-Hydroxyethyl)moranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wurde mit 3 n Salzsäure auf 5,7 eingestellt, und mit Wasser wurde auf 25 ml verdünnt. α-Cyclodextrin (80 g) wurden in 3975 ml Rohenzymlösung (250 Einheiten/ml) gelöst, die N-(2-Hydroxyethyl)-moranolin- Lösung wurde zugegeben, und das Gemisch wurde erneut auf pH 5,7 eingestellt. Es wurde dann 3 Tage lang bei 40°C geschüttelt, um eine Reaktion hervorzurufen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit durch eine Säule (200 ml, Dowex®50W × 2 (H⁺)) geschickt, das ein stark saures Ionenaustauschharz ist, so daß basische Substanzen adsorbiert wurden. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert, das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, und 14,8 g Gemisch von Oligoglukosyl-N-(2-hydroxy ethyl)moranolinen wurde erhalten.

Dieses wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromato graphie analysiert, wobei festgestellt wurde, daß es ein Gemisch aus 15% N-(2-Hydroxyethyl)moranolin und 85% Oligo glukosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin war. Die Bedingungen für die genannte Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie waren wie folgt:

Sumipax®R741 (Nucleosil 5NH₂, 5 Mikrometer, 4 mm ID × 25 cm). Entwickler: Acetonitril-Wasser (65/35). Strömungsgeschwindig keit der Flüssigkeit: 1 ml/min. RI-Bestimmung (ERC-7510). Datenverarbeitungssystem® Hitachi 655-60.

10 g des auf vorstehende Weise erhaltenen Oligoglukosyl-N- (2-hydroxyethyl)moranolin-Gemisches wurden in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung auf pH 5,1 eingestellt. Bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml wurde Wasser zugegeben, und 250 ml Glukoamylase (Glucozyme AF-6) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 50°C umgesetzt, die Reaktion wurde durch Erhitzen bis auf 80°C beendet und das Gemisch auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit durch eine Säule (200 ml Harzvolumen) von stark saurem Ionenaustauschharz geschickt, und die Säule wurde gründ lich mit Wasser gewaschen. Die Säule wurde dann mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, wobei 5,6 g Pulver erhalten wurden.

Dieses wurde durch Hochgeschwindigkeits-Chromatographie, wie vorstehend beschrieben, analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch aus 28,8% N-(2-Hydroxyethyl)moranolin, 71,0% 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin und 0,2% 4-O-α-D-Maltosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin bestand.

Eine weitere Ausführungsform verläuft wie folgt:
8 g lösliche Stärke wurden in 50 ml heißem Wasser gelöst, und in dieser Lösung wurde 1 g N-(2-Hydroxyethyl)moranolin gelöst. Die Lösung wurde auf 40°C abgekühlt, auf pH 5,7 eingestellt und mit 50 ml einer Rohenzymlösung (4000 Einheiten/ml) ver setzt. Diese Mischung wurde erneut auf pH 5,7 eingestellt und 3 Tage lang unter Schütteln bei 40°C umgesetzt. Die Reaktion wurde durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen auf 80°C beendet, es wurde auf 50°C abgekühlt, auf pH 5,1 eingestellt, 500 ml Glukoamylase (Glucozyme®AF-6) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 50°C umgesetzt. Die Umsetzung wurde beendet, indem 20 Minuten lang auf 80°C erhitzt wurde, es wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und zentrifugiert. Die überste hende Flüssigkeit wurde durch eine Säule (100 ml Harz) mit stark saurem Ionenaustauschharz Dowex®50W × 2 (H⁺) geschickt, wobei die basischen Substanzen adsorbiert wurden. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, wobei 1,8 g Pulver erhalten wurden.

Dieses wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromato graphie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch aus 29% N-(2-Hydroxyethyl)moranolin, 70% 4-O-α-D- Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin und 1% 4-O-α-D- Maltosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin bestand. Die Bedingungen bei der Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie waren wie vorstehend beschrieben, nur mit der Ausnahme, daß als Entwickler ein Gemisch von Acetonitril und Wasser (70/30) verwendet wurde.

1,5 g des vorstehenden Gemisches wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst, die Lösung wurde durch eine Säule geschickt (48 mm Durchmesser × 850 mm, Sephadex®G-15), und die Säule wurde mit destilliertem Wasser entwickelt, wovon jeweils 5 ml- Fraktionen gesammelt wurden.

Jede Fraktion wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits chromatographie analysiert, geeignete gesammelte Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde aus wäßrigem Ethanol umkristallisiert, wobei 550 mg 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin vom Fp. 99-102°C erhalten wurden. [a] = +76,5° (1%, Wasser).

Beispiel 2A

10 g 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin wurden in 150 ml heißem Dimethylsulfoxid gelöst, und 16 g Kaliumcarbonat wurden zuge setzt. 20 g Epibromhydrin wurden unter Rühren zugegeben, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 100 bis 110°C umgesetzt. Nach der Umsetzung wurden unlösliche Bestandteile von dem Ge misch abfiltriert. Es wurden 150 ml Wasser zugesetzt und das Gemisch sanft gerührt. Dieses wurde dann durch eine 300-ml- Säule mit stark saurem Ionenaustauschharz (Dowex®50W × 2 (H⁺)) geschickt und die gewünschte Verbindung wurde darin adsorbiert. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert, das Eluat unter Rühren am Rückfluß 3 Stunden lang bei 80°C erhitzt, im Vakuum eingeengt, mit Aktivkohle behandelt, durch eine 200-ml-Säule mit Diaion®HP-200 geschickt und mit Wasser gewaschen. Die Durchlauflösung und die Waschlösung wurden vereinigt, das Gemisch im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit Methanol aufgenommen, die methanolische Lösung mit 3 l Sephadex®LH-20 behandelt, die Säule mit Methanol ent wickelt. Die Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthiel ten, wurden gesammelt, dann wurde das Methanol verdampft, der Rückstand in einer geeigneten Menge heißem Wasser gelöst und aus Ethanol umkristallisiert. Die Kristalle wurden abfiltriert und nochmals umkristallisiert, wobei 5,0 g des Endproduktes, d. h. 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-2,3-dihydroxypropyl)moranolin vom Fp. 83-85°C erhalten wurden. [α] = + 73,7° (1%, Wasser).

Beispiel 2B

Hier wird die Herstellung derselben Verbindung, wie sie gemäß Beispiel 2A erzeugt wurde, unter Anwendung von Enzymen be schrieben, d. h. gemäß der alternativen Methode nach Anspruch 5.

8 g lösliche Stärke wurden in 50 ml heißem Wasser gelöst, und 1 g N-(2,3-Dihydroxypropyl)moranolin wurden darin gelöst. Die Lösung wurde auf 40°C abgekühlt, auf pH 5,7 eingestellt und mit 50 ml Rohenzymlösung (4000 Einheiten/ml) versetzt. Die Lösung wurde erneut auf pH 5,7 eingestellt und 3 Tage lang bei 40°C unter Schütteln umgesetzt. Dann wurde sie auf die in Beispiel 2A beschriebene Weise behandelt, wobei 1,6 g einer Mischung aus 31% N-(2,3-Dihydroxypropyl)moranolin, 68% 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin und 1% 4-O-α-D-Maltosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin erhalten wurden.

Dieses Pulvergemisch (1,5 g) wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst, die Lösung wurde durch eine Sephadex®-G-15-Säule (48 mm Durchmesser × 850 mm) geschickt, mit destilliertem Wasser entwickelt, und jeweils 5-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Jede Fraktion wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromato graphie analysiert, um geeignete Fraktionen sammeln zu können, und diese wurden im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde aus wäßrigem Ethanol umkristallisiert, wobei 505 mg 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin vom Fp. 83-86°C erhalten wurden. [α] = +72,3° (1%, Wasser).

Beispiel 3

L-Arabinosetetraacetat (Wolfram et al., J. Am. Chem. Soc. 63, 201, 1941) wurde zu 2,3,4,5-Tetra-O-acetylpentyl-1-bromid reduziert und bromiert. 11,8 g dieser Substanz und 5 g 4-O-α-D- Glukopyranosylmoranolin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wurde mit 6,4 g wasserfreiem Kaliumcarbonat versetzt, und das Gemisch wurde 5 Stunden lang bei 100°C umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und das Lösungsmittel daraus verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und durch eine 100-ml-Säule mit stark saurem Ionenaustauscherharz (Dowex®50W × 2 (H⁺)) geschickt. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und mit 1 n Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat wurde zum Entacetylieren eine Stunde lang auf 70°C erhitzt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Wasser aufgenommen und die Lösung durch eine 100-ml-Säule mit stark saurem Ionenaustauscherharz (Dowex®50W × 2 (H⁺)) geschickt. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert. Das Lösungsmittel wurde daraus entfernt. Der Rückstand wurde getrocknet, in Methanol gelöst, mit 4,5 g p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat versetzt, um auszukristallisieren. Nach dem Filtrieren wurden die Kristalle getrocknet, wobei 3,4 g 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3,4,5- tetrahydroxy-n-pentyl)moranolin-p-Toluolsulfonat erhalten wurden. Fp. 195-198°C, [α] = +139,2° (c = 1%, Wasser).

Beispiel 4

5 g 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin wurden in 50 ml Dimethyl formamid gelöst. Es wurden 10 ml Cyclohexenoxid zugegeben und das Gemisch 20 Stunden lang unter Erhitzen auf 110°C gerührt. Dann wurde das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit n-Hexan gewaschen. Dann wurde es durch eine 100-ml-Säule mit stark saurem Ionenaustauscherharz (Dowex®50W × 2 (H⁺)) geschickt, um die gewünschte Verbindung zu adsorbieren, und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Säule wurde mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert, das Lösungsmittel wurde verdampft, es wurde getrocknet, dann mit Methanol aufgenommen, und zum Umkristallisieren wurden 4,5 g p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat zugesetzt. Das Gemisch wurde filtriert und getrocknet, wobei 5,8 g 4-O-α-D-Glukopyranosyl- N-(2-hydroxycyclohexyl)moranolin vom Fp. 105-108°C erhalten wurden. [a] = +85,0° (c = 1%, Wasser).

Claims

1. Glukosylmoranolinderivate der folgenden allgemeinen Formel (I) in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und einer oder mehreren Hydroxylgruppen, eine Tetrahydroxy-n pentyl-Gruppe sowie eine 2-Hydroxyl-cyclohexyl-Gruppe ist.

2. Verfahren zur Herstellung von Moronolinderivaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung eines Moranolinderivats der folgenden all gemeinen Formel (III) und Cyclodextrin oder lösliche Stärke mit Cyclodextringlukosyl transferase zu 5-Oligoglukosylmoranolinderivat der allgemeinen Formel (II) umgesetzt werden, wobei R die in Anspruch 1 angegebene Bedeu tung hat und n eine ganze Zahl von 0 bis 15 ist, und das Reak tionsgemisch anschließend mit Glukoamylase behandelt wird.