CH648757A5 - Procede de preparation d'un allergene traite par un aldehyde. - Google Patents

Description

L'invention concerne le procédé de production d'un allergène traité par un aldéhyde, ayant une faible réactivité allergisante chez les humains allergiques et qui conserve les propriétés immunisantes désirées de l'allergène natif conduisant à une amélioration de la Symptomatologie des individus allergiques et à la production concomitante d'anticorps bloquants considérés associés à, mais non nécessairement uniquement responsables de cette diminution des symptômes, et qui est capable d'induire chez les mammifères la formation d'anticorps bloquants contre l'allergène natif en une concentration suffisante, procédé caractérisé en ce qu'on soumet les allergènes débarrassés de pratiquement tout matériel non allergisant à bas poids moléculaire, à une réaction chimique, dans des conditions douces, avec une solution de formaldéhyde, d'aldéhyde aliphatique inférieur saturé bifonctionnel ou de leurs mélanges, en au moins deux étapes, à condition que toute réaction avec le formaldéhyde soit conduite dans un milieu non phénolique, les conditions douces comprenant l'exécution d'une étape à une température juste supérieure au point de congélation de la solution et allant jusqu'à 15°C, et l'exécution de toute étape subséquente à une température comprise entre 25 et 40 C avec toute combinaison de formaldéhyde ou/et de dialdéhyde, pour former un produit présentant une réticulation intermoléculaire ou intramolêculaire provoquée par l'aldéhyde, et une modification des groupes allergisants telle que les propriétés allergisantes se trouvent réduites tout en conservant les propriétés immunisantes.

Les allergènes ainsi traités peuvent être totalement ou partiellement purifiés. Les aldéhydes en question répondent de préférence à la formule

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Il II HC-fCH^C-H

dans laquelle n est compris entre 1 et 6 environ.

Tel qu'utilisé ici, le terme aldéhyde se rapporte au formaldéhyde déjà mentionné et à des dialdéhydes aliphatiques inférieurs saturés tels que le glutaraldéhyde (n=3), ces aldéhydes pouvant être utilisés seuls ou en mélanges pendant le procédé par degrés.

Le terme non phénolique signifie qu'au plus seules quelques traces de composés phénoliques ajoutés sont présentes dans le milieu de réaction avec l'aldéhyde. Cependant, ce dernier terme n'exclut pas la présence de groupes hydroxyphénoliques qui, on le sait, sont contenus naturellement dans les allergènes, dans la plupart des cas, en tant que partie de la structure protéinique complexe.

Le procédé selon l'invention conduit à la production d'allergènes traités par un aldéhyde, de faible réactivité allergisante chez les " humains allergiques, mais qui conservent les propriétés immunisantes désirées des allergènes natifs (non traités), comprenant, mais de façon non limitée, l'aptitude à induire des quantités substantielles d'anticorps bloquants, très réactifs avec les allergènes natifs, lorsqu'ils sont injectés à des humains. Une thérapie prolongée avec des allergènes traités par un aldéhyde s'est révélée résulter en une diminution substantielle des anticorps sêriques de type IgE contre les allergènes respectifs. Des doses thérapeutiques efficaces, importantes, de ces allergènes traités par un aldéhyde peuvent être administrées à des humains allergiques avec un risque de réactions allergiques sys-témiques fortement diminué par rapport à des doses similaires d'allergènes natifs, ce qui permet au médecin traitant de réduire le nombre d'injections d'allergènes traités par un aldéhyde par rapport à celles d'allergènes natifs. Les allergènes traités par un aldéhyde sont également utilisables pour l'immunisation d'autres mammifères dans le but de produire des anticorps bloquants.

Bien que non lié à une théorie, le titulaire pense qu'une des principales raisons de la supériorité de ces allergènes modifiés par un aldéhyde, selon l'invention, par rapport à ceux décrits précédemment, est fondée sur l'utilisation d'une faible température de réaction au premier stade. A cette faible température, une réticulation inter- et intramolêculaire a lieu lentement sans dénaturation thermique ou chimique contraire des immunodéterminants instables, critiques, sur les allergènes, où ces réactions adverses sont contraires à la nécessité de conserver les propriétés immunisantes désirées dans l'allergène traité par un aldéhyde. Les rêticulations résultantes stabilisent la molécule pour des réactions ultérieures à température plus élevée, qui peuvent être conduites en un ou plusieurs stades utilisant le même ou un mono- ou un dialdéhyde différent. De plus, l'utilisation optimale de plus d'un aldéhyde crée une plus grande souplesse dans la suite des réactions, de telle sorte que les allergènes modifiés par un aldéhyde peuvent être rendus moins allergisants au moyen d'une réaction avec différents aldéhydes.

Les principales réactions de réticulation avec le formaldéhyde sont dues à la création de liaisons inter- et intramoléculaires avec pont méthylène entre des groupes amino, d'une part, et des groupes guanidino, amide d'acide et certains groupes aromatiques, d'autre part (essentiellement des résidus tyrosyle dans les protéines). Toujours sans être lié par aucune théorie, on pense également que les principales réactions de réticulation inter- et intramolêculaire avec les dialdéhydes ont lieu entre des paires de groupes amino. La chimie des deux types de réticulation est donc un peu différente, et la cinétique de la réaction de réticulation par un dialdéhyde est beaucoup plus rapide que celle impliquant le formaldéhyde. Il faut encore noter que, lorsqu'un additif approprié, décrit ici, est présent dans le mélange réactionnel, une réticulation intermoléculaire importante peut avoir lieu entre les molécules d'allergène et l'additif.

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Lorsqu'on utilise des allergènes bruts, il est nécessaire d'éliminer en grande partie les substances grasses et les matériels non allergisants à bas poids moléculaire contenus dans les substances natives, avant de procéder au traitement par un aldéhyde.

Des préparations allergisantes brutes qui sont particulièrement appropriées à un traitement par un aldéhyde peuvent être obtenues en dégraissant la substance contenant l'allergène natif avec de l'éther diéthylique anhydre, exempt de peroxyde ou de l'éther de pétrole et en extrayant les matériels dégraissés avec une solution aqueuse, de préférence tamponnée à un pH de 6 à 8 (par exemple, NH4HC03 0.125M). Les substances non allergisantes à bas poids moléculaire, normalement présentes, peuvent alors être séparées de l'extrait par dialyse ou ultrafiltration sur une membrane semi-perméable (par exemple tube de Visking, membrane Millipore, système à fibres creuses Amicon permettant d'obtenir une gamme appropriée de poids moléculaires, normalement de l'ordre d'environ 3000 à 10 000 daltons et de préférence de 3000 à 5000 daltons), bien qu'on puisse également avoir recours à des filtrations sur gel ou à un processus similaire bien connu des spécialistes, pour obtenir un résultat analogue; on peut également précipiter les matériels à haut poids moléculaire sans dénaturation significative irréversible, à partir de l'extrait global, par une opération de précipitation par un sel ou un solvant, et reconstituer ces matériels à haut poids moléculaire, à partir des matériels précipités, sous la forme d'une solution aqueuse. Des substances allergisantes totalement ou partiellement purifiées peuvent être préparées selon l'un des procédés ordinairement utilisés pour la purification des macromolécules à partir de mélanges complexes. Des procédés de purification appropriés sont décrits dans la littérature pour les allergènes de poissons, le pollen d'ambrosia, les pollens d'ivraie et de fléole des prés, les champignons, les acariens de poussières domestiques et des venins d'insectes, bien que ce ne soient pas les seuls procédés, ni les seuls matériels allergisants qui puissent être utilisés dans l'opération de traitement par un aldéhyde.

L'invention n'est pas limitée à un matériel ou à un extrait contenant un allergène particulier. Mais les matériels contenant du pollen végétal, en particulier ceux d'herbe, d'arbres et de mauvaises herbes, importants en allergie, peuvent être extraits et traités de façon avantageuse par les aldéhydes selon l'invention. Comme exemples de pollens de la famille de l'herbe (graminées) qui sont utilisables dans la mise en œuvre de l'invention, on citera le seigle bâtard des prairies (Festuca elatior), le pâturin des prés du Kentucky (Poapratensis), et le dactyle pelotonné (Dactylis glomerata) de l'espèce des festu-cées; le ray-grass anglais (Lilium perenne) et l'ivraie vivace d'Italie (Lolium multiflorum) de l'espèce des hordées; la fléole des prairies (Phleum pratense) et l'agrostide (Agrostis palustris) de l'espèce des agrostidées, et la flouve odorante (Anthoxanthum odoratum) de l'espèce des phalaridées. Des exemples comparables de pollens d'arbres comprennent diverses espèces de noyer, telles que Jugions californica, de bouleau (par exemple Betula alba), de chêne (par exemple Quercus alba) et d'orme (par exemple Ulmus parvifolis). Des pollens de mauvaises herbes utilisables sont par exemple l'ambrosia courte (Ambrosis eliator), l'ambrosia géante (Ambrosis trifida), le chardon de Russie (Salsolapestifer), la sauge commune (Artemisia tridentata), et le plantain anglais (Plantago lanceolata). D'autres matériels allergisants peuvent également être traités; ce sont: des extraits contenant des corps entiers et/ou des excrétions et sécrétions d'acariens de poussière domestique du genre Dermatophagoides et apparentés, tels que des extraits comprenant des extraits bruts de poussières domestiques, des solutions d'allergènes alimentaires (par exemple des extraits de noix, de légumes, d'oeufs de poules, etc.); des extraits de champignons (par exemple Alternaria, Pénicillium, Aspergillus, Helminthosporium, levures, basidiospores, ascospores, etc.); des extraits de graines et de fibres végétales (par exemple coton,

ricin, etc.), des extraits des corps entiers ou des venins d'insectes piquants et mordants (par exemple abeilles, frelons, guêpes et moustiques), et des extraits de pellicules/peau/poils d'animaux (par exemple chats, chiens, chevaux, cobayes, souris, lapins, etc.).

Des allergènes totalement purifiés ou partiellement purifiés peuvent également être traités par un aldéhyde, par exemple l'allergène du pollen de l'herbe du groupe I, l'antigène E du pollen d'ambrosia, des extraits d'acariens de poussière domestique partiellement purifiés et la phospholipase A du venin d'abeille.

La réaction entre les matériels allergisants bruts ou très purifiés et le ou les aldéhydes peut être conduite en présence d'un additif à bas poids moléculaire. Comme additifs appropriés, contenant normalement moins de 8 atomes de carbone environ, en plus de tout groupe fonctionnel présent, on peut citer des diamines aliphatiques; des guanidines; des amides d'acides aliphatiques; des acides car-boxyliques aliphatiques contenant des groupes aminés, comprenant des aminoacides aliphatiques (acides monoaminomonocarboxy-liques, acides monoaminodicarboxyliques, et acides diaminomono-carboxyliques), des hydroxyaminoacides aliphatiques, et des diaminoacides dicarboxyliques aliphatiques, et des composés aliphatiques contenant des combinaisons de permutations d'un ou plusieurs groupes amino, guanidino et acide amido. De plus, un 1 nombre limité de groupes hydroxy peut être présent dans l'un quelconque des types de composés ci-dessus. On peut citer comme espèces le 1,4-diaminobutane, la lysine, l'ornithine, l'acide 1,5-diaminopimélique, l'arginine, l'adipamide, l'acide aspartique, la sérine et l'alanine. L'additif est tel qu'il se combine par voie chimique avec les constituants de pollen pendant le traitement avec un aldéhyde.

A chaque stade du procédé, les concentrations de l'allergène, de l'aldéhyde et de tout additif présent dans le mélange réactionnel, ainsi que le pH et la période d'incubation du mélange réactionnel qui fournissent des conditions optimales du traitement par un aldéhyde, dépendent en partie les uns des autres. On préfère les conditions indiquées ci-après, chaque condition étant capable de maintenir les autres conditions dans des limites appropriées, afin d'obtenir un allergène, traité par un aldéhyde, recherché.

La concentration finale en les matériels allergisants utilisés pour la réaction avec un aldéhyde doit de préférence; 1) être telle que tous les constituants soient totalement solubles, et 2) être compatible avec la concentration de l'aldéhyde et de tout additif utilisé. Dans le cas de réactions avec le formaldéhyde, les solutions doivent être préparées dans un tampon aqueux, de préférence à un pH de 7,4 à 7,6 environ, d'une molarité adéquate pour maintenir ce pH entre 7,2 et 7,6 environ pendant la réaction, afin d'optimiser les réactions désirées avec l'aldéhyde. Des concentrations jusqu'à 12 mg/ml environ de matériels allergisants (sur un poids sec de solide/ml) dans un tampon de phosphate de sodium 0,1 M, à un pH de 7,5+0,1 satisfont généralement aux conditions ci-dessus, le choix de la concentration en allergène étant dans une certaine mesure fonction de la température d'incubation et de la concentration en aldéhyde.

Dans le cas de réactions avec un dialdéhyde, le pH des solutions réactionnelles doit être de préférence compris entre 7,0 et 8,0 et la concentration en allergène entre 1,0 et 2,0 mg/ml.

La concentration en aldéhyde(s) dans le mélange réactionnel ne doit pas être trop élevée au point de nuire aux propriétés immunisantes désirées de l'allergène, traité par un aldéhyde, résultant, mais doit être suffisante pour obtenir une destruction poussée du caractère allergisant de l'allergène natif à la température particulière du mélange d'incubation. La diminution résultante du caractère allergisant est normalement de l'ordre de 100 à 10 000 fois, après la fin du procédé par degrés. En plus des facteurs mentionnés ci-dessus, les gammes de concentrations préférées en aldéhyde varient selon la pureté de l'allergène à traiter, compte tenu du fait que la limite inférieure des gammes spécifiées ci-après est plus appropriée avec des matériels très purifiés.

Préparation de l'allergène

Dans le cas d'extraits allergisants, on élimine les substances grasses de la source d'allergène séché (pollen, pellicules, champignon, etc.) par extraction avec de l'éther de pétrole sec ou de l'éther diéthylique sec, exempt de peroxyde. On extrait le matériel allergi5

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sant dégraissé à 0 à 5° C pendant 15 min à 4 d environ avec une solution adéquatement tamponnée (par exemple NH4HC03 0,125M) à un pH de 6,0 à 8,0. La durée de l'extraction dépend du type d'extrait désiré et de la nature de la source d'allergène. La substance solide est séparée par filtration, centrifugation ou toute autre opération similaire. Plus de 90% des substances à bas poids moléculaire (essentiellement non allergisantes) sont séparées de l'extrait par dialyse ou ultrafiltration sur une membrane ou un système à fibres creuses (gamme de séparation de poids moléculaire de 3000 à 5000 daltons) ou par filtration sur gel. On amène la solution d'allergène à une concentration de base appropriée exprimée en poids sec de substance solide contenant l'allergène par millilitre (normalement 1,5 à 2,0 fois celle existant au stade 1 - voir ci-dessous), par ultrafiltration et dialyse de nouveau, ou lyophilisation et reconstitution dans un tampon tel que le phosphate de sodium 0,1 M ajusté à un pH de 7,5±0,1.

On prépare également des allergènes totalement ou partiellement purifiés, dans le même tampon, pour les réactions décrites ci-dessous.

Résumé des conditions de réaction:

Formaldéhyde, stade 1

Concentration en allergène 1,0 à 12,0 mg/ml; concentration en formaldéhyde 0,5 à 2,5M; température 5 à 15°C, de préférence 10°C environ; pH 7,2 à 7,6; temps 8 à 32 h.

Formaldéhyde, stade n: (où n> 1, et généralement n = 2)

Concentration en allergène 1,0 à 3,0 mg/ml; concentration en formaldéhyde 0,36 à 0,5M; température environ 25 à 40° C, de préférence 30 à 34°C; pH 7,2 à 7,6; temps 16 à 35 d.

Dialdéhyde, stade 1 :

Concentration en allergène 1,0 à 2,0 mg/ml; concentration en aldéhyde 0,01 à 0,1 M, de préférence environ 0,025M; température 5 à 15°C, de préférence environ 10°C; pH 7,0 à 8,0 environ; temps 4 à 24 h, de préférence 16 à 20 h.

Dialdéhyde, stade n: (où n> 1, et généralement n=2)

Concentration en allergène 1,0 à 2,0 mg/ml; concentration en aldéhyde 0,01 à 0,1 M, de préférence 0.025M environ; température 25 à 40CC environ, de préférence 30°C environ; pH 7,0 à 8,0 environ; temps 16 à 32 h, de préférence environ 24 h.

A la fin de l'incubation (ou des incubations), on élimine l'excès d'aldéhydes par l'un des procédés suivants: dialyse poussée avec plusieurs changements dans le dialysat en utilisant une enveloppe de cellulose telle que Visking N° 18, dialyse/ultrafiltration poussée sur membrane avec une membrane Millipore, Amicon ou équivalente ou système à fibres creuses avec gamme de séparation de poids moléculaire entre 5000 et 30 000 daltons environ, ou par filtration sur gel, en utilisant un xérogel approprié tel que le Sephadex G10 ou G25 vers 4,:C.

Conformément à l'invention, la réaction est conduite en un ou plusieurs stades, de préférence en deux stades. Lorsqu'on a recours à deux stades ou plus, le premier stade se distingue des stades ultérieurs par les différentes températures utilisées. Dans le cas de réactions en stades multiples, la suite des réactions peut être conduite avec: a) le formaldéhyde dans le premier stade et les stades ultérieurs, b) avec un dialdéhyde particulier dans le premier stade et les stades ultérieurs, c) avec le formaldéhyde dans le premier stade et un dialdéhyde particulier dans les stades ultérieurs, d) avec un dialdéhyde particulier dans le premier stade et le formaldéhyde dans les stades ultérieurs, e) avec une combinaison du formaldéhyde et d'un ou plusieurs dialdéhydes dans les divers stades. Les combinaisons préférées sont généralement les cas simples a ou b, mais les cas c et d présentent l'avantage d'une combinaison de différents types de réactions chimiques avec un mode opératoire relativement simple. Les réactions du type e, bien que souvent plus complexes à

conduire, offrent des combinaisons de réactions qui peuvent conduire à la diminution la plus importante des propriétés allergisantes.

Des mélanges de formaldéhyde et d'un dialdéhyde (normalement le glutaraldéhyde) peuvent être utilisés dans une série de stades (normalement deux). Cette technique élimine la séparation de l'aldéhyde après le premier stade, avant d'ajouter le second aldéhyde. Etant donné que le dialdéhyde réagit totalement en 20 h environ, le mélange peut alors être transféré au second stade afin de permettre une réaction plus complète avec le formaldéhyde. La concentration en allergène est maintenue entre 1,0 et 2,5 mg/ml environ, celle du formaldéhyde entre 0,36 et 0,5M et celle du dialdéhyde vers 0,025M, à un pH de 7,2 à 7,6. Le premier stade dure de 4 à 24 h (de préférence de 16 à 20 h) entre 5 et 15° C (de préférence vers 10°C), et le second stade de 16 à 32 d à 30-34° C.

Au premier stade, la réaction est conduite à une température supérieure au point de congélation de la solution (la gamme la plus efficace étant comprise entre 5 et 15° C environ) et de préférence vers 10°C. Le(s) stade(s) ultérieur(s) est (sont) conduit(s) de 25 à 40° C environ et de préférence entre 30 et 34° C. Le respect de cette suite de températures permet d'augmenter substantiellement l'efficacité du produit final pour l'immunisation des individus allergiques.

Dans le cas du procédé en deux stades, préféré, le premier stade à la température plus faible est généralement conduit pendant une période de temps de 8 à 32 d dans le cas du formaldéhyde, et d'environ 20 h dans le cas des dialdéhydes, bien que, dans ce dernier cas, des périodes d'incubation plus courtes (4 h) puissent être appliquées. La durée du second stade est généralement comprise entre 14 et 35 d pour le formaldéhyde, et est d'environ 24 h pour les dialdéhydes.

La présente invention est applicable au formaldéhyde, à tous les dialdéhydes aliphatiques inférieurs saturés, en particulier au glutaraldéhyde, et aux dialdéhydes de formule générale

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où n = 1 à 6, et à leurs isomères à chaîne ramifiée et aux précurseurs ainsi qu'aux mélanges de ces composés.

Les allergènes traités par un aldéhyde, préparés comme décrit ci-dessus, sont des agents immunothérapeutiques appropriés pour les mammifères, comprenant les humains allergiques. Un adjuvant tel qu'un alun ou un alginate peut être incorporé dans la préparation immunisante désirée afin d'en augmenter l'efficacité immunogène. Les allergènes traités par un aldéhyde peuvent être utilisés dans un examen diagnostique avant et pendant l'immunothérapie d'humains allergiques.

Les allergènes traités par un aldéhyde selon l'invention peuvent être administrés à des mammifères de façon classique, comme par voie intradermique, sous-cutanée ou intramusculaire. De plus, le faible caractère allergisant de ces matériels permet leur administration sous la forme d'une pulvérisation d'aérosol par le nez et/ou la bouche pour obtenir une immunisation à travers la muqueuse.

L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants.

Exemple I:

On utilise les pollens suivants: 1) ambrosia (herbe de Saint-Jacques) courte (Ambrosia elatior), et 2) herbe mixte constituée de 30% de dactyle pelotonné (Dactylis glomerata), 25% de pâturin des prés (Poapratensis), 25% de fléole des prés (Phleumpratense), 10% de seigle bâtard rouge (Festuca rubra), et 10% de seigle bâtard des prairies (Festuca elatior). On dégraisse chaque pollen par extractions successives avec l'éther diéthylique ou l'éther de pétrole (environ 8 fois 11) et on extrait à 4°C en une fois avec 10 fois le volume de NH4HC03 0,125M par rapport au poids (en milligrammes) de pollen, pendant environ 18 h (en agitant), ou en trois fois avec au total un volume de solution de NH4HC03 représentant 10 fois la quantité de pollen. Après centrifugation, on dialyse chaque extrait surnageant à 4°C, de façon poussée, dans un tube en cellulose Visking N° 18 contre NH4HC03 0.002M (4 à 5 fois 72 1), puis

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contre de l'eau distillée (1 fois 721), pendant 4 d environ au total. Cette dialyse a pour but d'éliminer pratiquement la totalité des constituants non allergisants à bas poids moléculaire. On centrifuge chaque extrait dialysé afin de séparer des traces de précipité, on lyophilise et conserve à — 20° C dans un récipient étanche à l'air, jusqu'à utilisation.

On incube l'extrait d'allergène dialysé 1 ou 2 à raison de 2 mg/ml avec une solution de formaldéhyde 0,5M pendant 14 à 18 d à 10 + PC dans un tampon de Na2HP04/NaH2P04 0,1M à pH 7,5+0,1 (tampon A), on transfère directement dans un incubateur à 32+ PC, et on incube pendant encore 14 à 18 d. On élimine l'excès de formaldéhyde par dialyse contre le tampon A, une solution saline physiologiquement tamponnée ou l'eau distillée (voir discussion ci-dessous).

Exemple II:

On incube un extrait d'allergène dialysé 1 (2 mg/ml) avec une solution de formaldéhyde 0,5M pendant 30 à 35 d à 10+ 1°C et à pH 7,5+0,1 dans le tampon A, on transfère directement dans un incubateur à 32 + PC et on incube pendant une autre période de 30 à 35 d. On élimine l'excès de formaldéhyde par dialyse contre le tampon A, une solution saline physiologiquement tamponnée ou l'eau distillée.

Exemple III:

On incube un extrait d'allergène dialysé 2 (2 mg/ml) avec une solution de formaldéhyde 0,5M pendant environ 8dàl0+l°Cetàun pH de 7,5 dans le tampon A, on transfère directement dans un incubateur à 32+ PC, et on incube pendant encore 32 d. On élimine l'excès de formaldéhyde par dialyse contre le tampon A, une solution saline physiologiquement tamponnée ou l'eau distillée.

Exemple IV:

On incube un extrait d'allergène dialysé 1 ou 2 (10 mg/ml) avec une solution de formaldéhyde 2M pendant environ 14 à 18 d à 10+ PC. On dilue la solution 4 fois (c'est-à-dire à 2,5 mg/ml d'ambrosia et du formaldéhyde 0,5M). On incube de nouveau la solution pendant 14 à 18 d environ à 32 + PC. On élimine l'excès de formaldéhyde par dialyse contre le tampon A, une solution sahne physiologiquement tamponnée ou l'eau distillée.

Exemple V:

On incube un extrait d'allergène dialysé 1 ou 2 (8 mg/ml) avec une solution de formaldéhyde 2M pendant 14 à 18 d environ à 10 + PC. On dilue 4 fois la solution (c'est-à-dire à 2,0 mg/ml d'ambrosia et du formaldéhyde 0,5M). On incube de nouveau la solution pendant 14 à 18 d environ à 32± PC. On élimine l'excès de formaldéhyde par dialyse contre le tampon A, une solution saline physiologiquement tamponnée ou l'eau distillée.

Exemple VI:

On incube un extrait d'allergène dialysé 1 de pollen d'ambrosia courte (2 mg/ml) avec une solution de formaldéhyde 2M pendant environ 14 à 18 d à 10+ PC à pH 7,5+0,1 dans un tampon de phosphate de sodium 0,1M (tampon A); on dialyse la solution de façon poussée à 4°C avec plusieurs changements du tampon A, afin d'éliminer le formaldéhyde; on ajoute lentement une nouvelle quantité de formaldéhyde (12,3M) pour obtenir une solution 0,36M en formaldéhyde, et on incube de nouveau la solution pendant 16 d à 32 +1° C et à pH 7,5+0,1. On élimine le formaldéhyde en excès par dialyse contre le tampon A ou une solution saline physiologiquement tamponnée.

Exemple VII:

On incube un extrait d'allergène dialysé 1 ou 2 (2 mg/ml) avec un mélange de glutaraldéhyde 0,025M et de formaldéhyde 0,5M dans le tampon A pendant environ 18 h à 10+ PC. On porte immédiatement le mélange à 32± PC et on incube pendant environ 21 d à pH

7,5 + 0,2. On élimine l'excès de glutaraldéhyde et de formaldéhyde par dialyse à la fin de l'expérience.

Exemple VIII:

On incube un extrait d'allergène dialysé 1 ou 2 (2 mg/ml) avec du glutaraldéhyde 0,025M dans le tampon A pendant environ 18 h à 10± PC. On élimine l'excès de glutaraldéhyde par dialyse contre le tampon A. On ajoute une solution de formaldéhyde à la solution de l'allergène traité par le gultaraldéhyde afin d'obtenir une solution 0,5M en formaldéhyde. On incube ce mélange pendant environ 21 d à 32 + PC. On élimine l'excès de formaldéhyde par dialyse à la fin de l'expérience.

Exemple IX:

On incube des extraits d'allergène dialysé 1 ou 2 (2 mg/ml) avec une solution de glutaraldéhyde 0,025M à 10+ PC pendant environ 20 h et à 30 + PC pendant environ 24 h à pH 7,5+0,1 dans le tampon A. On élimine l'excès de glutaraldéhyde par dialyse contre le tampon A ou une solution saline physiologiquement tamponnée à la fin de l'expérience. On étudie d'autres concentrations en glutaraldéhyde (de 0,0005 à 0,1M), mais la concentration 0,025M donne le meilleur produit quant à la faible activité allergisante et à la rétention des propriétés immunisantes désirées.

Exemple X:

On dégraisse du pollen d'ambrosia courte, sec (Ambrosia elatior) par extraction à l'appareil Soxhlet avec de l'éther de pétrole. On poursuit le reflux jusqu'à ce que l'éluant ne soit plus coloré par le pollen. On sèche le pollen à l'air, on pèse et conserve dans des récipients scellés entre —5 et — 30°C. On ajoute au pollen 5 ml d'un tampon au bicarbonate d'ammonium 0,125M par gramme de pollen dégraissé, et on extrait le mélange avec agitation constante, entre 0 et 5°C, pendant 18 à 26 h. Après cette première extraction, on sépare l'extrait des grains de pollen par filtration et on extrait de nouveau le gâteau de pollen avec 4 ml de tampon/g de pollen (poids initial) pendant 2 à 4 h entre 0 et 5°C, puis on rince avec 1 ml de tampon/g de pollen. On réunit les trois extraits et on dialyse dans un tube de cellulose Visking N° 18, sans joint, contre 35 fois le volume de bicarbonate d'ammonium 0,002M pendant 30 à 40 h. On dialyse encore pendant 12 à 14 h contre l'eau distillée. On filtre l'extrait sur une série de filtres, en finissant par une filtration stérile sur un filtre de 0,45 ii. On lyophilise l'extrait stérile et on pèse. On incube cet extrait dialysé (10 mg de solides de pollen/ml) en utilisant du formaldéhyde 2M dans un tampon au phosphate de sodium 0,1M, à pH 7,2 à 7,6 pendant 12 à 18 d à 10±2°C. On dilue 4 fois la solution résultante dans le tampon au phosphate 0,1 M et on incube à pH 7,2 à 7,6 pendant 18 à 24 d à 32±2°C. On dialyse la solution obtenue dans un tube de Visking de 47 mm de diamètre contre 2 fois 35 volumes de NH4HC03 0,002M. On vérifie l'absence de formaldéhyde dans la solution, on concentre en utilisant un système Mil-lipore Pellicon Cassette, on filtre dans des conditions stériles et on lyophilise.

Dans chacun des exemples précédents, les incubations et dialyses sont conduites en utilisant un tampon de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,5+0,1 et toutes les solutions sont dialysées de façon poussée vers 4°C, avec plusieurs changements d'importants volumes de dia-lysat, afin d'éliminer l'aldéhyde n'ayant pas réagi, à la fin de chaque expérience. Les solutions sont conservées à l'état congelé ou, dans certains cas, les allergènes modifiés par un aldéhyde sont lyophilisés à partir des solutions aqueuses, un procédé qui permet d'obtenir des solides pratiquement exempts d'aldéhyde, ayant d'excellentes caractéristiques de conservation à long terme.

Exemple XI:

Allergène. On conserve à — 20° C dans un récipient étanche à l'air du pollen d'ambrosia courte (Ambrosia elatior) vendu par Greer Laboratories. Jusqu'à emploi, on dégraisse 150 g du pollen par 8 extractions successives avec des portions de 11 d'éther diéthylique,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

648 757

exempt de peroxyde, anhydre (J.T. Baker Co.) qui permet une élimination totale de toute la substance grasse colorée. On laisse le pollen sécher et on évapore les traces d'éther sous vide pendant une nuit. On extrait alors le pollen dégraissé à 4°C en agitant modérément pendant 18 h, avec 1,5 1 de NH4HC03 0,125M et on sépare le pollen du produit surnageant par centrifugation. On soumet l'extrait surnageant (1185 ml) à une dialyse poussée dans un tube de cellulose de Visking N° 18 (Union Carbide Corp.) contre 5 fois 721 de NH4HCO3 0,002M, puis contre 2 fois 72 1 d'eau distillée, pendant une période totale de 4 d à 4° C. On centrifuge l'extrait dialysé pour éliminer une faible quantité de précipité et on lyophilise (rendement: 14,104 g). Ce matériel — qui sera appelé allergène de pollen d'ambrosia, lot 11RWC — est conservé à — 20° C dans un récipient étanche à l'air, jusqu'à emploi.

Allergoïde. On soumet une portion de l'allergène lyophilisé à une modification par le formaldéhyde selon le procédé en deux stades. On dissout 13,603 g d'allergène de pollen d'ambrosia dans un tampon de phosphate 0,1 M, pH 7,50 (préparé en mélangeant des volumes appropriés de NaH2P04 0,1M et de Na2HP04 0,1M, qualité pour réactif de Baker pour obtenir un pH final de 7,50) (453,4 ml) afin d'obtenir une solution contenant 30 mg de solides de pollen par millilitre. On dialyse cette solution (dans un tube de Visking N° 18) contre le tampon au phosphate (11,21) pendant 24 h à 4 C. Après la dialyse, on ajuste le volume final de la solution d'allergène à 907 ml (15 mg de solides de pollen/ml avec le tampon au phosphate 0,1 M à pH 7,50).

On prépare à 4~ C le mélange réactionnel suivant: à 900 ml de la solution d'allergène, on ajoute lentement en agitant constamment 270 ml d'une solution de formaldéhyde 10M (préparée en diluant du formaldéhyde qualité pour réactif, Fisher Scientific Co., 37% poids/-poids, avec de l'eau désionisée) en évitant de fortes concentrations locales de formaldéhyde. On vérifie le pH de la solution et, pendant le mélange, on ajoute au total 6,5 ml de NaOH 2M (Baker Co.) pour maintenir le pH à 7,50 ±0,1. On ajuste le volume final du mélange réactionnel à 1350 ml en utilisant 170 ml de tampon au phosphate 0,2M à pH 7,50,1,1 ml de NaOH 2M et 2,5 ml de tampon au phosphate 0,1M à pH 7,50, afin d'obtenir une solution ayant la composition suivante: solides de pollen, 10 mg/ml; formaldéhyde 2,0M; phosphate environ 0,1M, à un pH de 7,50 mesuré à 10°C.

On incube la solution ci-dessus pendant 16 d à 10+0,5°C, à l'expiration desquels le pH est tombé à 7,41. Après cette première incubation, on dilue la solution 4 fois avec le phosphate 0,1 M à pH 7,50 et on incube à 32 ± 0,5° C pendant encore 16 d. Le pH initial pour cette seconde incubation est de 7,49 (mesuré à 32° C) et le pH final de 7,47 (à 32° C). On dialyse la solution d'allergoïde résultante successivement contre 4 fois 721 d'eau désionisée à 4° C pour éliminer le formaldéhyde et les sels de tampon. On sépare les traces de précipité par centrifugation et on lyophilise la solution résultante, ce qui sert non seulement à préparer un matériel sec stable, mais également à éliminer le plus possible toute trace résiduelle de formaldéhyde. Le rendement en allergoïde de pollen d'ambrosia, 11RWF est de 13,135 g (97,3% du rendement théorique). On conserve l'allergoïde à 20UC dans un récipient étanche à l'air, jusqu'à emploi.

Préparation de solutions pour l'immunothérapie

On prépare des solutions en termes d'unités d'allergène/ml ou d'unités d'allergoïde/ml, où l'unité d'allergoïde est 50 fois plus élevée que l'unité d'allergène exprimée en solides de pollen et en équivalents d'antigène E/ml (équiv. AgE/ml). Dans le cas de l'allergène,

cela se rapporte à la teneur en antigène E; dans le cas de l'allergoïde, il s'agit de la teneur en antigène E dans l'allergène dont il dérive (l'antigène E n'est pas mesurable directement dans l'allergoïde).

Selon l'expérience précédente, on prépare une solution de base d'allergène 11RWC (1000 unités/ml) qui contient 10 jtg d'équiv. AgE/ml (0,28 mg de solides de pollen non dialysable/ml). De la même façon, on prépare la solution de base de l'allergoïde 11RWF (1000 unités/ml) à 500 ng d'équiv. AgE/ml (14.1 mg d'allergoïde solide/ml). On filtre les solutions de base dans des conditions stériles sur une unité de filtration Nalgene, équipée d'une membrane ayant un diamètre de pores de 0,45 um (Nalge Sybron Corp., Rochester N.Y.) et on verse approximativement 10 ml de chaque solution dans des fioles stériles. On prépare ainsi un total de 30 fioles d'allergène et de 23 fioles d'allergoïde. Les deux séries de fioles sont numérotées dans l'ordre dans lequel elles sont préparées. On prépare ces fioles environ 3 semaines avant de commencer la thérapeutique et on les conserve à 4' C pendant toute l'étude.

On examine les stérilités des solutions d'allergène et d'allergoïde par incubation de parties aliquotes de 0,5 ml prélevées dans des fioles sélectionnées, avec le milieu de thioglycolate, conformément aux règlements de la FDA (Food & Drug Administration), paragraphe 610.12, Stérilité. On effectue les incubations à des températures de 25 et 32° C pendant des périodes de deux semaines. Dans le cas de la solution d'allergène, on prélève des parties aliquotes dans les fioles Nos 1, 11, 20 et 30. Dans le cas de la solution d'allergoïde, on prélève des parties aliquotes dans les fioles Nos 1, 11 et 23. On examine toutes les solutions de l'essai de stérilité visuellement pour vérifier une prolifération les 4e, 7e et 14e jours de la période d'incubation. Ces examens visuels sont négatifs quant à la présence d'une contamination bactérienne. A la fin du 14e jour d'incubation, on dépose chaque culture expérimentale sur des plaques de trypticase/soja/agar avec 5% de sang de mouton (Baltimore Biological Labs, Cockeys-ville, MD) et on'incube à 37° C pendant 24 h. Tous les essais sont négatifs quant à un type quelconque de prolifération. Toutes les parties aliquotes d'allergène et d'allergoïde autres que celles servant au test de stérilité sont conservées à 4° C jusqu'à emploi.

On effectue des tests de toxicité générale sur les solutions d'aller-gène et d'allergoïde en utilisant la méthode d'essai décrite dans le paragraphe 610.11, Sécurité, des règlements de la FDA. Ces tests sont effectués sur des souris et des cobayes sous la direction de Irving Levenstein, ph.D., Leberco laboratories, 123 Hawthorne Street,

Roselle Park, N.J. Par voie intrapéritonéale, on administre à chaque souris 0,5 ml, et à chaque cobaye 5 ml de la solution de base d'aller-gène ou d'allergoïde. Les résultats de ces essais ne mettent en évidence aucune toxicité dans le cas de l'allergène ou de l'allergoïde, ce qui résulte de la constatation de l'absence de perte de poids inhabituelle 7 d après l'injection des matériels.

Analyses immunochimiques

Des analyses des teneurs en allergènes d'ambrosia, en antigènes E, Ra3 et Ra5 dans l'allergène de pollen d'ambrosia, lot 11 RWC, sont effectuées par immunodiffusion radiale (Baer H., Maloney C.J., Norman P.S. et Marsh D.G. 1974, «J. Allergy Clin. Immunol.», 54, 157-164) en utilisant des antisérums spécifiques appropriés et des antigènes de référence. La référence de l'antigène E est un matérial NIH, purifié de nouveau par Chromatographie sur Sephadex G75 et les références pour l'antigène Ra3 proviennent du Dr Lawrence Goodfriend, McGill University, Montréal. On utilise également un autre antigène E de référence, obtenu auprès du Dr R.P. King, Rockfeiler University, New York. On prépare des antisérums dans le laboratoire du titulaire en immunisant des lapins ou des chèvres avec les antigènes respectifs.

On effectue également une immunoélectrophorèse croisée de l'allergène en présence d'un sérum antiallergène de lapin en utilisant une technique analogue à celle décrite par Weeke et Lowenstein (1973) dans «A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis» (éd. N.H. Axelsen, J. Kroll et B. Weeke), Universitestsforlaget,

Oslo, pp. 149-153.

Des déterminations normalisées des unités d'azote protéique (PNU) de l'allergène et de l'allergoïde sont effectuées selon les méthodes de routine approuvées par la FDA, par Mr. Bill White, jun. & ass. of Greer Laboratories, Lenoir N.C.

Patients

14 volontaires caucasiens, payés, allergiques à l'ambrosia (7 hommes, 7 femmes, âge moyen 33 ans, moyenne d'âge de 25 à 44 ans), ont été choisis pour une étude selon les critères suivants.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

648 757

8

Tous les patients souffraient de rhume des foins plusieurs fois pendant la saison de l'ambrosia, avec des rhumes des foins modérés chez trois des sujets et anodins chez trois autres sujets, provoqués par l'herbe courante. Les patients souffrant d'asthme ont été exclus de l'étude. Les patients qui présentaient de sévères symptômes pendant le mois de juillet ont été également exclus. Comme les premières études ont révélé que l'immunothérapie avec des extraits d'ambrosia influence une réponse immunologique ultérieure, on a exclu automatiquement de l'étude les patients qui avaient subi un traitement antérieur avec un extrait d'ambrosia. Enfin, on a jugé les patients comme de bons candidats d'étude selon leur emploi et leur stabilité émotionnelle.

On a apparié les patients en 7 paires selon leur libération d'hista-mine par les leucocytes avant traitement et leurs résultats aux tests de sensibilité cutanée aux allergènes et allergoïdes, et leurs taux d'IgE sérique total.

Conditions du traitement

Les patients ont été traités entre la fin de mai et le milieu d'août 1977. Le premier jour du traitement (jour 0), ils ont reçu des séries de 1 à 5 injections de quantités croissantes d'allergène et d'allergoïde pendant des périodes de 30 min à 2 h jusqu'à ce qu'une papule locale et des réactions d'érythème ou des symptômes systémiques indiquent que la dose est proche de ou correspond à la dose tolérée. Le médecin chargé de l'étude a noté les injections et les réactions locales et systémiques immédiates pour chaque patient. Le patient a lui-même 5 noté les réactions locales retard à l'endroit des injections et les symptômes systémiques (s'il y avait lieu). Tous les patients ont été examinés par un médecin pendant la période de 24 h après la série d'injections et tous les renseignements sur chaque forme ont été confirmés par entretien téléphonique avec chaque patient. Toutes les réactions io locales ont été notées selon leur intensité maximale qui apparaissait généralement environ 24 h après l'injection. (Les informations concernant la notation des réactions locales et systémiques sont données dans la note après le tableau V.)

Après la première série d'injections, on a mesuré l'anticorps 15 sérique de type IgG opposé à l'antigène E, à des intervalles de 4 à 14 d environ, et on a procédé à des séries d'injections ultérieures lorsque les réponses des anticorps atteignaient des plateaux successifs chez les patients. On a enregistré les réactions aux injections à chaque occasion, comme décrit ci-dessus. Six patients traités à l'al-20 lergène et six patients traités à l'allergoïde ont reçu le traitement complet, soit 4 à 5 séries d'injections entre la fin du mois de mai et le milieu du mois d'août 1977 (tableaux I et II).

Tableau I

Doses et nombres d'injections par série pour les patients traités à l'allergène

Paire

Patient

Unités d'allergène (entre parenthèses, nombre d'injections)

Totaux

N"

l"

2e

3e

4"

5e cumulés

1

E.E.

6(4) +

15(2)

10(1)

60(2)

50(1)

141(10)

2

L.L.

31(4)

170(3)

50(1)

350(3)

1200(3)

1801(14)

3

M.K.

31(4)

70(2)*

50(2)

50(1)*

30(1)

231(10)

4

G.J. -

6(3)

15(2)

10(1)

60(2)*

20(1)

111(9)

5

B.D.

4(5)

17(3)

70(2)

150(2)*

100(2)

341(14)

7

L.D.

36(4)

164(3)

200(1)

700(2)

500(1)

1601(11)

Moyenne

19(4,0)

75(2,5)

65(1,3)

228(2,0)

317(1,5)

704(11,3)#

Exclu

6

S.B.

31(4)

170(3)*

25(1)

—

—

226(8)

Paire

Patient

Unités d'allergoïde (entre parenthèses, nombre d'injections)

Totaux

N°

lre

2e

3e

4e

5e cumulés

1

E.F.

31(4)

170(3)

100(1)

200(2)

200(2)

701(12)

2

D.H.

16(4)*

2(1)

5(2)

16(3)

—

40(10)

3

G.D.

32(4)

70(2)

125(2)

310(2)

1200(3)

1737(13)

4

J.B.

31(4)

170(3)

70(2)

300(2)

1200(3)

1771(14)

5

J.K.

37(4)

70(2)

150(2)

300(2)

300(2)

857(12)

7

M.B.

32(3)

170(3)

300(2)

1200(3)

—

1702(11)

Moyenne

30(3,8)

109(2,3)

125(1,8)

388(2,3)

725(2,5)

1135(12)#

Exclu

6

P.J.

26(4)

5(1)

6(2)

5(1)

—

42(8)

* Réaction systémique.

+ Administration de 2 injections par jour, pendant 2 d consécutifs.

# Dose totale moyenne pour tous les patients, à l'exception de S.B., égale à 7,04 (ig équiv. AgE.

Tableau II

Doses et nombres d'injections par série.pour les patients traités à l'allergoïde

* Réaction systémique.

La 5e série d'injections n'a pas été administrée.

# La dose cumulée moyenne pour tous les patients, à l'exception de P.J., est égale à 567,35 |ig de AgE.

9

648 757

Essais du caractère allergisant relatif allergoïde/allergène

Les caractères allergisants relatifs de l'allergoïde par rapport à l'allergène ont été déterminés chez les sujets de l'étude par l'essai de libération de l'histamine par les leucocytes (Marsh D.G., Lichtenstein L.M. et Campbell D.H., 1970, «Immunology», 18, 705-722), et le titrage du point final dans le test intradermique quantitatif (Norman P.S. 1976, dans «Manual of Clinical Immunology» (éd. N.R. Rose et H. Friedman), American Soc. for Microbiol.; Washington, D.C., p. 585). Le rapport de sensibilité des leucocytes de chaque patient était exprimé comme le rapport des concentrations en allergoïde/allergène produisant une libération de 50% d'hista-mine par les leucocytes du patient. Ce rapport de sensibilité dans le test cutané était le rapport des concentrations en allergoïde/allergène produisant deux plus (+ +) (papules de diamètre de 8 à 10 mm avec érythème) comme point final du test cutané.

Dosages de l'IgE sérique totale

La mesure de l'IgE sérique totale dans un sérum avant traitement et trois sérums après traitement, pour tous les patients, a été faite par un procédé RIST direct (RIST=Test du radio-immunosor-bant) mis au point par Schellenberg et Adkinson (Schellenberg R.R. et Adkinson N.F., 1975, «J. ImmunoL», 115,1577-1583). La méthode était semblable à la méthode PRIST de Wide [Wude L. A971, dans «Radioimmunoassay Methods» (éd. K.E. Kirkham et W.M. Hunter) Livingstone, Edinburgh, p. 173], si ce n'est que, dans le premier stade du dosage, on a utilisé un anticorps anti-IgE spécifique (développé chez une chèvre) couplé à la Sepharose 4B plutôt qu'à des disques de papier. Après l'incubation du sérum du patient avec les perles d'immunoadsorbant de Sepharose, on a lavé les perles et incubé ultérieurement avec un anti-IgE de lapin radiomarqué (anticorps purifié spécifique de chaîne). On a de nouveau lavé les perles et compté dans un compteur gamma. On a comparé les comptages avec ceux obtenus lors de titrage en série utilisant un sérum témoin de teneur en IgE connue. On a effectué toutes les expériences ci-dessus en double avec des témoins positifs et négatifs appropriés, et trois sérums de référence internes de teneur en IgE connue. Chaque essai a été également répété au moins une fois, et toutes les valeurs contradictoires (différant de plus de + 10% l'une de l'autre) ont été de nouveau déterminées jusqu'à ce que les valeurs obtenues concordent à ± 10%.

Dosage de l'anticorps sérique de type IgG contre l'antigène E

On a mesuré l'anticorps de type immunoglobuline G contre l'antigène E en utilisant une méthode de dosage radio-immunologique des anticorps, double, très sensible, semblable à celle décrite par Black et al. (Black P.L., Marsh D.G., Jarrett E., Delespesse G.J. et Bias W.B., 1976, «Immunogenetics», 3, 349-368). On a marqué l'antigène E purifié avec I125 par le procédé à la chloramine T, puis on a ultracentrifugé pour éliminer les microagrégats et conservé à — 70° C en petites parties aliquotes jusqu'à emploi. On a incubé des doubles dilutions en série appropriées, d'un sérum de référence (provenant d'un sujet allergique qui avait été traité intensément avec un extrait d'ambrosia), les sérums des patients examinés et des témoins appropriés, avec une quantité constante d'antigène E marqué (environ 1,2 ng à une concentration de 6,2 ng/ml) pendant 5 h à 23° C. Afin d'augmenter la sensibilité de l'essai pour de faibles concentrations en anticorps, la fixation non spécifique de la radioactivité (en premier sur les tubes à essai en matière plastique) a été réduite en recouvrant au préalable les tubes à essai avec de l'albumine de sérum de bovin, 0,3% (poids/volume) et en diluant l'antigène marqué dans 5% d'albumine (poids/volume). On a dilué tous les échantillons de sérum dans le rapport 1:50 dans une solution saline tamponnée au borate (BBS) pH 8,0, et on a fait d'autres dilutions appropriées dans le BBS contenant 1:50 de sérum humain normal exempt d'anticorps contre l'antigène E. Des tubes témoins négatifs consistaient en une dilution 1:50 de ce sérum normal. Après l'incubation initiale, on a précipité l'IgG sérique (et les complexes antigène fixé/anticorps) en ajoutant un léger excès d'anti-IgG de chèvre (fragment anti-Fc) et on a incubé pendant une nuit à 4°C. On a lavé et compté les précipités, puis comparé les sérums expérimentaux avec la courbe du témoin de référence. Tous les résultats ont été exprimés arbitrairement en unités d'anticorps de type IgG/ml de sérum, par rapport à la courbe du sérum témoin. Dans des études antérieures (Platts-Mills T.A.E., von Maur R.K., Ishizaka K., Norman P.S. et Lichtenstrein L.M., 1976, «J. Clin. Invest.», 57, 1041-1050), on a montré que le sérum témoin non dilué fixe environ 24 jxg d'antigène E/ml dans un excès d'antigène. A partir de ces données, on a calculé qu'une de ces unités arbitraires devrait fixer 1,3 ng d'antigène E dans un excès d'antigène. En supposant que, dans ces conditions, l'antigène fixé existe sous la forme de complexes Ag2Ab, une unité a; 2,8 ng d'anticorps. Dans les concentrations limitées en antigène de l'essai, une moindre quantité d'antigène se fixe et la concentration efficace en anticorps peut être environ 3 fois moindre (Platts-Mills T.A.E., Snajdr M.J., Ishizaka K. et Frankland A.W., 1978, «J. ImmunoL», 120, 1201-1210).

On a analysé 14 à 16 échantillons de sérum de chacun des patients faisant l'objet de l'étude et plusieurs échantillons des deux patients exclus. Pour que les changements dans les titres d'anticorps IgG puissent être rapidement évalués afin de permettre un échelonnement approprié de la série d'injections, on a mesuré les réponses de ces anticorps dans les 3 d après le prélèvement des échantillons de sang. Tous les essais ont été faits en double dans chaque expérience et répétés dans l'expérience suivante. Les essais ont été répétés, si nécessaire, jusqu'à ce que les valeurs obtenues concordent à ± 10%.

Chimie du sang et analyses d'urine

Des mesures chimiques du sang et des analyses d'urine ont été faites avant l'immunothérapie et environ 1 et 14 semaines après la fin de la thérapeutique. Les caractéristiques chimiques d'un sang témoin SMA-11 ont été déterminées par le laboratoire clinique du Good Samaritan Hospital, au moyen de procédés analytiques automatiques. Les analyses d'urine classiques ont été faites dans le laboratoire d'allergie du titulaire.

Evaluation des symptômes

Les symptômes du rhume des foins pendant la saison de pollinisation de l'ambrosia ont été évalués par chaque patient deux fois par jour sur un enregistrement témoin. Les scores des symptômes journaliers moyens (Norman P.S. et Winkenwerder W.L., 1965, «J. Allergy», 36, 284-292) pour des groupes de patients souffrant du rhume des foins correspondaient aux comptages journaliers de pollen. En plus de ces évaluations personnelles, chaque patient était interviewé par un médecin soignant, deux fois pendant la saison de l'ambrosia.

Résultats

Le tableau III résume les analyses immunologiques de l'allergène et de l'allergoïde.

Tableau III Analyse immunochimique des antigènes

35,5 ng AgE/mg de solides lyophilisés Allergène de pollen 6,5 jxg Ra3/mg de solides lyophilisés d'Ambrosia, 11 RWC 6,0 ng Ra5/mg de solides lyophilisés

6390 PNU/mg de solides lyophilisés Allergoïde de pollen 35,5 ng équiv. AgE/mg de solides lyophilisés d'ambrosia, 11 RWF 6100 PNU/mg de solides lyophilisés

) différence

1 unité d'allergène — 0,01 (ig équiv. AgE =1,8 PNU ( , en f * 1 unité d'allergoïde = 0,5 ng équiv. AgE = 86 PNU ( °1S

Les analyses d'autres préparations semblables d'allergène d'ambrosia dialysé lyophilisé ont donné les compositions moyennes suivantes en antigènes: AgE (5 préparations) = 24,3 |J.g/mg (gamme: 11,3-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

648 757

10

41,1 (ig/mg); Ra3 (4préparations) = 7,1 ng/mg (gamme: 5,0-9,4 ng/mg); Ra5 (4 préparations) = 4,1 ng/mg (gamme 2,3-

6,1 ng/mg)-

Les teneurs en antigènes E, Ra3 et Ra5 dans l'allergène sont généralement plus élevées que les valeurs moyennes obtenues en analysant plusieurs lots différents d'allergène lyophilisé (voir note après le tableau III). Les valeurs de PNU pour l'allergène et l'allergoïde sont semblables, comme attendu. (Il faut noter que les extraits d'ambrosia non dialysés, contenant les mêmes quantités de solides de pollen non dialysables, donnent des valeurs de PNU environ 2 fois plus élevées, car la technique mesure une partie de l'azote dans le matériel de peptide dialysable.) Les antigènes d'ambrosia E, Ra3 et Ra5 ne sont pas mesurables dans l'allergoïde; les concentrations exprimées s en terme d'équiv. AgE/ml, etc., sont donc fondées sur les teneurs en antigène respectif de l'allergène d'ambrosia natif.

Le tableau IV rassemble les données relatives à la libération d'histamine, au test cutané et à la quantité totale d'IgE, pour les 7 paires de patients au début de l'étude.

Tableau IV

Sensibilités à l'allergène et à l'allergoïde, et IgE totale, avant le traitement

Traitement à l'allergène

Traitement à l'allergoïde

Paire N°

Sensibilité à l'allergène*

Sensibilité à

l'allergoïde*

Rapport goïde/ gène

IgE totale (U/ml)

Sensibilité à l'allergène*

Sensibilité à l'allergoïde*

Rapport goïde/ gène

IgE totale (U/ml)

1

HR

6,0 x IO"4

4,0 x IO"2

67

218

HR

non déterminé

196

ST

IO-5

3 x IO-3

300

ST

IO"5

3x IO-3

300

O

HR

6,8 x IO"5

6,0 x IO"3

88

QC

HR

4,0 x IO-5

9,0 x IO"4

23

710

z

ST

IO-4

IO-2

100

OO

ST

IO"6

3 x IO-4

300

o

HR

très faible libér ation

—

174

HR

24%**

23%**

-100

113

Ó

ST

IO"5

IO-2

1000

ST

IO-4

IO"1

1000

A

HR

5,4x10" 5

2,2 x IO-1

278

119

HR

1,0 x IO-3

1,8 x IO"1

180

85

4

ST

IO-5

IO-2

1000

ST

3x 10~5

IO"2

300

c

HR

2,3 x 10~4

2,2x IO-1

957

107

HR

1,1 x IO"4

1,5 x IO"2

136

120

J

ST

IO-5

IO"2

1000

ST

IO"5

IO"3

100

HR

l,2x IO-4

3,6 x IO"2

300

28

HR

1,0 x IO-4

7,0 x IO"2

700

45

0

ST

3 x IO-5

IO-3

30

ST

IO"4

IO"1

1000

*7

HR

pas de libérât ion

—

679

HR

37%**

pas de libération

—

15

/

ST

IO-3

-3x10°

-3000

ST

IO-5

IO"2

1000

Moyenne

HR*** 1,4x IO-4

5,3 x IO-2

216

135

HR*** 1,4 x IO"4

2,0 x IO"2

132

102

géométrique

ST

3 x IO-5

7 x IO-3

432

ST

2x IO-5

7 x IO-3

432

* Concentration (ng/ml) provoquant une libération de 50% d'histamine (HR) ou un test cutané + + (ST).

** Faible libération, pourcentage maximal de libération indiqué. Estimation des rapports si possible. *** A l'exclusion des patients dont les valeurs ne sont pas mesurables.

Tous les patients, à l'exception de la paire N° 6, ont subi le trai- 45 tement complet, et les comparaisons ultérieures se rapportent surtout aux douze individus qui ont subi le traitement complet. Il s'est révélé extrêmement difficile de juger les patients selon tous les critères, mais la moyenne géométrique de la libération d'histamine et des sensibilités lors des essais de sensibilités cutanés vis-à-vis de l'aller- 50 gène et de l'allergoïde ainsi que les taux sêriques d'IgE totaux ont pu être comparés de façon satisfaisante.

Les tableaux I et II résument les doses d'injection, en termes d'unités d'allergène et d'allergoïde, pour les groupes traités à l'aller-gène et à l'allergoïde. Les six patients traités à l'allergène ayant subi 55 le traitement total ont reçu 5 séries d'injections, avec de 1 à 5 injections pour chaque série. Dans le groupe traité à l'allergoïde, deux des patients n'ont reçu que 4 séries d'injections et les autres ont reçu les 5 séries. La dose cumulée moyenne pour les patients traités à l'allergoïde était de 567 ng équiv. AgE (1135,7 unités), qui est 80,6 fois 60 supérieure à la dose moyenne cumulée de 7,0 ng équiv. AgE (704 unités) pour le groupe traité à l'allergène. De façon générale, les doses pouvaient être augmentées substantiellement à chaque nouvelle série, le principal obstacle étant la présence de 5 réactions systémiques dans le groupe traité à l'allergène (comprenant un patient ss qu'on a dû exclure) et une dans le groupe traité à l'allergoïde; celles-ci sont indiquées par des astérisques dans les tableaux I et II, et sont notées selon la fréquence et la sévérité dans le tableau V.

Tableau V

Nombre des réactions locales et systémiques après les injections d'allergène (gène) ou d'allergoïde (goïde)

Paire N°

Locales (24 h)

Systémiques gène goïde gène goïde

1

9

17

0

0

2

20

19

0

2

3

16

15

2

0

4

17

4

2

0

5

3

14

1

0

7

1

4

0

0

Nombre total

66

73

5

2

Moyenne par patient

11,0

12,2

0,86

0,33

Moyenne par injection

2,2

2,6

0,17

0,07

Exclusion

6

0

8

1

0

11

648 757

Les réactions locales ont été notées comme suit:

1 + (1 point): gonflement jusqu'à 10 cm de diamètre;

2+ (2 points): gonflement de 10 à 20 cm de diamètre;

3+ (3 points): plus de 20 cm, mais ne dépassant pas le coude; 4 + (4 points) : gonflement atteignant le dessous du coude (ne s'est pas produit dans cette série).

Les réactions systémiques ont été notées comme suit:

1 + (1 point): tout symptôme systémique au-delà de la zone locale d'injection, mais ne nécessitant pas d'épinéphrine; 2+ (2 points): urticaire, rbume des foins ou asthme nécessitant de l'épinéphrine, la pression sanguine reste normale; 3 + (3 points): symptômes allergiques systémiques avec abaissement de la pression sanguine (ne s'est pas produit dans cette série);

4+ (4 points): franche anaphylaxie requérant des mesures d'urgence (ne s'est pas produit).

Les réactions systémiques se sont produites dans les 30 min suivant l'administration d'antigène et, si nécessaire, ont été rapidement supprimées par l'administration d'épinéphrine. Les principales autres réactions adverses consistaient en un gonflement localisé aux endroits de l'injection des doses d'antigène plus élevées. Ces réactions avaient lieu environ 6 h après les injections et atteignaient leur maximum environ 24 h après les injections. Les scores moyens pour ces réactions localisées étaient à peu près les mêmes chez les deux groupes de patients (tableau V).

Un examen des caractéristiques chimiques du sang (SMA-11) et des données analytiques des urines montre que le traitement avec l'allergoïde ou l'allergène n'a donné lieu à aucune réponse toxique contraire.

Comme il était nécessaire d'effectuer des expériences de dosage radio-immunologique des anticorps, en double, pour la mesure de l'anticorps sérique de type IgG contre l'antigène E, on a fait très attention à assurer une bonne reproductibilité d'une expérience à l'autre. La flg. 1 illustre le bon degré de reproductibilité obtenu pour les courbes de référence dans 14 des 15 essais effectués. La courbe de référence pour le dernier essai était en dehors des limites des autres essais et les données de cette expérience ont été rejetées. Etant donné que les mesures étaient effectuées pour de simples dilutions du sérum sur la plus grande partie de l'étude, il était essentiel de s'assurer que les pentes des courbes de fixation pour chaque patient ne puissent pas être distinguées de celles du témoin. En conséquence, on a pris un sérum de chaque patient choisi au hasard et on a établi les courbes de fixation; on a alors constaté que les courbes de fixation de chaque patient n'étaient pratiquement pas différentes de celles du témoin (fig. 2), fournissant la base essentielle pour l'utilisation par le titulaire d'une simple dilution dans la détermination des taux d'anticorps dans les autres sérums.

Les fig. 2 à 4 du dessin annexé montrent les réponses de l'anticorps de type IgG contre l'antigène E dans les 6 paires de patients qui ont subi le traitement de l'étude, et la fig. 6 concerne les deux exclusions. Après la première série d'injections au jour 0, les titres d'anticorps IgG se sont élevés de façon significative chez la plupart des patients et ont atteint des plateaux entre 2 et 3 semaines. Ayant établi que les plateaux ont en fait été atteints chez la plupart des patients, en mesurant les titres d'anticorps dans une série de 4 à 5 échantillons de sang successifs, on a procédé à une seconde série d'injections entre les 28e et 42e jours. Après 3 à 4 autres semaines environ, des plateaux secondaires semblaient être atteints chez la plupart des patients et une autre série d'injections était alors entreprise. Une autre série de 2 ou 3 injections était administrée avant la saison de l'ambrosia vers la mi-août. En raison du peu de temps avant la saison, il n'était pas possible d'attendre pour s'assurer que les plateaux avaient été obtenus chez tous les patients entre l'administration de ces dernières séries.

Les fig. 2 à 5 du dessin annexé montrent que les patients avaient des taux d'anticorps très différents avant le traitement (3-114 unités/ml). Après le traitement, les taux d'anticorps s'élevaient chez tous les patients, le groupe traité à l'allergoïde montrant une moyenne géométrique d'augmentation 5,7 fois plus élevée et un titre avec un pic 5,2 fois plus élevé que le groupe traité à l'allergène. A l'exception de la paire N° 2, tous les patients traités à l'allergoïde produisaient de plus grandes quantités d'anticorps — normalement de 5 à 20 fois plus — que leurs homologues traités à l'allergène. On a trouvé, ce qui est également très important, qu'après seulement deux séries d'immunisation les patients traités à l'allergoïde produisaient, en moyenne, 47% (gamme de 17 à 91%) des réponses maxi- . maies d'anticorps atteintes après le traitement complet de 4 ou 5 séries. Les données correspondantes pour les individus traités à l'allergène étaient une réponse maximale de 32% (gamme de 6 à 43%) après deux séries d'injections. La moyenne géométrique de l'augmentation après seulement deux séries de traitement était 7,9 fois plus grande dans le groupe traité à l'allergoïde que dans le groupe traité à l'allergène. De façon inattendue, on a trouvé que tous les patients, à l'exception d'un seul, conservaient leurs titres d'anticorps IgG à raison de 50 à 100% des niveaux de leurs pics, quelque trois mois et demi après la dernière injection, c'est-à-dire deux mois après la saison de l'ambrosia.

La fig. 6 du dessin annexé illustre la relation entre la dose cumulée d'antigène (exprimée en ng équiv. AgE) et l'augmentation globale en réponses d'anticorps IgG (pic des réponses moins le taux initial) pour les douze patients ayant subi le traitement complet. Il y avait une relation évidente entre la réponse d'anticorps et la dose, que le patient ait été traité à l'allergène ou à l'allergoïde. Etant donné que les droites de régression pour les deux groupes n'étaient pratiquement pas différentes, on a rassemblé les données pour les douze patients. Par une analyse de régression linéaire de log (titre d'anticorps) contre log de la dose, on a obtenu le coefficient de corrélation, r=0,83; p< 0,001. Les données correspondantes pour la réponse d'anticorps en fonction de la dose cumulée après seulement deux séries d'injections ont montré une corrélation similaire (r=0,81 ; p<0,001).

Les scores moyens des symptômes jour par jour dans les deux groupes de patients pendant la saison 1977 du pollen d'ambrosia (fig. 7 du dessin annexé) montrent une tendance vers une Symptomatologie globale plus faible pendant toute la saison. Cette conclusion est due à une analyse des scores journaliers moyens pour chaque patient, dont on a établi la moyenne pour toute la saison de l'ambrosia (fig. 8A). Le score moyen pour le groupe traité à l'allergoïde était de 1,1 unité de symptôme inférieur au groupe traité à l'allergène. Ces résultats n'étaient pas statistiquement différents avec ces quelques patients. Des études antérieures (Norma P.S., Winkenwerder W.L. et Lichtenstein L.M., 1971, «J. Allergy», 47, 273) ont montré que les scores des symptômes journaliers moyens pour toute la saison de l'ambrosia, pour des patients de même sensibilité traités par un placebo, se trouvent normalement dans la gamme de 7 à 10 unités, avec des pics de score journalier moyen de 12 à 14 unités. En conséquence, la plupart des patients traités semblent mieux se comporter que ce qu'on aurait pu attendre d'un groupe placebo comparable. Les scores des patients traités sont semblables à ceux trouvés chez des patients (également préalablement non traités) qui ont subi un traitement classique de 16 à 24 injections d'antigène par semaine, dans une étude de 1973 comparant le traitement à l'allergène et le traitement à l'allergoïde (fig. 8B). Les évaluations des patients par le médecin pendant la saison de l'ambrosia concordaient avec les scores des symptômes évalués personnellement ci-dessus.

Discussion

La présente étude représente le premier essai systématique pour définir le traitement optimal, en termes de doses d'antigène et d'espacement des injections, pour l'immunothérapie de patients allergiques. A cette fin, le titulaire a utilisé un régime de choc intensif, constitué de 1 à 5 injections par jour. Cette posologie permet au médecin d'administrer au patient une dose tolérée optimale. Dans la plupart des cas, ces doses sont de 100 à 10000 fois supérieures à

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

648757

12

celles normalement administrées le premier jour du traitement d'un patient. Dans le cas de l'allergoïde, la dose de traitement, élevée le premier jour des injections, résulte en une augmentation substantielle (10 à 100 fois) des anticorps IgG contre l'antigène E, quelque 2 à 3 semaines plus tard. Une seconde série d'injections à des doses plus élevées peut alors être administrée et résulte en une réponse d'anticorps qui est en moyenne environ la moitié de celle obtenue ultérieurement après deux ou trois autres séries d'injections avec des doses élevées d'allergoïde.

D'après les études sur les anticorps, il semblerait qu'un espacement des injections de 2 à 4 semaines soit optimal, car entre-temps le patient a atteint les réponses maximales à l'immunisation. Cependant, il est possible qu'un intervalle un peu plus long, permettant un recrutement supplémentaire de cellules produisant des anticorps de type IgG, puisse se montrer un peu plus efficace, à condition que les taux d'anticorps ne puissent pas diminuer trop drastiquement.

Malgré les régimes à hautes doses (en particulier avec l'allergoïde), on n'a noté aucune réponse toxique contraire chez aucun des patients traités.

Ces études mettent en évidence les avantages de l'allergoïde par rapport à l'allergène, en ce que de très hautes doses d'allergoïde peuvent être administrées au patient avec un risque relativement faible de réactions systémiques, et résultant en même temps en des s taux élevés d'anticorps de type IgG. Dans cette étude, la seule exception à cette règle était le patient H.D. dans la paire N° 2 traitée à l'allergoïde. Cet individu a montré une sensibilité à l'allergoïde supérieure à la moyenne et, rétrospectivement, il semble que la série initiale du traitement ait été trop forte dans ce cas. L'incidence des io réactions systémiques dans le groupe traité à l'allergène était en moyenne de 0,7 par patient, avec un score de réaction moyen de 0,8 par patient (y compris le patient exclu). Cela est trop élevé pour recommander une telle posologie intensive pour un traitement de choc avec l'allergène.

15 Cette étude, effectuée sur deux petits groupes de patients traités avec l'allergène et avec l'allergoïde, incite le titulaire à entreprendre une autre étude avec des groupes de patients plus importants pour comparer le régime de traitement classique pour l'allergène avec le régime choc modifié pour l'allergoïde.

R

7 feuilles dessins

Claims (8)

1. 648 757

   2

   REVENDICATIONS

   1. Procédé de production d'un allergène traité par un aldéhyde, ayant une faible réactivité allergisante chez les humains allergiques et qui conserve les propriétés immunisantes désirées de l'allergène natif conduisant à une amélioration de la Symptomatologie des individus allergiques et à la production concomitante d'anticorps bloquants considérés associés à, mais non nécessairement uniquement responsables de cette diminution des symptômes, et qui est capable d'induire chez les mammifères la formation d'anticorps bloquants contre l'allergène natif en une concentration suffisante, procédé caractérisé en ce qu'on soumet les allergènes débarrassés de pratiquement tout matériel non allergisant à bas poids moléculaire à une réaction chimique, dans des conditions douces, avec une solution de formaldéhyde, d'aldéhyde aliphatique inférieur saturé bifonctionnel ou de leurs mélanges, en au moins deux étapes, à condition que toute réaction avec le formaldéhyde soit conduite dans un milieu non phénolique, les conditions douces comprenant l'exécution d'une étape à une température juste supérieure au point de congélation de la solution et allant jusqu'à 15'C, et l'exécution de toute étape subséquente à une température comprise entre 25 et 40° C avec toute combinaison de formaldéhyde ou/et de dialdéhyde, pour former un produit présentant une réticulation intermoléculaire ou intra-moléculaire provoquée par l'aldéhyde, et une modification des groupes allergisants telle que les propriétés allergisantes se trouvent réduites, tout en conservant les propriétés immunisantes.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à toutes les étapes, l'aldéhyde est le formaldéhyde.
3. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à toutes les étapes, l'aldéhyde est un dialdéhyde répondant à la formule

   O O

   I! Il HC-fCH^CH

   dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 6.
4. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à toutes les étapes, l'aldéhyde est le glutaraldéhyde.
5. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'aldéhyde est une combinaison de formaldéhyde et de dialdéhydes utilisés sous forme de mélange à chaque étape ou comme aldéhydes individuels dans des étapes successives.
6. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les allergènes réagissent avec l'aldéhyde (ou les aldéhydes) en deux étapes.
7. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, avec la solution de l'aldéhyde, est présent au moins un additif choisi parmi le 1,4-diaminobutane, la lysine, l'ornithine, l'acide 1,5-diamino-pimélique, l'arginine, l'adipamide, l'acide aspartique, la sérine et l'alanine.
8. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait réagir l'allergène purifié, dans une première étape, avec une solution contenant du formaldéhyde à une concentration comprise entre 0,36 et 0,5M et un aldéhyde bifonctionnel aliphatique inférieur saturé à une concentration comprise entre 0,01 et 0,1M à la température indiquée, et dans au moins une étape subséquente avec une solution contenant du formaldéhyde à raison de 0,36 à 0,5M et l'autre aldéhyde bifonctionnel mentionné à raison de 0,01 à 0,1 M, à une température comprise entre 25 et 40° C.

   Les patients qui souffrent d'allergies du type immédiat (atopies) sont capables de produire des types spéciaux d'anticorps (réagines) lorsqu'ils sont exposés à certaines substances (allergènes) auxquelles ils sont sensibles. Les réagines se fixent solidement sur certaines cellules contenant de l'histamine, comprenant les mastocytes de l'épi-

   thélium. Après une exposition ultérieure au matériel allergisant sensibilisant, il se produit une combinaison physique entre le(s) allergè-ne(s)et ses (leurs) réagines homologues fixées sur les cellules, ce qui a pour résultat des manifestations allergiques sur les sites de la combinaison réagine/allergène. Les individus allergiques sont également capables de produire des anticorps dits bloquants d'un type opposé aux réagines, qui sont capables de se combiner avec les allergènes et de les rendre inactifs, généralement sans réactions secondaires indésirables. L'activité réaginique a été attribuée à l'immunoglobuline E (IgE) et l'activité bloquante à l'IgG dans le sérum et à l'IgA et l'IgC dans les sécrétions.

   La pratique clinique a depuis longtemps consisté à injecter à un patient allergique des doses croissantes d'extraits aqueux contenant le matériel allergisant auquel le patient est sensible. Historiquement, le principe de ce traitement était d'abord d'augmenter la concentration en anticorps bloquants protecteurs dans le sérum (et d'autres fluides corporels) à un taux où ces anticorps pourraient efficacement rivaliser avec la réagine fixée sur les cellules vis-à-vis de l'allergène qui pénètre dans le corps, et empêcher ainsi les réactions allergiques. On sait maintenant que le(les) mécanisme(s) grâce auquel (auxquels) l'immunothérapie conduit à une amélioration des symptômes allergiques est(sont) plus complexe(s). Dans certains cas, cette thérapie s'est montrée également capable de supprimer la production de réagines et de diminuer la réponse cellulaire envers les allergènes injectés.

   Quel que soit le mécanisme (ou les mécanismes) grâce auquel (auxquels) l'immunothérapie résulte en un soulagement symptomati-que, plusieurs études ont montré qu'il est essentiel d'injecter une quantité relativement importante d'extrait au patient, afin de rendre le traitement efficace. Malheureusement, dans un traitement classique, les doses immunisantes de l'extrait allergisant doivent être augmentées graduellement pour minimiser le risque d'une réponse allergique générale (anaphylactique) du patient.

   Les principaux inconvénients de cette immunothérapie sont: 1) une période de traitement longue de plusieurs semaines pour les injections répétées; 2) une efficacité du traitement rarement totale quant au soulagement du syndrome allergique, et 3) un risque toujours présent d'une réaction anaphylactique générale à chaque stade du traitement.

   On a donc modifié la thérapie originale dans le but de remédier à ces inconvénients. Des formes de traitement plus récentes comprennent l'immunisation du patient avec une émulsion eau-dans-huile de l'extrait allergisant ou l'incorporation d'un adjuvant à libération lente, tel qu'un gel d'alumine ou un alginate avec un extrait du matériel allergisant. Mais ces procédés n'ont pas donné entière satisfaction en raison de la présence de quelques réactions anaphylactiques et de quelques réactions toxiques chez le patient, ou du manque d'efficacité clinique de ces préparations.

   Plusieurs chercheurs ont essayé de traiter les matériels allergisants par voie chimique ou physique de façon à réduire substantiellement leurs propriétés allergisantes, tout en conservant leur capacité à protéger un individu allergique contre un allergène natif. On espérait qu'une immunothérapie des individus allergiques utilisant des allergènes modifiés permettrait de conserver les propriétés immunisantes désirées de l'allergène natif, comprenant son aptitude à induire la formation d'anticorps bloquants contre l'allergène natif, en quantités substantielles. De plus, le caractère allergisant réduit de ces matériels modifiés permettrait l'emploi de doses croissantes de matériel immunisant, et, par conséquent, augmenterait considérablement la quantité d'anticorps bloquants protecteurs produits.

   On a également trouvé que, en utilisant une solution de formaldéhyde, avec ou sans certains additifs à faible poids moléculaire, la grande majorité des substances contenant des allergènes peut être modifiée de façon à remédier aux inconvénients des allergènes eu égard à leur utilisation en immunothérapie. (Par la suite, toute substance contenant un allergène sera dénommée allergène dans un but de simplification, bien qu'on sache que tous les constituants d'une substance contenant un allergène ne sont pas nécessairement des allergisants.)

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   3

   648 757

   Conformément au brevet britannique N° 1282163, des matériels de pollen modifiés par le dialdéhyde, insolubles dans l'eau ou peu solubles dans l'eau, qui sont potentiellement utilisables dans le traitement des patients allergiques, ont pu être préparés. Conformément à Patterson et al. («J. Immunol.», 110,1402,1973), on a préparé des polymères d'ambrosia modifiés par le glutaraldéhyde, solubles dans l'eau. Une étude ultérieure de l'antigène E de l'ambrosia modifiée par le glutaraldéhyde [Metzger et al., «New Eng. J. Med.», 295, 1160 (1976)] suggère que ce matériel peut être utilisé dans la thérapie des sujets allergiques à l'ambrosia.

   Le titulaire a maintenant trouvé qu'on peut obtenir des matériels contenant des allergènes traités par le formaldéhyde ou par un dialdéhyde aliphatique saturé inférieur, par réaction, dans un premier stade à basse température, normalement aux environs de 10°C, avec le formaldéhyde et/ou un dialdéhyde, suivi de préférence, mais pas nécessairement, d'un second stade à température élevée, normalement vers 32e C, suivi, si nécessaire, d'autres stades à température élevée similaire, où des aminés, des acides aminés et des composés apparentés peuvent être éventuellement utilisés dans un stade quelconque ou dans une combinaison de plusieurs stades, et où le formaldéhyde ou l'un des dialdéhydes peuvent être utilisés dans une combinaison ou une suite quelconque dans le procédé par degrés. En ce qui concerne les nouveaux allergènes traités par un aldéhyde, le terme modifié par un aldéhyde s'applique uniquement aux allergènes modifiés dans lesquels des rêticulations inter- ou intramoléculaires ont été établies entre ou dans les molécules d'allergène elles-mêmes et entre l'allergène et d'autres molécules réactives présentes dans le mélange réactionnel.

   Le brevet US N° 3135662 et l'article correspondant dans «Brit. J. Exp. Path.», 44, ìli (1963) décrivent la transformation de la toxine de la diphtérie purifiée en toxoïde, au moyen de la formaline dans le bicarbonate de sodium (0,5% poids/volume) à pH 7,5. La transformation en toxoïde a lieu à la température ambiante et semble complète en 3 à 4 semaines, comme cela est vérifié par des tests intracutanés chez des cobayes. Les tests de non-toxicité (200 unités Lf dans un volume de 5,0 ml injecté par voie sous-cutanée chez des cobayes) montre une paralysie retardée chez tous les cobayes. Une incubation à 30-32°C pendant trois autres semaines, après que la transformation en toxoïde a semblé complète à la température ambiante, donne un produit qui, après élimination de la formaline libre par ultrafiltration, ne montre plus aucune toxicité; mais l'état toxique réapparaît après un stockage. Conformément à ces enseignements, la tendance à la réversion ou à l'inversion est empêchée par l'addition de divers aminés et acides aminés.