NO792968L - Fremgangsmaate til fremstilling av aldehydbehandlede allergenholdige stoffer - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av aldehydbehandlede allergenholdige stoffer.

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av aldehydbehandlede allergenholdige stoffer.

Pasienter som lider av allergier av umiddelbar type (atopier) har evnen til å frembringe visse typer allergiske antilegemer (reaginer) når de blir eksponert for visse stoffer (allergener) som de er fblsomme overfor..Reaginene blir sterkt knyttet til visse histamin-inneholdende celler, deriblant mastceller i epitelium. Etterfølgende eksponering til det allergene materiale pasienten er folsom overfor, frem-bringer en fysisk kombinasjon mellom allergenene og deres homo-loge celle-tilknyttede reaginer, noe som forer til allergiske manifestasjoner på området for reagin-allergen-kombinasjonen. Allergiske individer er også istand til å frembringe såkalte "blokkerende antilegemer" av en ikke-reagintype som er istand til å kombineres med allergenet og.gjore dette inaktivt, vanligvis uten uonskede sidereaksjoner. Reaginaktivitet er til-skrevet immunoglobulin E (igE) og "blokkerings"-akti<y>iteten til IgG i serum og IgA og IgG i sekreter.

Det har lenge vært klinisk praksis å injisere allergiske pasienter med gradvis okende doser av vandige ekstrakter som inneholder det allergene materialet som pasienten er folsom overfor. Historisk har basis for denne behandling primært vært å bygge opp konsentrasjonen av beskyttende blokkerende antilegemer i serumet (og andre kroppsvæsker) til et nivå hvor disse effektivt vil konkurrere med celle-tilknyttet reagin for allergen som trenger inn i legemet, noe som hemmer de allergiske reaksjoner. Man antar nå at mekanismene hvorigjen-nom immunoterapi forer til forbedring av de allergiske symp tomer er komplekse. I visse tilfeller, har denne terapien også vist seg å undertrykke produksjonen av reaginer og å redusere cellenes mottagelighet. overfor innsproytede allergener.

Uansatt hva de presise mekanismer måtte være hvor-igjennom immunoterapi forer til symptombedring, har visse studier vist at,det er vesentlig å innsproyte en tilstrekkelig stor dose av ekstrakt for at behandlingen skal være effektiv. Uheldigvis må de immuniserende doser av allergent ekstrakt bkes meget gradvis i vanlig behandling for å redusere risikoen for en generell allergisk (anafylaktisk) reaksjon hos pasienten.

Hovedulempene ved denne.immunoterapien er: (1) gejn-tatt injeksjoner kreves over mange uker, (2) behandlingen er sjelden fullstendig effektiv når det gjelder å mildne det allergiske syndrom og (3) risikoen for generell anafylaktisk reaksjon er alltid tilstede i hvert trinn av behandlingen.

. Den opprinnelige "terapi er derfor blitt modifisert

for å overvinne disse.ulemper. Nyere former for behandling omfatter immunisering av pasienten med enten en vann-i-olje-emulsjon av allergent ekstrakt eller ved å tilsette et langsomt utl<y>sende tilsatsstoff såsom en aluminiumoksydgel eller et alginat med et ekstrakt av det allergene materialet. Slike metoder har ikke vist seg å være fullstendig tilfredsstillende på grunn av tilstedeværelsen av visse anafylaktiske og noen giftige reaksjoner hos pasienten eller på grunn av svikt i disse preparatene når det gjelder å være tilstrekkelig effektivt klinisk.

Flere arbeidere har behandlet allergene materialer kjemisk eller fysisk i forsok på å redusere deres allergene egenskaper, samtidig som deres evne til å beskytte allergiske individer mot det opprinnelige allergen beholdes. Immunoterapi av allergiske individuer hvor slike modifiserte allergener benyttes, var håpet å skulle beholde de onskede immuniserende egenskaper hos det opprinnelige allergen, deriblant dets evne til å frembringe dannelsen av blokkerende antilegemer mot det opprinnelige allergen i vesentlige mengder. Videre tillater den. reduserte allergene virkning i slike modifiserte materialer bruken av okede doser immuniserende materialer, noe som i hby grad oker mengden beskyttende blokkerende antilegemer som frembringes...

Det ble også påvist at anvendelse av formaldehydopplosning med eller uten visse tilsatsstoffer med lav molekylvekt, vil fore til at de fleste av de stoffer som inneholder allergen kan modifiseres slik at de nevnte ulemper i de opprinnelige allergener med hensyn til bruk i immunoterapi kan overvinnes. (Heretter vil et hvilket som helst stoff som inneholder allergen benevnes som et allergen, selv om det er underforstått at ikke alle komponenter i et stoff.som inneholder allergen nodvendigvis er allergent.)

Ifolge britisk patent nr. 1.282.163, er der blitt fremstilt vannopploselig eller svakt, vannopploselige dialde-hydmodifiserte pollmaterialer som potensielt er nyttige for å behandle allergiske pasienter. Ifolge Pattersen et al.

(J. Immunol. 110, 1402, 1973) er det blitt fremstilt vannopploselige glutaraldehydmodifiserte ambrosiapolymere. En etter-følgende studie av glutaraldehydmodifiserte ambrosia-antigen E .

(Metzger et al., New Eng. J. Med., 295, 1160, 1976) antyder

at dette materialet kan være nyttig i terapi av ambrosia-, allergiske pasienter.

Patentsokerne har nå oppdaget at forbedrede formaldehyd- og lavere mettede alifatisk dialdehyd-behandlede materialer som inneholder allergen kan tilveiebringes ved en reaksjon i et forste trinn ved lav temperatur, vanligvis rundt 10°C, med formaldehyd og/eller dialdehyd, fortrinnsvis, men ikke nodvendigvis, fulgt av et annet trinn under oppvarming vanligvis til ca. 32°C, fulgt av, om dette er nbdvendig, ytterligere trinn under tilsvarende oppvarming, hvor aminer, aminosyrer og tilsvarende forbindelser eventuelt kan benyttes i én eller flere kombinasjoner av trinn, og hvor formaldehyd eller et hvilket som helst av de nevnte dialdehyder kan benyttes i en hvilken som helst kombinasjon eller rekkefolge i den trinnvise prosess. Når man beskriver de nye aldehydbehandlede allergener, vil uttrykket "aldehydmodifisert" begrense seg til å beskrive modifiserte allergener hvor inter-eller intra-molekylære kryssforbindelser er etablert mellom eller i allergenmolekylene selv og mellom allergen og andre reaktive molekyler som er tilstede i reaksjonsblandingen.

U.S. patent nr. 3.135.662 og tilhorende artikkel i J. Brit. Exp. Path., 44, 177 (1963) beskriver toksoidering av renset difteritoksin med formalin i natriumbikarbonat (0,5 vekt-%) ved pH 7,5. Toksoideringen startes ved værelsetem-peratur og synes å være avsluttet i lopet av 3 - 4 uker etter bedommelse ved intrakutane prover i marsvin. Prover med hensyn på ikke-giftighet (200 Lf enheter i et volum på 5,0 ml innsproytet subkutant i marsvin) viste sen paralyse i alle marsvinene. Inkubering ved 30 - 32°C i ytterligere 3 uker etter at toksoidering synes å være avsluttet ved værelses-temperatur ga et produkt som etter at fri formalin var fjernet ved ultrafiltrering, ikke viste noen giftighet,men som etter lagring vendte■tilbake til giftig tilstand. Ifolge disse beskrivelsene, kunne tendensen til reversering hindres ved tilsats av forskjellige aminer og aminosyrer. Oppsummering av oppfinnelsen

I korthet beskriver foreliggende oppfinnelse nye formaldehyd og lavere mettede alifatiske dialdehyd-behandlede allergenderivater fremstilt ved å 3a allergener omsettes kjemisk under milde betingelser med fortynnede aldehyder inn-befattet kombinasjoner av disse i en rekke trinn, og fortrinnsvis foregår det forste trinn ved en lav temperatur over frysepunktet for opplbsningen ogyanligvis fra ca. 5 - 15°C, og etterfølgende trinn ved temperaturer på fra 25 - 40°C, under forbehold av at alle reaksjoner som omfatter formaldehyd utfores i ikke-fenolisk miljo. Reaksjonen, med kombinasjoner (blandinger) åv aldehyder kan utfores i et enkelt trinn.

Allergene som behandles kan være meget renset, delvis renset eller råekstrakter. De nevnte dialdehyder har formelen

hvor n er fra 1-6. Uttrykket "aldehyd" slik som det. er benyttet her vil beskrive det forannevnte formaldehyd og lavere mettede alifatiske dialdehyder såsom glutaraldehyd (n = 3),

hvor et hvilket som helst kan benyttes alene eller i en hvilken som helst kombinasjon med andre under den trinnvise

. prosess.

Uttrykket "ikke-fenolisk" betyr at hbyst spor-mengder tilsatte fenolforbindelser er tilstede i miljoet for aldehydreaksjonen. Sistnevnte uttrykk forhindrer imidlertid ikke nærvær av fenoliske hydroksygrupper som allergene per se i de fleste tilfeller er kjent for naturlig å inneholde, som del av den komplekse proteinstruktur.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen forer til fremstilling av aldehydbehandlede allergener med lav allergenisk reaktivitet i allergiske mennesker, men som beholder de bnskede immuniserende egenskaper av det opprinnelige (ubehandlede) allergener, deriblant, men ikke begrenset til det, evnen til å frembringe vesentlige mengder blokkerende antilegemer, sterkt kryssreaktivt med opprinnelige.allergener når de injiseres i mennesker. Forlenget terapi med slike aldehydbehandlede allergener har vist seg å resultere i en vesentlig undertrykkelse av serum IgE-antilegemer mot de respektive allergener. Store, terapeutisk effektive doser av slike aldehydbehandlede allergener kan tilfores allergiske pasienter med vesentlig redusert risiko for systemiske allergiske reaksjoner sammenlignet med tilsvarende store doser opprinnelige allergener, noe som tillater den behandlende lege å redusere antall injeksjoner av aldehydbehandlede allergener i forhold til.det som er nodvendig med opprinnelige allergener. Aldehydbehandlede allergener er også nyttige for immunisering av andre pattedyr med det formål å frembringe blokkerende antilegemer.

Selv om man ikke er bundet til en bestemt teori, antar patentansokerne at en vesentlig grunn til at de foreliggende aldehydmodifiserte allergener er overlegne i forhold til de som tidligere er beskrevet, ligger i anvendelsen av den lave .reaksjonstemperatur i det forste trinn. Ved denne lave temperatur, finner inter- og intra-molekylær kryssforbindelse sted langsomt uten negativ termisk eller kjemisk denaturering av kritisk labile immuno-dterminanter i allergenene, hvor slike negative reaksjoner motvirker behovet for å bevare onskede immuniserende egenskaper i det aldehydmodifiserte allergen.

De resulterende kryssforbindelser stabiliserer molekylet for etterfølgende reaksjoner ved hoyere temperatur, som kan utfores i ett eller flere trinn under anvendelse av det samme eller forskjellig mono- eller dialdehyd. Videre skaper den optimale anvendelse av mer enn ett dialdehyd storre fleksi-bilitet i reaksjonsrekkefb'lgen slik at aldehydmodifiserte allergener kan gjores mindre allergene ved hjelp av reaksjon med en rekke forskjellige aldehyder.

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye og forbedrede klasser av■aldehydmodifi-serte allergener.

Det er også et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe nye fremgangsmåter for fremstilling av nevnte aldehydmodifiserte allergener.

Disse og andre formål og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende, detaljerte beskrivelse..

Beskrivelse av foretrukne utfpreiser

Selv om man ikke er bundet til en bestemt teori, under reaksjpnsbetingelsene ifolge oppfinnelsen, antar man,at de viktigste kryssforbindelsesreaksjoner som omfatter formaldehyd finner sted ved etablering av inter- og intra-molekylære metylenbroer mellom amino på den ene side og guanidino, syreamid og visse aromatiske grupper (spesielt tyrosylrester i proteiner) på den annen side. Selv om man igjen ikke er bundet av noen spesiell teori, antar man også at de viktigste inter- og intra-molekylære kryssforbindelsesreaksjoner som omfatter dialdehyder finner sted mellom par av aminogrupper. Kjemien av de to typer kryssforbindelse er derfor noe forskjellig, og kinetikken i dialdehyd-kryssforbindelsesprosessen er vesentlig raskere enn den som omfatter formaldehyd. Man skal videre bemerke at når et passende tilsatsstoff som er beskrevet er tilstede i reaksjonesblandingen, kan omfattende inter-molekylære kryssforbindelser finne sted mellom allergen-molekyler og tilsatsstoffet.

Når urensede allergener benyttes, bor fettstoffer og ikke-allergene materialer med lav molekylvekt i de opprinnelige stoffer fortrinnsvis, men ikke nodvendigvis, i hovedtrekkene være fjernet for aldehydbehandlingen.

Urensede allergenpreparater som spesielt er passende for aldehydbehandling kan fremstilles ved avfetting av det

opprinnelige materiale som inneholder allergen med vannfri, peroksydfri dietyleter eller petroleter og ekstrahering av . de avfettede materialer med en vandig opplbsning, fortrinnsvis bufret til ca. pH 6 - 8 (f.eks. 0,125M Nf^HCO^).. Ikke-allergene stoffer med lav molekylvekt som normalt er tilstede, kan deretter fjernes fra ekstraktet ved dialyse eller ultrafiltrering gjennom et semipermeabelt membran (f.eks. "Visking"-rbr, "Millipore"-membran, "Amicon" hulfiberinnretning med en passende molekylvektsavskjæring, vanligvis i området 3.000 -

10.000 dalton og fortrinnsvis 3.000 - 5.000 dalton), selv om gelfiltrering eller tilsvarende fremgangsmåte som i og for

seg er kjent, kan benyttes for å tilveiebringe et tilsvarende

resultat; eventuelt kan materialer med hby molekylvekt ut-' felles uten vesentlig irreverserbar denatureri.ng fra hele ekstraktet ved en prosess med salt eller opplbsningsutf elling,:. og disse materialer med hby molekylvekt kan rekonstitueres fra de.utfelte materialer i form av en vandig opplbsning.

Rensede eller delvis rensede allergene stoffer kan fremstilles ved en hvilken som helst av de fremgangsmåter som vanligvis benyttes for rensing av makromolekyler fra komplekse blandinger. Passende renseprosesser er blitt beskrevet i litteraturen for fiskeallergener, ambrosiapollen, rug og

timoteigresspollen, sopp, husstbv, midd- og insektgift, selv om disse ikke er de eneste fremgangsmåter eller de eneste allergene materialer som kan benyttes i aldehydbehandlings-prosessen.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til et gitt spesielt materiale som inneholder allergen eller ekstrakt. Plantepollenmaterialer som inneholder allergen og spesielt slike materialer av gress, tre og ugress er imidlertid viktige i allergi og kan ekstraheres og behandles med hell med aldehyder ifolge oppfinnelsen. Eksempler på pollen fra gress-familien (Gramineae) som er nyttige ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse omfatter engsvingel (Festuca elatior), Ken-tucky blått gress (Poa pratensis) og hundegress (Dactylis

glomerata) av arten Festuceae; vanlig rye-gress (Lolium perenne) og italinsk rye-gress (Lolium multiflprum) av arten

Hordeae; timotei (Phleum prtense) og krypkvein (Agrostis palustris) av arten Agrostideae; og gulaks (Anthoxanthum odo-ratum) av arten Phalarideae. Sammenlignbare eksempler av tre-pollen omfatter forskjellige arter valnott, såsom Juglans californica, av bjerk (f.eks. Betula alba), av ek (f.eks.

Quercus alba), og av alm (f.eks. Ulmus. parvifolia). Nyttige ugresspollen omfatter kort ambrosia (Ambrosia elatior), hoy ambrosia (Ambrosia trifida), russisk tistel (Salsola pestifer), vanlig malurt (Artemisia tridentatå) og engelsk kjempe (Plan-tago laceolata). Andre allergene materialer • som kan behandles omfatter: ekstrakter som inneholder hele. legemer og/eller ekskret og sekret av husstovmidd av typen Dermatophagoides og tilsvarende og slike ekstrakter omfatter råekstrakter av hus-stov; opplbsninger av matallergener (f.eks. ekstrakter av notter, gronnsaker, honseegg etc.);, ekstrakter av sopp (f.eks. Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Helminthosporium, gjær, basidiesporer, askosporer etc); ekstrakter av plantefrd og fibre (f.eks. bomull, kastor etc); ekstrakter av hele legemer eller gifter av stikkende og bitende insekter,(f.eks. bier, veps, og mygg); og ekstrakter av flass/hud/hår av dyr (f.eks. katter, hunder, hester, marsvin, mus, kanniner osv.).

Hbyt rensede eller delvis rensede allergener kan også bli aldehydbehandlet f.eks. gruppe I gresspollenallergen-er, antigen E av ambrosiapollen, delvis renset husstovmidd-ekstrakter og fosfolipase-A fra biegift.

Reaksjonen mellom urensede og hoyt renset allergent materiale og aldehyder kan utfores i nærvær av et tilsatsstoff med lav molekylvekt. Passende tilsatsstoffer som vanligvis inneholder mindre enn 8 karbonatomer i tillegg til eventuelle funksjonelle grupper som er tilstede omfatter: alifatiske diaminer; guanidiner; alifatiske syreamider; alifa- ' tiske karboksylsyrer som inneholder aminogrupper, deriblant alifatiske aminosyrer (monoamino-monokarboksylsyrer, monoamino-dikarboksylsyrer og diaminomonokarboksylsyrer), alifatiske hydroksyaminosyrer og alifatiske diaminodikarboksylsyrer og alifatiske forbindelser inneholdende kombinasjoner eller per-mutasjoner av én eller flere amino-, guanidino-og syreamido-grupper. I tillegg kan et begrenset antall hydroksygrupper

være tilstede i en hvilken.som helst av de ovenfor nevnte for-

bindelsestyper. Typene omfatter 1,4-diaminobutan, lysin, oritinin, 1,5-diaminopimelinsyre, arginin, adipamid, aspartinsyre, serin og alanin. Tilsatsstoffet er slik at det kjemisk forbinder seg med pollenkomponentene under aldehydbehandlingen.

For hvert trinn i prosessen, er konsentrasjonene av

. allergen, aldehyd og eventuell tilsatsstoff som er tilstede

i reaksjonsblandingen og pH og inkubasjonstiden i reaksjonsblandingen som forer til optimale betingelser for aldehydbehandlingen i en viss grad gjensidig avhengig. Fblgende betingelser er foretrukket og hver betingelse krever at de

andre betingelser opprettholdes innen passende grenser for å

få det ønskede aldehydbehandlede allergen.

Den endelige konsentrasjon av allergent materiale

som benyttes for aldehydreaksjonen bor fortrinnsvis være (1) slik at alle komponenter er fullstendig oppløselige og (2) forenlige med konsentrasjonen av aldehyd og eventuelt tilsatsstoff. Når det dreier seg om formaldehydreaksjoner,

bor oppløsningene fremstilles i en vandig buffer, fortrinnsvis ved pH 7,4 - 7,6, av passende molaritet for å opprett-holde denne pH til ca. 7,2 - 7,6 under reaksjonen for å opti-malisere de onskede aldehydreaksjoner. Konsentrasjoner av opptil ca. 12 mg/ml allergent materiale (basert på torr vekt faststoff/ml) i 0,1M natriumfosfatbuffer ved pH 7,5 - 0,1

moter vanligvis de forannevnte krav, og utvelgelsen av allér-genkonsentrasjoner er i en viss grad avhengig av inkubasjons-, temperaturen og aldehydkonsentrasjonen.

Når det dreier seg om dialdehydreaksjoner, bor pH

i reaksjonsopplosningen fortrinnsvis være 7,0 - 8,0 og aller-genkonsentrasjonen 1,0 - 2,0 mg/ml.

Konsentrasjonen av aldehyd og aldehyder i.reaksjonsblandingen bor ikke være så stor at den får en negativ virkning på de bnskede immuniserende egenskaper i det resulterende aldehydbehandlede allergen, men den bær være tilstrekkelig til å fore til en utstrakt destruksjon av allergeniteten i det opprinnelige allergen ved temperaturen i inkubasjonsblandingen.

Den resulterende reduksjon i allergenitet ligger vanligvis i området 100 - 10.000 ganger etter avslutning av den trinnvise prosess. I tillegg til de forannevnte faktorer, varierer foretrukne aldehydkonsentrasjoner ifolge renheten av det allergen som behandles ved at den lavere del av de områder som er angitt nedenunder passer bedre for bruk med meget rensede materialer.

Foretrukne fremgangsmåter ifolge oppfinnelsen

Allergenfremstilling:

Når det dreier seg om allergenekstrakter, fjernes fettholdige materialer fra den torkede allergenkilde (pollen,

flass, sopp etc.) ved ekstraksjon med torr petroleter eller

torr peroksydfri dietyleter. Det avfettede allergene materialet ekstraheres ved 0 - 5°C i ca. 15 minutter til 4 dager med en passet bufret .opplbsning (f.eks. 0,125M NH^HCO^) ved pH 6,0-8,0. Tiden avhenger av den type ekstrakt man

bnsker og typen allergenkilde. Fast materiale fjernes ved filtrering, sentrifugering eller tilsvarende fremgangsmåter. Over 90% av materialet med lav molekylvekt (som hovedsakelig

er ikke-allergent) fjernes fra ekstraktet ved dialyse eller ultrafiltrering over et membran eller en hul fiberinnretning (molekylvekt-avkutting ved 3.000 - 5.000 dalton), eller gelfiltrering. Allergenopplbsningen bringes til passende lager-konsentrasjon med hensyn til torr vekt fast allergenholdig materiale pr. ml (vanligvis 1,5 - 2,0 ganger det som er tilstede i trinn 1 - se nedenunder), ved ultrafiltrering eller dialyse mot, eller lyofilisering og rekonstituering i, en buffer såsom 0,IM natriumfosfat justert til pH 7,5 - 0,1.

Rensede eller delvis rensede allergener fremstilles også i den samme buffer for reaksjoner beskrevet nedenunder. Oppsummering av reaks. jonsbetingelser: Formaldehyd, trinn ett: Allergen konsentrasjon, 1,0 - 12,0 mg/ml; form-aldehydkonsentrasjon 0,5 - 2,5M; temperatur 5 15°C, fortrinnsvis ca. 10°C; pH 7,2 - 7,6; tid 8 - 32 dager. Formaldehyd, trinn " n" ( hvor n> 1 og vanligvis n = 2): Allergenkonsentrasjon 1,0 - 3,0 mg/ml; formalde-hydkonsentrasjon 0,36 - 0,5M; temperatur ca. 25 .- 40°C, fortrinnsvis 30 - 34°C; pH 7,2 - 7,6; tid 16 - 35 dager.

Dialdehyd, trinn ett:.

Allergenkonsentrasjon 1,0 - 2,0 mg/ml; aldehyd- konsentrasjon 0,01 - 0,1M, fortrinnsvis ca. 0,025M; temperatur 5 - 15°C, fortrinnsvis ca. 10°C; pH 7,0 - 8,0; tid 4 - 24 timer, fortrinnsvis 16 - 20 timer.

Dialdehyd, trinn " n" ( hvor n>l og vanligvis n = 2): Allergenkonsentrasjon 1,0 - 2,0 mg/ml; aldehyd- konsentras jon 0,01 - 0,1M, fortrinnsvis 0,025M; temperatur ca. 25 - 40°C, .fortrinnsvis ca. 30°C; pH 7,0 - 8,0; tid

16 - 32 timer, fortrinnsvis ca. 24 timer.

Ved slutten av inkubasjonen fjernes overskudd av aldehyder ved én av følgende fremgangsmåter: utstrakt dialyse med flere forandringer i dialysatet undér anvendelse av et celluloseror såsom "Visking" størrelse 18, omfattende membrandialyse/ultrafiltrering under anvendelse av et "Millipore", "Amicon" eller tilsvarende'membran eller en hul fiberinnretning med en molekylvekts-avkutting på ca. 5.000 - 30.000 dalton, eller ved gelfiltrering på en passende xerogel.såsom "Sephadex G10" eller "G25" ved ca. 4°C.

Ifolge oppfinnelsen uffores reaksjonen i ett eller flerebg fortrinnsvis i to trinn. Når to eller flere trinn benyttes, skilles, det fbrste fra de etterfølgende trinn ved de forskjellige temperaturer som benyttes. Når det dreier seg om flertrinnsreaksjoner, kan reaksjonsrekkefolgen utfores med: (a) formaldehyd i det fbrste og etterfølgende trinn, (b) med et spesielt dialdehyd i det fbrste og etter-fblgende trinn, (c) med formaldehyd i det fbrste og et spesielt dialdehyd i de etterfølgende trinn, (d) med ét spesielt, dialdehyd i det fbrste og formaldehyd i etterfølgende trinn (e) .... med en hvilken som helst kombinasjon av.formaldehyd og ett eller.flere dialdehyder i en serie trinn. De foretrukne kombinasjoner vanligvis de enkle tilfeller (a) eller (b), men tilfellene (c) og (d) gir fordelen med en kombinasjon av forskjellige typer kjemiske reaksjoner under anvendelse av en relativt enkel fremgangsmåte. Reaksjoner av typen (e) gir, selv om de ofte er mer kompliserte å utfore, kombinasjoner av reaksjonsprosesser som kan fore til den stbrste reduksjon av allergene egenskaper.

Blandinger av formaldehyd og et dialdehyd (vanligvis glutaraldehyd) kan benyttes i en serie trinn (vanligvis to). Denne.fremgangsmåte eliminerer fjerning av aldehydet etter det fbrste trinn for tilsats av det annet aldehyd. Siden dialdehydreaksjonen stort sett er avsluttet i lopet av 20 timer, kan blandingen overfores til det annet trinn for en mer omfattende reaksjon med formaldehyd. Allergenkonsentra-sjonen holdes på ca. 1,0 - 2,5 mg/ml, formaldehyd ved 0,36 - 0,5M og dialdehyd på ca. 0,025M, ved pH 7,2 - 7,6. Det fbrste trinn varer i 4 - 24 timer (fortrinnsvis 16 - 24 timer) ved 5 - 15°C (fortrinnsvis ca. 10°C) og det annet trinn i 16 - 32 dager ved 30 - 34°C.

I det fbrste trinn utfores reaksjonen ved en temperatur over frysepunktet for opplbsningen (det mest effektive området er fra 5 - 15°C) og fortrinnsvis ved ca. 10°C. De etterfølgende trinn utfores ved ca. 25 - 40°C og fortrinnsvis 30 - 34°C. Anvendelse av denne rekkefolge i temperatur-ene har vist seg i vesentlig grad å oke effektiviteten i sluttproduktet når det gjelder å immunisere allergiske individer.

Når det dreier seg om den foretrukne totrinns-prosess, utfores fortrinnsvis det fbrste trinn ved lavere temperaturer i en tidsperiode fra ca. 8 - 32 dager når det dreier seg om formaldehyd, og i ca. 20 timer når det dreier seg om dialdehyder, selv om kortere inkubasjonsperioder på 4 timer kan benyttes i det siste tilfellet. Varigheten av det annet trinn er vanligvis 14 - 35 dager for formaldehyd og ca. 24 timer for dialdehyder.

Oppfinnelsen kan. benyttes med formaldehyd, med alle lavere mettede alifatiske dialdehyder og spesielt glutaralde-(CH2)n\QH0

hvor n = 1 -6 og deres forgrenede isomerer og forprodukter og blandinger av disse.

Aldehydbehandlede allergener, fremstilt som beskrevet ovenfor, passer immunoterapeutiske midler for pattedyr og deriblandt allergiske mennesker. Tilsatsstoff såsom et alum eller et alginat kan tilfores det onskede immuniseringspre-parat for å oke den immunogene effektivitet. Aldehydbehandlede allergener kan benyttes i diagnostisk proving både for og under immunoterapi i allergiske mennesker.

Aldehydbehandlede allergener ifolge oppfinnelsen kan tilfores pattedyr på i og for seg kjent måte såsom intra- dermalt, subkutant elleruintramuskulært. I tillegg vil deri lave allergenitet i disse materialer tillate tilfbrsel i form av aerosolsproyter til nese og/eller munn for å få en immunisering over slimhinnene.

Oppfinnelsen illustreres av, men er ikke begrenset

av folgende eksempler.

Eksempel 1

Folgende pollen ble benyttet: (1) ambrosia (Ambrosia elatior) og (2) et blandet gress som består av 30% hundegress (Dactylis glomerata), 25% blått (Poa pratensis), 25 % tiomotei (Phleum pratense), 10% rod svingel (Festuca rubrå) og 10% engsvingel (Festuca elatior). Hver av pollene ble avfettet ved suksessive ekstraksjoner med dietyléter, eller petroleter (ca. 8x1 liters mengder) og ekstrahert ved 4°C enten én gang med 10 ganger volumet (ml) av 0,125M NH^HCO^i forhold til vekten (g) pollen i ca. 18 timer (med omrbring) eller i tre etter-følgende ekstraksjoner med et volum på NH^HCO-^-opplbsningen som tilsvarte 10 ganger mengden på pollen. Etter sentrifugering ble hvert overstående ekstrakt dialysert grundig ved 4°C i et "Visking" stbrrelse 18 celluloserbr mot 0,002M NH^HCO^

(4 - 5 x 72 liter) og endelig mot destillert vann (1 x 72 liter) i lbpet av 4 dager. Dialyseprosessen tjente til å fjerne stort sett alle ikke-allergiske komponenter med lav molekylvekt. Hvert dialysert ekstrakt ble sentrifugert for å fjerne spor-mengder utfelling, lyofilisert og lagret ved -20°C i en lufttett beholder inntil bruk.

Dialysert allergenekstrakt (1) eller (2) på 2 mg/ml ble inkubert med 0,5M formaldehydopplbsning i 14 - 18 dager ved 10°C<i>.l°C i 0,1M Na2HP04/NaH2P04-buffer ved pH 7,5<±>0,1 (buffer A), overfort direkte til en inkubator ved 32°C - 1°C

og inkubert i ytterligere 14 - 18 dager. Overskudd av formaldehyd fjernes ved dialyse mot buffer A, fysiologisk bufret saltvannsopplbsning eller destillert vann (se diskusjon nedenunder).

Eksempel 2 '

Dialosert allergenekstrakt (1) (2 mg/ml) ble inkubert med 0,5M formaldehydopplbsning i 30 - 35 dager ved 10°C

- 1°C ved pH 7,5 0,1 i buffer A, overfort direkte til en in-

kubator ved 32°C - 1°C og inkubert i ytterligere 30 - 35 dager. Overskudd av formaldehyd ble. fjernet ved dialyse mot buffer A, fysiologisk bufret saltvannsopplbsning eller destillert vann.

Eksempel 3

Dialysert allergenekstrakt (2) (2 mg/ml) ble inkubert med 0,5M formaldehydopplbsning i ca. 8 dager ved 10°C

1°C og pH 7,5 i buffer A, overfort direkte til en inkubator ved 32°C - 1°C, og inkubert i ytterligere ca. 32 dager. Overskudd av formaldehyd ble fjernet ved dialyse mot buffer A,

fysiologisk bufret saltvannsopplbsning eller destillert vann. Eksempel. 4

Dialysert allergenekstrakt. (l) eller (2) (10 mg/ml) ble inkubert med 2M formaldehydopplbsning i cå. 14 - 18 dager ved 10°C - 1°C... Oppløsningen ble fortynnet fire ganger (dvs.

,til 2.5 mg/ml pollen og 0,5M formaldehyd). Oppløsningen ble reinkubert i ca. 14-18 dager ved 32°C - 1°C. Overskudd av formaldehyd ble fjernet ved dialyse mot buffer A, fysiologisk bufret saltvannsopplbsning eller destillert vann.

Eksempel 5

Dalysert allergenekstrakt (1) eller (2) (8 mg/ml)

ble inkubert med 2M formaldehydopplbsning i ca. 14 - 18 dager ved 10°C - 1°C. Oppløsningen ble fortynnet fire ganger (dvs. til 2,0 mg/ml pollen og 0,5M formaldehyd). Oppløsningen ble reinkubert i ca. 14 - 18 dager ved 32°C - 1°C. Over-

skudd av formaldehyd ble fjernet ved dialyse mot buffer A,

fysiologisk bufret saltvannsopplbsning eller destillert vann.

Eksempel 6

Et dialysert allergenekstrakt (1) av ambrosiapj3llen (2 mg/ml) ble inkubert med 2M formaldehydopplbsning i ca. 14 - 18 dager ved 10°C - 1°C ved pH 7,5 - 0,1 i 01M natriumfosfatbuffer (buffer A); oppløsningen ble inngående dialysert ved 4°C mot flere tilsatser buffer A for å fjerne formaldehyd;

ytterligere formaldehyd (12,3M) ble langsomt tilsatt for å

gjore oppløsningen 0,36M med hensyn til formaldehyd; oppløs-ningen ble reinkubert i .16 dager ved 32°C 1°C og pH 7,5 - 0,1..

overskudd av formaldehyd ble fjernet ved dialyse mot buffer A eller fysiologisk bufret saltvannsopplbsningi

Eksempel 7

Dialysert allergenekstrakt (1) eller (2) (2 mg/ml) ble inkubert med en blanding av 0,25M glutaraldehyd og 0,5M formaldehyd i buffer Ai ca. 18 timer ved 10°C - 1°C. Blandingen ble deretter umiddelbart plassert ved 32°C - 1°C og inkubert i ca. 21 dager ved pH 7,5 - 0,2. Overskudd av glutaraldehyd og formaldehyd ble fjernet ved slutten av eksperimentet ved dialyse.

Eksempel 8

Dialysert allergenekstrakt (1) og (2) (2 mg/ml)

ble inkubert med 0,025M glutaraldehyd i buffer Ai ca. 18 timer ved 10°C - 1°C. Overskudd av glutaraldehyd ble fjernet ved dialyse mot buffer A. Formaldehydopplosning ble tilsatt til glutaraldehyd-behandlet allergenopplosning for å gjore denne 0,5M med hensyn på formaldehyd. Denne blanding ble deretter inkubert i 21 dager ved 32°C 1°C. Overskuddet

av formaldehyd ble fjernet ved dialyse ved slutten av eksperimentet. Eksempel 9

Dialysert allergenekstrakt (1) eller (2) (2 mg/ml) ble inkubert med glutaraldehyd (0,025M) ved.lO°C - 1°C i ca. 20 timer og 30°C - 1°C i ca. 24 timer ved pH 7,5 1 0,1 i buffer A. Overskuddet av glutaraldehyd ble fjernet ved dialyse mot buffer A eller fysiologisk bufret saltvannsopplbsning ved slutten av eksperimentet. Andre glutaraldehydkon-sentrasjoner ble undersbkt (området 0,0005 - 0,1M), men 0,025M viste seg å gi det beste produktet med hensyn til lav allergenisk aktivitet og bibehold av de onskede immuniserende egenskaper.

Eksempel 10

Tbrket ambrosia (Ambrosia elatior)-pollen ble avfettet ved Soxhlet-ekstraksjon under anvendelse av petroleter. Tilbakelbpsvirkningen ble fortsatt inntil élueringsmidlet

ble uten farge fra pollene. Pollen ble lufttbrket, veiet og lagret i tett forseglede beholdere ved -5 - -30°C. 5 ml 0,125M ammoniumbikarbonatbuffer pr. gram avfettet pollen ble tilsatt pollene og blandingen ble ekstrahert med konstant omrbring ved 0 - 5°C i 18 - 26 timer. Etter denne fbrste ekstraksjon ble ekstraktet fjernet fra pollenkornene ved filtrering og

pollenkaken ble reekstrahert med 4 ml buffer/g pollen (utgangs-vekt) i 2 - 4 timer ved 0 - 5°C, fulgt av skylling med 1 ml buffer/g pollen. Alle tre ekstrakter ble slått sammen, og dialysert i et "Visking" storre 18 somlost celluloserbr mot et 35 ganger storre volum 0,002M ammoniumbikarbonat i 30 - 40

timer. Ytterligere 12 - 14 timers dialyse ble utfort mot destillert vann. Ekstraktet ble filtrert gjennom en serie filteré, og avsluttet med en steril filtrering gjennom et 0,45 nyu filter. Det sterile ekstrakt ble lyofilisert og veiet. Inkubering av dette dialyserte ekstrakt (10 mg pollen faststoff/ml) ble utfort under anvendelse av 2M formaldehyd i 0,1M natriumfosfatbuffer ved pH 7,2 - 7,6 i 12 - 18 dager ved 10°C - 2°C. Den resulterende.opplbsning ble fortynnet 4 ganger i 0,1M fosfatbuffer og inkubert til pH 7,2 - 7,6

i 18 - 24 dager ved 32°C - 2°C. Den resulterende opplbsning ble dialysert i et "Visking"-rbr størrelse 1 - 7/8 tommer diameter mot to 35 ganger volumer 0,002M NH^HCO^. Oppløs-ningen ble undersbkt med hensyn på fråvær av formaldehyd, kon-sentrert under anvendelse av et "Millipore Pellicon Cassette"-system, sterilfiltrert og lyofilisert.

I hvert av de foregående eksempler ble inkubering-

ene og dialysene utfort under anvendelse av 0,1M natriumfosfatbuffer, pH 7,5 - 0,1 og alle oppløsninger ble inngående dialysert ved ca. 4°C mot flere utbyttinger av store volumer dialysat for å fjerne ureagert aldehyd ved slutten av hvert eksperiment. Oppløsningene ble enten lagret nedfrosne, eller i flere tilfeller, ble de aldehydmodifiserte allergener lyofilisert fra vandige oppløsninger, en prosess som stort sett forer til aldehydfrie faste stoffer med utmerkede langstids-lagringsegenskaper.

Eksempel 11 Allergen

Pollen av ambrosia . (Ambrosia elatior) ble kjbpt fra Greer Laboratories og lagret ved -20°C i en lufttett beholder inntil bruk. Pollen (150 g) ble avfettet ved 8 etterfølgende

ekstraksjoner med 1 liters porsjoner vannfri, peroksydfri dietyleter (J.T. Baker Co.), som tillot fjerning av alt farget fettmateriale. Pollen fikk tbrke og spor av eter ble fordam-pet i vakuum over natten. Det avfettede pollen ble ekstrahert

ved 4°C under forsiktig omroring i 15 timer med 1,5 liter 0,125M NH^HCO^, og pollen ble fraskilt fra den ovenstående væske ved sentrifugering. Det ovenstående ekstrakt (1185 ml) ble underkastet omfattende dialyse i et "Visking" stb'rrelse 18 celluloserbr (Union Carbide Corporation), mot 0,002M NH^HCO^

(5 x 72 liter) og endelig mot destillert vann (2 x 72 liter) i lbpet av 4 dager ved 4°C. Det dialyserte ekstrakt ble sentrifugert for å fjerne små mengder utfelling og lyofilisert (utbytte 14,104 g). Dette materialet som vil benevnes som "Ambrosia pollen-allergen, prove 11RWC", ble lagret ved -20°C i en lufttett beholder inntil bruk.

Allergoid

En del av det lyofiserte allergen ble underkastet formaldehydmodifisering ved "totrinns-metoden". Ambrosia pollenaHergen (13,603 g) ble opplost i 0,1M fosfatbuffer,

pH 7,50<1>(453,4 ml) for å gi en opplbsning som inneholdt 30 mg pollen-faststoff pr. ml. Denne opplbsning ble dialysert/Ci stbrrelse 18 "Visking"-rbr) mot fosfatbuffer (11,2 liter) i 24 timer ved 4°C. Etter dialyse ble det endelige volum av allergenopplbsning justert til 907 ml (15 mg pollen faste stoffer/ml) med 0,1M fosfatbuffer ved pH 7,50.

Den folgende reaksjonsblanding ble fremstilt ved 4°C. 10-molar formaldehydopplbsning (270 ml) ble meget langsomt tilsatt under konstant omroring til 900 ml allergenopplbsning, slik at man unngikk lokaliserte hbye konsentrasjoner av formaldehyd. pH i oppløsningen ble fulgt under hele tilsatsen, og totalt 6,5 ml 2M NaOH (Baker Co.) ble tilsatt under blandingen for å holde pH på 7,50 - 0,1. Det endelige volum i reaksjonsblandingen ble jusert til 1350 ml under anvendelse av 170 ml 0,2M fosfatbuffer ved pH 7,50, 1,1 ml 2M NaOH og 2,5 ml 0,1M fosfatbuffer med pH 7,50, for å få en opplbsning som hadde

"^Fremstilt ved å blande sammen passende volumer 0,1M NaHgPO^og 0,1M Na2HP0^(begge analytisk rene fra Baker) for å gi en endelig pH på 7,50.

2Fremstilt ved fortynning av. analytisk ren formaldehyd (Fisher Scientific Co., 37%) med deionisert vann.

folgende sammensetning: pollen faste stoffer 10 mg/ml; formaldehyd 2,OM; fosfat ca. 0,1M, ved pH 7,50 målt ved 10°C.

Den ovennevnte opplbsning ble inkubert i 16 dager ved 10°C - 0,5°C og på dette tidspunkt hadde pH falt til 7,41. Etter denne fbrste inkubering, ble oppløsningen fortynnet 4 ganger med 0,1M fosfat ved pH 7,50 og inkubert ved 32°C - 0,5°C i ytterligere 16 dager. Start-pH på denne annen inkubering var pH 7,49 (målt ved 32°C) og slutt-pH var 7,47 (ved 32°C). Den resulterende allergoide' opplbsning ble dialysert suksessivt mot 4 x 72 liter deionisert vann ved 4°C for å fjerne formaldehyd og buffersalter. En sporutfelling ble fjernet ved sentrifugering og den resulterende opplbsning ble lyofilisert, noe som ikke bare tjente, til å fremstille et stabilt, tort materiale., men også å fjerne eventuelle små rester av formaldehyd. Utbyttet av "ambrosia pollen-allergoid, 11 RWF" var 13.135 g (97,3% av det teoretiske). Allergoidet ble lagret ved 20 C i en luft.-' tett beholder inntil bruk.

Fremstilling av opplbsninger for immunoterapi

Oppløsninger ble fremstilt som "allergenenheter/ml" eller "allergoienheter/ml" hvor allergoidenheten var 50 ganger storre enn allergenenheten når det gjelder innhold av faste pollenstoffer og "antigen E ekvivalenter/ml (AgE ekvivalenter/ ml)"^. Basert på tidligere erfaring ble lageropplbsningen av allergen 11RWC (1.000 enheter/ml) fremstilt slik at den inneholdt 10<y>ug AgE ekvivalenter/ml (0,28 mg ikke-dialyserbare faste pollenstoffer/ml). På tilsvarende måte ble lageropplbsningen av allergoid 11RWF (1.000 enheter/ml) fremstilt med 500^ug AgE ekvivalenter/ml (14,1 mg fast allergoid/ml). Lageropplbsningene av allergen og allergoid ble sterilfiltrert gjennom.en "Nalgene" filterenhet utstyrt med en membran med porestbrrelse 0,45/Uiri (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.)

^Når det dreier seg om allergen, refereres det til innholdet av antigen E; når det dreier seg om allergoid, refereres det til innholdet av antigen E i allergenet hvorfra det er fremstilt (antigen E ér ikke direkte målbart i allergoidet).

og hver opplosning hie deretter overfort til sterile glassampuller i en mengde på ca. 10 ml. Totalt 30 glassampuller allergen og 23 glassampuller allergoid ble fremstilt. Begge sett ampuller ble nummerert i den rekkefolge de ble fylt. Ampullene ble fremstilt ca. 3 uker for terapien begynte og

ble holdt på 4°C under studiene.

Steriliteten i allergen- og allergoidopplosningene

ble undersokt ved inkubering av 0,5 ml prover tatt fra ut-valgte ampuller med tioglykollate medium, i overensstemmelse med FDA Rule.s and Regulations, "Paragraph 610.12, Sterility". Inkuberingene ble utfort ved temperaturer på 25 dg 32°C i

lopet av 2 uker. Når det dreier seg om allergen opplosning,

ble provene tatt fra ampuller nr.-i,- 11, 20 og 30. Når det dreier seg om allergoidopplosning, ble provene tatt fra am-pulle nr. 1, 11 og 23. Alle sterilitetsprover ble undersokt visuelt med hensyn på vekst på den 4., 7. og 14. dag i inku^basjonsperioden. Man så ingen tegn til bakteriell forurens-ning ved slik visuell undersokelse. Ved slutten av 14-dagers inkubasjonen, ble hver av provekulturene overfort til plater av tryptikase-soyaagar med 5% saueblod.(Baltimore Biological Labs, Cockeysville, MD., U.S.A.) og inkubert ved 37°C i 24 timer. Alle viste seg å være negative med hensyn på enhver type vekst.. Alle prover av allergen og allergoid, bortsett fra de som var provet med hensyn til sterilitet, ble lagret ved 4°C til bruk.

Generelle giftighetsprSver både på allergen- og allergoidopplosninger ble utfort under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i "Paragraph 610.11, Safety" i FDA Rules and Regulations. Disse prover ble utfort på mus og marsvin under oppsyn av Irving Levenstein, Ph.D., Leberco Laboratories,

123 Hawthorne Street, Roselle Park, N.J., U.S.A. Hver mus mottok 0,5 ml og hvert 5 ml enten av allergen- eller allergoid-opplosningen fra lageret tilfort intraperitonealt. Resultatene av disse prover viste ingen tegn på toksisitet når det dreier seg om hverken allergen eller allergoid, idet man ikke fant noe uvanlig vekttap 7 dager etter innsprøyting av materialene.

Immunokjemjske analyser

Analyser av innholdet av ambrosia-allergener, anti-

gen E, Ra3 og Ra5 i ambrosia pollen-allergen, prove 11RWC ble utfort ved radial immunodiffusjon (Baer, H., Maloney, C.J.,

Norman,■P.S.'og Marsh, D.G., 1974, J. Allergy Clin. Immunol. 54, 157 - 164) under anvendelse av passende spesifikkekriti-sera og ref eranseantigener.. Antigen E-referansen var NIH-materiale ytterligere renset ved "Sephadex G75" kromatografi og Ra3-referansen var fra Dr.Lawrence Goodfriene, McGill University, Montreal, Canada. En ytterligere antigen E-refer-anse var. tilveiebragt fra Dr. T.P. King, Rockefeller University, New York, U.S.A. Antisera ble fremstilt.i vårt labora-torium ved immunisering av kaniner.eller geiter med de respektive antigener.

Krysset immunoelektroforése av allergen ble også utfort mot kanin anti-allergenserum under anvendelse av en

.teknikk tilsvarende som beskrevet av Weeke og Lowenstein

(1973) i A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (eds.

N.H. Axelsen, J. Kroll og B. Weeke), Universitetsforlaget, Oslo, sidene 149 - 153.

Standard "proteinnitrogenenhet (PNU)"-bestemmelser av allergen og allergoid ble gjort ifolge rutinemessige FDA-fremgangsmåter av Mr. Bill White, Jr. og medarbeidere i Greer Laboratories, Lenoir, N.C., U.S.A.

Pasienter

14 ambrosia-allergiske kaukasiske, betalte, fri-villige (7 menn, 7 kvinner; gjennomsnittsalder 33; alders-område 25 - 44) ble valgt for studium etter folgende kriterier. Alle pasienter hadde alvorlig hoyfeber under ambrosiasesongen hvor gresshoyfeber forekom moderat i tre personer .. og mildt hos ytterligere tre personer. Pasienter som eventuelt led av astma ble spesielt utelukket fra studium. Også pasienter med store symptomer i juli ble utelatt. Siden tidligere studier hadde vist at immunoterapi med ambrosiaekstrak-ter påvirker etterfølgende immunologisk respons, utelukket eventuell tidligere behandling med ambrosiaekstrakt automa-tisk pasienter fra studiet. Endelig ble alle pasienter be-dømt som gode studiekandidater med hensyn til beskjeftigelse og følelsesmessig stabilitet.

Pasientene ble plasert i syv par ifolge deres for-behandling leukocytt histaminutlosning og hudprovefolsomhet overfor allergen og allergoid og total serum IgE-nivåer. Behandling .Pasientene ble behandlet mellom slutten av mai og midten av august 1977. På den fbrste behandlingsdag (dag 0) fikk de fra 1-5 innsprøytninger av okende mengder av allergen eller allergoid i lopet av 30 minutter - 2 timer inntil lokale hevelses- og erytemareaksjoner eller systemiske symptomer anga at doseringen var nær toleransenivået. Eh fullstendig registrering av innsprøytningene og umiddelbare, lokale og systemiske reaksjoner for hver pasient ble tatt av overvåkende lege. Forsinkede lokale reaksjoner på innsproytnings-stedene og systemiske symptomer (om disse fant sted) ble gjen-gitt av pasienten. Medisinske konsultasjoner var tilgjenge-lige for alle pasienter under 24-timers perioden som fulgte innsprøytningen og informasjonen ble bekreftet ved telefon-intervju med hver pasient. Alle lokale reaksjoner ble gra-dert med hensyn på maksimal intensitet som vanligvis fant sted 24 timer etter innsprøytningen. (Informasjon vedrør-ende gradering av lokale og systemiske reaksjoner er gitt i fotnoten i tabell V) . Etter den fbrste behandling ble serum IgG-antilegeme overfor antigen E målt ved intervaller på ca. 4 - 14 dager og annen og etterfølgende behandlinger ble gitt etterhvert som antilegemeresponsene nådde sine suksessive platåniyåer i pasientene. Reaksjonene overfor innsprøytningene ble regis-trert ved hvert tilfelle som beskrevet ovenfor. Seks allergen- og seks allergoid-behandlede pasienter gjennomførte studiene og hver mottok 4-5 innsproytningsbehandlinger mellom slutten av mai og midten av august 1977 (tabell I og II).

Prover med hensyn på relativ allersenitet, allergoid/ allergen

De relative allergeniteter av allergoid i forhold

til allergen i studiene ble bestemt både ved leukocytt-hista-minutlosningsprove (Marsh, D.G., Lichtenstein, L.M. og Camp-bell, D.H., 1970, Immunology, 18, 705 - 722) og ved kvanti-tativintradermal sluttpunkts hudtitrering (Norman, P.S., 1976,

i Manual of Clinical Immunology (eds. N.R. Rose og H. Fried-. man), American Soc. for Microbiol., Washington D.C., side 585). Hver pasients leukocytt-sensitivitetsforhold ble ut-

trykt som forholder allergoid/allerginkonsentrasjo ær som ga-, 50% histaminutlbsning fra pasientens leukocytter." Husprbve-sensitivitetsforholdet var forholdet hvor allergoid/allergin-konsentrasjohene ga to-pluss (8 - .10.mm hevelsesdiameter med erytema) hudprbve-sluttpunkter.

Totalt serum IgE- prbver

Måling av totalt serum IgE i én pre- og tre post-béhandlingssera på alle pasienter ble utfort ved "direct RIST"-fremgangsmåten utviklet av Schellenberg og Adkinson (Schellenberg, R.R. og Adkinson, N.F., 1975, J. Immunol., 115, 1577 - 1583). Fremgangsmåten tilsvarer "PRIST"-metoden til Wide (Wide, L., 1971, i Radioimmunoassay Methods (eds. K.E. Kirk-ham og W.M. Hunter), Livingstone, Edinburgh, Storbritannia,

side 173), bortsett fra at fbrste trinnet i prbven anvendte spesifikt anti-IgE-antilegemer (dyrket i en geit) koblet til "Sepharpse 4B" snarere enn papirskiver. Etter inkubering av pasientens serum med "Sepharose" immunoadsorberende kuler, ble kulene vasket og deretter inkubert med radioaktivt merket kanin anti-IgE (£- -kjede spesifikt renset antilegeme). Kulene ble deretter vasket igjen og telt i en gammateller. Telling-

en ble sammenlignet med den man fikk med serumtitreringer under anvendelse av et kontrollserum med kjent IgE-innhold. Ovennevnte eksperimenter ble alle kjbrt dobbelt med passende positive og negative kontroller og tre indre standardområder for hvert kjent IgE-innhold. Hver prove ble også gjentatt minst én gang, og avvikende verdier (som atskilte seg fra hverandre mer enn - 10%) ble gjentatt inntil man fikk verdier innenfor - 10%.

Prove på serum IgG- antilegeme overfor antigen E

Immunoglobulin G antilegeme til antigen E ble målt under anvendelse- av en menget folsom, dobbelt antilegeme radio-immunologisk fremgangsmåte tilsvarende til den som er beskrevet av Black et al (Black, P.L., Marsh, "D.G.', Jarrett, E,, Delespesse, G.J. og Bias, W.B., 1976, Immunogenitics 3, 349 - 368). Renset antigen E ble merket med I ved kloramin-T fremgangsmåten, ultrasentrifugert for å fjerne mikroaggre-gater og lagret ved -70°C i små prover inntil bruk. Passende serum to ganger fortynnelser av standardserum (fra en allergisk person som i omfattende grad var behandlet med ambrosiaekstrakt), serum fra pasientene fra studiet og passende

kontroller ble inkubert med en konstant mengde merket antigen E (ca. 1,2 ng med konsentrasjon 6,2 ng/ml) i 5 timer ved 23 o C. 4 Alle serumprover ble fortynnet 1:50 i boratbufret

saltvannsopplbsning (BBS), pH 8,0, og passende ytterligere fortynninger ble fremstilt i BBS som inneholdt 1:50 normalt menneskelig serum uten antilegeme til antigen E. Negative kontrollrbr består av 1:50-fortynninger av dette normale serum. Etter den opprinnelige inkubering, ble serum IgG

(og bundet antigen-antilegeme-komplekser) utfelt ved tilsats av et lite overskudd av anti-IgG fra geit (anti-Fc-fragment) og inkubert over natten ved 4°C. De resulterende utfelling-er ble vasket og telt, og testsera sammenlignet med standard-kontrollkurven. Alle resultater ble uttrykt i "enheter i IgG-antilegeme/ml serum" basert på kontrollserumkurven. I tidligere studier (Platts-Mills, T.A.E., vonMaur, R.K., Ishizaka, K., Norman, P.S. og Lichtenstein, L.M., 1976 i J. Clin. In-vest., 57, 1041 <- 1050) er det vist at ufortynnet kontrollserum vil binde ca. 24^ug antigen E/ml i antigen-overskudd. På denne basis ble det beregnet at én av de tilfeldige enheter skulle binde 1,3 ng antigen E i antigen-overskudd. Under antagelse av dette, vil under slike betingelser bundet antigen opptre som Ag2Ab-komplekser, én enhet 2,8 ng antilegeme.

^For å oke fblsomheten i prbven for lave konsentrasjoner av antilegeme, blir den ikke-spesifikke binding av radioakti-vitet (primært til prbverbrene av plast) redusert både ved

forbelegg av prbverbrene med okseserumalbumin, 0,3% og ved fortynning av det merkede antigen i 5% albumin.

Under de begrensede antigenkonsentrasjoner i den foreliggende prove vil mindre antigen bindes og den effektive antile<g>eme-konsentrasjonen kan være ca. 3 ganger mindre. (Platts-Mills, T.A.E., Snajdr, M.J., Ishizaka, K. og Frankland, A.W., 1978, J. Immunol., 120, 1201 - 1210).

14 - 16 serumprbver fra hver pasient som avsluttet studiene og flere prover for hver av de to som avbrot studiene ble analysert. For at forandringer i IgG antilegeme-titrertall raskt skulle kunne vurderes for å tillate passende tidsbestemmelse av injeksjonssekvensen, ble disse antilegemeresponsene målt i lbpet av 3 dager etter at blodprbven var tatt. Alle prover ble kjbrt dobbelt i hvert eksperiment og ble gjentatt i det etterfølgende' eksperiment. Provene.ble gjentatt om nbdvendig inntil man fikk verdier innenfor 10%. Blodkjemi og urinanalyse

Blodkjemimålinger og urinanalyser ble utfort fbr immunoterapien og ca. 1 og ca. 14 uker etter at terapien var avsluttet. Standard SMA-11 blodkjemi ble bestemt ved The Good Samaritan Hospital Clinical Laboratory under anvendelse av automatiske analysemetoder. Standard urinanalyse ble utfort i vårt allergilaboratorium.

SymptomVurdering

Hbyfebersymptomer under pollinering av ambrosia

ble vurdert for hver pasient to ganger pr. dag etter en stan-dardvurdering. Gjennomsnittlige poeng for daglige symptomer (Norman, P.S. og Winkenwerder, W.L., 1965, J. Allergy, 36, 284 - 292) for grupper av hbyfeberpasienter har vist seg å korrelere med daglige pollentelllnger. I tillegg til disse selvvurderinger, ble hver pasient intervjuet av overvåkende lege to ganger under ambrosiasesongen.

Resultater

Tabell III gjengir de immunokjemiske analyser av allergen og allergoid.

Innholdet antigen E, Ra 3 og Ra 5 i allergen er vanligvis hoyere enn den gjennomsnittlige verdi man får ved å analysere forskjellige prcjver lyofilisert allergen (se fotnote til tabell III). PNU-verdiene for allergen og allergoid er tilsvarende, som ventet. (Man skal bemerke at ikke-dialysert ambrosiaekstrakt som inneholder samme mengde ikke-dialyserbare faste pollenstoffer gir ca. 2 ganger disse PNU-verdier under det forhold at teknikken måler noe nitro-gen i dialyserbart peptidmateriale). Åmbrosiaantigen_ E, Ra3 og Ra5 er ikke målbare i allergoidet; de refererer derfor til konsentrasjonene som "AgE ekvivalenter/ml" etc. basert på respektive antigeninnhold i det opprinnelige allergen.

Tabell IV viser histamin-utlSsning, husprove og total IgE data for 7 pasientpar ved begynnelsen av studiet.

Alle pasienter, bortsett fra de i par nr. 6, gjen-nomførte studiene, og etterfølgende sammenligninger vil primært referere til de 12 individer som avsluttet studiene. Det var meget vanskelig å matche pasientene fullstendig med hensyn til alle kriterier, men det geometriske gjennomsnitt av histaminutlosning og hudprovefolsomhet overfor allergen og allergoid og totalt serum IgE-nivå var rimelig godt matched..

Tabell I og II gjengir injeksjonsdosene som allergen- og allergoidenheter for de allergen- og.allergoid-behandlede grupper. Alle 6 allergenbehåndlede pasienter som gjennomgikk studiet, mottok 5 injeksjonsbehandlinger som hver bestod av 1 - 5 behandlinger. '-.I den allergoidbehandlede gruppe, mottok 2 av pasientene bare fire hovedbehandlinger,

og resten mottok fem hovedbehandlinger. Den gjennomsnittlige, kumulative dose for allergoidbehandlede pasienter var 567/Ug AgE-ekvivalenter (1135,7 enheter) som er 80,6 ganger.storre

enn den gjennomsnittlige, kumulative dosering på 7,0^ug AgE-ekvivalenter (704 enheter) for den allergenbehåndlede gruppe. Generelt kunne doseringene vesentlig okes for hver.,

ny hovedbehandling, og hovedhindringen var at det fant sted 5 systemiske reaksjoner i den allergenbehåndlede gruppe (deriblant én i pasienten som avbrot behandlingen) og én'i den allergoidbehandlede gruppe, disse er angitt med stjerne i tabell I og II og er vurdert med hensyn til frekvens og alvor i tabell V.

Lokale reaksjoner ble poengberegnet på folgende måte:

1+ (1 poeng): Hevelse opp til 10 cm i diameter;

2+ (2 poeng): Hevelse 10 - 20 cm i diameter;

3+ (3 poeng): Storre enn 20 cm, men utbredelse ikke lenger

enn til albuen;

4+ (4 poeng): Hevelsen når lengre enn albuen (opptrådte ikke

i denne serien).

Systemiske reaksjoner ble poengberegnet på folgende måte:

1+ (1 poeng): Hvilke som helst systemiske symptomer ut over det lokale injeksjonsområdet, men hvor det ikke var behov for epinefrin;

2+ (2 poeng): Elveblest, hoyfeber og astmasymptomer som krevde epinefrin, blodtrykk normalt;

3+ (3 poeng): Systemiske, allergiske symptomer med blod-trykkssenkning (fant ikke sted i denne serien); 4+ (4 poeng): Direkte anafylakse krevde øyeblikkelig hjelp .

(fant ikke sted).

De systemiske reaksjoner fant sted i lopet av

en halv time etter antigentilfbrsél og, om nbdvendig, ble de øyeblikkelig reversert ved tilfbrsel av epinefrin. Hoved-delen av andre negative reaksjoner bestod i lokal oppsvulm-ing på tilfSrselsstedene ved hoyere antigendoseringer. Disse reaksjonene startet etter ca. 6 timer og nådde sitt maksimum ca. 24 timer etter injeksjonene. Den gjennomsnittlige poeng-

beregning for slike lokale reaksjoner, var omtrent den sammé

i begge pasientgrupper (tabell V).

Undersøkelse av blodkjemi (SMA-11) og-urinanaly- ■;-tiske data viser ingen negative giftige reaksjoner som et resultat av behandlingen med allergoid eller allergen.

Siden det er nodvendig å gjenta flere doble antilegeme-radioimmunologiske eksperimenter for måling av serum IgG-antilegemet til antigen E, tok man spesielt sikte på å sikre god reproduserbarhet fra ett eksperiment til det neste. Fig. 1 viser den hbye grad av reproduserbarhet man fikk for standardkurver i 14 av 15 av de prover som ble gjennomfort. Standardproven for den gjenværende prove lå utenfor grensen av de andre prover- og data i disse'eksperimentene ble for-kastet. Siden antilegememålinger ble utfort for enkel ser-umfortynning gjennom det meste av studiet, var det vesentlig å sikre at helningene av bindekurvene for hver pasient ikke kunne skilles fra kontrollkurven. Derfor ble det tatt til-feldig valgt serum fra hver pasient og hele bindingskurven ble utprovet,dg det ble påvist at bindingskurvene for hver pasient ikke var vesentlig forskjellig fra standarden (fig. 2), noe som ga den vesentlige begrunnelse for anvendelse av en enkel fortynning når det gjaldt å undersbke antilegemenivået i de gjenværende serum. Fig. 2 - 4 viser anti-antigen E IgG-respons i 6 par av pasienter som gjennomførte studiet, og fig. 6 viser de 2 som avbrot. Etter den fbrste serie innsprbytninger på dag 0, steg IgG-antilegeme-titrertallene vesentlig i de fleste pasienter og nådde platånivåer etter mellom 2 og 3 uker. Etter å ha: fastslått at platånivåer vesentlig var nådd i de fleste pasienter, ved å måle antilegeme-titrertall i en serie av fire-til-fem etterfølgende blodprbver, ble en annen serie injeksjoner gitt mellom dag 28 og 42. Etter ytterligere 3-4 uker, synes man å ha nådd et annet platå-nivå i de fleste pasienter og ga ytterligere én injeksjonsbehandling. Ytterligere 2 eller 3 injeksjonsbehandlinger ble tilfort for-ambrosiasesongen i midten av august. På grunn av tidsknapphet for sesongen, var man ikke istand til å vente og forsikre seg om at platånivåene var nådd i alle pasienter mellom gjennomfbring av disse siste•behandlinger. Fig. 2 5 illustrerer at pasientene startet med meget forskjellige antilegemenivåer for behandlingen (3-114 enheter/ml). Antilegemenivåene steg i alle pasienter etter behandling, og den allergoidbehandlede gruppe hadde en 5,7 ganger hSyere geometrisk gjennomsnittlig okning og et 5,2 ganger hoyere topp titrertall enn den allergenbehåndlede gruppe. Med unntak av par nr. 2, fikk alle allergoidbehandlede pasienter en storre antilégemestigning, vanligvis 5 - 20 ganger storre, enn de allergenbehåndlede motpartér. Av storre viktighet er påvisningen at etter bare 2 immuniser-ingsbehandler, ga allergoidbehandlede pasienter gjennomsnittlig 47% (området 15 - 91%) av den maksimale antilegemerespons som ble oppnådd etter den.fulle behandling. De korresponderende data for allergenbehåndlede individer var 32% (området 6 43%) av maksimal respons etter 2 injeksjonsbehandlinger. Stigningen i det geometriske gjennomsnitt

etter bare 2 behandlinger var 7,9.ganger storre i den allergoid- enn i den allergenbehåndlede gruppe. Uventet fant man at alle, bortsett fra én pasient, (G.T., Gen nr. 4) beholdt. IgG-antilegemetall på opptil 50 - 100% av toppnivåene 3^ måned etter siste injeksjon som er 2 måneder etter ambrosiasesongen.

Fig. 6 illustrerer forholdet mellom kumulativ antig-gen-dosering (uttrykt i^ug AgE-ekvivalenter) og total okning i IgG-antilegemerespons (topprespons minus opprinnelig nivå) for alle 12 pasienter som avsluttet studiet. Det var en klar sammenheng mellom antilegemerespons og dosering uav-hengig av om pasienten ble behandlet med allergen eller allergoid. Siden regresjpnslinjene for de to grupper ikke var vesentlig forskjellige, ble data for alle 12 pasienter slått sammen. Ved lineær regresjonsanalyse av log (antilegeme-titrertall) mot log dosering, er korrelasjonskoeffisienten r = 0,83; P < 0,001. De korresponderende data for antilegemerespons mot kumulativ dosering etter bare 2 injeksjoner viste en tilsvarende korrelasjon (r = 0,81; p< 0,001).

De gjennomsnittlige .dag-til-dag-symptom-poengoall

i de to grupper pasienter i pollensesongen 1977 (fig. 7)

viser en trend mot lavere total symptomatologi i lopet av

sesongen. Dette bekreftes av analyse av gjennomsnittlig daglige poengtall for hver pasient, med gjennomsnitt over hele sesongen (fig. 8A). Det gjennomsnittlige poengtall for den allergoidbehandlede gruppe var 1,1 symptomenhet mindre enn den allergenbehåndlede gruppe. Disse resultater var ikke sta-tistisk forskjellige med disse få pasienter. Tidligere studier (Norman, P.S., Winkenwerder, W.L. og Lichtenstein, L.M., 1971,. J. Allergy, 47, 273) har vist at gjennomsnittlige daglige symptompoengtall for hele ambrosiasesongen for tilsvarende fblsomme placebo-behandlede pasienter vanligvis•faller i området 7 - 10 enheter, med topppunkt for gjennomsnittlige daglige poengtall på mellom 12 og 14 enheter. De fleste pasienter synes derfor å gjore det bedre enn det man kunne vente med en tilsvarende placebo-gruppe. Poengtallene i våre behandlede pasienter er tilsvarende til de man har funnet i pasienter (også tidligere ubehandlede) som ble underkastet en vanlig behandling med 16 - 24 ukentlige injeksjoner av antigen i

vår 1973-studie. av allergen mot allergoid (fig. 8B). Legens vurdering av pasientene under sesongen falt sammen med de ovenfor selv-vurderte symptompoeng.

Diskusjon

Foreliggende studie representerer det fbrste syste-matiske forsok på å forsoke å definere en optimal behandling når det gjelder antigendosering og avstand mellom injeksjonene for :immunoterapi av allergiske pasienter. For dette formål har man benyttet et intensivt "haste"-program som består av 1-5 injeksjoner på hver behandlingsdag. Denne protokollen tillater legen å tilfore en optimal tolerert dosering til pasienten. I de fleste tilfeller er slike doseringer 100 - 10.000 ganger storre enn de som vanligvis tilfores fbrste dag i pasientens behandling. Når det gjelder allergoid, forer den hbye behandlingsdosering på den fbrste injeksjons-

dag til en vesentlig (10 - 100 ganger) bkning i IgG-antilegeme til antigen E 2 - 3 uker senere. En annen injeksjonsbehandling med hoyere dosering kan derfor benyttes som forer til en antilegemerespons som i gjennomsnitt er 50% av det man får etter ytterligere 2-3 behandlinger med innsprøytning med.en hby dose allergoid.

Det vil fremgå av antilegeme-studiene at et. injek-sjonsintervall på 2 - 4 uker kan være optimalt, siden pasienten på dette tidspunkt har fått maksimal respons-overfor immu-'nisering. Det er Imidlertid mulig at et noe storre intervall som tillater ytterligere rekruttering av IgG-antilegeme-pro-duserende celler, kan vise seg å være noe mer effektivt for-utsatt at antilegemenivåene ikke får falle for drastisk.

På tross av den hbye dosering (spesielt med allergoid), fant man ingen negative, giftige reaksjoner i noen av de behandlede pasienter.

Disse studier viser en klar fordel for allergoid

i forhold til allergen idet meget hoye doser allergoid kan tilfores pasienten med relativt liten risiko for systemiske reaksjoner, og med resulterende hby nivåer for. IgG-antilegeme.

I det foreliggende studiet var det eneste unntak fra denne regel pasienten D.H. i allergoidpar nr. 2. Denne personen viste en hoyere enn normal sensitivitet overfor allergoid,

og i retrospekt, synes det mer sannsynlig at den opprinne-

lige behandling ble kjbrt for hardt i'dette tilfellet. Opp-treden av systemiske reaksjoner i den allergenbehåndlede gruppe var i gjennomsnitt 0,7 pr. pasient, med en gjennomsnittlig poengberegning for reaksjoner på 0,8 pr. pasient (dette omfatter de som avbrot). Dette er for hoyt for at man kan anbefale en slik intensiv doseringsskala for "haste"-behandling med allergen.

Denne studien som er utfort med to små grupper . pasienter behandlet med allergen og allergoid oppmuntrer til å fortsette med storre pasientgrupper for å sammenligne kon-vensjonell behandling for allergen med den modifiserte "håste"-behandling for allergoid..

Det er underforstått at oppfinnelsen bare er begrenset av de vedheftede krav..

Claims (44)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av aldehydbehandlet, allergen med lav allergenisk reaktivitet i allergiske mennesker og som beholder de onskede immuniserende egenskaper i det opprinnelige allergen som forer til en forbedring av

symptomatologien i allergiske individer og en samtidig fremstilling av blokkerende antilegeme som ansees å være for-bundet med, men som ikke nodvendigvis alene er ansvarlig'" for, en slik lindring av symptomer, og som er istand til i pattedyr å frembringe dannelse av blokkerende antilegemer mot det opprinnelige allergen i tilstrekkelig konsentrasjon, karakterisert ved at allergener for å reagere kjemisk under milde betingelser med en opplbsning som er valgt fra gruppen som består av formaldehyd, lavere, mettet, alifatisk di-funksjonelle aldehyder og kombinasjoner av disse, i en rekke trinn med forbehold av at en eventuell formalde-hydreaksjon utfores i et ikke-fenolisk miljb.

2. Fremgangsmåte ifolge krav.l, karakterisert ved at der er en fbrste trinns reaksjon som utfores ved en temperatur på fra like over frysepunktet for opplesningen til 15°C, og ved at hvert etterfølgende trinn utfores ved en temperatur på fra ca. 25 - 40°C, med en hvilken som helst kombinasjon av formaldehyd og dialdehyd i hvert av de etterfølgende trinn.

3. Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at aldehydet i alle trinn er formaldehyd.

4. Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at aldehydet i alle trinn er et dialdehyd med formelen:

hvor n er et helt tall fra 1 - ca. 6.

5. Fremgangsmåte ifolge krav 2, k a r a'k t e r i-sert ved at aldehyd i alle. trinn er glutaraldehyd.

6. Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at aldehydet er en kombinasjon av formaldehyd og dialdehyder benyttet som en blanding i hvert trinn eller som individuelle aldehyder i etterfblgehde trinn.

7. Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at aldehydet er. en kombinasjon av formaldehyd og glutaraldehyd anvendt som en blanding i hvert trinn eller som individuelle aldehyder i etterfølgende trinn.

8. Fremgangsmåte ifolge krav 2, karakterisert ved at allergenene får omsettes med'nevnte aldehyd eller aldehyder i to trinn.

9. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved . at der er tilstede sammen med nevnte for- . tynnede formaldehydopplbsning minst ett tilsatsstoff valgt fra gruppen som består av 1,4-diaminobutan, lysin, ornitin, 1,5-diamino-pimelinsyre, arginin, adipamid, aspartinsyre, serin og alanin.

10. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det materialet som inneholder.allergen er et vandig ekstrakt av en pollensUbstans.

11. Fremgangsmåte ifolge krav 1,. karakterisert ved at materialet som inneholder pollen er et vandig ekstrakt av gresspollensubstans.

12. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det materiale som inneholder allergen inneholder et gruppe I gresspollen-allergenpreparat.

13. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at materialet som inneholder allergen er et vandig ekstrakt av ugresspollensubstans.

14. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det allergenholdige materialet er et vandig ekstrakt av en trepollensubstans.

15. Fremgangsmåte ifolge krav 1, k a r a k t e r i-S e r t v e d at det materialet som inneholder pollen inneholder ambrosiapollens antigen E.

16. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det materialet som inneholder pollen er et vandig ekstrakt som inneholder husstbvmidd eller deres rester.

17. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at materialet som inneholder, pollen er et vandig ekstrakt av en sopp eller, flere.

18. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at materialet som inneholder pollen er et vandig ekstrakt av et insekt eller et insektprodukt.

19. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det materialet.som inneholder pollen er et vandig ekstrakt av dyreflass/hud/hår.

20. Fremgangsmåte if&Mge krav 1, karakter i-» sert v e d at det materialet som inneholder pollen er et vandig ekstrakt av et matallergen.

21. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det materialet som. inneholder pollen er et renset allergenpreparat.

22. Produkt, karakterisert , ved at det. er fremstilt ifolge fremgangsmåten etter krav 1.'

23. Produkt, karakterisert v.edat det er fremstilt ifolge fremgangsmåten'etter krav 2.

24. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 3«

25. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 4.■

26. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 5.

27. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 6.

28. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 7.

29. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 8.

30. Produkt, karakterisert ved at det er. fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 9.

31. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 10.

32. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 11.

33. Produkt, karakterisert ved at det ér fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 12.

34. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt ifolge fremgangsmåten etter krav 13.

35. Produkt, karakterisert vedat det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 14.

36. Produkt, karakterisert ved - at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 15.

37. " Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 16.

38. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 17.

39. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 18.

40. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 19.

41. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 20.

42. Produkt, karakterisert ved .at det er fremstilt etter fremgangsmåten, ifolge krav 21.

43. Fremgangsmåte for fremstilling av et aldehydbe-hah dlet allergen med lav allergenisk reaktivitet i allergiske mennesker og som beholder de onskede immuniserende egenskaper av det opprinnelige allergen som forer til forbedring av symptomatologien i allergiske individer med den sam-hbrende produksjon av blokkerende antilegeme som betrakter som tilknyttet til, men ikke nodvendigvis alene ansvarlig for, en slik lindring av symptomene og som er istand til i pattedyr å frembringe dannelsen av blokkerende antilegemer mot det opprinnelige allergen i tilstrekkelig konsentrasjon» karakterisert ved at allergenene får reagere kjemisk under milde betingelser med en blanding av minst to medlemmer av gruppen som består av formaldehyd og et lavere, mettet, difunksjonelt aldehyd, i minst ett trinn, med det forbehold at eventuelle formaldehydreaksjoner utfores i et.ikke-fenolisk miljb.

44. Produkt, karakterisert ved at det er fremstilt etter fremgangsmåten ifolge krav 43.