CH650592A5

CH650592A5 - Reagenz zur verwendung bei immunoassays sowie verfahren zur durchfuehrung des immunoassays.

Info

Publication number: CH650592A5
Application number: CH822/79A
Authority: CH
Inventors: Claude Henry Moussebois; Joseph Nicolas Limet; Cesar Lorenzo Cambiaso; Pierre Lucien Masson
Original assignee: Technicon Instr
Priority date: 1978-01-26
Filing date: 1979-01-26
Publication date: 1985-07-31
Also published as: US4253844A; FR2415810A1; IT1119258B; GB2013688B; NL7900585A; AU4356679A; NL185798C; JPS6338667B2; SE445150B; AU522762B2; BE873674A; DE2902677C2; GB2013688A; IT7967166A0; NL185798B; SE7900662L; FR2415810B1; CA1118344A; DE2902677A1; JPS54119293A

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz enthaltend unlöslich gemachte Antikörper oder Untergruppen davon oder Proteinantigene zur Verwendung bei Immunoassays, ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays unter Verwendung des genannten Reagenzes, ein Verfahren zur Herstellung des Reagenzes sowie eine brückenbildende Substanz als Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung des Reagenzes.

Bekanntlich werden unlöslich gemachte Antikörper und Antigene als Reagenzien bei verschiedenen Immunoassays verwendet. Diese Reagenzien werden normalerweise hergestellt, indem man entweder das Antigen oder den Antikörper an einen wasserunlöslichen Träger adsorbiert oder Antikörper oder Antigen an einen wasserunlöslichen Träger kovalent bindet, wobei eine bifunktionelle Brückengruppe eingesetzt wird. Unter den am allgemeinsten verwendbaren bifunktionellen Brückengruppen sind die Dialdehyde, wie beispielsweise Glutaraldehyd, zu nennen. Derartige Brückengruppen reagieren leicht mit freien Aminogruppen im Antikörper oder im Proteinantigen.

Bei vielen Immunoassayverfahren, bei denen unlöslich gemachte Antikörper oder Proteinantigene verwendet werden, treten die wohlbekannten immunospezifischen Reaktionen zwischen einem bestimmten Antikörper (oder Antigen) und dessen entsprechendem Antigen (bzw. Antikörper) auf. Bekanntlich gibt es in den Proteinmolekülen bestimmte aktive Stellen, die für derartige Umsetzungen spezifisch sind, und es ist weiter bekannt, dass an diesen aktiven Stellen oder ihnen benachbart freie Aminogruppen sitzen. Wenn ein Antikörper (oder Proteinantigen) durch kovalentes Überbrücken gemäss den üblichen Verfahren unlöslich gemacht wird, werden daher die aktiven Stellen in gewissem Ausmass blockiert. Dadurch wird die Aktivität des Proteins bei einer folgenden immunspezifischen Reaktion, wie beispielsweise bei einem Immunoassay, verringert, was von Nachteil ist.

Es wurde nun ein Verfahren zur Überwindung oder Verminderung dieses Nachteils gefunden. Insbesondere wurde gefunden, dass Antikörper und Proteinantigene durch kova-lente Bindung an ein wasserunlösliches Substrat unlöslich gemacht werden können, wobei diese Bindung über eine als Brücke dienende Gruppe erfolgt, die sich eher an die im Protein vorhandenen Schwefelatome als an die Aminogruppen bindet.

Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, enthaltend ein Proteinantigen, einen Antikörper oder die F(ab')2-Untergruppen eines Antikörpers, kovalent über eine Brückengruppe an ein wasserunlösliches Substrat gebunden, wobei die Brückengruppe über das a-Kohlenstoffatom eines in ihr enthaltenen Acetylrestes unmittelbar mit Schwefelatomen in dem Antigen, dem Antikörper oder den Untergruppen verknüpft ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine immunspezifische Umsetzung zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder F(ab')2-Untergruppen davon unter Verwendung des weiter oben definierten Reagenzes durchführt.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Reagenzes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Proteinantigen oder einen Antikörper oder die F(ab')2-Untergruppen davon mit einer einen Monochloracetylrest enthaltenden brückenbildenden Substanz unter kovalenter Bindung der brückenbil5

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denden Substanz über den Monochloracetylrest an Schwefelatome in dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den Untergruppen davon umsetzt und vor oder nach dieser Umsetzung die brückenbildende Substanz kovalent an ein wasserunlösliches Substrat bindet.

Schliesslich bezieht sich die Erfindung auch auf die brük-kenbildende Substanz als Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemässen Reagenzes, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sich eine Monochlorace-tylgruppe enthält.

Eine solche bevorzugte Verbindung weist die Formel auf

0 - CO - NH

1

CO

CH

(CH,,)

2Jn

NHC0CH2C1,

vorliegt. Eine derartige Gruppe reagiert leicht mit freien Aminogruppen eines Proteins, wie beispielsweise des Albumins.

Zur Herstellung eines erfindungsgemässen Reagenzes, in dem ein Antikörper oder ein Proteinantigen kovalent an ein 5 Protein, wie beispielsweise Albumin, gebunden ist, wird vorzugsweise eine bifunktionelle, brückenbildende Substanz verwendet, die an dem einen Ende die Chloracetylgruppe I und am anderen Ende die Anhydridgruppe II aufweist. Eine besonders bevorzugte Klasse für derartige brückenbildende io Mittel ist diejenige der allgemeinen Formel

0 H

0-C-NH I i CO—CH

(CH2)n—-NH-CO-CHg- Cl

[ml worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 4, ist.

Antikörper-Immunglobuline enthalten eine Anzahl von Polypeptidketten, die in bestimmten Abständen durch Disul-fidbindungen miteinander verknüpft sind, die Ketten selbst können ebenfalls Disulfidgruppen enthalten. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden bevorzugt die Disulfidbin-dungen einer milden Reduktion zu Sulfhydrylgruppen -SH unterworfen, wobei diese dann mit dem Monochloracetylrest -CO-CH2-CI (I) als der einen funktionellen Gruppe eines bifunktionellen brückenbildenden Mittels umgesetzt werden.

Die andere funktionelle Gruppe des bifunktionellen brük-kenbildenden Mittels reagiert in der Regel mit dem wasserunlöslichen Substrat, an das der Antikörper oder das Proteinantigen gebunden werden soll. Die Natur dieser funktionellen reaktiven Gruppe hängt von der Art des gewählten Substrats ab, und es sind viele geeignete Substrate (sowie mit ihnen reaktionsfähige funktionelle Gruppen) bekannt. Das Substrat kann beispielsweise in Folienform oder in Form eines Rohres vorliegen. Im letztgenannten Fall kann das Antigen oder der Antikörper an der Innen- oder der Aussenseite des Rohres oder an beiden Seiten immobilisiert werden. Vornehmlich liegt das Substrat jedoch in Teilchenform vor, und die Reagenzien gemäss der Erfindung können dann beispielsweise aus den Teilchen in Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit bestehen, die zweckmässigerweise einen Puffer enthalten kann. In einer bevorzugten Durchführungsform ist das teil-chenförmige Substrat magnetisch anziehbar, so dass es leicht durch Anwendung eines Magnetfeldes aus einem Gemisch abgetrennt werden kann. Die Verwendung von teilchenförmi-gem Material in Immunoassays ist ebenfalls bekannt. Ein besonders bevorzugtes teilchenförmiges Substrat besteht aus Latexteilchen.

Die Art des Materials, aus dem das Substrat zusammengesetzt ist, ist nicht von entscheidender Bedeutung, wenn es nur in der Lage ist, mit einem Ende oder Teil des brückenbildenden Mittels zu reagieren. Künstliche polymere Materialien, die wasserunlöslich sind, können zur Ausbildung des Substrats verwendet werden, wobei normalerweise derartige Substrate mit einem reaktionsfähigen Überzug versehen werden, beispielsweise einem Proteinüberzug. Ein typisches Protein, das sich für diesen Zweck eignet, ist Albumin. In derartigen Fällen enthält die brückenbildende Substanz als eine funktionelle Gruppe eine Gruppe, die leicht mit Albumin reagiert. Zwar sind mehrere derartige Gruppen bekannt, jedoch wird gemäss einem bevorzugten Merkmal der Erfindung ein Anhydrid verwendet, das bevorzugt als ein solches der Formel

CO— 0V I > =

R-CH— NH'

(n;

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 und vorzugsweise 4 bedeutet. Diese Verbindungen sind selbst neu und als solche Gegenstand der Erfindung als Mittel zur Herstellung des 20 erfindungsgemässen Reagenzes. Die Verbindung gemäss Formel III mit n = 4 wird im folgenden als «NCA» bezeichnet.

Wenn wie bei der Verbindung NCA und den anderen Verbindungen der Formel III das brückenbildende Mittel eine funktionelle Gruppe enthält, die leicht mit den Aminogrup-25 pen des Proteins reagiert, ist es wichtig, sicherzustellen, dass diese funktionelle Gruppe nicht mit freien Aminogruppen in dem Antigen, dem Antikörper bzw. den F(ab')i-Untergruppen davon reagiert. Das kann dadurch geschehen, dass man beispielsweise das brückenbildende Mittel zunächst mit dem 30 wasserunlöslichen Träger umsetzt und lediglich danach mit dem Immunglobulin-Antikörper oder Proteinantigen in Berührung bringt.

Im folgenden wird ein Beispiel für ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäss der Erfindung 35 beschrieben: Latexteilchen werden mit Albumin (oder einem anderen Protein oder Polypeptid, wie Lactoferrin) überzogen, wobei das Albumin an die Latexteilchen adsorbiert wird. Im Falle eines Sulfidgruppen enthaltenden Überzuges, die mit den brückenbildenden Substanzen reagieren können, wie bei-40 spielsweise im Falle einer Beschichtung mit Albumin, wird das Beschichtungsmaterial (vor oder nach Ausbildung der Beschichtung) alkyliert, um derartige Gruppen zu zerstören oder zu inaktivieren. Die mit Albumin überzogenen Teilchen werden anschliessend etwa 24 h bei neutralem pH-Wert (bei-45 spielsweise 7,1) mit NCA bebrütet, und die Anhydridgruppen des NCA reagieren mit den Aminogruppen an dem Albumin. (Alternativ kann das NCA zunächst an das alkylierte Albumin gekuppelt werden, und die Teilchen können mit der erhaltenen Verbindung beschichtet werden.) 50 Der Antikörper wird unter milden Bedingungen reduziert (beispielsweise mit Dithiothreit), um an ihm Sulfhydrylgruppen zu erzeugen. Anschliessend wird er mit den Latex-Albu-min-NCA-Teilchen vermischt und das Ganze bei Raumtemperatur 36 h bebrütet. Der Antikörper reagiert mit den Chlor-55 acetylgruppen am NCA und wird somit kovalent über das NCA an das Albumin gebunden.

Von den verschiedenen Antikörper-Immunglobulinen ist das IgG das gebräuchlichste. Bekanntlich nehmen IgG-Mole-küle leicht die Form eines Y an, wobei die beiden oberen 60 Glieder (F(ab')2-Anteile) an ihren äusseren Enden die Stellen für die Antigenbindung enthalten und das untere Glied (F(c)-Anteil) unter anderem Stellen enthält, an denen beispielsweise Umsetzungen mit dem Rheumatoidfaktor und der Komponente Clq ablaufen. Die Stelle, an der die drei Glie-65 der des Y zusammenstossen, wird der Verzweigungsbereich (hinge area) genannt. In diesem Bereich treten Disulfidbin-dungen zwischen benachbarten Polypeptidketten auf, und vermutlich mit diesen Bindungen reagieren die bevorzugten

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brückenbildenden Mittel bei der Herstellung des Reagenzes. Es ergibt sich deshalb, dass die als Brücken dienenden Gruppen die Antigenbindungsstellen an den F(ab')2-Anteilen der Moleküle nicht stören.

Erfindungsgemäss ist es bevorzugt, eine brückenbildende Substanz zu verwenden, die eine Kette von mindestens 5 Atomen Länge enthält (noch stärker bevorzugt sind brückenbildende Mittel gemäss Formel III, in denen n 4 oder grösser ist), um den Antikörper (beispielsweise IgG) oder das Antigen in einer gewissen Entfernung von der Substratoberfläche, an die sie gebunden sind, zu halten. Dies führt dazu, dass das Antigen oder der Antikörper für Umsetzungen besser zugänglich sind als bei früheren Verfahren, bei denen beispielsweise als brückenbildende Mittel Bromcyan oder Glutaraldehyd verwendet werden. Somit wurde gefunden, dass die Aktivität eines Antikörpers an einem erfindungsgemässen Reagenz unter Verwendung von NCA sehr viel grösser ist als in dem Fall, wenn derselbe Antikörper unmittelbar an das Substrat adsorbiert worden ist. Beispielsweise ist die Empfindlichkeit des Tests bei einem Agglutinierungsassay unter Verwendung von Latex-Rinderserumalbumin-NCA-Antikörper und -Antigen etwa 50mal grösser als in dem Fall, in dem der Antikörper lediglich unmittelbar an den Latex adsorbiert war (in diesem Falle war das Antigen Pferdeferritin und der Antikörper Kaninchenantiferritin).

In der britischen Patentanmeldung 3237/78 ist ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays beschrieben, bei dem anstelle des Gesamtimmunglobulins die F(ab')2-Unter-gruppen davon verwendet werden. Die Reagenzien gemäss der Erfindung können anstelle des Antikörpers auch die F(ab')2-Untergruppen davon enthalten. Derartige Reagenzien können in äusserst vorteilhafter Weise unter Erwendung der Verbindungen gemäss Formel III, vorzugsweise von NCA, wie folgt hergestellt werden: Nach Herstellung der Latex-Albumin-NCA-Antikörperteilchen, bei denen der Antikörper beispielsweise IgG ist, wie oben ausführlich beschrieben, werden die Teilchen mit Pepsin digeriert. Dies führt zur Bildung von Latex-Albumin-NCA-F(ab')2, d.h. die F(c)-Untergruppe ist nicht länger anwesend. Am meisten bevorzugt ist es, dass die Reagenzien gemäss der Erfindung, die die F(ab')2-Untergruppen von IgG enthalten, praktisch frei von dem entsprechenden Gesamt-IgG und den F(c)-Untergrup-pen sind. Weiter Einzelheiten bezüglich der Verwendung der F(ab')2-Untergruppen in Immunoassays sind der genannten Patentanmeldung zu entnehmen.

Die erfindungsgemässen Reagenzien können in einer grossen Vielfalt von Immunoassayverfahren verwendet werden, wie dem Fachmann klar ist. Ein bevorzugtes Verfahren gemäss der Erfindung zur Bestimmung eines Antigens in einer Flüssigkeit besteht darin, dass man a) ein Gemisch einer Probe der Flüssigkeit mit einem erfindungsgemässen Reagenz, das einen Antikörper oder eine F(ab')2-Untergruppe davon, die an das zu bestimmende Antigen gebunden werden, enthält, herstellt,

b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung bebrütet und c) das Gemisch zur Bestimmung des Ausmasses der Umsetzung und dadurch der Menge an Antigen in der Flüssigkeitsprobe untersucht.

Wenn ein Reagenz gemäss der Erfindung verwendet wird, das F(ab')2-Untergruppen enthält, ist das Umsetzungsgemisch vorzugsweise praktisch frei von dem entsprechenden Immunglobulin und den F(c)-Untergruppen davon.

Ein analoges Verfahren kann zur Bestimmung eines Antikörpers in einer Flüssigkeit angewandt werden, wobei ein entsprechendes Proteinantigen verwendet wird, an das sich der Antikörper bindet.

Ein sehr bevorzugtes erfindungsgemässes Verfahren zur

Durchführung eines Assays ist der Latexagglutinierungsassay. Bei diesem Assay wird ein Reagenz in der Form einer Suspension von Latexteilchen verwendet, wobei die Teilchen nach Umsetzung mit dem zu ermittelnden Antigen oder Antikörper agglutinieren. Das Ausmass der Umsetzung wird durch Beobachten des Ausmasses der Agglutinierung bestimmt, woraus sich die Menge an dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper in der Flüssigkeitsprobe ermitteln lässt. Am meisten bevorzugt ist es, das Ausmass der Agglutinierung durch selektives Auszählen der nicht agglutinierten Latexteilchen zu bestimmen, die in dem Umsetzungsgemisch zurückbleiben.

Bei einem weiteren bevorzugten erfindungsgemässen Verfahren zur Durchführung eines Assays enthält das Reagenz Teilchen, die anschliessend aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, wobei entweder die abgetrennten Teilchen oder das zurückbleibende Gemisch oder beides analysiert werden, um die Menge an zu bestimmendem Antigen oder Antikörper festzustellen. Vorzugsweise sind die Teilchen magnetisch anziehbar und werden unter Anwendung eines Magnetfeldes abgetrennt. Die Verwendung von magnetischen Teilchen auf diese Weise ist in der belgischen Patentschrift 852 327 im einzelnen beschrieben.

Das Assayverfahren gemäss der Erfindung kann auf eine Vielzahl von Flüssigkeiten angewandt werden, jedoch werden üblicherweise am meisten menschliche Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum oder Plasma, untersucht.

Die erfindungsgemässen Verfahren können manuell oder automatisch durchgeführt werden, beispielsweise nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses, wobei einzelne Abschnitte des Reaktionsgemisches, getrennt durch Inertstoffsegmente, wie beispielsweise Luft, und gewünschtenfalls durch Abschnitte aus einer Waschflüssigkeit, eine Leitung entlanggeschickt werden. Dieses Verfahren ist im einzelnen in der US-PS 2 797 149 beschrieben.

Im allgemeinen können die teilchenförmigen Reagenzien gemäss der Erfindung eine beliebige zweckmässige Teilchen-grösse aufweisen. Für die meisten Zwecke ist eine Teilchen-grösse von etwa 1 bis 20 u geeignet. Besonders, jedoch nicht ausschliesslich in dem Falle der Verwendung bei der kontinuierlichen Durchflusstechnik muss das spezifische Gewicht der Teilchen vorzugsweise etwa 1,4 bis 3,2 betragen (oder mindestens demjenigen der Flüssigkeit des Reaktionsgemisches benachbart sein), um ein übermässiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in dem fliessenden flüssigen Reaktionsgemisch zu vermeiden.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Serum- oder Plasmaprobe mit einem zu bestimmenden Gehalt an Antigen wird mit einer Suspension aus Latexteilchen vermischt, an die Antikörper gegenüber diesem Antigen gebunden sind. Das Gemisch wird in eine mit Luftabschnitten versehene Leitung geführt. Es wird in einer Verzögerungsschlange gehalten und dort 15 bis 20 min bei 50 Hz einer Vibrationsbehandlung unterzogen, um die starke Agglutinierung zu beschleunigen. Die Latexteilchen wurden nacheinander im Verhältnis 1:80 und noch einmal 1:80 verdünnt, so dass eine Endverdünnung von 1:6400 erhalten wurde. Anschliessend wurden die Teilchen durch eine Zählapparatur geführt, die elektronisch speziell so modifiziert worden war, dass sämtliche nichtmonomeren Teilchen zurückgewiesen wurden.

Die Abnahme in der Monomerenanzahl ist direkt proportional der Konzentration an dem vorhandenen Antigen.

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Zusätze

Serum (Antigen)

Latex

(Antikörper)

Puffer als Verdünnungsmittel

Analytisches gezählte

Verfahren

min

Monomere

>

f

Entfernte Bestandteile

Agglutinierter Latex (elektronisch abgewiesen)

Beispiel 2

Herstellung des Reagenzes Latexteilchen

Dow®, 0,794 ,u Durchmesser (Standardabweichung (S.D.) 0,044 u) No. 41943, Serva, Feinbiochemica, D-6900 Heidelberg 1 (10%ige Suspension).

Alkyliertes Rinderserumalbumin

Alkyliertes Rinderserumalbumin wurde wie folgt hergestellt. Eine Lösung von Rinderserumalbumin in 0,1m Phosphatpuffer vom pH 8,5 wurde mit dem fünfmolaren Überschuss von Dithiothreit vermischt und 1 h bei 37 °C belassen. Das Dithiothreit reduziert das Rinderserumalbumin. Danach wird Jodessigsäure im zehnfachen Überschuss, bezogen auf Dithiothreit, zugesetzt. Nach 2 h Stehen bei Raumtemperatur wurde das Rinderserumalbumin abgetrennt und der alkalische Anteil an Sephadex G25 in einer Phosphatpufferlösung (0,1 m, pH 7,2) ins Gleichgewicht gebracht.

Kuppeln von NCA an Rinderserumalbumin

Das alkylierte Rinderserumalbumin in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH 7,2 wurde mit '/? seines Gewichtes an NCA bei 4 °C über Nacht bebrütet. Das Protein kann nach Dialyse bei pH 7 unmittelbar verwendet oder nach Dialyse in Ammoni-umbicarbonat lyophilisiert werden.

Kuppeln von Rinderserumalbumin/NCA an Latex

0,4 ml Phosphatpuffer vom pH 7,1 wurden in einem Glasrohr mit 250 mg Rinderserumalbumin/NCA in Phosphatpuffer sowie 50 ml der 10%igen Latexsuspension vermischt. Kurz vor dem Gebrauch wurde der zu behandelnde Latex zweimal mit 0,1 m Pufferlösung vom pH 9,6 gewaschen und dann erneut in demselben Puffer suspendiert.

Reduktion von IgG

Antiferritinantiserum vom Schaf wurde unter milden Bedingungen in Dithiothreit wie folgt reduziert. Das IgG wurde 1 h in Gegenwart eines zweimolaren Überschusses von Dithiothreit in einer Lösung von 0,1 m Bicarbonat vom pH 8,5 bebrütet.

Latex-Rinderserumalbumin/NCA-IgG

50 ml 10%iger Suspension von Latex-Rinderserumalbu-min/NCA wurden mit 1 mg reduziertem IgG vermischt. Das Gemisch wurde 30 min mit Stickstoff durchspült und anschliessend unter weniger als 5 mm Hg Druck in einem Glasrohr verschlossen und im Dunkeln gehalten. Vor seiner

Verwendung wurde es zweimal mit 1 ml Puffer aus 0,17 m NaCl, 0,1 m Glycin (pH 9,2) und 0,05% Tween 20 gewaschen und anschliessend in l%igem Rinderserumalbumin in demselben Puffer (0,27 m), jedoch in Abwesenheit von Tween 20 5 suspendiert.

Assay

Das Agglutinierungsassay auf Ferritin im Serum wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Es wurden Sera mit 27 io unterschiedlichen Ferritingehalten untersucht, wobei jedes Serum mehrere Male bestimmt wurde. Die Sera wurden ausserdem nach dem Radioimmunoassay-Verfahren RAMCO untersucht. Der Korrelationskoeffizient zwischen den beiden Assaymethoden betrug 0,92. Die Serumproben wurden bei 15 einer Verdünnung von 20:1 dem Assay unterzogen und besas-sen einen normalen Gehalt von 20 bis 300 ug Ferritin/1.

20 Beispiel 3

Herstellung von NCA

442 mg (0,00123 Mol) e-N-Chloracetyl-a-carbobenzoxy-L-lysin wurden bei 25 °C in 1 ml Dioxan gelöst. Die Lösung wurde mit 80 ml eines Gemisches aus Benzol und Ethylether 25 (1 Volumen zu 1 Volumen) vermischt und das erhaltene Gemisch bei 25 °C 3 h lang in trockener Atmosphäre mit 256 mg Phosphorpentachlorid in Berührung gebracht.

Das Lösungsmittel wurde bei 25 °C unter einem Druck von 300 mm Hg während etwa 2 h in trockener Atmosphäre 3o verdampft und die erhaltene Flüssigkeit zweimal mit je 10 ml Ethylether gewaschen. Der Ether wurde entfernt und der Rückstand zur Trockene eingedampft. Er wurde anschliessend erneut in 5 ml Essigester gelöst und bei 4 °C mit 20 ml niedrigsiedendem Petrolether (40 bis 60 ° C) erneut gefällt. 35 Analyse: NCS gemäss Formel

0 II

O-C-NH I I CO -CH

40

(CH2)n -NH-CO-CH2-Cl mit n = 4.

Berechnet: C 43,47 H 5,27 N 11,26 45 Gefunden: C 43,44 H 5,31 NI 1,27

Zur Herstellung analoger Verbindungen, bei denen n beispielsweise grösser als 4 ist, wird ein Derivat einer a-Amino-säure verwendet, das eine zweite Aminogruppe innerhalb der 50 langen Kette enthält, oder das entsprechende Amid wurde aus einer Beta-, Gamma- oder Delta-Aminosäure hergestellt. Beispielsweise erhält man aus

E-NH2+ HOOC-(CH2)n-NH-CO-CH2-Cl

55

das Produkt:

E-NH-CO-(CH2)n-NH-COCH2Cl.

G

Claims

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1. Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, enthaltend ein Proteinantigen, einen Antikörper oder die F(ab')2-Untergruppen eines Antikörpers, kovalent über eine Brückengruppe an ein wasserunlösliches Substrat gebunden, wobei die Brückengruppe über das a-Kohlenstoffatom eines in ihr enthaltenen Acetylrestes unmittelbar mit Schwefelatomen in dem Antigen, dem Antikörper oder den Untergruppen verknüpft ist.

2. Reagenz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Untergruppen die F(ab')2-Untergruppen eines Immunglobulins G sind.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Reagenz gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2,

dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat ein teilchenförmi-ges Material ist.

4. Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, dass man eine immunspezifische Umsetzung zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder F(ab')z-Untergruppen davon unter Verwendung eines Reagenzes gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche durchführt.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein Gemisch herstellt aus einer Probe der Flüssigkeit mit einem Reagenz gemäss Anspruch 1, das einen Antikörper oder die F(ab')2-Untergruppe davon bzw. ein Proteinantigen enthält, die sich an das zu bestimmende Antigen bzw. den zu bestimmenden Antikörper binden,

b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung bebrütet und c) das Gemisch zur Bestimmung des Ausmasses der Umsetzung und dadurch zur Bestimmung der Menge an Antigen bzw. Antikörper in der Flüssigkeitsprobe untersucht.

6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung eines Reagenzes mit einem Gehalt an F(ab')2-Untergruppen das Umsetzungsgemisch frei von dem Proteinantikörper, aus dem die Untergruppen erhalten worden sind, sowie frei von den entsprechenden F(c)-Unter-gruppen gehalten wird.

7. Verfahren gemäss Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reagenz in der Form einer Suspension aus Latexteilchen einsetzt, wobei die Umsetzung die Aggluti-nierung der Teilchen verursacht, und dass man das Ausmass der Umsetzung durch Beobachtung des Ausmasses der Agglutinierung bestimmt.

8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 4 bis 7,

dadurch gekennzeichnet, dass man es nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses durchführt.

9. Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Proteinantigen oder einen Antikörper oder die F(ab')2-Untergruppen davon mit einer einen Monochloracetylrest enthaltenden brückenbildenden Substanz unter kovalenter Bindung der brückenbildenden Substanz über den Monochloracetylrest an Schwefelatome in dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den Untergruppen davon umsetzt und vor oder nach dieser Umsetzung die brückenbildende Substanz kovalent an ein wasserunlösliches Substrat bindet.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die brückenbildende Substanz über einen in ihr enthaltenen Anhydridrest an ein im Substrat enthaltenes Protein bindet.

11. Brückenbildende Substanz als Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Monochloracetylgruppe enthält.

12. Mittel gemäss Anspruch 11 der allgemeinen Formel

0-- CO - NH

I i

CO CH (CH2^n NHC0CH2C1,

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.

13. Mittel gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass n gleich 4 ist.