JPS62132172A - 固相化抗体およびその製造方法 - Google Patents
固相化抗体およびその製造方法Info
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- JPS62132172A JPS62132172A JP60273825A JP27382585A JPS62132172A JP S62132172 A JPS62132172 A JP S62132172A JP 60273825 A JP60273825 A JP 60273825A JP 27382585 A JP27382585 A JP 27382585A JP S62132172 A JPS62132172 A JP S62132172A
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- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、診断薬ことに免疫測定法を利用した診断薬の
分野で有用な固相化抗体およびその製造方法に係る。
分野で有用な固相化抗体およびその製造方法に係る。
〔従来技術］
免疫測定法の分野において、固相化抗体は非固相化抗体
に比べて取り扱いが容易であるため、その利用がますま
す拡大する傾向にある。
に比べて取り扱いが容易であるため、その利用がますま
す拡大する傾向にある。
抗体を不溶性担体に結合きせるには、これまで目的に応
じて、物理的吸着法または化学的縮合法が用いられてき
た。
じて、物理的吸着法または化学的縮合法が用いられてき
た。
このうち、化学的縮合法としては、カルボジイミドで代
表される縮合剤を用いるのが一般的である。
表される縮合剤を用いるのが一般的である。
ところで二抗体法による免疫測定法において、同相化し
た第二抗体がひろく使用されているが、この場合の固相
化抗体は第一抗体に結合している標識抗原を遊離の標識
抗原から分離するために加えられるもので、通常高度の
特異性や感度を必要としないので、調製上の問題は少な
い。
た第二抗体がひろく使用されているが、この場合の固相
化抗体は第一抗体に結合している標識抗原を遊離の標識
抗原から分離するために加えられるもので、通常高度の
特異性や感度を必要としないので、調製上の問題は少な
い。
これに対して一抗体法における同相化抗体には高度の特
異性と感度とが要求されるためその調製法がとくに重要
であり、困難を伴う。しかし優れた同相化抗体を得るこ
とができれば、−抗体法は二抗体法に比べて、測定が短
時間で済み、手間がかからず操作性の良い点で遥かに優
れているばかりでなく、抗体がその性能、即ち特異性、
反応性、感度などの面においても向上することが期待き
れる。
異性と感度とが要求されるためその調製法がとくに重要
であり、困難を伴う。しかし優れた同相化抗体を得るこ
とができれば、−抗体法は二抗体法に比べて、測定が短
時間で済み、手間がかからず操作性の良い点で遥かに優
れているばかりでなく、抗体がその性能、即ち特異性、
反応性、感度などの面においても向上することが期待き
れる。
〔発明が解決しようとしている問題点］抗体と不溶性担
体とをカルボジイミドなどの縮合剤を用いて縮合させた
ときは、抗体分子間あるいは分子内にも結合を生じ、抗
体の重合化ないし不均一化は避けられず、ひらに変性を
伴うため固相化抗体の性能を著しく低下させることが多
く、ましてその性能を向上させることを期待するのは難
かしかった。
体とをカルボジイミドなどの縮合剤を用いて縮合させた
ときは、抗体分子間あるいは分子内にも結合を生じ、抗
体の重合化ないし不均一化は避けられず、ひらに変性を
伴うため固相化抗体の性能を著しく低下させることが多
く、ましてその性能を向上させることを期待するのは難
かしかった。
現在、二抗体法によって行なわれているプロインシュリ
ンＣ−ペプチドの測定に一抗体法を適用し、上記縮合法
によって作られた固相化抗体を用いた場合も上記の欠点
を免れることはできない。
ンＣ−ペプチドの測定に一抗体法を適用し、上記縮合法
によって作られた固相化抗体を用いた場合も上記の欠点
を免れることはできない。
また、二抗体法について見れば、第一反応に長時間（２
０時間）を要するばかりでなく、第二抗体添加後の第二
反応にも更に１時間を要するうえ、測定操作も繁雑で、
検体中のＣ−ペプチドの検出感度も不充分な場合がある
。そこで上記欠点のない固相化第一抗体を用いる一抗体
法の出現が待ち望まれていた。
０時間）を要するばかりでなく、第二抗体添加後の第二
反応にも更に１時間を要するうえ、測定操作も繁雑で、
検体中のＣ−ペプチドの検出感度も不充分な場合がある
。そこで上記欠点のない固相化第一抗体を用いる一抗体
法の出現が待ち望まれていた。
［問題点を解決するための手段］
本発明は、上記の問題点を解決するために提案されたも
のである。すなわち本発明者らは、抗ヒトプロインシュ
リンＣ−ペプチド抗体を担体に結合きせるに際し、抗体
をあらかじめ特定の条件下で部分的に還元して一定数の
チオール基を遊離さ仕、そのチオール基と、アミン化し
た担体表面のアミ７基との間で架橋することにより、固
相化前に比べてより優れた反応性と遥かに高い感度とを
有する同相化抗体が得られることを見出すと共に、固相
化のための至適条件の探索と再現性確保のための検討を
重ねた結果この発明を完成した。
のである。すなわち本発明者らは、抗ヒトプロインシュ
リンＣ−ペプチド抗体を担体に結合きせるに際し、抗体
をあらかじめ特定の条件下で部分的に還元して一定数の
チオール基を遊離さ仕、そのチオール基と、アミン化し
た担体表面のアミ７基との間で架橋することにより、固
相化前に比べてより優れた反応性と遥かに高い感度とを
有する同相化抗体が得られることを見出すと共に、固相
化のための至適条件の探索と再現性確保のための検討を
重ねた結果この発明を完成した。
従来、同相化抗体は免疫測定法における利便性と操作性
のみが重要視され、固相化抗体の性能に関して言及され
ることは殆どなかった。固相化抗体についての特許（そ
の多くは出願公開公報）も多数みられるが、いずれの場
合も同相化の方法と担体に関するものであり、同相化を
抗体の性能の向上のための手段として捉えたものは全く
見当らない。本発明者らはまさにこの線に沿って同相化
の方法とその条件を探索した結果、上記の発明に到達し
たのである。
のみが重要視され、固相化抗体の性能に関して言及され
ることは殆どなかった。固相化抗体についての特許（そ
の多くは出願公開公報）も多数みられるが、いずれの場
合も同相化の方法と担体に関するものであり、同相化を
抗体の性能の向上のための手段として捉えたものは全く
見当らない。本発明者らはまさにこの線に沿って同相化
の方法とその条件を探索した結果、上記の発明に到達し
たのである。
本発明は、不溶性担体に保有させたアミン基と、゛ヒト
プロインシュリンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブ
リン由来の部分還元抗体が保有するチオール基とが、ヘ
テロ二官能性架橋剤残基を介して結合していることを特
徴とする固相化抗体を第１の要旨とする。また、アミン
基を有する少なくとも水に不溶性の担体に、ヘテロ三官
能性架橋剤を作用きせたのち、これにヒトプロインシュ
リンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブリン由来のチ
オール基を有する部分還元抗体を結合させることを特徴
とする同相化抗体の製造方法を第２の要旨とする。
プロインシュリンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブ
リン由来の部分還元抗体が保有するチオール基とが、ヘ
テロ二官能性架橋剤残基を介して結合していることを特
徴とする固相化抗体を第１の要旨とする。また、アミン
基を有する少なくとも水に不溶性の担体に、ヘテロ三官
能性架橋剤を作用きせたのち、これにヒトプロインシュ
リンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブリン由来のチ
オール基を有する部分還元抗体を結合させることを特徴
とする同相化抗体の製造方法を第２の要旨とする。
該不溶性担体としては、本来アミン基を有している任意
の担体が用いられる。こうした担体としては、ポリアミ
ノ安息香酸アクリルアミド、アミノアルキルシランを付
加したガラスなどが挙げられる。
の担体が用いられる。こうした担体としては、ポリアミ
ノ安息香酸アクリルアミド、アミノアルキルシランを付
加したガラスなどが挙げられる。
ここでは、アミノ基を付加した微粒状ポリアクリルアミ
ドが適当なものとして用いられる。該アミ７基の付加は
、好ましくは、カルボキシル基を有するポリアクリルア
ミド坦体に、直鎖アルキレンジアミンを結合させること
によって行なわれる。直鎖アルキレンジアミンとしては
へキサメチレンジアミンが適当である。
ドが適当なものとして用いられる。該アミ７基の付加は
、好ましくは、カルボキシル基を有するポリアクリルア
ミド坦体に、直鎖アルキレンジアミンを結合させること
によって行なわれる。直鎖アルキレンジアミンとしては
へキサメチレンジアミンが適当である。
また、アミン基を付加する前の微粒状ポリアクリルアミ
ドが適当な粒度分布を有することが、本同相化抗体にと
って必須のことである。大き過ぎる場合は、反応中、器
底に沈降してしまい、小さ過ぎる場合は、分離操作を困
難にする。一般に、０．１μｍ〜１０μｍ好ましくは１
〜５μｍの粒度分布を有するイムノビード・マトリック
ス（商品名）が使用される。
ドが適当な粒度分布を有することが、本同相化抗体にと
って必須のことである。大き過ぎる場合は、反応中、器
底に沈降してしまい、小さ過ぎる場合は、分離操作を困
難にする。一般に、０．１μｍ〜１０μｍ好ましくは１
〜５μｍの粒度分布を有するイムノビード・マトリック
ス（商品名）が使用される。
また、該ヘテロ三官能性架橋剤としては、両官能基がそ
れぞれアミノ基およびチオール基に対して優先的反応性
を有するもの、たとえば、４−フルオロ−３−ニトロフ
ェニル・アシド、ξ−クロルアセチルーリジン・Ｎ−カ
ルボキシ無水物（ＮＣＡ）、ξ−クロルアセチルーリジ
ン・Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル、ξ−ブロモ
アセチルーリジン・Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステ
ル、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスルホ琥珀
酸イミドエステル、４−ヨードアセチルアミノ安息香酸
Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル、４−（Ｎ−マレ
イミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒド
ロキシ琥珀酸イミドエステル、４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル、４
−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスルフォ琥珀酸イミドエステル、４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ａ酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀
酸イミドエステルなどが挙げられるが、好ましくは、ｍ
−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエス
テル（ＭＢ Ｓ ）である。 本固相化抗体の製造は、
先ず、カルボキシル基を有する微粒状ポリアクリルアミ
ドに、ＥＤＣ［１−エチル−３（３−ジメチルアミンプ
ロピル）カルボジイミドコの存在下にヘキサメチレンツ
アミンを作用させアミン基を付加することによって開始
される。 次いで、このアミノ基を付加した担体に対し
てヘテロ三官能性架橋剤を作用させ、架橋基を導入する
。
れぞれアミノ基およびチオール基に対して優先的反応性
を有するもの、たとえば、４−フルオロ−３−ニトロフ
ェニル・アシド、ξ−クロルアセチルーリジン・Ｎ−カ
ルボキシ無水物（ＮＣＡ）、ξ−クロルアセチルーリジ
ン・Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル、ξ−ブロモ
アセチルーリジン・Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステ
ル、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスルホ琥珀
酸イミドエステル、４−ヨードアセチルアミノ安息香酸
Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル、４−（Ｎ−マレ
イミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒド
ロキシ琥珀酸イミドエステル、４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル、４
−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスルフォ琥珀酸イミドエステル、４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ａ酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀
酸イミドエステルなどが挙げられるが、好ましくは、ｍ
−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエス
テル（ＭＢ Ｓ ）である。 本固相化抗体の製造は、
先ず、カルボキシル基を有する微粒状ポリアクリルアミ
ドに、ＥＤＣ［１−エチル−３（３−ジメチルアミンプ
ロピル）カルボジイミドコの存在下にヘキサメチレンツ
アミンを作用させアミン基を付加することによって開始
される。 次いで、このアミノ基を付加した担体に対し
てヘテロ三官能性架橋剤を作用させ、架橋基を導入する
。
一方、同相化すべき抗体は、ヒトプロインシュリンＣ−
ペプチドに特異的なイムノグロブリン由来の部分還元抗
体であるが、これを得るには、先ず抗ヒトプロインシュ
リンＣ−ペプチド血清を、ヒトプロインシュリンＣ−ペ
プチドまたはそのフラグメントをリガンドとするアフィ
ニティー・クロマトグラフィーにかけ精製することが好
ましい。
ペプチドに特異的なイムノグロブリン由来の部分還元抗
体であるが、これを得るには、先ず抗ヒトプロインシュ
リンＣ−ペプチド血清を、ヒトプロインシュリンＣ−ペ
プチドまたはそのフラグメントをリガンドとするアフィ
ニティー・クロマトグラフィーにかけ精製することが好
ましい。
こうして得られた精製イムノグロブリンは、メルカプト
エチルアミンで還元すると、そのＳ−８結合の一部が開
裂される。たとえば、うさぎイムノグロブリンの場合に
は、還元条件を適切に選ぶことにより、分子中に一個の
み存在するＨ！間Ｓ−Ｓ結合が鎖中Ｓ−８結合に優先し
て開裂される２言われているので好ましい。
エチルアミンで還元すると、そのＳ−８結合の一部が開
裂される。たとえば、うさぎイムノグロブリンの場合に
は、還元条件を適切に選ぶことにより、分子中に一個の
み存在するＨ！間Ｓ−Ｓ結合が鎖中Ｓ−８結合に優先し
て開裂される２言われているので好ましい。
最後に、この還元抗体に対して、上記架橋基導入担体を
反応させることにより目的とする同相化抗体を得る。
反応させることにより目的とする同相化抗体を得る。
［好ましい具体例の説明コ
以下、本発明を実施例および対照実験によってより詳細
に説明する。
に説明する。
［実施例コ
（上ユ迭僅五韮ｌ；
０．５ｍｌの抗ヒトプロインシュリンＣ−ペプチドうさ
ぎ血清を、ヒトプロインシュリンＣ−ペプチドまたはそ
のフラグメント（たとえば、Ｃ−ペプチド（７〜２４）
）を常法により結合させたセファローズ４Ｂ（商品名）
のカラム（容量１゜８ｍ１）にチャージし１５倍量の５
０ｍＭトリス・塩酸１１ｉｈＴｎ＆（ｐ Ｈ７、５’）
ｔ’洗浄り、り。
ぎ血清を、ヒトプロインシュリンＣ−ペプチドまたはそ
のフラグメント（たとえば、Ｃ−ペプチド（７〜２４）
）を常法により結合させたセファローズ４Ｂ（商品名）
のカラム（容量１゜８ｍ１）にチャージし１５倍量の５
０ｍＭトリス・塩酸１１ｉｈＴｎ＆（ｐ Ｈ７、５’）
ｔ’洗浄り、り。
特異的に結合したイムノグロブリンを、６ｍＭ塩酸にて
溶出させ精製抗体（ＩｇＧ）を得た。
溶出させ精製抗体（ＩｇＧ）を得た。
（ｌユ迭僅ム１ｊ：
精製抗体０．５ｍｇを含む０．１Ｍ−燐酸カリ緩衝液（
ｐＨ６，０）５４０１をとり、４０ｍＭメルカプトエチ
ルアミン６ ち、３７°Ｃで６０分間反応させた．過剰のメルカプト
エチルアミンは、セファデックスＧ−２５（メシアム）
（商品名）のカラムで除去し還ｘ抗体を得た。
ｐＨ６，０）５４０１をとり、４０ｍＭメルカプトエチ
ルアミン６ ち、３７°Ｃで６０分間反応させた．過剰のメルカプト
エチルアミンは、セファデックスＧ−２５（メシアム）
（商品名）のカラムで除去し還ｘ抗体を得た。
この還元抗体は、平均してＩｇＧ一分子当り二個に相当
する数のチオール基を有する。
する数のチオール基を有する。
（ｆｆ）不′性担体のアミノヒ：
バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社より市販されているイ
ムノビーズ・マトリクス （ Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ Ｍａｔ ｒｉｘ，商品名
）の粒度１〜７．５μｍのもの、２００ｍｇに対し、ヘ
キサメチレンジアミン２．２５ｍモルおよび３ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．３）２０ｍｌを加え、４°Ｃで１時間
攪拌ののち、４ ０ ｍ ｇの固形ＥＤＣ［ １−エチ
ル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩］を添加し、ＩＮ塩酸を加えることによりｐＨ・
５．０に約３０分間維持したのち、４°Ｃで、２時間反
応させる、この操作を繰り返し担体上のカルボキシル基
を完全にブロックすると同時にアミノ化した。
ムノビーズ・マトリクス （ Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ Ｍａｔ ｒｉｘ，商品名
）の粒度１〜７．５μｍのもの、２００ｍｇに対し、ヘ
キサメチレンジアミン２．２５ｍモルおよび３ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．３）２０ｍｌを加え、４°Ｃで１時間
攪拌ののち、４ ０ ｍ ｇの固形ＥＤＣ［ １−エチ
ル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩］を添加し、ＩＮ塩酸を加えることによりｐＨ・
５．０に約３０分間維持したのち、４°Ｃで、２時間反
応させる、この操作を繰り返し担体上のカルボキシル基
を完全にブロックすると同時にアミノ化した。
（４ マレイミドベンゾイル（ＭＢ 化担体の！ｌ：
上記アミノ化不溶性担体２０ｍｇを、０．１Ｍ燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ ７．０）中で、１０ＭモルのＭ
Ｂ Ｓ （ ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ
琥珀酸イミドエステル）（不溶性担体中のアミノ基含量
の約５倍量）と、最終容量・１ 、６ｍｌ、３０°Ｃで
、１時間反応させた。
リウム緩衝液（ｐＨ ７．０）中で、１０ＭモルのＭ
Ｂ Ｓ （ ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ
琥珀酸イミドエステル）（不溶性担体中のアミノ基含量
の約５倍量）と、最終容量・１ 、６ｍｌ、３０°Ｃで
、１時間反応させた。
未反応のＭＢＳを５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０。
１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）とＴＨＦ（
テトラヒドロフラン）との１：１混液で３回、更に５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．０）で３回洗浄することにより除去し、最
終容量２．２５ｍｌ＋７１ＭＢ化担体懸濁液とした。
テトラヒドロフラン）との１：１混液で３回、更に５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．０）で３回洗浄することにより除去し、最
終容量２．２５ｍｌ＋７１ＭＢ化担体懸濁液とした。
（Ｕ丞体五里韮北：
上記還元抗体のＯ．Ｄ．（２８０ｎｍおける吸光度Ｘｍ
ｌ）＝０．１に対して、上記懸濁液０。
ｌ）＝０．１に対して、上記懸濁液０。
５ｍｌを加え、最終容量を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０
．１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ６、０）で１
ｍｌにｍ整し、４°Ｃで２０時間混合・反応させた．不
溶性担体上の未反応ＭＢ基は、推定残存量の３倍量の２
−メルカプトエタノールを加え、３０°Ｃ１２０分間処
理することにより失活させた。
．１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ６、０）で１
ｍｌにｍ整し、４°Ｃで２０時間混合・反応させた．不
溶性担体上の未反応ＭＢ基は、推定残存量の３倍量の２
−メルカプトエタノールを加え、３０°Ｃ１２０分間処
理することにより失活させた。
同相化抗体は、５０ｍＭ 燐酸塩／食塩緩衝液（ｐＨ
７．５）で５回、塩野義製薬（株）より市販されている
１Ｃ−ペプチドテストシオノギ。
７．５）で５回、塩野義製薬（株）より市販されている
１Ｃ−ペプチドテストシオノギ。
キットの１構成要素である緩衝剤試薬（以下、単に緩衝
剤という）、すなわち０．９％ＮａＣＩ。
剤という）、すなわち０．９％ＮａＣＩ。
０、５％ＢＳＡ，０ 、ＱＩＭＥＤＴＡおよび０。
０５％アジ化ナトリウムを含む０．０１Ｍ ｍ酸塩緩
衝液（ｐＨ７．５）で５回、それぞれ洗浄し、最終容量
を緩衝剤で適当量に調整し、４°Ｃにて保存した。
衝液（ｐＨ７．５）で５回、それぞれ洗浄し、最終容量
を緩衝剤で適当量に調整し、４°Ｃにて保存した。
（６）几 および杭木、の測 ：
上記「Ｃ−ペブチドテストシオノギ，に含まれる試薬を
利用し、緩衝剤に溶解または懸濁させることにより次の
溶液または懸濁液を調製した。
利用し、緩衝剤に溶解または懸濁させることにより次の
溶液または懸濁液を調製した。
ａ．標準ヒトＣ−ペプチド溶液
（０ 、２ 〜５０ｎｇ／ｍｌ）
ｂ．ヨウ化［ ＩＲ“Ｉ］チロシン化ヒトＣ−ペプチド
溶液 Ｃ．上記（５）で得た同相化抗体懸濁液上記ａ．ｂおよ
びＣのそれぞれ０．１ｍｌを混和、激しく攪拌して反応
を開始させ、その後室温に３時間静置した。次いで、２
，０００Ｘｇ、７分間遠心分離し、上澄液を吸引除去し
てＢ／Ｆ分離を行ない、その不溶残金の放射能を測定し
、ラジオイムノアッセイの常法により力価および感度を
求めた。
溶液 Ｃ．上記（５）で得た同相化抗体懸濁液上記ａ．ｂおよ
びＣのそれぞれ０．１ｍｌを混和、激しく攪拌して反応
を開始させ、その後室温に３時間静置した。次いで、２
，０００Ｘｇ、７分間遠心分離し、上澄液を吸引除去し
てＢ／Ｆ分離を行ない、その不溶残金の放射能を測定し
、ラジオイムノアッセイの常法により力価および感度を
求めた。
江凰叉薫（従来法）：
前記実施例（１）で原料として用いた抗ヒトプロインシ
ュリンＣ−ペプチドうさぎ血清と、上記ａおよびｂを、
それぞれＯ，１ｍｌ宛とり緩衝剤０．５ｍｌに加え、混
和して反応を開始させ（第一反応）、２０°Ｃで２０時
間静置した。
ュリンＣ−ペプチドうさぎ血清と、上記ａおよびｂを、
それぞれＯ，１ｍｌ宛とり緩衝剤０．５ｍｌに加え、混
和して反応を開始させ（第一反応）、２０°Ｃで２０時
間静置した。
これにうさぎイムノグロブリン抗体結合ゲル懸濁液０．
１ｍｌを加え（第二反応）、２０°Ｃで１時間静置後、
１．５００Ｘｇ、５分間遠心分離し、以下、実施例（６
）と同様の操作を行なった。
１ｍｌを加え（第二反応）、２０°Ｃで１時間静置後、
１．５００Ｘｇ、５分間遠心分離し、以下、実施例（６
）と同様の操作を行なった。
同操作によって得られた標準曲線（本発明法及び従来法
）を図面に対照して示す。
）を図面に対照して示す。
［発明の効果］
上記のように、本発明によれば、現在、二抗体法Ｇコよ
って行なわれているプロインシュリンＣ−ペプチドの測
定を一抗体法によって行なうことができるので操作が簡
便となるばかりでなく、時間において７〜８倍、感度に
おいても添付図面中の標準曲線に示すように２〜４倍程
度の改善が得られる。それゆえ本発明は多大の工業的効
果を有するものである。
って行なわれているプロインシュリンＣ−ペプチドの測
定を一抗体法によって行なうことができるので操作が簡
便となるばかりでなく、時間において７〜８倍、感度に
おいても添付図面中の標準曲線に示すように２〜４倍程
度の改善が得られる。それゆえ本発明は多大の工業的効
果を有するものである。
図面は、本発明実施例によって得られた標準曲線と、対
照実験によって得られた標準曲線とを対比して示すもの
である。
照実験によって得られた標準曲線とを対比して示すもの
である。
Claims (9)
- （１）不溶性担体に保有させたアミノ基と、ヒトプロイ
ンシュリンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブリン由
来の部分還元抗体が保有するチオール基とが、ヘテロ二
官能性架橋剤残基を介して結合していることを特徴とす
る固相化抗体。 - （２）該不溶性担体が、アミノ基を付加した微粒状ポリ
アクリルアミドであることを特徴とする特許請求の範囲
（１）に記載の固相化抗体。 - （３）該不溶性担体が、カルボキシル基を有するポリア
クリルアミド坦体に、直鎖アルキレンジアミンを結合さ
せたものであることを特徴とする特許請求の範囲（１）
に記載の固相化抗体。 - （４）該ヘテロ二官能性架橋剤が、ｍ−マレイミド安息
香酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル（ＭＢＳ）で
あることを特徴とする特許請求の範囲（１）に記載の固
相化抗体。 - （５）アミノ基を有する少なくとも水に不溶性の担体に
、ヘテロ二官能性架橋剤を作用させたのち、これにヒト
プロインシュリンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブ
リン由来のチオール基を有する部分還元抗体を結合させ
ることを特徴とする固相化抗体の製造方法。 - （６）該不溶性の担体が、微粒状ポリアクリルアミドに
アミノ基を付加して得たものであることを特徴とする特
許請求の範囲（５）に記載の製造方法。 - （７）該不溶性の担体が、カルボキシル基を有するポリ
アクリルアミドに、直鎖アルキレンジアミンを縮合させ
て得たものであることを特徴とする特許請求の範囲（５
）に記載の製造方法。 - （８）該ヘテロ二官能性架橋剤が、ｍ−マレイミド安息
香酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル（ＭＢＳ）で
あることを特徴とする特許請求の範囲（５）に記載の製
造方法。 - （９）該ヒトプロインシュリンＣ−ペプチドに特異的な
イムノグロブリン由来の部分還元抗体が、その還元前に
、ヒトプロインシュリンＣ−ペプチドまたはそのフラグ
メントをリガンドとするアフィニティー・クロマトグラ
フィーによつて精製されることを特徴とする特許請求の
範囲（５）に記載の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60273825A JPS62132172A (ja) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | 固相化抗体およびその製造方法 |
| CA000524229A CA1283852C (en) | 1985-12-04 | 1986-12-01 | Immobilized c-peptide antibody, process for preparation of and immunoassay using the same |
| EP86309432A EP0227351B1 (en) | 1985-12-04 | 1986-12-03 | Immobilized c-peptide antibody, and the preparation and use thereof |
| GB8628882A GB2184127B (en) | 1985-12-04 | 1986-12-03 | Immobilized c-peptide antibody, and the preparation and use thereof |
| DE8686309432T DE3682491D1 (de) | 1985-12-04 | 1986-12-03 | Immobilisierter c-peptid-antikoerper, seine herstellung und verwendung. |
| KR1019860010368A KR910004141B1 (ko) | 1985-12-04 | 1986-12-04 | 고상화 c 펩타이드 항체, 그 제조방법 및 동 물질을 이용하는 면역 측정법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60273825A JPS62132172A (ja) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | 固相化抗体およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62132172A true JPS62132172A (ja) | 1987-06-15 |
Family
ID=17533076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273825A Pending JPS62132172A (ja) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | 固相化抗体およびその製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0227351B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62132172A (ja) |
| KR (1) | KR910004141B1 (ja) |
| CA (1) | CA1283852C (ja) |
| DE (1) | DE3682491D1 (ja) |
| GB (1) | GB2184127B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0346130A (ja) * | 1989-07-14 | 1991-02-27 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 光記録再生装置 |
| EP0484961A1 (en) | 1990-11-09 | 1992-05-13 | Tosoh Corporation | Method of measuring human c-peptide |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3640412A1 (de) * | 1986-11-26 | 1988-06-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| JPS6488367A (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-03 | Japan Chem Res | Immobilized antibody |
| DE69029873T2 (de) * | 1989-05-02 | 1997-08-07 | Abbott Lab | Kovalente Kupplung von spezifischen Bindungspartnern an einer Festphase |
| US5279954A (en) * | 1989-06-30 | 1994-01-18 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska And Bionebraska | Exopeptidase catalyzed site-specific bonding of supports, labels and bioactive agents to proteins |
| WO1991004753A1 (en) * | 1989-10-02 | 1991-04-18 | Cetus Corporation | Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof |
| GB8927365D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-01-31 | Ici Plc | Reagent |
| US5279955A (en) * | 1991-03-01 | 1994-01-18 | Pegg Randall K | Heterofunctional crosslinking agent for immobilizing reagents on plastic substrates |
| US5436147A (en) * | 1991-03-01 | 1995-07-25 | Nucleic Assays Corporation | Heterobifunctional crosslinked agents for immobilizing molecules on plastic substrates |
| WO1993000586A1 (fr) * | 1991-06-26 | 1993-01-07 | Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostju 'dies' | Immunoadsorbant utilise dans le diagnostic de l'epilepsie et d'un groupe a risque |
| CN113049811A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒 |
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Citations (4)
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| JPS61103838A (ja) * | 1984-10-29 | 1986-05-22 | Oriental Yeast Co Ltd | 免疫吸着体及びその製造法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| GB2013688B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Insolubilised proteins and immunoassays utilising them |
| JPS5745454A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-15 | Fuji Photo Film Co Ltd | Immunochemical measuring method for various minor components |
| US4429008B1 (en) * | 1981-12-10 | 1995-05-16 | Univ California | Thiol reactive liposomes |
| ATE42317T1 (de) * | 1983-07-29 | 1989-05-15 | Henning Berlin Gmbh | Voraktivierte kunststoffoberflaechen zur immobilisierung von organisch-chemischen und biologischen materialien, verfahren zur herstellung und verwendung derselben. |
-
1985
- 1985-12-04 JP JP60273825A patent/JPS62132172A/ja active Pending
-
1986
- 1986-12-01 CA CA000524229A patent/CA1283852C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-03 EP EP86309432A patent/EP0227351B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-03 GB GB8628882A patent/GB2184127B/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-03 DE DE8686309432T patent/DE3682491D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-04 KR KR1019860010368A patent/KR910004141B1/ko not_active Expired
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0227351A2 (en) | 1987-07-01 |
| EP0227351B1 (en) | 1991-11-13 |
| CA1283852C (en) | 1991-05-07 |
| KR910004141B1 (ko) | 1991-06-22 |
| GB8628882D0 (en) | 1987-01-07 |
| GB2184127B (en) | 1990-04-25 |
| EP0227351A3 (en) | 1988-09-07 |
| KR870005649A (ko) | 1987-07-06 |
| DE3682491D1 (de) | 1991-12-19 |
| GB2184127A (en) | 1987-06-17 |
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