CH664574A5

CH664574A5 - Lymphokine et anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine, leurs production et utilisations.

Info

Publication number: CH664574A5
Application number: CH4800/85A
Authority: CH
Inventors: Masakazu Mitsuhashi; Masashi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1984-11-09
Filing date: 1985-11-08
Publication date: 1988-03-15
Also published as: GB2168355B; FR2572936A1; DE3539775C2; ES548727A0; FR2572936B1; GB8527466D0; AT395017B; KR930004596B1; ATA327685A; DE3539775A1; SE8505286L; ES8703161A1; GB2168355A; US5002878A; SE468853B; IT1184668B; US5030564A; IT8548762A0; ES556785A0; US5003048A

Description

DESCRIPTION

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La présente invention se rapporte à une nouvelle lymphokine, à sa production et à ses utilisations. Elle concerne également un anticorps monoclonal spécifique de cette lymphokine et sa production.

La lymphotoxine (LT) et le facteur de nécrose tumoral (TNF) so sont connus comme étant les lymphokines qui endommagent les cellules tumorales. Par exemple, LT est décrit par: Aoki, Ryuichi et coll. dans SHIN-MENEKIGAKU, vol. 6, «Lymphokine», pp. 87-105 (1979), publié par Igaku-Shoin, In Vitro Method in Cell-Media-ted Immunity, édité par B.R. Bloom et P.R. Giade, publié par Aca-55 demie Press, Inc. (1971), et Cellular Immunology, vol. 38, pp. 388-402 (1978), et TNF est décrit par E.A. Carswell et coll. dans Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of the USA, vol. 72, N° 9, pp. 3666-3670 (1975), et6 Lymphokines, vol. 2, pp. 235-272, «Tumor Necrosis Factor», édité par E. Pick, publié par Academic 60 Press, Inc. (1981).

Récemment, H. Ohnishi et coll. ont décrit une lymphokine anti-oncotique, glycoprotéinique dans le brevet japonais Kokai N° 146293/83.

C. Milstein a passé en revue les anticorps monoclonaux dans 65 Scientific American, vol. 243, N° 4, pp. 56-64 (1980).

En chimiothérapie, on utilise généralement un ou plusieurs des produits suivants: agents d'alkylation, antagonistes métaboliques, antibiotiques anti-oncotiques et alcaloïdes de plantes.

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Toutefois, ces produits chimiothérapeutiques présentent les inconvénients suivants: ils peuvent provoquer chez les patients des effets secondaires excessifs, leur spectre tumoral est relativement étroit et insuffisant, et ils sont susceptibles d'induire des tumeurs résistant aux médicaments.

La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur grâce à la découverte d'une nouvelle lymphokine dotée d'une activité cytotoxique sur les cellules des tumeurs malignes, et ayant des propriétés physico-chimiques entièrement différentes de celles des lymphokines connues.

La nouvelle lymphokine humaine, en abrégé LK 2, ayant une activité cytotoxique sur les cellules de tumeurs malignes selon l'invention est caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes:

(a) Poids moléculaire: 20000 ± 2000 daltons.

(b) Point isoélectrique: pi = 6,2 ± 0,3.

(c) Mobilité électrophorétique: sur pastille de PAGE, Rf = 0,29 ± 0,02.

(d) Spectre d'absorption dans l'UV : absorption maximale pour une longueur d'onde proche de 280 nm.

(e) Solubilité dans les solvants: soluble dans l'eau, le sérum physiologique et le tampon phosphate; difficilement soluble ou insoluble dans l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.

(f) Réactions colorées: protéine positif selon le procédé de Lowry, ou le procédé à la microburette; saccharide positif selon le procédé phénol-acide sulfurique ou le procédé anthrone-acide sulfu-rique.

(g) Activités biologiques: cytotoxique sur cellule L 929, et sur cellule KB. Pratiquement exempte d'activité interféron.

(h) Stabilité en solution aqueuse: stable jusqu'à 60° C lorsqu'on met à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes.

Stable dans l'intervalle de pH de 4 à 11 lorsqu'on met à incuber à 4° C pendant 16 heures.

(i) Stabilité à la cryoconservation: stable à —10° C sur une durée de I mois ou plus.

Cette invention concerne également des procédés tels que définis dans les revendications 2 et 3 pour la production de cette nouvelle lymphokine, une composition pharmaceutique à action anti-oncoti-que telle que définie dans la revendication 11, l'utilisation de cette nouvelle lymphokine telle que définie dans la revendication 14 pour obtenir un anticorps monoclonal spécifique de la nouvelle lymphokine ainsi que l'anticorps monoclonal spécifique de cette lymphokine tel que défini dans la revendication 17.

Ci-après, cette lymphokine sera simplement désignée par l'abréviation «LK 2».

LK 2 est produit par l'exposition d'une cellule humaine productrice de LK 2, par exemple leucocyte ou lymphocyte humains, ainsi que leurs lignées de cellules établies, à l'action d'un inducteur de LK 2. Les lymphocytes et leucocytes humains peuvent être isolés à partir de sang humain frais. On peut faire proliférer les lignées de cellules humaines établies par des procédés classiques in vitro.

Afin de rendre la présente invention plus efficace dans la pratique, il est souhaitable d'utiliser une prolifération de cellules in vivo, en transplantant directement cette lignée de cellules humaines dans le corps d'un animal à sang chaud, ou bien en l'ensemençant dans une chambre de diffusion de type classique, où on lui fournit le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud.

Contrairement à la prolifération cellulaire in vitro, le mode opératoire in vivo nécessite peu ou pas de milieu nutritif renfermant du sérum coûteux, demande moins de soins au cours de la prolifération cellulaire, et les cellules humaines ayant proliféré présentent une activité LK 2 bien supérieure.

En outre, dans le mode opératoire in vivo, la lignée de cellules humaines peut aisément proliférer par utilisation du fluide corporel nutritif fourni par un animal à sang chaud, en transplantant cette lignée dans l'animal, ou en la plaçant dans une chambre de diffusion de type classique, conçue pour recevoir le fluide corporel et située dans ou sur l'animal. Dans tous les cas, l'animal est nourri de manière habituelle.

De plus, le mode opératoire in vivo est caractérisé en ce qu'on a une prolifération cellulaire plus rapide et plus stable, une production cellulaire supérieure, et une production bien plus forte de LK 2 par cellule, que dans le cas d'un mode opératoire in vitro.

Les lignées cellulaires utilisables selon l'invention sont celles qui sont productrices de LK 2, peuvent être transplantées dans un animal à sang chaud, et peuvent y proliférer aisément. Conviennent par exemple des lignées cellulaires humaines énumérées dans Protein, Nucleic Acid and Enzyme, vol. 20, N° 6, pp. 616-643 (1975). Conviennent spécifiquement des lignées de lymphoblastoïdes humains, comme Namalwa (ATCC CRL 1432) décrit dans Journal of Clinical Microbiology, vol. 1, pp. 116-117 (1975); BALL-1, TALL-1 et NALL-1, décrits par I. Miyoshi dans Nature, vol. 267, p. 844 (1977); M-7002 et B-7101, décrits dans The Journal of Im-munology, vol. 113, pp. 1334-1345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) et EBV-HO, décrits dans The Tissue Culture, vol. 6, N° 13, pp. 527-546 (1980); CCRF-SB (ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM 2; DND-41, et d'autres lignées de cellules établies, obtenues par transformation de granulocytes ou monocytes humains normaux au moyen de virus d'agent ou de radiation carcinogène.

Le taux de prolifération et/ou la productivité en LK 2 par cellule, de ces lignées cellulaires, peuvent être améliorés par la technique de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendai, ou par la technique de recombinant de gène, utilisant l'enzyme nucléase, l'enzyme ligase, l'enzyme ADN polymérase, etc. L'énumération des lignées cellulaires humaines utilisables, ci-dessus, ne limite en aucune façon le cadre de l'invention. On peut utiliser en combinaison un ou plusieurs membres de ces lignées, dans les étapes allant jusqu'à l'induction de LK 2 qui est décrite ci-après. Si nécessaire, des leucocytes ou lymphocytes humains, qui peuvent être préparés à partir de sang humain frais, peuvent être utilisés en combinaison avec l'une de ces lignées cellulaires humaines.

L'animal à sang chaud utilisable selon l'invention peut être tout animal dans lequel la cellule humaine peut proliférer. Conviennent par exemple les volailles comme poulet et pigeon; des mammifères comme chien, chat, singe, lapin, chèvre, porc, cheval, vache, cobaye, rat, rat nu, hamster, souris, souris nue, et similaires.

Comme la transplantation de cellules humaines à l'animal provoque une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser un animal à sang chaud au stade le plus jeune possible, par exemple œuf, embryon ou fœtus, ou animal nouveau-né ou en bas âge, afin de réduire autant que possible cette immunoréaction.

Avant la transplantation, l'animal peut être irradié avec un rayonnement —X ou —y, environ 200 à 600 rem, ou peut recevoir une injection d'un antisérum ou d'un immunosuppresseur, afin de réduire l'immunoréaction au niveau le plus bas possible.

Lorsqu'on utilise comme hôte un animal immunodéficient comme rat nu ou souris nue, on peut transplanter dans ces animaux, sans traitement préalable, toutes les lignées cellulaires humaines mentionnées précédemment, et les faire proliférer facilement avec moins de danger de provoquer une immunoréaction indésirable, car ces animaux présentent moins d'immunoréaction, même à l'état adulte.

On peut stabiliser la prolifération cellulaire et/ou augmenter la production de LK 2 par une succession de transplantations utilisant des animaux à sang chaud semblables ou différents. Ces objectifs peuvent être atteints, par exemple en transplantant d'abord une lignée cellulaire humaine à un hamster, à l'y faire proliférer, puis à transplanter ces cellules humaines proliférées à une souris nue. Dans ce cas, les transplantations successives peuvent s'effectuer avec un animal à sang chaud de même classe ou ordre, aussi bien qu'avec ceux de même espèce ou genre.

Les cellules humaines peuvent être transplantées en tout site de l'animal, dans la mesure où elles prolifèrent dans ce site: par exemple dans la cavité allantoïque, ou par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée.

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Ou bien on fait proliférer les cellules humaines en les plaçant dans une chambre de diffusion classique de forme et de dimension variables, munie de moyens convenables pour empêcher la contamination par les cellules de l'animal, mais pour fournir aux cellules humaines le fluide corporel nutritif de l'animal, par exemple membrane filtrante, ultrafiltre ou fibre creuse ayant une dimension de pore de l'ordre de 10~7 à 10"5 m; on incorpore par exemple par voie intrapé-ritonéale cette chambre dans l'animal, et on laisse les cellules humaines proliférer dans la chambre grâce à l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal. De plus, la chambre de diffusion peut être prévue pour être placée, par exemple, sur l'animal, de manière que le fluide nutritif puisse circuler librement au travers de la chambre. On peut observer la culture dans la chambre au cours de la prolifération cellulaire, par une fenêtre latérale transparente située sur les parois de la chambre, et/ou la chambre en soi peut être remplacée par intervalles par une chambre fraîche, à la fois pour poursuivre la prolifération cellulaire sur la période de vie de l'animal sans le sacrifier, et pour augmenter beaucoup plus la production cellulaire par animal. Comme du fait de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cellules animales, cette chambre de diffusion entraîne beaucoup moins d'immunoréaction indésirable, on peut utiliser tout animal à sang chaud facilement, sans traitement préalable pour réduire l'immunoréaction, et l'on peut recueillir aisément à partir de la chambre de diffusion les cellules humaines vivantes ayant proliféré.

L'alimentation de l'animal peut s'effectuer de manière habituelle et aucune précaution particulière n'est requise, même après la transplantation. La période nécessaire pour obtenir une prolifération cellulaire maximale est généralement de 1 à 10 semaines. Le nombre de cellules humaines ainsi obtenues est proche de 107 à 1012 cellules, ou plus, par animal. Plus particulièrement, selon l'invention, les cellules humaines transplantées voient leur nombre multiplié par 102 à 107, ou plus, ce qui est 10 à 106 fois supérieur, ou même plus, à ce que l'on obtient par ensemencement et prolifération des cellules humaines sur un milieu de culture nutritif, in vitro. Cela est très avantageux pour la production de LK 2.

Conformément à l'invention, on peut utiliser tout procédé dans la mesure où il permet d'induire la production de LK 2 dans les cellules humaines proliférées. Ces cellules sont exposées, dans l'animal utilisé comme hôte pour la prolifération cellulaire, à un inducteur de LK 2. Par exemple, une cellule humaine ayant proliféré en ascite en suspension, ou une cellule tumorale formée par exemple sous la peau, est directement exposée in vivo à un inducteur de LK 2 pour en déclencher la production, et le LK 2 accumulé est recueilli à partir de l'ascite, du sérum et/ou de la tumeur, puis on purifie ce produit. Ou bien, on recueille les cellules humaines ayant proliféré, à partir de l'animal, et puis on les expose in vitro à l'action d'un inducteur de LK 2. Par exemple, les cellules humaines ayant proliféré, obtenues par récolte de la suspension d'ascite, ou par extraction et désagrégation des masses tumorales formées par exemple sous la peau, sont mises en suspension dans un milieu de culture nutritif, préalablement chauffé à une température de l'ordre de 20° à 40° C, de manière à avoir une densité cellulaire voisine de 105 à 108 cellules/ml, et l'on expose in vitro à l'action d'un inducteur de LK 2, puis on recueille à partir de la culture le LK 2 accumulé.

Lorsqu'on utilise une chambre de diffusion de type classique, l'exposition des cellules humaines ayant proliféré à l'action d'un inducteur de LK 2 s'effectue dans la chambre ou après récolte.

Les cellules humaines ainsi obtenues peuvent être cultivées in vitro pendant 1 à 4 jours supplémentaires, afin de contrôler le temps de génération, avant l'induction de LK 2.

La production de LK 2 par animal peut être encore augmentée par utilisation de l'un ou de plusieurs des procédés suivants :

(1) Procédé au cours duquel les cellules humaines ayant proliféré sont exposées à un inducteur de LK 2 dans l'animal, qui a été utilisé comme hôte pour la prolifération cellulaire, puis sont récoltées à partir de certains sites de l'animal ou de la totalité de son corps, et sont soumises à l'exposition in vitro à l'inducteur de LK 2.

(2) Procédé dans lequel les cellules humaines sont exposées à maintes reprises à l'action d'un inducteur de LK 2.

(3) Procédé au cours duquel la chambre de diffusion, incorporée dans l'animal ou reliée à lui, est remplacée par intervalles par une

5 chambre fraîche.

Les inducteurs de LK 2 utilisables conformément à l'invention sont des inducteurs d'interféron-a classique (inducteur IFN-a), tels que virus, acide nucléique et nucléotide; et des inducteurs d'interfé-ron-y classique (inducteur IFN-y) comme phytohémagglutinine, io concanavaline A, phytolaque mitogène, lipopolysaccharide, endo-toxine, Polysaccharide et bactéries. Les antigènes agissent sur les cellules sensibilisées comme des inducteurs de LK 2.

La production de LK 2 peut être augmentée par l'utilisation combinée des inducteurs de IFN-a et IFN-y, comme inducteur de 15 LK 2. Il se confirme que cette combinaison induit simultanément la production d'interféron spécifique à l'homme (HuIFN). Cela s'avère très avantageux lors de la production en grande quantité, à faible coût et simultanément, de deux ou plusieurs substances biologique-ment actives, c'est-à-dire de HuIFN et de LK 2 d'une valeur inesti-2o mable, aussi bien que pour une utilisation beaucoup plus efficace des cellules humaines.

Le LK 2 ainsi obtenu peut être recueilli par un ou plusieurs modes opératoires de purification et/ou de séparation, par exemple relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et/ou lyo-25 philisation. Lorsqu'on désire une préparation encore plus pure de LK 2, on peut obtenir une préparation très pure par les modes opératoires décrits plus haut, en combinaison avec d'autres modes opératoires classiques, par exemple adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, fractionnement au point isoélectri-30 que, électrophorèse, Chromatographie par échange d'ions, Chromatographie liquide à grande performance, Chromatographie sur colonne, et/ou Chromatographie par affinité.

Les anticorps monoclonaux immobilisés, obtenus par liaison d'un anticorps monoclonal anti-LK 2, qui sera décrit ci-après, sur 35 un support convenable insoluble dans l'eau, par exemple Sepharose activé au BrCN, un produit de Pharmacia Fine Chemical AB, peuvent être avantageusement utilisés pour accélérer et faciliter la purification de LK 2.

Il se confirme que LK 2 ainsi obtenu a bien les propriétés physi-40 co-chimiques mentionnées plus haut.

Il se confirme également que LK 2 n'exerce pratiquement pas de cytolyse sur les cellules humaines normales, mais a des effets cytoly-tiques remarquables sur un certain nombre de cellules tumorales humaines, ainsi que sur la lignée de fibroblastoïdes de souris, L 929, 45 pour tuer ces cellules. Ainsi, LK 2, sous forme de composition, convient pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des maladies sensibles à LK 2, par exemple les tumeurs malignes, plus particulièrement de différentes tumeurs malignes dont le traitement est jugé très difficile.

so Conformément à une forme de réalisation de la présente invention, les effets anti-oncotiques des produits chimiothérapeutiques peuvent être augmentés à l'aide d'un renforçateur renfermant LK 2 comme constituant actif.

La dose des produits chimiothérapeutiques peut être réduite 55 d'environ Zz à ]/iooo, du fait que leur effet anti-oncotique peut être très augmenté par le renforçateur. De plus, l'utilisation de ce renforçateur élargit le spectre tumoral de ces produits, et permet le traitement de tumeurs résistant aux drogues. Les produits chimiothérapeutiques utilisables selon l'invention sont constitués par exemple 60 par un ou plusieurs des produits suivants : agents d'alkylation comme melphalan, cyclophosphamide, ifosfamide, phosphate sodi-que d'estramustine, busulfan, tosylate d'imorposulfan, biphényl-di-sulfonate-4,4' de N-méthyl dimésyl-3,3' oxydipropyl-amine, carbo-quone, thio-TEPA, carmustine, chlorhydrate de nimustine, strepto-65 zocine, dacarbazine et pipobroman; antagonistes métaboliques comme méthotrexate, fluoro-uracile, tegaful, carmoful, cytarabine, chlorhydrate d'ancitabine, enocitabine, mercapto-6 purine, et thio-inosine; antibiotiques anti-oncotiques comme doxorubicine, dauno-

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rubicine, aclarubicine, bléomycine, pêplomycine, mitomycine C, ac-tynomycines D et C, chromomycine A3, mithramycine, et néocarzi-nostatine; et alcaloïdes végétaux comme sulfate de vincristine, sulfate de vinblastine, sulfate de vindésine et podophyllotoxine. Dans le cas de traitement du cancer de la prostate ou de cancer du sein, il peut être souhaitable d'utiliser en combinaison une ou plusieurs hormones anti-oncotiques comme prednisolone, méthyltestostérone et œstrogène conjugué. Les conditions pour combiner ces produits chimiothérapeutiques et LK 2 doivent être choisies de manière souhaitable, et ne sont pas limitées.

Le procédé de production d'un anticorps monoclonal, selon la présente invention, comprend les stades de: immunisation d'un animal à sang chaud avec le LK 2, comme antigène; isolation à partir du corps de l'animal des cellules productrices d'anticorps; fusion de ces cellules avec des cellules de myélome; sélection d'un clone capable de produire un anticorps spécifique de LK 2 à partir des cellules d'hybridome résultant; prolifération du clone; et production par les cellules ayant proliféré de l'anticorps monoclonal spécifique de LK 2.

L'immunisation peut être obtenue par injection, par exemple par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, d'une solution, émulsion ou suspension aqueuse de LK 2, en tant qu'antigène, à un animal à sang chaud convenable, par exemple poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster ou souris, suivie de l'alimentation, pendant 3 jours ou plus, de l'animal, afin d'induire la production d'anticorps. On peut également utiliser comme antigène un produit conjugué de LK 2 et d'un saccharide, comme décrit dans la publication de brevet japonais N° 23 847/83. L'antigène peut être injecté en une dose unique, ou éventuellement en 2 ou plusieurs dosages à des intervalles de l'ordre de 3 à 30 jours.

Les cellules spléniques de l'animal immunisé, dans lequel la production d'anticorps a été induite, sont fusionnées avec des cellules de myélome d'espèce semblable ou différente, au moyen d'un mode opératoire convenable, par exemple ceux qui sont reportés par G. Kohler et coll. dans Nature, vol. 256, pp. 495-497 (1975) et Eur. J. Immunol. vol. 6, pp. 511-519 (1976). Les cellules hybrides ainsi obtenues sont alors choisies et clonées, après quoi les clones sont cultivés in vitro ou in vivo, puis on recueille à partir de la culture résultante les anticorps monoclonaux hautement spécifiques, accumulés. Plus particulièrement, le mode opératoire in vivo est de beaucoup préférable au mode in vitro, car le premier permet d'atteindre une prolifération bien plus élevée du clone, et une production plus forte de l'anticorps monoclonal, sans utilisation de sérum coûteux. Au cours du mode opératoire in vivo, le clone prolifère en utilisant le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, l'espèce semblable ou différente de celle qui a été utilisée lors de l'immunisation, soit en le transplantant directement dans l'animal, soit en l'ensemençant dans une chambre de diffusion de type classique conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif de cet animal, et l'anticorps monoclonal accumulé est recueilli à partir de fluides corporels comme ascite et sérum. Autre possibilité, le clone, après prolifération in vivo, peut être cultivé sur un milieu de culture dénué de sérum pendant 1 à 5 jours supplémentaires, avant que l'on recueille l'anticorps monoclonal accumulé à partir de la culture résultante.

Les anticorps monoclonaux ainsi obtenus peuvent être facilement récupérés, avec un ou plusieurs modes de séparation et/ou de purification, comme relargage, dialyse, filtration, centrifugation et/ou lyophilisation. Lorsqu'on souhaite une purification plus poussée, on peut obtenir une préparation très pure en combinant les modes opératoires ci-dessus avec d'autres modes opératoires classiques comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, fractionnement au point isoélectrique, électrophorèse, Chromatographie avec échange d'ions, Chromatographie liquide à haute performance, Chromatographie sur colonne, et/ou Chromatographie par affinité. Le rendement de récupération de l'anticorps monoclonal peut être avantageusement amélioré grâce à l'utilisation d'un gel de LK 2 immobilisé, obtenu par liaison de LK 2 très pur sur un support insoluble dans l'eau, convenable, par exemple Sepharose activé par BrCN.

L'anticorps monoclonal obtenu conformément à l'invention est avantageusement utilisable comme coordinat pour la Chromatographie par affinité orientée vers la production de LK 2, aussi bien que pour le diagnostic de différentes maladies humaines, en raison de sa spécificité envers LK 2, qui endommage les tumeurs malignes.

Les titres de LK 2 sont déterminés grâce à l'utilisation de cellules KB, ou de cellules L 929, prises comme cellules cibles: lorsqu'on utilise les cellules KB, l'activité cytostatique sur ces cellules est déterminée selon le procédé décrit dans Cancer Chemotherapy Reports, partie 3, vol. 3, N° 2, septembre (1972); lorsqu'on utilise les cellules L 929, l'activité cytotoxique sur ces cellules en présence d'Actinomy-cine D est déterminée par le procédé décrit dans Lymphokines, vol. 2, pp. 245-249, «Tumor Necrosis Factor», édité par E. Pick, publié par Academic Press, Inc. (1981), avec une légère modification. Dans la présente description, sauf indication contraire, on utilise le dernier procédé avec cellules L 929.

Les titres de HuIFN sont déterminés par le procédé classique de réduction sur plaque, utilisant des cellules FL d'origine amniotique humaine, décrit dans Protein, Nucleic Acid and Enzyme, vol. 20, N° 6, pp. 616-643 (1975).

Les titres d'hémagglutination sont déterminés selon le procédé reporté par S.E. Salk, The Journal of Immunology, vol. 49, pp. 87-98 (1944) avec une légère modification.

Les expérimentations suivantes illustrent plus en détail la présente invention.

Expérimentation A-l

Préparation de LK 2 partiellement purifié

On injecte à des hamsters nouveau-nés un antisêrum classique préparé à partir de lapin afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes humains, BALL-1, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. Les masses tumorales, formées sous la peau, sont extraites, hachées et désagrégées dans un sérum physiologique. La suspension de cellules ainsi obtenue est alors rincée avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,2) additionné de sérum, et on remet en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, afin d'avoir une densité cellulaire de l'ordre de 2 x 106 cellules/ml. On ajoute à cette suspension du virus de Sendai (environ 400 titres d'hémagglutina-tion/ml), et l'on met à incuber à 37° C pendant 24 heures pour induire la production de LK 2. La culture est alors centrifugée vers 4° C et 1000 g et le précipité résultant est enlevé. La partie surnageante ainsi obtenue est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 20 heures, et est traitée avec une membrane filtrante. On fait alors passer le filtrat au travers d'une colonne d'un anticorps anti-HuIFN immobilisé, et l'on collecte la fraction non adsorbée. A partir de cette fraction, on récupère une fraction active, au moyen de chromatoconcentration, on la concentre et la lyophilise pour obtenir un produit pulvérulent doté d'activité LK 2.

L'activité spécifique de cette poudre est de l'ordre de 106 uni-tés/mg de protéine. Le rendement en LK 2 est de l'ordre de 2 x 107 unités par hamster.

Expérimentation A-2 Préparation d'anticorps anti-LK 2

Une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l, est dissoute dans du sérum physiologique afin d'avoir une concentration de l'ordre de 0,05% de protéine en poids/volume, et on ajoute à cette solution le même volume d'adjuvant complet de Freund. Des souris sont immunisées par injection sous-cutanée de portions de 0,2 ml du mélange ainsi obtenu, avec rappel 7 jours après la première injection. Après induction de la production d'anticorps anti-LK 2 dans les cellules productrices d'anticorps des animaux, on extrait les rates de ces derniers, les hache, les désagrège, et les met en suspension conjointement avec une lignée

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cellulaire de myélome de souris, P3-X63-Ag8, en provenance de Flow Laboratories Inc. USA, dans du milieu essentiel minimal de Eagle dépourvu de sérum (pH 7,2) renfermant 50% poids/volume de polyéthylène glycol 1000, préchauffé à 37° C, afin d'obtenir des densités cellulaires respectives de 104 cellules/ml, puis on laisse reposer 5 minutes le mélange résultant. Ce mélange est ensuite dilué 20 fois dans une préparation fraîche du même milieu de culture, et les cellules d'hybridome capables de se développer sur le milieu renfermant hypoxanthine, aminoptérine et thymidine, sont recueillies selon le procédé reporté par R.L. Davidson et P.S. Gerald dans Somatic Cell Genetics, vol. 2, N° 2, pp. 175-176 (1976) pour cloner les cellules d'hybdridome capables de produire l'anticorps anti-LK 2. On transplante dans des souris, par voie intrapéritonéale, les cellules d'hybridome clonées à la dose d'environ 106 cellules par souris, on les alimente pendant 2 semaines avant de les sacrifier. Les fluides corporels des animaux, comme fluide ascitique et sang, sont recueillis, centrifugés et relargués avec du sulfate d'ammonium, puis on collecte les fractions déposées pour des saturations de 30-50%. Ces fractions sont dialysées et soumises à une Chromatographie par affinité utilisant un gel d'anticorps anti-LK 2 immobilisé, obtenu par réaction d'un spécimen de LK 2, préparé par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l, avec du Sepharose activé par BrCN, à température ambiante, pour obtenir une fraction d'anticorps anti-LK 2, qui est ensuite dialysée, concentrée et lyophylisée. Le produit pulvérulent résultant présente une neutralisation immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxique de LK 2.

La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse est étudiée par détermination des activités neutralisantes résiduelles, après mise en incubation dans les conditions prescrites: lorsqu'on opère à pH 7,2 et à différentes températures pendant 30 minutes, à 60° C il reste au moins 80% de l'activité, mais à 70° C il y a perte de plus de 90%. Après mise en incubation à 4° C et différents pH pendant 16 heures, l'activité reste stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et 11, mais à pH 2 la perte d'activité est d'au moins 90%.

Lorsqu'on étudie les propriétés de l'anticorps monoclonal, on constate qu'il ne résiste pas au mercapto-2 éthanol, et provoque une réaction spécifique antigène-anticorps avec l'anticorps Immunoglobuline M anti-souris. Ainsi, le présent anticorps monoclonal se clas-se-t-il dans le groupe des anticorps immunoglobuline M.

Expérimentation A-3

Préparation et propriétés physico-chimiques de LK 2 très pur

Un spécimen de LK 2 partiellement purifié, obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l, est soumis à une Chromatographie par affinité au moyen d'un gel d'anticorps monoclonal immobilisé, préparé par le procédé décrit dans l'expérimentation A-2, et l'on recueille des fractions de LK 2 qui sont ensuite dialysées, concentrées et lyophilisées.

Le résultat est une préparation très pure de LK 2 ayant une activité spécifique de l'ordre de 109 unités/mg de protéine.

Les propriétés physico-chimiques de LK 2 sont étudiées à partir de cette préparation.

1) Poids moléculaire:

Le poids moléculaire de LK 2 est déterminé par les procédés électrophorétiques utilisant du gel de SDS-polyacrylamide, décrits par K. Weber et M. Osborn, J. Biol. Chem., vol. 244, p. 4406 (1969). Les colonnes de gel à 10% d'acrylamide sont chargées avec des portions d'environ 10 ng de la préparation, en présence de 0,1% de SDS, et l'on met sous charge de 8 mA par colonne pendant 4 heures, afin de réaliser l'électrophorèse. Après extraction et dosage ultérieur de LK 2 des fractions actives, le poids moléculaire de LK 2 est de 20 000 ± 2000 u (20 000 ± 2000 daltons).

2) Point isoélectrique:

Une électroconcentration à 25 W de la préparation, de 2 heures, utilisant « AMPHOLINE PAGPLATE» (pH = 3,5 à 9,5), un gel fabriqué pour l'électroconcentration par LKB-Produkter AB, Suède, donne un point isoélectrique pi de 6,2 ± 0,3.

3) Mobilité électrophorétique:

Selon le procédé décrit par B.J. Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 121, p. 404 (1964), on charge sur des colonnes de gel d'acrylamide à 7,5% des fractions d'environ 10 |ig de la préparation, on soumet à 5 une électrophorèse à pH 8,3 et 3 mA par colonne pendant 2 heures, on extrait et on dose l'activité de LK 2 pour obtenir une mobilité électrophorétique Rf de 0,29 ± 0,02.

4) Spectre d'adsorption UV :

10 Après analyse du spectre UV de la préparation à l'aide d'un spectromètre UV-250, fabriqué par Shimadzu Seisakusho KK, Japon, on observe une absorption maximale au voisinage de 280 nm.

15 5) Solubilité dans les solvants:

Le produit est soluble dans l'eau, le sérum physiologique et la solution tampon phosphate; faiblement ou pas soluble dans l'oxyde de diéthyle, l'acétate d'éthyle et le chloroforme.

20 6) Réaction colorée:

Elle est protéine-positive par le procédé de Lowry et celui à la microburette; sucre-positive par le procédé au phénol-acide sulfuri-que et celui à l'anthrone-acide sulfurique.

25 7) Activité biologique:

On observe une activité cytotoxique sur les cellules L 929 et une activité cytostatique sur les cellules KB. On ne remarque pas d'activité HuFIN marquée.

30 8) Stabilité en solution aqueuse:

a) Stabilité à la chaleur:

On met à incuber à pH 7,2, pendant 30 minutes, et à différentes températures, des fractions d'environ 1 x I0S unités/ml de la préparation, et l'on détermine les activités-cytotoxiques résiduelles. On 35 constate que LK 2 est stable jusqu'à 60° C.

b) Stabilité au pH :

Des fractions de 0,1 ml de la préparation (1 x 10® unités/ml) sont additionnées avec 1 ml de solution tampon de différentes 40 valeurs de pH, c'est-à-dire de tampon de Mcllvaine à pH 2 à 7; tampon phosphate, pH 7 à 8 ; tampon glycine-NaOH, pH 8 à 11, et l'on met à incuber à 4° C pendant 16 heures. Puis on ajuste à pH 7,2 avec du tampon phosphate 0,05M, 0,1 ml du mélange incubé, et l'on détermine l'activité résiduelle. On constate que LK 2 est stable dans 45 l'intervalle de pH compris entre 4 et 11.

c) Stabilité à la DISPASE:

A environ 1 x 105 unités/ml de la préparation, on ajoute delà «DISPASE», une protéase de micro-organisme Bacillus, commer-50 cialisée par Godo Shusei Co., Ltd. Japon, de manière à donner une activité enzymatique de 100 unités/ml, et l'on fait incuber ce mélange à pH 7,2 et 37° C pendant 2 heures. Au cours de l'incubation, on prélève périodiquement de petites portions du mélange et on les additionne d'albumine et de sérum de veau de manière à avoir une 55 concentration de 1 % en poids/volume, afin d'arrêter la réaction enzymatique. Lors du dosage des activités LK 2 dans les échantillons, on constate que LK 2 est sensible au traitement par la dispase et perd son activité à mesure que se déroule la réaction enzymatique.

9) Stabilité à la cryoconservation:

6°

La préparation de LK 2 est entreposée en solution aqueuse à —10° C et pH 7,2 pendant 1 mois, est dégelée et dosée. On ne constate pas de diminution d'activité.

Il ressort de ce qui précède que LK 2 a des propriétés physico-65 chimiques différentes de celles des lymphokines connues comme LT, TNF ou IFN. De même, l'anticorps monoclonal selon l'invention est nouveau, car il présente une neutralisation immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxique de la nouvelle lymphokine LK 2.

7

664 574

Expérimentation B-l

Action cytostatique sur les celulles des tumeurs malignes

L'effet cytostatique, exercé par LK 2 sur plusieurs cellules humaines, a été étudié en utilisant les préparations de ce produit obtenues par le procédé décrit dans les expérimentations A-l et A-3.

10® cellules de l'une des lignées humaines, énumérées dans le tableau 1, sont mises en suspension dans 1 ml de milieu nutritif classique additionné de sérum fœtal de veau; on cultive pendant 1 jour, y ajoute 0,1 ml de sérum physiologique renfermant 50 ou 500 unités de préparation de LK 2, préparée par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l ou A-3, et met à incuber à 37° C pendant 2 jours. Lorsque la culture est achevée, les cellules viables sont colorées avec du rouge neutre, un type d'agent colorant, selon le procédé décrit dans Applied Microbiology, vol. 22, N° 4, pp. 671-677 (1971), et l'agent colorant est élué au moyen d'une solution d'éthanol acidifié. Ensuite, le nombre de cellules viables est déterminé par mesure de la capacité d'absorption de l'éluat, pour une longueur d'onde de 5 540 nm.

On utilise comme témoin 0,1 ml de sérum physiologique exempt de LK 2.

Le pourcentage d'inhibition de croissance est calculé grâce à l'équation suivante:

10 Inhibition de croissance (%) =

^ _ Capacité d'absorption avec LK 2^ x jqq Capacité d'absorption du témoin

15 Les résultats sont indiqués dans le tableau I.

leaul

Nom de la lignée cellulaire

Source de la lignée cellulaire

LK 2 de l'expérimentation A-l

LK 2 de l'expérimentation A-3

50 unités

500 unités

50 unités

500 unités

HEp#2*

Carcinome épidermoïde du larynx

33

40

46

68

PC-8*

Carcinome du poumon

26

37

56

80

MKN 7*

Cancer de l'estomac

35

41

60

77

HLE*

Carcinome du foie

32

38

55

71

HeLa*

Carcinome épithéloïde du col de

l'utérus

24

35

46

68

L-132**

Poumon embryonnaire

3

-2

1

-3

Foie de Chang**

Foie

2

-3

-4

-1

Cœur de Giradi**

Cœur

-2

2

-1

-2

Note: *) indique les lignées cellulaires humaines provenant de tumeurs malignes; **) cellules d'origines normales.

Ces résultats confirment que LK 2 n'affecte guère les cellules normales, mais qu'il inhibe fortement la croissance de différentes cellules de tumeurs malignes. Il se confirme également que l'action d'un LK 2 partiellement purifié (A-l) est bien comparable à celle du produit très purifié (A-3).

Expérimentation B-2

Un groupe de'souris BALB/c reçoivent un transplant de cellules Meth A, provenant de sarcome de souris. A partir du dixième jour après la transplantation, on injecte par voie sous-cutanée aux souris du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 2, obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, à raison de 100 ou 1000 unités/kg et par jour, pendant 15 jours. Ces souris sont ensuite sacrifiées, et les masses tumorales formées chez les animaux sont mesurées.

Les résultats figurent dans le tableau II.

Tableau II

Traitement

Dosage/jour (unités/kg)

Masse tumorale (g)

Témoin

0

5,7 ± 0,7

LK 2

100

3,3 ± 0,4*

1000

2,8 ± 0,4* .

Note: *) indique les résultats statistiquement significatifs par rapport au témoin de valeur 5%.

Expérimentation B-3

Des groupes de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés, dans la région dorsale, de petits fragments de tissu de cancer du sein humain.

Lorsque la croissance des masses tumorales atteint environ 200 mm3 dans le corps des animaux, on injecte par voie intravei-40 neuse du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l ou A-3, une fois par jour à raison de 100 ou de 1000 unités/kg, pendant 20 jours. Puis on sacrifie les animaux et les tumeurs résultantes sont pesées.

45 Les résultats figurent dans le tableau III.

Tableau III

Traitement

Dosage quotidien - (unités/kg)

Masse tumorale (g)

Témoin

0

10,8 ± 1,0

LK2 de l'expérimentation A-l

%

O

o

7,3 ± 0,7*

1000

6,8± 0,5*

LK 2 de l'expérimentation A-3

100

6,4 ± 0,5*

1000

5,6 ± 0,7*

65 Expérimentation B-4

Un groupe de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés, dans la région dorsale, de petits fragments de tissu de cancer du sein humain, comme dans l'expérimentation B-3. Lorsque

664 574

8

la croissance des masses tumorales atteint environ 200 mm3 dans le corps des animaux, on injecte par voie intraveineuse du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, et/ou une préparation de HuIFN-a, une fois par jour pendant 20 jours. Puis on sacrifie les animaux et les tumeurs résultantes sont pesées. On utilise comme témoin un sérum physiologique exempt de LK 2 et d'HuIFN-a.

Les résultats sont reportés dans le tableau IV.

Il en ressort clairement que l'utilisation combinée de LK 2 et de HuIFN-a augmente considérablement l'effet anti-oncotique de HuIFN-a.

Tableau IV

Traitement

Dosage quotidien (unités/kg)

Masse tumorale (g)

Témoin

0

10,8 ± 1,0

LK 2

100

6,4 ± 0,5*

HuIFN-a

1000

6,7 ± 0,5*

LK 2

100

5,3 ± 0,4*

plus HuIFN-a

1000

Expérimentation B-5

Un essai de toxicité aiguë, au cours duquel on administre à un groupe de souris âgées de 20 jours une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, confirme que la toxicité de la préparation est extrêmement faible, c'est-à-dire que DLS0 est égale ou supérieure à 109 unités, par injection intrapérito-néale.

Ainsi qu'il ressort des expérimentations ci-dessus, le LK 2 exerce un fort effet cytostatique sur les tumeurs malignes in vitro aussi bien qu'in vivo. En outre, l'administration de LK 2 est sans risque eu égard au fait qu'un dosage élevé n'affecte pratiquement pas les cellules normales, alors qu'un faible dosage agit remarquablement sur les cellules tumorales.

Le dosage efficace du présent LK 2 se situe généralement dans l'intervalle de 5 à 500000000 unités/jour pour un adulte; plus particulièrement, pour l'administration locale, par exemple sous forme de collyre ou d'injection locale, le dosage se situe entre 5 et 10000000 unités/jour; pour l'administration percutanée ou permucosale, par exemple sous forme d'onguent ou de suppositoire, entre 10 et 50000000 unités/jour; pour l'administration systémique, par exemple par injection intraveineuse ou intramusculaire, entre 50 et 100000000 unités/jour; et pour l'administration orale, entre 500 et 500000000 unités/jour, mais ces dosages sont très variables selon les symptômes du patient et les indications.

Bien que LK 2 puisse être préparé sous forme de médicament de manière habituelle après mélange avec support, base et/ou véhicule convenable, la teneur en LK 2 est de préférence d'au moins 5 unités/g, eu égard à la toxicité, au dosage actif et à l'innocuité.

La forme et le conditionnement des agents prophylactiques et/ou thérapeutiques, pour les maladies sensibles à LK 2, peuvent être librement choisis: par exemple pour l'administration orale, ils peuvent être façonnés en préparations pour usage entérique, par exemple capsule, comprimé ou poudre; pour l'administration rectale, suppositoire; pour injection, ils peuvent être par exemple préparés sous forme de produit lyophilisé qui est dissous, avant l'usage, avec de l'eau distillée pour donner une solution injectable; ils peuvent également se présenter sous forme d'onguent, de collyre ou de «collunarium».

Lors du traitement d'un patient à tumeur maligne, par exemple, on peut traiter in vitro un fragment de tissu tumoral provenant de ce patient, avec LK 2 afin d'augmenter l'immunogénicité de ce fragment, que l'on administre au patient afin d'obtenir un traitement beaucoup plus efficace de la tumeur maligne.

Les utilisations combinées de LK 2 avec des anti-oncotiques, par exemple, des lymphokines comme HuIFN, TNF, LT et TGCF (facteur de croissance de cellule-T); des saccharides anti-oncotiques comme ß-glucane-1,3, arabinomannane, lipopolysaccharide, OK-432 (picibanil), PSK (krestin) et lentinane; des antagonistes métaboliques comme méthotrexate et fiuoro-uracile; et des antibiotiques anti-oncotiques comme doxorubicine et mitomycine C, sont très avantageux, car ils augmentent considérablement l'effet anti-oncotique de LK 2.

Plus particulièrement est éclaircie ci-après la propriété de LK 2 d'augmenter l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques.

Expérimentation C-l

Augmentation de l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques par LK 2

Cet effet est étudié sur des cellules de tumeurs malignes. On ensemence 106 cellules de tumeur maligne humaine sur 1 ml d'un milieu de culture nutritif, de type classique, additionné de sérum fœtal de veau, et l'on cultive pendant 1 jour. Puis on ajoute à cette culture 0,1 ml de sérum physiologique renfermant 100 unités d'un échantillon de LK 2, préparé par le procédé de l'expérimentation A-3, et/ou un produit chimiothérapeutique, et l'on cultive pendant 2 jours supplémentaires à 37° C.

Comme témoin, on utilise un sérum physiologique exempt de LK 2 et de produit chimiothérapeutique.

Lorsque la culture est terminée, on compte le nombre de cellules viables selon le procédé de l'expérimentation B-l, et l'on détermine le pourcentage d'inhibition de croissance.

Les concentrations des produits chimiothérapeutiques essayés sont comme suit: chlorhydrate de nimustine (ACNU), 1 x 106 g/ml de culture; fiuoro-uracile (5-FU), 1,5 x 10~8 g/ml de culture; doxorubicine (ADM), 1 x 10~10 g/ml de culture; mitomycine C (MMC), 2,5 x 10~9 g/ml de culture; et sulfate de vincristine (VCR), 1,5 x 10"'° g/ml de culture.

Les résultats sont reportés dans le tableau V. Ils montrent clairement que LK 2 augmente considérablement l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques.

(Tableau en tête de la page suivante)

Expérimentation C-2

Un groupe de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés, dans la région dorsale, de petits fragments de tissu de cancer du sein humain.

Lorsque la croissance des masses tumorales atteint environ 200 mm3 dans le corps des animaux, on injecte par voie intraveineuse du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 2, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3 et/ou un produit chimiothérapeutique, une fois par jour pendant 20 jours. Puis on sacrifie les animaux et les masses tumorales résultantes sont pesées. On utilise comme témoin du sérum physiologique exempt de LK 2 et de produits chimiothérapeutiques.

Les résultats figurent dans le tableau VI. Il en ressort clairement que LK 2 augmente considérablement l'effet anti-oncotique des produits chimiothérapeutiques, même in vivo.

(Tableau en page suivante)

Les preuves mentionnées ci-dessus confirment qu'une combinaison d'un produit chimiothérapeutique avec LK 2 aboutit à un effet anti-oncotique supérieur.

L'utilisation de LK 2 comme renforçateur des produits chimiothérapeutiques réduit considérablement dans la pratique la concentration de ces derniers, empêche la manifestation d'effets secondaires, et élargit leurs spectres tumoraux.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9 664574

Tableau V

Lignée cellulaire

Néant

ACNU

5-FU

ADM

MMC

VCR

+

-

+

-

+

-

+

-

+

Hep ± 2

52

4

67

8

80

13

70

10

72

5

66

(carcinome épidermoïde du larynx)

PC-8

62

2

71

10

85

6

71

5

68

8

72

(carcinome du poumon)

MKN 7

62

4

73

6

77

5

69

3

73

6

70

(cancer de l'estomac)

HLE

57

5

75

8

81

7

73

12

74

10

69

(carcinome du foie)

Hela

51

5

71

12

69

7

62

7

61

10

63

(carcinome épithéloïde du col de l'utérus)

Note: +) avec produit chimiothérapeutique,

—) sans produit chimiothérapeutique;

et les valeurs indiquent le pourcentage d'inhibition de croissance des cellules tumorales.

Le rendement est de l'ordre de 1,5 x 106 unités/litre de suspension de cellules induites.

Exemple A-2

On injecte à des hamsters nouveau-nés un antisérum classique, préparé à partir de lapin, afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes humains, BALL-1, et on les nourrit pendant 3 semaines de manière habituelle. Les masses tumorales, environ 15 g chacune, formées sous la peau des animaux, sont extraites, hachées et désagrégées dans du sérum physiologique. Après rinçage avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (pH 7,2), les cellules ayant proliféré sont remises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, afin d'obtenir une densité cellulaire de l'ordre de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendai et d'endotoxine de E. coli, à raison respectivement de 1000 titres d'hémagglutination/ml et de 10 |ig/ml, environ, et l'on met à incuber à 37° C pendant 1 jour, pour induire la production de LK 2. Après centrifugation de la culture à 4° C et 1000 xg, environ, pour éliminer le sédiment, la partie surnageante est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 21 heures, et est traitée avec une membrane filtrante. Le filtrat est purifié avec une colonne d'anticorps, comme dans l'exemple A-l, et la solution d'éluat est concentrée et lyophilisée pour donner un produit pulvérulent ayant une activité spécifique LK 2 de l'ordre de 109 unités/mg de protéine.

Le rendement est voisin de 3,2 x 107 unités.

Exemple A-3

On transplante dans des souris nues adultes, par voie intrapérito-néale, une lignée de lymphoblastoïdes humains, TALL-1, on les alimente de manière habituelle pendant 5 semaines, leur injecte par voie intrapéritonéale du virus de la maladie de Newcastle (environ 3000 titres d'hémagglutination par souris nue) qui a été au préalable pratiquement inactivé par irradiation aux UV, et les sacrifie 24 heures après cette injection, puis on recueille leurs fluides ascitiques. Ces fluides sont purifiés, concentrés et lyophilisés comme dans l'exemple A-2, pour donner un produit pulvérulent possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 3,5 x 10® unités/souris nue.

Exemple A-4

Des souris adultes sont irradiées avec environ 400 rem de rayons X afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes humains, Mono-1, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. Les masses tumorales, environ 10 g chacune, formées sous la peau des animaux, sont extraites, et désagrégées comme dans l'exemple A-2. Les

Tableau VI

Traitement

Dosage quotidien

Masse tumorale (g)

Témoin LK2 MMC

LK 2 plus MMC

0

100 unités/kg 1 mg/kg

100 unités/kg 0,1 mg/kg

10,8 ± 1,0 6,4 ± 0,5* 5,1 ± 0,4*

4,8 ± 0,4*

Note: *) indique les résultats statistiquement significatifs par rapport au témoin de valeur 5 %.

Le renforçateur renfermant LK 2 selon l'invention, qui présente une activité de renforcement de l'effet anti-oncotique quand il est utilisé conjointement avec des produits chimiothérapeutiques, est mélangé avec un de ces produits avant d'être administré avec lui, par une seule voie. Ou bien, on peut administrer d'abord le renforçateur 40 ou le produit chimiothérapeutique, puis l'autre produit, par une voie identique ou différente.

Les exemples suivants A, B et C illustrent respectivement la production de LK 2, des compositions pharmaceutiques renfermant LK 2 et l'anticorps monoclonal spécifique de LK 2. 45

Exemple A-l

Une lignée humaine de lymphoblastoïdes, BALL-1, est ensemencée sur un milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4) additionné de 20% de sérum fœtal de veau, et est cultivée in vitro, en suspension à so 37° C, de manière habituelle: Les cellules humaines ayant proliféré sont alors rincées avec du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4) exempt de sérum, et sont remises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, de façon à avoir une densité cellulaire de 1 x 107 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est addi- 55 tionnée de virus de Sendai à la dose d'environ 1000 titres d'hémagglutination/ml, et l'on met à incuber à 38° C pendant 1 jour afin d'induire la production de LK 2. Après centrifugation de la culture résultante à 4° C et 1000 xg, environ, la partie surnageante est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon «o phosphate (pH 7,2) pendant 15 heures, et l'on traite avec une membrane filtrante. On fait ensuite passer le filtrat au travers d'une colonne d'anticorps anti-LK 2, comme dans l'expérimentation A-l,

et la fraction nonadsorbée est purifiée comme dans l'expérimentation A-3, au moyen d'une Chromatographie par affinité utilisant une 65 colonne de gel d'anticorps anti-LK 2, puis l'on concentre afin d'obtenir un concentré ayant une activité spécifique LK 2 d'environ 109 unités/mg de protéine.

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10

cellules humaines ainsi obtenues sont mises en suspension comme dans l'exemple A-2, après quoi la suspension cellulaire résultante est additionnée de virus de Sendai et de concanavaline A, aux doses respectives de 500 litres d'hémagglutination/ml et de 0,8 ng/ml, et l'on met à incuber à 37° C pendant 1 jour pour induire la production de LK 2. Cette culture est ensuite purifiée, concentrée et lyophilisée comme dans l'exemple A-2, pour donner une poudre possédant une activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 2 x 107 unités/souris.

Exemple A-5

On transplante, dans des hamsters nouveau-nés, une lignée de lymphoblastoïdes humains, Namalwa (ATCC CRL 1432), comme dans l'exemple A-2, et on les alimente de manière habituelle pendant

4 semaines. Les masses tumorales, environ 20 g chacune, formées sous la peau des animaux, sont extraites et désagrégées pour donner une suspension cellulaire ayant une densité de l'ordre de 3 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendai à raison de 1000 titres d'hémagglutination/ml, et l'on met à incuber à 36 C pendant 2 jours pour induire la production de LK 2. Cette culture est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-l, pour donner un concentré possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 2,2 x 107 unités/hamster.

Exemple A-6

Une lignée de lymphoblastoïdes humains, NALL-1, est mise en suspension dans du sérum physiologique, et est placée dans une chambre de diffusion cylindrique de 10 ml environ, en matière plastique, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore nominale d'environ 0,5 |i. Cette chambre est incluse par voie intra-péritonéale dans un rat adulte, et l'animal est nourri de manière habituelle pendant 4 semaines. Après enlèvement de la chambre, on constate que la densité cellulaire dans celle-ci est de l'ordre de

5 x 108 cellules/ml, ce qui est environ 102 fois, ou plus, supérieur à ce que l'on obtient dans le cas d'une prolifération in vitro dans un incubateur à C02 utilisant un milieu de culture nutritif. Ces cellules humaines sont mises en suspension dans un milieu de culture semblable à celui de l'exemple A-2, on y ajoute du virus de la maladie de Newcastle (environ 500 titres d'hémagglutination/ml) préalablement inactivé par irradiation aux UV, et de la phytohémagglutinine (environ 50 ng/ml), et l'on met à incuber à 37° C pendant un jour pour induire la production de LK 2. Cette culture est ensuite purifiée, concentrée et lyophilisée comme dans l'exemple A-2 pour donner une poudre possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 8 x 10® unités/rat.

Exemple A-7

Une lignée de lymphoblastoïdes humains, CCRF-CEM (ATCC CCL 119), est ensemencée dans les cavités allantoïques d'oeufs em-bryonnés qui ont été mis à incuber à 37° C pendant 5 jours, et ces œufs sont remis à incuber à la même température pendant une semaine supplémentaire. Les cellules humaines ayant proliféré sont recueillies à partir des œufs, et mises en suspension comme dans l'exemple A-l de manière à donner une densité cellulaire de 5 x 10® cellules/ml. Cette suspension cellulaire est alors additionnée de virus de Sendai (environ 500 titres d'hémagglutination/ml) et mise à incuber à 37° C pendant un jour, pour induire la production de LK 2. La culture résultante est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2, pour donner une poudre possédant l'activité LK 2.

Le rendement est de l'ordre de 7 x 10s unités pour 10 œufs em-bryonnés.

Exemple B-l Injection

500000 unités de spécimen de LK 2, préparées dans l'exemple 1-2, sont dissoutes dans 200 ml de sérum physiologique, et on filtre dans des conditions stériles à l'aide d'une membrane filtrante. Des portions de 2 ml de ce filtrat sont réparties dans des fioles de verre stérilisées, sont lyophilisées et on scelle ces fioles pour obtenir un produit injectable en poudre.

Ce produit injectable est avantageusement utilisable seul, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme melphalan, méthotrexate ou doxorubicine, pour le traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon, du carcinome du foie et de la leucémie.

Exemple B-2 Injection

Un produit injectable en poudre est préparé comme dans l'exemple B-l, mais avec dissolution dans 200 ml de sérum physiologique, de 3 x 108 unités de HuIFN-a provenant de cellules de lymphoblas-toïde humain, conjointement avec 5 x 10s unités de LK 2.

Ce produit injectable est avantageusement utilisable seul, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme tegafur, mitomycine C ou sulfate de vincristine, pour le traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon, du carcinome du foie et de la leucémie, et son efficacité thérapeutique est supérieure à celle du produit injectable de l'exemple B-l.

Exemple B-3 Onguent

Le spécimen de LK 2, préparé dans l'exemple A-3, est pétri avec une quantité minimale de paraffine liquide, jusqu'à homogénéité. Ce mélange est alors additionné de vaseline blanche de manière habituelle, pour obtenir un onguent ayant une teneur en LK 2 de 20 000 unités/g.

Cet onguent est avantageusement utilisable seul, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme cyclosphamide, fiuoro-uracile ou sulfate de vincristine, pour le traitement du carcinome de la peau, du cancer du sein et de la maladie de Hodgkin.

Exemple B-4 Collyre

Un mélange de 800 ml d'eau distillée, 5 ml de p-phényléthanol et 20 000 000 unités de spécimen de LK 2, préparé dans l'exemple A-4, est mélangé avec du chlorure de sodium dans une quantité supplémentaire d'eau distillée, afin d'obtenir 1000 ml de solution isotonique.

Cette solution peut être avantageusement utilisée seule, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme cytarabine ou sulfate de vincristine, pour traiter le rétino-blastoma.

Exemple B-5

Comprimés entèriques enrobés

On prépare des comprimés entèriques enrobés selon un procédé classique, à partir d'un mélange d'amidon, de maltose et de spécimen de LK 2, préparé dans l'exemple A-7, de manière à avoir une teneur en LK 2 de 200 000 unités par comprimé (100 mg), puis on enrobe les comprimés avec de l'ester phtalique de méthyl cellulose. Ces comprimés peuvent être avantageusement utilisés seuls, ou comme renforçateur en combinaison avec un produit chimiothérapeutique comme doxorubicine, fiuoro-uracile ou mitomycine C, pour le traitement du carcinome du côlon et du carcinome du foie.

Exemple C-l

Des souris sont immunisées comme dans l'expérimentation A-2, à ceci près que l'on utilise comme antigène un LK 2 très pur, obtenu par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3. Ensuite, des cellules de rate de ces animaux sont mises en suspension avec une lignée de myélome de souris, P3-NS-l/l-Ag4-l, un produit de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd, Japon, dans une solution saline renfermant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2P04 et 2 mM de CaCl2, de manière à avoir des densités cellulaires respecti5

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ves de IO4 cellules/ml. On ajoute à cette suspension cellulaire une solution saline fraîche de même composition, mais renfermant en plus du virus Sendai, préalablement inactivé par une irradiation aux UV, avec refroidissement à la glace, et on laisse reposer ce mélange pendant 5 reprises. Puis on le dilue environ 20 fois dans un milieu 5 RPMI 1640 à 37° C, et les cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps anti-LK 2, sont clonées comme dans l'expérimentation A-2. Les cellules d'hybridome clonées sont transplantées par voie in-trapéritonéale dans des hamsters âgés de 7 jours (environ 107 cellules par hamster) dont l'immunoréaction a été affaiblie par des modes 10 opératoires classiques, et l'on récupère l'anticorps monoclonal à partir des corps des animaux comme dans l'expérimentation A-2.

Tout comme l'anticorps monoclonal préparé dans l'expérimentation A-2, le produit présente une neutralisation immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxique de LK 2. 15

La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse est étudiée par dosage des activités neutralisantes résiduelles après mise à incuber dans les conditions prescrites: lors d'une incubation à pH 7,2 et de différentes températures pendant 30 minutes, 80% ou plus de l'activité est conservée à 60° C; mais 90% ou plus est perdue 20 à 70° C. Après incubation à 4° C et différentes valeurs de pH pendant 16 heures, l'activité reste stable dans un intervalle de pH compris entre 2 et 11.

Lors de l'étude de plusieurs propriétés de l'anticorps monoclonal, on constate que l'anticorps monoclonal selon l'invention résiste au mercapto-2 éthanol, et suscite une réaction spécifique antigène-anticorps avec un anticorps anti-immunoglobuline de souris. Ainsi, l'anticorps monoclonal selon l'invention se classe-t-il dans le groupe des anticorps de l'immunoglobuline.

Exemple C-2

Un anticorps anti-LK 2 monoclonal est préparé comme dans l'exemple C-l, à ceci près que l'on remplace P3-NS-l/l-Ag4-l par une lignée de myélome de souris, SP2/0-Agl4, provenant de Dainip-pon Pharmaceutical Co., Ltd, Japon.

Lors de la neutralisation immunologiquement spécifique par l'anticorps monoclonal de l'activité cytotoxique de LK 2, on obtient des résultats semblables à ceux de l'exemple C-l. Ainsi, l'anticorps monoclonal se situe-t-il dans la classe des anticorps d'immunoglobu-line G.

Il est bien entendu que la description détaillée et les exemples particuliers indiquant des formes de réalisation préférées de l'invention ne sont donnés qu'à titre d'illustration; différents changements et modifications possibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant de cette description détaillée, sans sortir du cadre de l'invention.

R

Claims

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2

REVENDICATIONS

1. Lymphokine humaine, en abrégé LK 2, ayant une activité cy-totoxique sur les cellules de tumeurs malignes, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes:

(a) Poids moléculaire: 20000 ± 2000 u (20000 ± 2000 daltons)

(b) Point isoélectrique: pi = 6,2 ± 0,3

(c) Mobilité électrophorétique: sur pastille de PAGE, Rf = 0,29 ± 0,02

(d) Spectre d'absorption dans l'UV : absorption maximale pour une longueur d'onde proche de 280 nm.

(e) Solubilité dans les solvants: soluble dans l'eau, le sérum physiologique et le tampon phosphate; difficilement soluble ou insoluble dans l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.

(f) Réactions colorées: protéine positive selon le procédé de Lowry, ou le procédé à la microburette; saccharide positif selon le procédé phénol-acide sulfurique ou le procédé anthrone-acide sulfu-rique.

(g) Activités biologiques: cytotoxique sur cellule L 929, et sur cellule KB. Pratiquement exempte d'activité interféron.

(h) Stabilité en solution aqueuse: stable jusqu'à 60° C lorsqu'on met à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes. Stable dans l'intervalle de pH de 4 à 11 lorsqu'on met à incuber à 4° C pendant 16 heures.

(i) Stabilité à la cryoconservation : stable à —10° C sur une durée de 1 mois ou plus.
2. Procédé pour la production de lymphokine humaine, en abrégé LK 2, selon la revendication 1, caractérisé par les stades de: exposition d'une cellule humaine capable de produire LK 2 à l'action d'un indicateur de LK 2, dans des conditions permettant l'accumulation de quantités marquées de ce produit, et récupération du LK 2 ainsi obtenu.
3. Procédé pour la production de lymphokine humaine, en abrégé LK 2, selon la revendication 1, caractérisé par des stades de: prolifération in vitro ou iti vivo d'une cellule humaine capable de produire LK 2, exposition de la cellule humaine proliférée à l'action d'un inducteur de LK 2, dans des conditions permettant l'accumulation de quantités marquées de ce produit, et récupération du LK 2 ainsi obtenu.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 2, sont obtenues in vivo, par leur transplantation dans un animal à sang chaud, que l'on alimente, afin de permettre à ces cellules d'utiliser le fluide corporel nutritif de l'animal pour leur prolifération, suivie d'une extraction et de la désagrégation de la tumeur qui s'est formée dans l'animal.
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire LK 2 sont obtenues in vivo, par mise en suspension de cellules humaines dans une chambre de diffusion, dans laquelle leur est apporté le fluide corporel nutritif dans un animal à sang chaud, la chambre de diffusion étant incrustée dans ou placée sur l'animal de façon à permettre l'apport de son fluide corporel nutritif dans la chambre, et l'animal étant alimenté pour permettre aux cellules humaines d'utiliser ce fluide pour leur prolifération, suivie de la récolte des cellules, ayant proliféré, à partir de cette chambre.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'animal est immunodéficient ou que ses réactions immunologiques sont supprimées.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la chambre de diffusion est munie d'une ou de plusieurs membranes filtrantes, fibres creuses ou ultrafiltres, ayant une dimension de pore nominale de 10~7 à 10~5 m.
8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 2, sont des lymphocytes ou des leucocytes humains, en particulier des lymphoblas-toïdes, notamment ceux des lignées suivantes: Namalwa ATCC CRL 1432, BALL-1, TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, MOLT-3 ATCC CRL 1552, CCRF-

SB ATCC CCL 120, CCRF-CEM ATCC CCL 119, BALM-2, DND-41 et Mono-1.
9. Procédé selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'inducteur de LK 2 est choisi dans les groupes suivants: induc-

5 teur d'interféron-a, inducteur d'interféron-y et leurs mélanges.
10. Procédé suivant l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une solution renfermant LK 2 et une quantité marquée d'impuretés, avec une colonne d'un anticorps anti-LK 2 immobilisé, afin de réaliser une Chromatographie par affi-

10 nité, puis à recueillir la fraction active de LK 2 résultante.
11. Composition pharmaceutique à action anti-oncotique, caractérisée en ce qu'elle renferme, outre un support pharmaceutique-ment acceptable, du LK 2 selon la revendication 1.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle renferme au moins 5 unités de LK 2 par gramme.
13. Composition selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle renferme en outre un produit chimiothérapeutique comme agent d'alkylation, antagoniste métabolique, antibiotique anti-onco-

20 tique, alcaloïde, et leurs mélanges.
14. Utilisation de LK 2, selon la revendication 1, pour produire un anticorps monoclonal spécifique de LK 2, caractérisée en ce qu'elle consiste à immuniser un animal à sang chaud avec LK 2 comme antigène, à receuillir les cellules productrices d'anticorps à

25 partir de cet animal, à fusionner ces cellules avec des cellules de myélome, à choisir un clone capable de produire à partir des cellules d'hybridome résultant des anticorps anti-LK 2, à faire proliférer ce clone et à laisser les cellules ayant proliféré produire un anticorps monoclonal spécifique de LK 2.

30 15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que la cellule productrice est une cellule splénique, en- particulier de souris.
16. Utilisation selon la revendication 14 ou 15, caractérisée-en ce que le stade de fusion comprend la mise en suspension des cellules

3j productrices d'anticorps avec des cellules de myélome, dans une solution saline renfermant une quantité efficace d'un agent inducteur de la fusion, en particulier du virus de Sendai ou du polyéthylène glycol, suivie d'un repos de durée suffisante pour que la fusion se1 réalise.

40 17. Anticorps monoclonal spécifique de LK 2 obtenu selon une des revendications 14 à 16.