CH650801A5

CH650801A5 - Procede pour preparer de l'interferon de type ii et preparation contenant de l'interferon de type ii.

Info

Publication number: CH650801A5
Application number: CH341/80A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto; Shokichi Yuen
Original assignee: Hayashibara Ken; Ashida Shin
Priority date: 1979-01-18
Filing date: 1980-01-16
Publication date: 1985-08-15
Also published as: FR2446637B1; DE3001585C2; ES487852A0; SE8701856L; DE3001585A1; FR2446637A1; GB2040292A; US4285929A; NO156051B; IT8047632A0; AU536477B2; JPS631296B2; FI68519C; IT1143056B; NL8000291A; NO156051C; SE451797B; DK11880A; SE456741B; SE8000243L

Description

La présente invention concerne un procédé pour préparer de l'interféron de type II et une préparation pour le traitement et/ou la prévention des maladies sensibles à l'interféron de type II.

Comme décrit par Shigeyasu Kabayashi, «Interferon», publié par Kodansha Co. Ltd, Tokyo, Japon, (1975), par D.A.J. Tyrrell, «Interferon and Its Clinical Potential», publié par William Heine-man Medicai Books Ltd. (Londres) (1976), et dans «Protein,

Nucleic Acid and Enzyme», vol. 21, N° 4 (1976), le terme interféron désigne une substance protéique, induite intracellulairement ou extracellulairement par des cellules vivantes, exposées à l'action d'un inducteur d'interféron, par exemple virus, bactérie, protozoaire, ri-

ckettsie, acide nucléique, endotoxine Polysaccharide, etc., qui inhibe de façon non spécifique la multiplication de divers virus à l'intérieur des cellules. En raison de son pouvoir d'inhibition de la multiplication virale, on considère depuis sa découverte déjà ancienne que l'in-5 terféron est un agent prophylactique et thérapeutique prometteur pour la lutte contre les maladies virales. On a récemment démontré que l'interféron se comporte comme un agent antitumoral, non seulement vis-à-vis des tumeurs virales, mais également des tumeurs non virales: par conséquent, on attend beaucoup de l'application io médicale de l'interféron.

Il est bien connu que le terme interféron englobe les interférons des types I et II ; le type I ou interféron classique a un poids moléculaire d'environ 1-3 x 104 et est induit par l'exposition des cellules vivantes à des infections virales, tandis que le type II, ou interféron 's immunitaire, a un poids moléculaire d'environ 4-7 x 104 et est induit dans les lymphocytes par stimulation par des agents mitogènes ou en réponse à des antigènes. D'après L.B. Epstein, «Texas Reports on Biology and Medicine», vol. 35, pp. 41-56 (1977), publié par la branche médicale de l'Université du Texas, Galveston, Texas, USA, zi) l'interféron de type II est moins stable que celui du type I dans des conditions sévères, c'est-à-dire à un pH inférieur à 2 ou supérieur à 10 et/ou une température supérieure à 56 C. Cependant, comme l'interféron de type II présente une relation étroite avec les réactions immunitaires, on escompte qu'il aura des efficacités thérapeutiques 25 et prophylactiques, vis-à-vis des maladies justiciables de l'interféron, bien supérieures à celles de l'interféron de type I.

Comme l'interféron a une grande spécificité vis-à-vis de l'espèce, on n'obtient pas d'effet thérapeutique ou prophylactique sur les maladies humaines avec de l'interféron provenant de sources autres que 30 les cellules humaines vivantes. A ce jour, on utilise les leucocytes pour préparer l'interféron de type II. Il est très difficile d'obtenir une quantité importante d'interféron de type II de façon peu coûteuse à partir de leucocytes, car ceux-ci doivent être séparés et préparés à partir du sang frais et ils ne résistent pas à des conservations prolon-35 gées. Cela explique que la production industrielle d'interféron de type II, convenant comme agent thérapeutique et prophylactique des maladies humaines, n'ait pas été réalisée.

Le titulaire a étudié des procédés permettant la production in-dustrielle facile d'interféron de type II et l'application de cet interféron comme agent thérapeutique et prophylactique. Ces études ont conduit à la constatation que l'on ne peut pas obtenir une grande quantité d'interféron de type II, de titre élevé, par transplantation et multiplication de cellules humaines, productrices d'interféron de 45 type II, dans un milieu de culture nutritif in vitro, mais qu'on peut facilement l'obtenir par un procédé caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1.

L'interféron de type II, obtenu selon ce procédé, constitue un excellent agent thérapeutique et prophylactique des maladies sensibles so à l'interféron de type II.

La préparation mentionnée au début est caractérisée selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 9.

Le procédé de l'invention diffère des procédés classiques dans lesquels on multiplie les cellules vivantes in vitro ; il présente l'avantage 55 de ne pas nécessiter, ou de nécessiter beaucoup moins, de milieu nutritif additionné de sérum coûteux; le maintien et l'ajustement des conditions, pendant la multiplication des cellules humaines établies, sont plus faciles et l'on obtient aisément un interféron de type II de titre plus élevé. Dans le procédé de l'invention, on peut facilement 60 multiplier des cellules humaines établies dans le corps d'un autre animal à sang chaud par utilisation du fluide corporel, par transplantation des cellules dans l'organisme de cet animal, ou par adaptation dans ou sur le corps de l'animal d'une chambre de diffusion chargée d'un milieu de culture, dans lequel les cellules sont en sus-65 pension, tandis que l'on alimente l'animal de façon habituelle. En particulier, par rapport aux procédés classiques, dans lesquels on multiplie les cellules in vitro, le procédé de l'invention présente comme caractéristiques additionnelles une multiplication des cellules

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plus régulière, une vitesse de multiplication plus élevée et un rendement en interféron de type II, induit par cellule, bien supérieur.

On peut utiliser toutes les cellules humaines établies qui se multiplient facilement lorsqu'on les transplante dans le corps d'un autre animal à sang chaud. Par exemple, on peut utiliser dans l'invention les cellules HPB-ALL, MOLT-3, P 12/Ichikawa, HPB-MLT, P 8/Seki, JBL, HCL et P 10/Shibata, décrites dans «Protein, Nucleic Acid and Enzyme», vol. 23, N° 6 pp. 697-711 (1978), la cellule Namalva décrite dans «Journal of Clinical Microbiology», vol. 1, pp. 116-117 (1975) et les cellules BALL-1, TALL-1 et NALL-1 décrites par I. Miyoshi, «Nature», vol. 267, pp. 843-844 (1977). En particulier, on préfère les lignées de cellules lymphoblastoïdes humaines. On peut choisir les cellules humaines établies, utiles dans l'invention, parmi les cellules précitées, mais l'invention n'est pas limitée à l'emploi de telles cellules. Dans les stades précédant l'induction de l'interféron de type II, on peut utiliser les cellules ci-dessus séparément ou en combinaion. Si on le désire, on mélange à ces cellules des leucocytes humains, préparés à partir de sang humain frais.

Tout animal à sang chaud peut convenir, pourvu que les cellules humaines établies puissent s'y multiplier facilement; ces animaux sont par exemple des oiseaux, comme poulet ou pigeon, et des mammifères, comme chien, chat, singe, chèvre, bovin, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris normale et souris nue. Comme la transplantation des cellules humaines dans les corps des animaux précités tend à produire des réactions immunitaires indésirables, on doit choisir des animaux à l'état le plus immature possible, c'est-à-dire à l'état d'œuf, de fœtus, d'embryon, d'animal nouveau-né ou en bas âge, pour réduire autant que possible les réactions immunitaires. Avant la transplantation des cellules, on peut irradier l'animal avec environ 200 à 600 rems de rayons X ou y ou lui injecter un antisérum ou un agent immunodépresseur pour réduire les réactions immunitaires. On préfère comme animal à sang chaud la souris nue, même adulte, car elle a moins tendance à présenter des réactions immunitaires indésirables, et l'on peut lui transplanter des cellules humaines établies pour qu'elles se multiplient rapidement sans aucun traitement préalable. La transplantation des cellules humaines multipliées du corps d'un animal à sang chaud au corps d'un autre animal à sang chaud peut rendre la multiplication cellulaire plus régulière et accroître la quantité induite d'interféron de type II ; par exemple, on transplante des cellules humaines établies chez le hamster, puis on récolte les cellules humaines multipliées et on les transplante chez la souris nue. Dans ce cas, on peut, de plus, transplanter les cellules multipliées du corps d'un animal à sang chaud dont l'espèce, le genre, la classe ou la division sont les mêmes. On peut également transplanter les cellules humaines établies dans une partie quelconque du corps de l'animal, pourvu qu'elles s'y multiplient facilement; par exemple, on peut effectuer une transplantation intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou dans la cavité allantoïque.

Au lieu de transplanter et de multiplier les cellules humaines établies dans le corps d'un autre animal à sang chaud, on peut ensemencer et multiplier les cellules précitées dans le fluide corporel nutritif du corps d'un autre animal à sang chaud dans une chambre de diffusion classique qui est par exemple placée dans le péritoine et est conçue pour permettre aux cellules d'utiliser ce fluide corporel nutritif. Les chambres, que l'on peut utiliser dans l'invention, peuvent avoir des formes et des tailles diverses avec interposition de membranes filtrantes, par exemple de type membrane-filtre, ultrafiltre ou fibres creuses, pour éviter la fuite des cellules. En particulier, on préfère les chambres avec interposition de membranes filtrantes ayant des pores d'environ 10~7àl0~sm. Si nécessaire, on peut concevoir la chambre de diffusion et la placer, par exemple, sur la surface du corps de l'animal, de façon que le fluide corporel nutritif de l'animal puisse circuler dans la chambre et que l'on puisse observer le développement des cellules humaines établies, dont on a ensemencé la chambre à travers une fenêtre latérale transparente ménagée dans la paroi de la chambre. La chambre de diffusion peut également être conçue de telle sorte qu'on puisse la séparer périodiquement du corps de l'animal et que les cellules se multiplient pendant toute la vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier inutilement l'animal, afin d'accroître encore le rendement en cellules multipliées par ce dernier. Le procédé, qui utilise une telle chambre de diffusion, présente, en plus de la facilité de récolter des cellules humaines multipliées, par suite de l'absence de contact direct entre ces cellules et les cellules de l'animal, la caractéristique de permettre d'utiliser divers animaux à sang chaud sans aucun prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires, car il y a moins de risque que ces réactions immunitaires se produisent.

Le procédé de l'invention présente l'avantage que l'on peut alimenter de façon habituelle l'animal auquel on transplante les cellules humaines établies et qu'aucun traitement particulier n'est nécessaire, même après la transplantation des cellules. La durée nécessaire à une multiplication suffisante des cellules humaines établies, transplantées, est généralement d'environ 1 à 10 semaines.

La numération des cellules humaines multipliées peut montrer la présence d'environ 107 à 1012 cellules ou plus par animal. En d'autres termes, le procédé de l'invention est extrêmement avantageux pour préparer de l'interféron de type II, du fait qu'il peut accroître d'un facteur d'environ 102 à 107 le nombre des cellules transplantées ou ensemencées dans le corps de l'animal ou dans la chambre de diffusion. Le nombre des cellules obtenues peut être multiplié d'un facteur d'environ 10 à 106 ou plus par rapport à celui que l'on obtient par ensemencement et multiplication des mêmes cellules in vitro, dans un milieu de culture nutritif.

On peut utiliser un procédé quelconque d'induction de l'interféron de type II, à condition qu'il provoque la formation d'interféron de type II dans les cellules humaines, vivantes, multipliées. On peut exposer les cellules en cours de multiplication à l'action d'un inducteur d'interféron de type II. Par exemple, on peut exposer à l'action d'un inducteur d'interféron de type II in vivo en cours de multiplication les cellules humaines multipliées en suspension dans le liquide d'ascite ou les cellules tumorales sous-cutanées, puis purifier et séparer l'interféron de type II induit du liquide d'ascite ou de la tumeur. Au contraire, on peut exposer à l'action d'un inducteur d'interféron de type II in vitro les cellules humaines multipliées après isolement pour provoquer la production d'interféron de type II. Par exemple, on met en suspension dans un milieu nutritif, maintenu entre environ 20 et 40'C, les cellules humaines multipliées, séparées du liquide d'ascite ou isolées et dissociées des tumeurs sous-cutanées massives, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 10s à 108 cellules/ml, puis on les expose à l'action d'un inducteur d'interféron de type II. Ensuite, on purifie et sépare l'interféron de type II induit. Lorsqu'on multiplie des cellules humaines dans une chambre de diffusion, on peut exposer les cellules à l'action d'un inducteur d'interféron de type II dans cette chambre, in vivo, ou les exposer à l'action de l'inducteur in vitro, après les avoir recueillies à partir de cette chambre.

Dans la production d'interféron de type II, il est souhaitable d'augmenter encore la quantité de cet interféron induit, selon des procédés connus tels que celui d'amorçage avec de l'interféron très spécifique de l'espèce humaine et/ou le procédé de superinduction avec un inhibiteur métabolique. De plus on peut encore augmenter le rendement en interféron de type II induit par animal selon un ou plusieurs des procédés suivants.

1) On expose tout d'abord les cellules multipliées à l'action d'un inducteur d'interféron de type II pour provoquer la production de cet interféron en cours de multiplication, puis on les expose, après les avoir recueillies dans une partie ou la totalité du corps de l'animal, à l'action d'un inducteur d'interféron de type II, pour induire in vitro la production de l'interféron.

2) In vivo ou in vitro, on fait agir un inducteur d'interféron de type II sur des cellules humaines que l'on a déjà utilisées une ou plusieurs fois pour produire de l'interféron de type II, pour induire la production d'interféron.

3) Une chambre de diffusion, implantée sur ou dans le corps d'un animal, est retirée périodiquement pour augmenter le nombre de cellules humaines multipliées.

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Comme inducteurs de l'interféron de type II, on préfère des agents mitogènes habituels, tels que la phytohémagglutinine, la con-canavaline A, l'agent mitogène du phytolaque, un lipopoly-saccharide, un Polysaccharide, une endotoxine ou une bactérie.

Dans le cas de cellules sensibilisées, un antigène se comporte également comme un inducteur d'interféron de type II. On utilise généralement les inducteurs d'interféron de type II précités à une concentration d'environ 0,001 |xg à 10 mg/ml. Egalement l'emploi d'un ou de plusieurs inducteurs d'interféron de type I, par exemple un virus, un acide nucléique ou un polynucléotide, en combinaison avec un inducteur d'interféron de type II, accroît encore le rendement en interféron de type II induit et permet d'induire simultanément la formation d'interférons de types I et II.

On peut purifier et séparer facilement l'interféron de type II induit selon des techniques classiques de purification et de séparation, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Si l'on désire une préparation d'interféron de type II très purifiée, on peut obtenir la pureté maximale par emploi de techniques classiques telles que I'adsorption et la désorp-tion avec un échangeur d'ions, la filtration sur gel, la Chromatographie d'affinité, le fractionnement au point isoélectrique et l'électro-phorèse, en combinaison avec les techniques précitées.

On détermine les activités des interférons de type I et de type II qui présentent une grande spécificité vis-à-vis de l'espèce humaine selon la méthode de réduction des plages avec des cellules FL provenant d'amnios humain, comme décrit dans «Protein, Nucleic Acid and Enzyme», vol. 20, N° 6, pp. 616-643 (1975), publié par Kyoritsu Shuppan Co. Ltd., Tokyo, Japon.

On détermine le titre d'hémagglutination selon la méthode décrite par J.E. Salk, «Journal of Immunology», vol. 49, pp. 87-98 (1944).

L'expérience A ci-après illustre la production d'interféron de type II.

Expérience A

Production d'interféron par des cellules multipliées in vitro ou in vivo Expérience A-l : Multiplication in vitro

On ensemence avec des cellules BALL-1 du milieu RPMI-1640 additionné de 20% de sérum fœtal de veau à pH 7,2 et on cultive en suspension à 37" C. On lave les cellules multipliées avec du milieu RPMI-1640 non additionné de sérum à pH 7,2 et on les met en suspension dans du milieu frais ayant la même composition pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 1 x 106 cellules/ml.

Expérience A-2: Multiplication in vivo

On effectue une injection préalable d'antisérum préparé à partir de lapins, selon un procédé connu, à des hamsters nouveau-nés,

pour réduire leurs réactions immunitaires, puis on leur transplante par voie sous-cutanée des cellules BALL-1. On alimente les hamsters de façon habituelle pendant trois semaines. On isole les tumeurs massives qui se sont développées sous la peau, on les découpe en particules fines et on les dissocie dans une solution salée physiologique contenant de la trypsine pour recueillir les cellules multipliées. On lave les cellules, ainsi obtenues, avec du milieu RPMI-1640 non additionné de sérum à pH 7,2 et on les met en suspension dans du milieu frais de même composition, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 1 x 10a cellules/ml.

Expérience A-3: Production d'interféron

On expose les suspensions des cellules BALL-1, obtenues dans les expériences A-l et A-2 de concentration cellulaire d'environ 1 x 106 cellules/ml, à l'action de phytohémagglutinine et/ou de virus Sendai pour induire la formation d'interféron. Plus particulièrement, lorsqu'on utilise la phytohémagglutinine seule, on l'ajoute aux suspensions à raison d'environ 100 |J.g/ml et on incube à 37' C pendant 3 d, pour induire la formation d'interféron. Quand on emploie le virus Sendai seul, on ajoute aux suspensions le virus à raison d'environ 300 unités d'hémagglutination/ml et on incube à 37" C pendant un jour pour induire la production d'interféron. Si l'on utilise en combinaison la phytohémagglutinine et le virus Sendai, on ajoute tout d'abord aux suspensions environ 100 ng/1 de phytohémag-5 glutinine, on incube à 37'C pendant 2 d, puis on ajoute le virus Sendai à raison d'environ 300 unités d'hémagglutination/ml et on incube à 37' C pendant encore 1 d pour induire la formation d'interféron.

On centrifuge les suspensions contenant l'interféron ainsi ob te-io nues. On concentre les surnageants avec un ultrafiltre dont la limite de séparation correspond à un poids moléculaire de 6000, puis on fractionne selon le poids moléculaire avec du gel de dextrane. On détermine les activités de l'interféron de type I de poids moléculaire d'environ 25000 et de l'interféron de type II à poids moléculaire de 15 50000, pour évaluer l'activité de l'interféron par millilitre de suspension incubé. Les résultats figurent dans le tableau 1.

Tableau 1

Inducteur d'interféron

Multiplication in vitro in vivo

Phytohémagglutinine

20

400

(20)

(400)

Virus Sendai

1700

6700

(0)

Phytohémagglutinine

1740

24000

+ Virus Sendai

(30)

(11000)

30 Nota: Les activités totales de l'interféron déterminées par incubation sont exprimées en unités par millilitre de suspension et les activités de l'interféron de type II de chaque préparation sont indiquées entre parenthèses.

Comme le montrent de façon évidente les résultats du tableau I, 35 une quantité faible d'interféron est induite dans les cellules multipliées in vitro, tandis qu'une quantité importante d'interféron est induite dans les cellules multipliées in vivo. Les cellules multipliées in vitro de même que les cellules multipliées in vivo produisent de l'interféron de type I lorsqu'on les expose à l'action du virus Sendai. 40 Cependant, l'activité des cellules multipliées in vivo est 4 fois supérieure à celle des cellules multipliées in vitro. En ce qui concerne les activités d'interféron des préparations induites par la phytohémagglutinine et/ou le virus Sendai, on observe une remarquable synergie attribuée aux inducteurs d'interféron dans la production d'interfé-45 rons de type I et de type II lorsqu'on utilise les cellules multipliées in vivo. En particulier, l'interféron de type II, induit par l'emploi d'une combinaison de phytohémagglutinine et de virus Sendai, a une activité environ 28 fois supérieure à celle obtenue par emploi de phytohémagglutinine seule. Cependant, on n'observe pas de synergie lors-50 qu'on utilise les cellules multipliées in vitro.

Divers modes de réalisation illustrant la production d'interféron de type II selon l'invention figurent ci-après.

Exemple A 55 Production d'interféron de type II Exemple A-l :

On transplante par voie sous-cutanée des cellules humaines BALL-1 établies à des souris nues adultes que l'on alimente de façon 60 habituelle pendant 3 semaines. On isole les tumeurs massives apparues sous la peau qui pèsent environ 10 g par souris nue et on les découpe en particules fines que l'on dissocie dans une solution salée physiologique contenant de la trypsine pour recueillir les cellules humaines multipliées. On lave les cellules avec le milieu minimal essen-& tiel de Eagle additionné de 5% en volume de sérum humain à pH 7,2 et on les met en suspension dans du milieu frais de même composition pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 5 x 106 cellules/ml à 37 C. On ajoute à cette suspension de l'interféron très

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spécifique de l'espèce humaine partiellement purifié à raison d'environ 100 unités/ml et on incube le mélange pendant environ 2 h. On ajoute ensuite au mélange de la phytohémagglutinine à raison d'environ 200 ng/ml. On incube ensuite le mélange à cette température pendant encore 3 d pour induire la formation d'interféron de type II. On centrifuge le milieu incubé à environ 1000 x g à 4 C pour éliminer des précipités tels que les débris cellulaires et on dialyse le surnageant obtenu contre une solution salée physiologique tamponnée à pH 7,2 avec du tampon phosphate 0,01 M pendant 24 h. On filtre ensuite soigneusement le produit obtenu sur une membrane filtrante et on concentre le filtrat contenant l'interféron de type II, puis on lyophilise sous la forme d'une poudre.

L'actitivé d'interféron de type II de la poudre obtenue correspond à environ 1500000 unités par souris nue.

Exemple A-2:

On transplante dans le péritoine de souris nues adultes des cellules humaines BALL-1 et TALL-1 établies et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 5 semaines. On injecte ensuite aux souris nues par voie intrapéritonéale 1 mg de phytohémagglutinine en 24 h, après on injecte environ 3000 unités d'hémagglutination du virus de la maladie de Newcastle dont on a presque totalement supprimé au préalable l'activité par irradiation par des ultraviolets. On sacrifie les souris nues pour recueillir le liquide d'ascite 24 h après l'injection. On centrifuge les liquides d'ascite à environ 1000 x g à 4 C pour éliminer les précipités tels que les débris cellulaires. On dialyse le surnageant obtenu contre une solution salée physiologique tamponnée à pH 7,2 avec du tampon phosphate 0,01 M pendant 15 h. On filtre le produit obtenu et on le concentre soigneusement avec des membranes filtrantes pour obtenir un concentré contenant de l'interféron.

L'activité totale d'interféron du concentré est d'environ 800000 unités pour 10 souris nues dont environ 300000 unités correspondent à l'activité d'interféron de type II.

Exemple A-3:

On soumet des hamsters nouveau-nés à une injection préalable d'antisérum préparé à partir de lapins selon un procédé connu pour réduire leurs réactions immunitaires, puis on leur injecte par voie sous-cutanée des cellules humaines JBL établies. On alimente les hamsters de façon habituelle pendant 4 semaines. On isole les tumeurs massives formées sous la peau qui pèsent environ 30 g par hamster et on les traite comme décrit dans l'exemple A-l. On lave les cellules multipliées avec du milieu RPMI-1640 additionné de 10% en volume de sérum fœtal de veau à pH 7,4 et on les met en suspension dans du milieu frais ayant la même composition pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 2 x 107 cellules/ml à 37r C. On ajoute au mélange de l'interféron de type II très spécifique de l'espèce humaine partiellement purifié à raison d'environ 200 unités/ml et on incube à 37r C pendant environ 1 h. On ajoute ensuite au mélange incubé de la concanavaline A à raison d'environ 500 ng/ml, on incube pendant 3 d et on ajoute du virus Sendai à raison d'environ 300 unités d'hémagglutination/ml et on incube pendant 16 h pour induire la formation d'interféron. On purifie le mélange et on le concentre soigneusement avec des membranes filtrantes, comme décrit dans l'exemple A-2, pour obtenir une solution contenant de l'interféron.

L'activité totale d'interféron de la solution est d'environ 17000000 unités par hamster dont environ 6000000 unités correspondent à l'activité d'interféron de type II.

Exemple A-4:

On transplante par voie intrapéritonéale à des rats nouveau-nés des cellules humaines Namalva établies et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On isole les tumeurs massives formées sous la peau qui pèsent environ 50 g par rat, on les coupe en fragments fins et on les dissocie comme décrit dans l'exemple A-l. On traite les cellules humaines multipliées comme décrit dans l'exemple A-l si ce n'est que, au lieu de phytohémagglutinine, on ajoute du vaccin Maruyama à raison d'environ 1 |ig/ml pour induire la formation d'interféron de type II. On purifie l'interféron de type II induit et on lyophilise la solution obtenue contenant l'interféron de type II pour obtenir une poudre, comme décrit dans l'exemple A-l.

L'activité d'interféron de type II de la poudre est d'environ 8000000 unités par rat.

Exemple AS:

On irradie tout d'abord des souris adultes avec environ 400 rems de rayons X pour réduire leurs réactions immunitaires puis on leur transplante par voie sous-cutanée des cellules humaines TALL-1 établies et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines. On isole les tumeurs massives formées sous la peau qui pèsent environ 10 g par souris, on les découpe en fragments fins puis on dissocie les cellules tumorales comme décrit dans l'exemple A-l. On traite les cellules comme décrit dans l'exemple A-3 pour induire la formation d'interféron. On purifie l'interféron induit et on le concentre comme décrit dans l'exemple A-2 pour obtenir un concentré contenant l'interféron.

L'activité totale d'interféron du concentré est d'environ 9000000 unités par souris dont environ 3000000 unités correspondent à l'activité d'interféron de type II.

Exemple A-6:

On transplante tout d'abord par voie sous-cutanée à des hamsters des cellules humaines MOLT-3 établies, comme décrit dans l'exemple A-3, et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 semaines pour multiplier les cellules. On transplante ensuite les cellules multipliées dans le péritoine de souris nues âgées de 10 d et on alimente les souris de façon habituelle pendant encore 5 semaines. On anesthésie les souris pour recueillir le liquide d'ascite. On centrifuge les liquides d'ascite obtenus pour recueillir les cellules multipliées. On lave les cellules et on les traite comme décrit dans l'exemple A-l pour induire la formation de cellule de type II. On purifie l'interféron de type II induit et on le concentre comme décrit dans l'exemple A-2 pour obtenir un concentré contenant de l'interféron de type II.

L'activité d'interféron de type II du concentré est d'environ 500000 unités par souris nue.

Exemple A-7:

On met des cellules humaines JBL établies en suspension dans une solution salée physiologique dans des chambres de diffusion cylindriques en matière plastique, comportant des membranes filtrantes, interposées, ayant des pores de 0,5 |im, dont la capacité est d'environ 10 ml. On place les chambres dans le péritoine de rats adultes. On alimente les rats de façon habituelle pendant 4 semaines et on retire les chambres. La concentration des cellules humaines, multipliées, dans les chambres, est d'environ 5 x 109 cellules/ml, ce qui est supérieur d'un facteur d'environ 1000 fois ou plus à la concentration obtenue in vitro dans un milieu nutritif avec un incubateur à dioxyde de carbone. On ajoute à la suspension cellulaire obtenue des cellules MOLT-3 préparées dans l'exemple A-6 pour obtenir une concentration d'environ 20% en volumes et on traite le mélange comme décrit dans l'exemple A-I pour induire la formation d'interféron de type II. On purifie l'interféron de type II induit et on le concentre sous la forme d'un concentré contenant de l'interféron de type II que l'on lyophilise sous la forme d'une poudre.

L'activité d'interféron de type II de la poudre est d'environ 4000000 unités par rat.

Exemple AS:

On transplante des cellules humaines NALL-1 établies dans les cavités allantoïques d'œufs embryonnés que l'on a préalablement incubés à 37 C pendant 5 d puis on incube les œufs à cette température pendant encore 7 d. On ouvre les œufs et on recueille les cellules

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6

humaines multipliées. On ajoute à la suspension cellulaire un volume égal contenant des cellules TALL-1 préparées dans l'exemple A-5 et on traite comme décrit dans l'exemple A-l pour induire la formation d'interféron de type II. On purifie l'interféron de type II induit et on le concentre comme décrit dans l'exemple A-2 pour obtenir un concentré contenant de l'interféron de type II.

L'activité d'interféron de type II du concentré est d'environ 300000 unités pour 10 œufs embryonnés.

Exemple A-9:

On soumet une poudre, préparée selon le procédé décrit dans l'exemple A-l, à une purification ménagée complémentaire dans une gamme de pH de 4 à 9 selon des procédés classiques tels que l'ad-sorption el la désorption avec un échangeur d'ions, le fractionnement selon le poids moléculaire par filtration sur gel, la concentration et la filtration ménagée comme décrit dans la publication de Bodo «Symposium on Préparation, Standardization and Clinical Use oflnterferon», 1 Ie symposium international d'immunobiologie, 8 et 9 juin 1977, Zagreb, Yougoslavie. On obtient une préparation d'interféron très purifiée ayant une activité spécifique de 2 x 106 uni-tés/mg de protéine avec un taux de récupération total d'environ 40%.

Les résultats de l'expérience B montrent que l'interféron de type Il obtenu selon les procédés décrits dans les exemples ci-dessus peut être utilisé isolément, en combinaison avec de l'interféron de type I ou en mélange avec une ou plusieurs autres substances, comme agent thérapeutique et/ou prophylactique efficace injectable ou comme médicament pour l'administration externe ou interne, contre les maladies sensibles à l'interféron de type II.

Expérience B

Effets thérapeutiques et prophylactiques de l'interf éron de type II sur les maladies sensibles à l'interféron

Expérience B-l : Traitement de maladies virales avec de l'interféron de type II (effet d'inhibition de la multiplication virale in vitro)

A des couches monocellulaires de cellules de poumon d'embryon humain formées par culture primaire dans des boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre, on ajoute 0,1, 1,0 ou 10,0 unités d'interféron de type II préparé selon le procédé de l'exemple A-9 et on incube les mélanges obtenus dans un incubateur à 5% en volumes de dioxyde de carbone à 37 C pendant 20 h. On ajoute aux cellules du virus Varice/la zoster ou du cytomégalovirus humain en quantité telle qu'il se forme 100 plages en l'absence d'interféron de type II. On incube les mélanges et on compte les plages formées.

On détermine l'effet d'inhibition de l'interféron de type II sur la multiplication virale à partir de l'équation suivante:

Diminution du nombre de plages (%) =

A-B

x 100

la multiplication de virus provoquant des maladies virales. Dans l'essai, l'addition d'interféron de type II ne provoque pas d'anomalies des cellules humaines.

5 Expérience B-l : Traitement de maladies non virales avec de l'interféron de type II

I) Inhibition de la multiplication de cellules tumorales in vitro:

On ajoute de l'interféron de type II préparé selon le procédé de l'exemple A-9 à du milieu RPMI-1640 additionné de 15% en 10 volumes de sérum fœtal de veau pour obtenir une concentration finale de 5, 50 ou 500 unités/ml. On introduit dans les mélanges diverses cellules tumorales pour obtenir une concentration de 5 x 10s cellules/ml. On incube ensuite les mélanges dans un incubateur à 5% en volumes de dioxyde de carbone à 37: C pendant 5 d et on 15 compte le nombre de cellules par millilitre de milieu. On effectue des expériences témoins dans les mêmes conditions si ce n'est que l'on utilise de l'interféron de type II que l'on a préalablement inactivé par chauffage à 100 C pendant 30 min.

On détermine l'effet d'inhibition de l'interféron de type II sur la 20 multiplication des cellules tumorales à partir de l'équation suivante: Inhibition de la multiplication des cellules tumorales (%) =

(A—5 x IO5) — (B—5 x IO5) 0 (A—5 x 105) X 1UU

25

où A est le nombre des cellules du témoin et B le nombre des cellules de l'expérience avec l'interféron de type II. Les résultats figurent dans le tableau 3.

Comme le montrent de façon évidente les résultats du tableau 3, 30 l'interféron de type II utilisé dans l'invention inhibe de façon efficace la multiplication des cellules tumorales telles que les cellules BALL-1, TALL-1, NALL-1 et JBL et est efficace dans une gamme de concentrations de 5 à 500 unités/ml.

35

Tableau 3

Concentration en interféron de type II (unités/ml)

Cellules tumorales humaines (%)

BALL-I

TALL-1

NALL-1

JBL

5

+ 17

+ 13

+ 19

+ 18

50

+55

+59

+61

+ 50

500

+ 84

+ 80

+86

+ 89

où A est le nombre de plages formées en l'absence d'interféron de type II et B le nombre de plages formées en présence d'interféron de type II. Les résultats figurent dans le tableau 2.

Tableau 2

Interféron de type II

Virus Varicella

Cytomégalovirus

(unité)

zoster humain (%)

(%)

60

0

0,1

8

6

1,0

49

54

10,0

88

83

65

2) Inhibition de la multiplication de cellules tumorales in vivo : On effectue l'essai sur 8 souris nues âgées de 2 mois. On transplante des cellules TALL-1 sous la peau de 8 souris nues à raison de 7,5 x 10® cellules par souris nue. A partir du second jour : suivant l'implantation, on administre à 4 souris nues 3 injections in-trapéritonéales par semaine de 1000 unités d'interféron de type II préparé selon le procédé de l'exemple A-6 avec un nombre total d'injections de 20. 48 d après, on sacrifie les souris nues et on détermine les poids humides des tumeurs massives formées. On effectue une expérience témoin sur les 4 souris nues restantes auxquelles on n'administre pas d'interféron de type II. Les résultats figurent dans le tableau 4.

Tableau 4

Comme le montrent de façon évidente les résultats du tableau 2, l'interféron de type II utilisé dans l'invention inhibe de façon efficace

Expérience N°

Témoins (g)

Souris nues traitées par l'interféron de type II (g)

1

5,6

1,3

2

4,5

0,8

3

9,0

0

4

6,3

0

poids moyen

6,3

0,5

7

650 801

3) Inhibition de la multiplication des cellules tumorales in vivo:

On effectue l'essai sur 8 souris nues âgées d'environ 2 mois.

On transplante des cellules tumorales JBL sous la peau des 8 souris nues à raison de 1 x IO1 cellules par souris nue. Après la deuxième semaine suivant la transplantation, on administre chaque semaine à 4 souris nues deux injections intrapéritonéales de 1000 unités d'interféron de type II préparé selon le procédé de l'exemple A-2 avec au total 8 injections. 42 d après, on sacrifie les souris nues et on détermine les poids humides des tumeurs massives formées. On effectue une expérience témoin sur les 4 souris nues restantes auxquelles on n'administre pas d'interféron de type II. Les résultats figurent dans le tableau 5.

Tableau 5

Souris nues traitées

Expérience N°

Témoins (g)

par l'interféron

de type II (g)

1

4,7

0,5

2

6,2

0,5

3

15,3

0,5

4

16,9

0,8

poids moyen

10,8

0,6

Comme le montrent de façon évidente les résultats des tableaux 4 et 5, l'injection d'interféron de type II inhibe la formation des tumeurs et réduit extrêmement leur développement lorsqu'il se produit. Les poids humides des tumeurs massives apparues chez les souris nues traitées par l'interféron de type II sont bien inférieurs à ceux des témoins. De plus, les souris nues traitées par l'interféron de type II présentent un appétit bien meilleur et sont plus actives que les témoins.

Expérience C

Toxicité aiguë

La détermination de la toxicité aiguë de la préparation d'interféron de type II obtenue selon le procédé de l'exemple A-9 effectuée sur des souris de 20 d montre que la toxicité de cette préparation est extrêmement faible: DLS0 ^ 20000000 unités/kg dans le cas de l'injection intrapéritonéale.

Il ressort des expériences ci-dessus que les maladies sensibles à l'interféron de type II mentionnées dans la présente description sont celles qui peuvent être traitées ou prévenues au moyen de l'interféron préparé selon l'invention, c'est-à-dire les maladies virales telles que la kératoconjonctivite épidémique, la kératite herpétique, la grippe, la rubéole et l'hépatite sérique et des maladies non virales comme la leucémie et l'ostéosarcome.

On peut préparer les agents thérapeutiques et prophylactiques contenant l'interféron de type II que l'on peut utiliser contre lesdites maladies sensibles à l'interféron de type II, sous diverses formes et dans diverses phases selon l'emploi, par exemple des préparations liquides telles que des pulvérisations, des collyres, des gouttes nasales, des gargarismes et des injections, des formes pâteuses telles qu'une pommade et des préparations solides telles que des poudres, des granulés et des comprimés. L'efficacité des agents est suffisante lorsque leur teneur en interféron de type II est comprise entre 1 et 10000000 unités/g, et si on le désire on peut utiliser l'interféron de type II en combinaison ou en mélange avec une ou plusieurs autres substances, par exemple un agent thérapeutique, un véhicule, une charge ou un stabilisant.

En particulier comme l'interféron injecté par voie intraveineuse s'élimine facilement du sang en environ 10 min pour être excrété hors de l'organisme, l'administration par injection lente de l'interféron, par exemple par incorporation d'interféron à un soluté sucré pour perfusion, permet de prolonger la durée d'administration pour permettre une utilisation totale et efficace de l'interféron administré et accroître encore son effet thérapeutique et prophylactique sur les maladies sensibles à l'interféron.

Plusieurs modes de réalisation de préparations contenant de l'interféron de type II selon l'invention sont décrits ci-après.

Exemple B

Préparations contenant de l'interféron de type II Exemple B-l : Préparation liquide

Pour réaliser une préparation liquide, on dissout la poudre contenant de l'interféron de type II préparée selon le procédé de l'exemple A-l dans une solution salée physiologique à raison d'environ 500 unités/ml.

La préparation convient comme pulvérisation, collyre, gouttes nasales et gargarisme pour le traitement et la prévention de maladies virales, en particulier de la kératoconjonctivite épidémique et la grippe.

Exemple B-2: Solution injectable

On prépare une solution injectable par mélange de l'interféron de type II préparé selon le procédé de l'exemple A-9 à une solution salée physiologique à raison d'environ 100000 unités/ml.

La solution injectable convient pour le traitement et la prévention de toutes les maladies sensibles à l'interféron de type II, y compris les maladies virales et tumorales.

Exemple B-3: Solution injectable sucrée

Pour préparer une solution injectable sucrée convenant à la perfusion intraveineuse, on mélange 1000000 unités d'une préparation d'interférons contenant des interférons de type I et de type II préparée selon le procédé décrit dans l'exemple A-5 et 100 mg de cyclo-phosphamide dans 500 ml d'une solution aqueuse à 100 g/1 de maltose.

La solution injectable sucrée convient à la perfusion intraveineuse continue pour le traitement et la prévention des maladies tumorales.

Exemple B-4: Solution injectable

Pour préparer une solution injectable, on dissout 500000 unités de préparation d'interférons contenant des interférons de types I et II préparée selon le procédé de l'exemple A-2 et 2 mg de mitomycine C dans 100 ml d'une solution aqueuse à 100 g/1 de maltose.

La solution injectable convient pour le traitement et la prévention des maladies tumorales.

Exemple B-5: Pommade

On prépare une pommade selon un procédé classique, par mélange de la poudre préparée selon le procédé de l'exemple A-4, de paraffine liquide et de vaseline pour obtenir une activité d'interféron de type II de 10000 unités/g.

La pommade convient pour le traitement des maladies cutanées virales.

Exemple B-6: Comprimés

On prépare des comprimés selon un procédé classique à partir d'un mélange de la poudre contenant de l'interféron de type II préparée selon le procédé de l'exemple A-7, d'amidon et de maltose pour obtenir une activité d'interféron de type II d'environ 1000 unités par comprimé (environ 100 mg).

Les comprimés conviennent pour le traitement et la prévention des maladies virales du système digestif.

Exemple B-7: Préparation liquide

Pour obtenir une préparation liquide convenant à l'administration orale, on dissout 5 mg de méthotrexate et le concentré ayant une activité d'interféron de 200000 unités préparé selon le procédé de l'exemple A-8 dans 10 ml d'une solution aqueuse à 100 g/1 de maltose.

La préparation convient pour le traitement et la prévention des maladies tumorales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Claims

650 801

1. Procédé pour la préparation de l'interféron de type II, caractérisé en ce que l'on transplante des cellules humaines établies, productrices d'interféron de type II, dans le corps d'un autre animal à sang chaud, ou en ce qu'on ensemence avec les cellules un milieu de culture placé dans une chambre de diffusion avec interposition d'une membrane filtrante, dont la conception et l'adaptation dans ou sur le corps de l'animal sont telles que les cellules peuvent se développer à partir de son fluide corporel nutritif, on multiplie les cellules transplantées dans le corps de l'animal à sang chaud ou ensemencées dans la chambre de diffusion à partir du fluide corporel, on expose les cellules humaines, multipliées, à l'action d'un inducteur d'interféron de type II in vivo ou in vitro, pour induire la formation d'interféron de type II et on purifie et sépare l'interféron de type II induit.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules humaines établies productrices d'interféron de type II sont des cellules humaines de la lignée lymphobiastoïde, en particulier cellules HPB-ALL, MOLT-3, P 12/Ichikawa, HPB-MLT, P 8/Seki, HCL, P 10/Shibata, Namalva, BALL-1, TALL-1, NALL-1 ou JBL.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise plus d'une variété de cellules humaines établies.

4. Procédé scion l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les animaux à sang chaud sont des mammifères, notamment chiens, chats, singes, porcs, bovins, chevaux, chèvres, lapins,

cobayes, rats, hamsters, souris ordinaires ou nues.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la chambre de diffusion comporte des membranes filtrantes interposées ayant des pores mesurant 10~7 à 10~s m.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise en combinaison des inducteurs d'interféron de type I et des inducteurs d'interféron de type II.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on expose la suspension de cellules humaines multipliées à l'action d'un inducteur d'interféron avec une concentration de cet inducteur de 0,001 |ig à 10mg/ml.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on expose les cellules humaines multipliées à l'action d'un inducteur d'interféron à une température de 20 à 40' C.

9. Préparation pour le traitement et/ou la prévention des maladies sensibles à l'interféron de type II, caractérisée en ce qu'elle contient un interféron de type II préparé selon le procédé de l'une des revendications I à 8.

10. Préparation selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle contient de l'interféron de type II à raison de 1 à 10000000 unités/g, cette préparation pouvant être sous la forme liquide, injectable, de pommade ou de comprimés.

11. Préparation selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la lutte contre les maladies tumorales virales.

12. Préparation selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'elle contient également de l'interféron de type I.