CH653349A5 - Polysaccharide, ihre herstellung und diese enthaltende therapeutische zusammensetzungen. - Google Patents

Polysaccharide, ihre herstellung und diese enthaltende therapeutische zusammensetzungen. Download PDF

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CH653349A5
CH653349A5 CH937/83A CH93783A CH653349A5 CH 653349 A5 CH653349 A5 CH 653349A5 CH 937/83 A CH937/83 A CH 937/83A CH 93783 A CH93783 A CH 93783A CH 653349 A5 CH653349 A5 CH 653349A5
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CH
Switzerland
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polysaccharide
gel
molecular weight
molecular sieve
gel filtration
Prior art date
Application number
CH937/83A
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English (en)
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Masaki Shimizu
Takeo Nomura
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Terumo Corp
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polysaccharide, ihre Herstellung und diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen.
Insbesondere betrifft die Erfindung Polysaccharide, die durch Reinigung der Heisswasserextrakte der Rinde von Melia azadirachta L. erhalten werden, ihre Herstellung und sie enthaltende therapeutische Zusammensetzungen. Die erfindungsgemässen Polysaccharide sind zur Therapie verschiedener Krebsarten nützlich.
Es ist bekannt, dass Extrakte von Melia azadirachta L. verschiedene pharmakologische Wirkungen zeigen. So sind ein Verfahren zur Herstellung von Kosmetika für die Haut aus der Rinde, den Blättern, den Blüten, den Früchten, der Wurzelhaut (Epidermis) oder dem Harz von Melia azadirachta L. durch Extraktion derselben mit Wasser oder einem hydrophilen Lösungsmittel oder durch feines Pulverisieren derselben bekannt (Japanische Patentveröffentlichungen Nr. 28853/77,28854/77 und 10125/78); ein Verfahren zur Herstellung von Bestandteilen aus solchen Rohmaterialien von Melia azadirachta L., die antimikrobische Wirkungen oder die gastrointestinale oder leberfunktionverbessernde Wirkungen besitzen, durch Extraktion derselben mit heissem Wasser (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 10124/78); und ein Verfahren zur Herstellung von Bestandteilen aus solchen Rohmaterialien von Melia azadirachta L., die für die Therapie dermatologischer und rheumatischer Erkrankungen nutzbar sind, durch Extraktion derselben mit einem hydrophoben Lösungsmittel (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 13689/78).
Nach ausführlichen Studien der pharmakologisch wirksamen Bestandteile der Rinde von Melia azadirachta L. wurden nun aus den Heisswasserextrakten der Rinde Polysaccharide mit Anti-Tumor-Wirkungen isoliert. Aus dem Stand der Technik war es nicht bekannt, dass die Rinde von Melia azadirachta L. Polysaccharide enthält.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung von Polysacchariden, die als Antikrebsmittel brauchbar sind. Eine andere Aufgabe betrifft die Bereitstellung therapeutischer Zusammensetzungen, die diese Polysaccharide enthalten. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung dieser Polysaccharide anzugeben.
Wie nachfolgend beschrieben wird, besitzen die erfindungsgemässen Polysaccharide, die neue Substanzen sind, starke inhibierende Wirkungen gegen Ascites Sarkom 180 (Sarcoma 180 ascites) und feste transplantierte Tumore in Mäusen und Meth A feste transplantierte Tumore in Mäusen. Sie sind insbesondere bei fixierten festen Tumoren wirksam.
Das erfindungsgemässe Polysaccharid N9GI weist die fol- " genden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:
1) Farbe und Aussehen
Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weisses oder blassgelblich bis braunes Pulver.
2) Infrarot-Absorptionsspektrum
Wie in Fig. 1 gezeigt
IRVmax. cm -1:3400,1630,1030.
3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In wässriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.
4) Löslichkeit
Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.
5) Farbreaktion
Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv; bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
Das Verfahren zu seiner Herstellung ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Rinde von Melia azadirachta L. mit heissem Wasser extrahiert, den Extrakt mittels Alkoholfällung oder einer permeablen Membran reinigt, das so erhaltene gereinigte Produkt in Wasser löst, die wässrige Lösung mit einem Molekularsiebagens mit einem Molekularge-wichts-Fraktionierungsbereichvon 1 x 103- 1 x 105 bis 1 x 103 - 1,5 x 105 behandelt und die erste Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert, wobei das erhaltene Polysaccharid N9GI die weiter oben beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
Das erfindungsgemässe Polysaccharid N9GIa besitzt die folgende Strukur und Eigenschaften:
1) Struktur
Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette a-(l — 4)-Glucan enthält, das über eine a-(l — 6)-Bindung mit Ara-binose verknüpft ist und aus Glukose und Arabinose im Verhältnis ca. 5:1 zusammengesetzt ist.
2) Farbe und Aussehen
Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weisses Pulver.
3) Löslichkeit
Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform,
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Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.
4) Farbreaktion
Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jôd tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
5) Molekulargewicht
Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von Dextrangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbe-reich von 1 x 103 - 2 x 105 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000.
6) Spezifische Drehung
Md : — 35° (c = 0,4, H2O).
7) Infrarot-Absorptionsspektrum
Wie in Fig. 2 gezeigt.
IRvJS. cm-1:3400,2930,1620.
8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In wässriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.
9) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum
Ein 100 MHz-kernmagnetisches Resonanzspektrum gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 4.
Dieses Polysaccharid wird erfindungsgemäss erhalten, indem man das Heisswasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. mit einem Molekularsieb behandelt, um eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000 zu isolieren, die die weiter oben beschriebene Struktur und Eigenschaften besitzt.
Schliesslich weist das Polysaccharid N9GIb die folgende Struktur und Eigenschaften auf:
1) Struktur
Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette a-(l — 4)-Glucan enthält, das mit ß-(l^ 3)-Fucose durchsetzt und mit a-(l — 6)-Arabinose verzweigt ist und aus Glukose, Ara-binose und Fucose im Verhältnis ca. 5:2:1 zusammengesetzt ist.
2) Farbe und Aussehen
Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weisses Pulver.
3) Löslichkeit
Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.
4) Farbreaktion
Phenolsulfat-Reaktion unf Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
5) Molekulargewicht
Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von Dextrangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbe-reich von lxl 03 - 2x105 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000.
6) Spezifische Drehung
Md : — 46° (c = 0,28, H2O).
7) Infrarot-Absorptionsspektrum
Wie in Fig. 4 gezeigt.
IRVm!«. cm-1:3400,2930,1630.
8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In wässriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.
9) l3C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum
Ein 100 MHz 13C-kernmagnetisches Resonanzspektrum, gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 5.
Das Polysaccharid N9GIb wird erfindungsgemäss erhalten, indem man ein Heisswasserextrakt der Rinde von
Melia azadirachta L. einer Behandlung mit einem Molekularsieb unterwirft und dabei eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000 isoliert, die die weiter oben beschriebene Struktur und Eigenschaften besitzt.
Therapeutische Zusammensetzungen in Form einer Dosierungseinheit enthalten pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg eines der weiter oben beschriebenen neuen Polysaccharide und ein pharmazeutisches Streckmittel.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Polysaccharid N9GI.
Die Fig. 2 bzw. 3 zeigen ein Infrarot-Absorptionsspektrum und ein l3C Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Polysaccharid N9GIa.
Die Fig. 4 bzw. 5 zeigen ein Infrarot-Absorptionsspektrum und ein 13C Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Polysaccharid N9GIb.
Das erfindungsgemäss als Ausgangsmaterial verwendete Gewächs wird wissenschaftlich Melia azadirachta L. oder Azadirachta indica Juss bezeichnet und ist ein grosser Baum mit einer Höhe von 10 m oder mehr, der in den Tropen beheimatet ist. In den erfindungsgemässen Verfahren werden die Heisswasser-Extrakte der Rinde dieses Gewächses als Poly-saccharidquelle verwendet. Die zu jeder Jahreszeit geerntete Rinde kann als Ausgangsmaterial verwendet werden. Die Heisswasserextraktion der Rinde von Melia azadirachta L. wird in der Regel nach üblichen Verfahren durchgeführt. Im wesentlichen wird sie durchgeführt durch Zugabe von heissem Wasser von ungefähr 80°C oder höher zu einer fein zerteilten Rinde oder durch Zugabe von Wasser zu der Rinde und Erhitzen der Mischung zum Kochen. Das Erhitzen kann in einem kochenden Wasser-Bad oder über Direkterhitzer durchgeführt werden. Obwohl die Zeit des Erhitzens von der Qualität des Ausgangsmaterials und anderen Faktoren abhängt, beträgt sie im allgemeinen 1 bis 48 Stunden. Nach Vervollständigung der Extraktion wird die Extraktionsmischung einer Filtration unterworfen, um das Extrakt zu erhalten. Da das so erhaltene Heisswasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. grosse Mengen von Verunreinigungen enthält, wird das Extrakt vor der erfindungsgemässen Stufe des Molekularsiebens mittels einer Alkoholfällung oder einer permeablen Membran gereinigt. Wenn zum Beispiel die Reinigung mittels einer Alkoholfällung durchgeführt wird, wird Alkohol wie zum Beispiel Methanol oder Äthanol zu dem vorgenannten Extrakt gegeben, und die dabei erhaltenen Niederschläge isoliert, zum Beispiel mittels einer Zentrifugentrennung, um das gewünschte Extrakt zu erhalten. Wenn zur Reinigung eine permeable Membran verwendet wird, wird das Extrakt auf eine permeable Membran gebracht, die dann gewöhnlich zur Durchführung der Dialyse in Wasser eingetaucht wird. Wenn erwünscht, wird das Dialysat bis zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet, um das gewünschte Extrakt zu ergeben. Als permeable Membran wird vorzugsweise regenerierte Zellulose mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 50 000 oder weniger verwendet, zum Beispiel Spectra Por 1-6 (hergestellt von Spectrum Medicai Industries Co.) oder Visking Tube (hergestellt von Union Carbide Co.). Das Heisswasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. wird nach der Reinigung mittels einer permeablen Membran oder durch Alkoholfällung in Wasser gelöst. Daneben ist es auch wünschenswert, vor der Heisswasserextraktion der Rinde von Melia azadirachta L. nutzlose Bestandteile zu entfernen, indem man die Rinde z.B. einer Vorbehandlung mit einem organischen Lösungsmittel und/oder Wasser bei Raumtemperatur unterwirft. Als bevorzugte Lösungsmittel für die Vorbehandlung
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werden polare organische Lösungsmittel genannt, wie zum Beispiel Methanol, Äthanol, Propanol, Pyridin und Aceton und nicht-polare organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Benzol, Toluol, Xylol, n-Hexan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid und Äthylacetat.
Die erfindungsgemäss zur Trennung der Polysaccharide erfolgende Behandlung mit einem Molekularsieb wird vorzugsweise durch Gelfiltration mittels eines Gelfiltrationsagens durchgeführt. Als Gelfiltrationsagens wird vorzugsweise Dextrangel, Polyacrylamidgel, Polyvinylpolymergel, poröse Glasperlen und dergl. verwendet.
Das erfindungsgemässe Polysaccharid N9GI wird vorzugsweise hergestellt durch Durchlaufenlassen des vorgenannten Heisswasserextrakts der Rinde von Melia azadirachta L. durch eine Säule, die mit einem Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1 x IO3—1 x IO5 bis 1 x 103-1,5 x 105 bestückt ist, bevorzugtes Eluieren der Säule mit destilliertem Wasser, Sammeln der ersten Fraktion der drei getrennten Polysacharidfraktionen und bevorzugt Verdampfen zur Trockne oder Gefriertrocknung der gesammelten Fraktion. Bei der Durchführung der Elution kann die Elution des Polysaccharids gemäss üblicher Verfahren, wie zum Beispiel nach der Phenolsulfat-Methode, bestimmt werden. Als Gelfiltrationsagens mit einem Moleku-largewichts-Fraktionierungsbereich von 1 x IO3—1 x 105 bis
1 x 103-1,5 x 105 werden vorzugsweise verwendet Sephadex G-100 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden), welches ein Dextrangel ist, Biogel P-100 (hergestellt von Biorad Co., USA), welches ein Polyacrylamidgel ist, Toyopal HW-55 (hergestellt von Toyo Soda Industries), welches ein Polyvinylpolymergel ist, CPG-10 (hergestellt von Electro-Nucleo-nics, USA), welches poröse Perlen darstellt.
Die Polysaccharide N9GIa und N9GIb werden erhalten, indem man das Heisswasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. einer Behandlung mit einem Molekularsieb unterwirft, um ein Polysaccharid mit dem Molekulargewicht von ca. 94 000 und ein Polysaccharid mit dem Molekulargewicht von ca. 21 000 zu isolieren.
Vorzugsweise wird ein das vorgenannte Polysaccharid N9GI enthaltende Heisswasser-Extrakt durch eine Säule laufen gelassen, die mit einem Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1 x 103-
2 x IO5 bis 1 x 103 - 8 x 105 beladen ist, die Säule mit destilliertem Wasser eluiert und Polysaccharid N9GIa aus der ersten Fraktion der zwei getrennten Polysaccharidfraktionen erhalten, und Polysaccharid N9GIb aus der zweiten Polysa-charidfraktion.
Als Gelfiltrationsagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1 x 103-2x 10sbis 1 x 103—8 x 105 wird vorzugsweise verwendet Sephadex G-200, Sephacril S-300 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden), welche Dextrangele sind, Biogel P-300 (hergestellt von Biorad Co., USA), welches ein Polyacrylamid ist, Toyopal HW-60 (hergestellt von Toyo Soda Industries), welches ein Polyvinylpo-lymer ist, poröse Perlen CPG-10 und dergleichen.
Das erfindungsgemässe Polysaccharid N9GI ist eine Mischung von Polysaccharid N9GIa und Polysaccharid N9GIb. Pharmakologische Untersuchungen haben ergeben, dass es ausgeprägte inhibierende Wirkungen gegen Ascites Sarkom 180 (Sarcoma 180 ascites) und feste transplantierte Tumore in der Maus und Meth A feste transplantierte Tumore in der Maus besitzt. Es wurde auch nachgewiesen, dass die Polysaccharide N9GIa und N9GIb ähnliche pharmakologische Wirkungen aufweisen. Deshalb ist eine Trennung von Polysaccharid N9GI in Polysaccharid N9GIa und Polysaccharid N9GIb für die Verwendung als Antikrebs-mittel nicht notwendig. Praktisch ist es, die beiden in Mischung zu verwenden, das heisst als Polysaccharid N9GI.
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Die folgenden Beispiele und die pharmakologischen Tests veranschaulichen die Erfindung weiter, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiel 1
Herstellung eines Heisswasserextraktes der Rinde von Melia azadirachta L.
1) Vorbehandlung wurde durchgeführt durch Extraktion von 50 g trockener Rinde von Melia azadirachta L. mit Benzol (3 x 500 ml) und Methanol (3 x 500 ml) bei Raumtemperatur während 24 Stunden. Der so erhaltene Extraktionsrückstand wurde mit 3 x 200 ml heissem Wasser extrahiert.
Die vereinigten Extrakte wurden an einem Rotationsverdampfer zur Trockne konzentriert und ergaben 1960,5 mg Pulver.
2) Zu einer Lösung von 1000 mg des nach (1) hergestellten Pulvers in 200 ml Wasser wurde langsam reines Äthanol unter Rühren bei Raumtemperatur bis zu einer Äthanolkonzentration der wässrigen Lösung von 80% zugegeben. Es bildeten sich Niederschläge, die durch Zentrifugentrennung abgetrennt wurden und es wurden 594,5 mg eines braunen Pulvers erhalten.
3) Eine Lösung von 500 mg des nach (1) erhaltenen Pulvers in 50 ml Wasser wurde in Spectra Por 6 (Molekularge-wichts-Fraktionierungsbereich 50 000) zur Dialyse gegen Wasser gegeben. Das Dialysat wurde am Rotationsverdampfer zur Trockne konzentriert und es wurden 310 mg eines braunen Pulvers erhalten.
Beispiel 2
Herstellung von Polysaccharid N9GI
Eine Lösung von 1020 mg des nach dem obigen Beispiel unter (2) oder (3) erhaltenen Heisswasserextraktes der Rinde von Melia azadirachta L. in 20 ml destilliertem Wasser wurde in eine Säule (7,0 cm Durchmesser und 35,0 cm Länge), die mit Sephadex G-100 gefüllt war, gegossen und die Gelfiltration wurde unter Verwendung von destilliertem Wasser durchgeführt. Während der Gelfiltration wurde der Zuckergehalt des Eluats durch die Phenolsulfat-Methode bestimmt. Es wurden drei Polysaccharidfraktionen erhalten. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels aus der ersten Eluatfrak-tion wurden 273 mg des gewünschten Polysaccharids N9GI erhalten.
Nach dem obigen Verfahren wurde ein ähnliches Ergebnis unter Verwendung von Biogel P-100 anstelle des Gelfiltrationsagens Sephadex G-100 erhalten.
Beispiel 3
Herstellung der Polysaccharide N9GIa und N9GIb
Eine Lösung von 50 mg des nach Beispiel 2 hergestellten Polysaccarids N9GI in 5 ml destilliertem Wasser wurde in eine Säule (4,0 cm Durchmesser und 50,0 cm Länge), die mit Sephadex G-200 gefüllt war, gegossen und die Gelfiltration unter Verwendung von destilliertem Wasser ausgeführt. Der Zuckergehalt des Eluates wurde während der Gelfiltration durch die Phenolsulfat-Methode bestimmt. Es wurden zwei Polysaccaridfraktionen erhalten. Die erste Polysaccharid-fraktion ergab 18 mg Polysaccharid N9GIa und die zweite 16 mg Polysaccharid N9GIb. Mittels Hochleistungsflüssig-keitschromatographie und Elektrophorese wurde gefunden, dass diese Polysaccharide jeweils eine einzige Verbindung darstellten.
Ein ähnliches Ergebnis wurde bei der obigen Gelfiltration unter Verwendung von Sephacril S-300 anstelle von Sephadex G-200 erhalten.
Die Strukturen und Eigenschaften der Polysaccharide N9GI, N9GIa und N9GIb sind wie oben angegeben, wobei das IR-Absorptionsspektrum mittels der KBr-Methode
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Die Ergebnisse der pharmakologischen Tests der erfindungsgemässen Polysaccharide N9GI, N9GIaund N9GIb werden nachfolgend beschrieben.
Testbeispiel 1 Wirkung auf Sarkom 180 Ascites-Tumor (Herstellung des Testmaterials)
In einer Suspension von 0,5% Carboxymethylcellulose (CMC) in Phosphatpuffer-Salzlösung (hergestellt von Gibco, enthaltend 9,5 mM Phosphat; PBS) wurde das Testmaterial in einer vorbestimmten Konzentration gelöst.
(Transplantation von Sarkom 180 Tumorzellen) Sarkom 180 Tumorzellen aus einer Tochterkultur der Bauchhöhle der Maus wurden entfernt und mit physiologischer Salzlösung auf eine Zellzahl von 1,0 x 108/ml verdünnt. Die Zellsuspension wurde intraperitoneal in männliche, vier Wochen alte ICR-Mäuse in einer Menge von 0,5 ml pro Maus mittels einer Spritze transplantiert. Die Zahl der transplantierten Zellen pro Maus wurde als 1,0 x 107 berechnet.
(Applikation des Testmaterials)
Einen Tag nach der Transplantation der Sarkom 180 Tumorzellen wurde das wie oben hergestellte Testmaterial intraperitoneal mittels einer Spritze in einer Dosis von 0,1 ml/Maus appliziert und die Applikation einmal am Tag vier Tage lang durchgeführt. Für jede Konzentration eines jeden Testmaterials wurden sechs Mäuse verwendet. Als Kontrolle wurde die CMC-enthaltende PBS verwendet, das Lösungsmittel für das Testmaterial, das auf die gleiche Weise appliziert wurde. Die Dosis wurde in mg pro kg Körpergewicht der Maus angegeben.
(Auswertungsmethode)
Am siebten Tag nach der Tumorzellentransplantation wurde das Körpergewicht jeder Maus bestimmt. Dann wurde die in der Bauchhöhle angehäufte Ascites sorgfältig entfernt und das Körpergewicht der Maus gemessen. Die Differenz des Körpergewichts vor und nach der Entfernung der Ascites wird als Menge der Ascites angegeben. Die entfernte Ascites wurde in ein Blutzentrifugengefäss gegeben und dann an einer Blutzentrifuge bei einer niederen Temperatur zentrifu-giert, um einen Asciteswert (Anteil der Tumorzellen in der Ascites) zu ergeben, der dem Blutzentrifugenwert (blood hematocrit value) entsprach. Dieser Wert multipliziert mit dem Volumen der Ascites gibt das Volumen der in der gesamten Ascites vorhandenen Zellen wieder. Dieser wird als Gesamtzellenvolumen (total packed cell volume; TPCV) bezeichnet. Im Falle der Kontrollprobe war das Gesamtvolumen von Ascites 6 bis 10 ml und TPCV 1,6 - 2,5 ml.
Die Wirkung auf den Tumor wurde als schlecht (-) bezeichnet, wenn das TPCV-Verhältnis von Mäusen, denen das Testmaterial appliziert wurde, zu den Kontrollmäusen (T/C) 100-66% war, mittel (+), wenn es 65-41% betrug, gut (+ +), wenn es 40-11% betrug und ausgezeichnet (+ ++), wenn es 10-0% betrug. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Testbeispiel 2 Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor (Transplantation von Sarkom 180 Tumorzellen) Die Zellsuspension mit einer Konzentration von 1,0 x 108 5 Zellen/ml wurde auf die gleiche Weise wie im Testbeispiel 1 hergestellt. Die Zellen wurden subkutan in den Rücken männlicher, vier Wochen alter ICR-Mäuse mit einer Dosis von 0,1 ml pro Maus mittels einer Spritze transplantiert.
(Applikation des Testmaterials)
10 Am 21. Tag nach der Tumorzellentransplantation wurde gewachsenes Tumorgewebe ausgeschnitten und gewogen (Mittelwert für eine Gruppe von sechs Tieren). Die Wirkung wurde auf der Basis des Verhältnisses durchschnittliches Gewicht der behandelten Tiere zu dem der Kontrolltiere 15 (T/C) ermittelt. Das Gewicht des Tumorgewebes der Kontrolltiere war 3,0-4,5 g. Die Wirkung wurde als schlecht (-) bezeichnet, wenn das Verhältnis 100-71% war, mittel (+), wenn das Verhältnis 70- 51% war, gut (+ +), wenn es 50-21% betrug, und hervorragend (+ + +), wenn es 20-0% betrug. 20 Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgezeigt.
Tabelle 1
25 Wirkung auf Tumoren von transplantiertem Sarkom 180 (Mäuse)
Testmaterial
Dosis
Ascites Tumor
Fester Tumor
mg/kg
T/C (%)
Bewer
T/C (%)
Bewer
tung
tung
Polysaccharid
75
60
+
43
+ +
N9GI
50
46
+ +
26
+ +
25
52
+
34
+ +
5
100
-
100
-
Polysaccharid
75
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+ +
43
+ 4-
N9GIa
50
23
+ +
61
+
25
25
+ +
70
+
5
17
+ +
98
-
Polysaccharid
75
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+ +
64
+
N9GIb
50
24
+ +
77
-
25
30
+ +
103
-
5
43
+
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Testbeispiel 3 Wirkung auf Sarkom 180-Festtumor so Die Herstellung des Testmaterials, die Transplantation von Sarkom 180-Tumorzellen, die Applikation des Testmaterials und die Auswertung der Wirkung wurden auf die gleiche Weise wie im Testbeispiel 2 vorgenommen, mit der Ausnahme, dass die Applikation des Testmaterials auf drei ss Wegen durchgeführt wurde: Applikationen am ersten, dritten, fünften, siebten und neunten Tag der Zelltransplantation einmal am Tag, darauffolgende Applikationen vom ersten Tag der Transplantation einmal am Tag 10 Tage lang und nachfolgende Applikationen vom ersten Tag der Trans-60 plantation einmal am Tag 20 Tage lang. Die Wirkung wurde am 35. Tag nach der Tumorzellentransplantation durch Ausschneiden des Tumorgewebes bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle 2
Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor (Mäuse)
Testmaterial
Dosis (mg/kg)
Tag der Applikation l.,3., 5., 7.
T/C (%)
+ 9. Bewertung
1.-10.
T/C (%)
Bewertung
1.-20. T/C(%)
Bewertung
Polysaccharid
50
4
(+ + +) 7/9*
7
(+ + +) 5/7
N9GI
25
11
(+ + +) 5/9
10
68
(+) 1/9
24
(++) 5/10
6
(+ + +)
7/11
2
74
(-)
53
(+) 2/11
* gibt den Anteil der Mäuse an, bei denen das Tumorgewebe vollständig rückgebildet war.
Testbeispiel 4
Wirkung auf fixierten Festtumor kation einer vorbestimmten Dosis des Testmaterials 5 Tage
Sarkom 180 Zellen wurden subkutan am Rücken männ- lang einmal am Tag intraperitoneal. Am 21. Tag nach der licher ICR-Mäuse (10 Tiere) in einer Dosis von 1 x 107 Zellen 20 Transplantation wurde der Tumor ausgeschnitten und das pro Tier transplantiert, und die Mäuse gezüchtet. Vom 10. Gewicht mit dem der Kontrollgruppe verglichen. Die Wir-Tage an, nachdem der feste Tumor vollständig fixiert und auf kung wurde gemäss der Methode des Testbeispiels 2 eine Grösse von ca. 1 - 2 g angewachsen war, erfolgte Appli- bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wirkung auf fixierten Festtumor
Testmaterial
Dosis (mg/kg)
T/C (%)
Bewertung
Polysaccharid
100
6
+ + +
N9GI
50
15
+ + +
25
33
+ +
10
39
+ +
Polysaccharid
100
5
+ + +
N9GIa
50
7
+ + +
25
22
+ +
10
47
+ +
Polysaccharid
100
18
+ + +
N9GIb
50
25
+ +
25
39
+ +
10
54
+
Testbeispiel 5
Wirkung auf fixierten Festtumor bis zum 10. Tag nach der Tumortransplantation einmal am
Die Wirkungen auf fixierten Festtumor wurden auf die Tag, vom 6. Tag bis zum 15. Tag einmal am Tag und vom 11. gleiche Weise wie im Testbeispiel 4 bestimmt, mit der Aus- 50 bis 20. Tag einmal am Tag. Die Wirkung wurde am 35. Tag nähme, dass die Applikationen des Testmaterials auf drei nach der Tumorzellentransplantation bestimmt. Die Ergeb-Wegen erfolgten: Nachfolgende Applikationen vom 6. Tag nisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Wirkung auf fixierten Festtumor (Mäuse)
Tag der
6.-
-10.
6.-
■15.
11.
-20.
Testmaterial
Dosis
Applikation
T/C (%)
Bewertung
T/C (%)
Bewertung
T/C (%)
Bewertung
(mg/kg)
Polysaccharid
50
6
(+ ++) 7/9*
3
(+ + +) 4/6
5
(+ + +)
5/7
N9GI
25
3
(+ + +)7/10
-
-
-
-
10
57
(+) 1/10
1
(+ + +)8/9
7
(+ + +)
8/10
* gibt den Anteil der Mäuse an, bei denen das Tumorgewebe vollständig rückgebildet war.
653349
8
Wie aus den obigen Tabellen 1 bis 4 klar ersichtlich ist, besitzen die erfindungsgemässen Polysaccharide N9GI, N9GIa und N9GIb bei intraperitonealer Applikation starke inhibierende Wirkungen gegen Ascites Sarkom 180 und feste Tumore und fixierte feste Tumore.
Testbeispiel 6
Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor bei oraler Applikation Die Wirkung der erfindungsgemässen Polysaccharide bei oraler Applikation auf Sarkom 180 Festtumor wurde unter den gleichen Bedingungen wie in den Testbeispielen 2 und 3 geprüft, mit der Ausnahme, dass die Dosis der transplan-tierten Zellen 2 x 106 Zellen pro Maus war und die Auswer-s tung auf der Basis des Gewichtes am 32. Tag erfolgte. Die Applikation des Testmaterials in einer vorbestimmten Konzentration erfolgte mittels einer Magensonde zwangsweise bei einer Dosis von 0,1 ml/Applikation/Maus. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 5.
Tabelle 5
Wirkung auf Sarkom 180 Festtumor bei oraler Applikation (Mäuse)
Testmaterial
Dosis (mg/kg)
Tag der Applikation
1-, 3., 5., 7., 9.
T/C (%) Bewertung
7., 9., 11., 13., 15. T/C (%) Bewertung
5., 7., 9., 19., 21., 23. T/C (%) Bewertung
Polysaccharid N9GI
250 50
80
(++) (-)
54 71
(+) (-)
57 95
(+) (-)
Aus Tabelle 5 folgt klar, dass die erfindungsgemässen Polysaccharide in Dosen von 250 mg/kg Körpergewicht auch bei oraler Applikation eine Anti-Tumor-Wirkung besitzen.
Testbeispiel 7 Wirkung auf Meth A Fibroblastsarkom Die in der Bauchhöhle einer Balb/C-Maus subkultivierten Zellen von Meth A Fibroblastsarkom wurden zusammen mit dem Ascites entfernt und mit physiologischer Salzlösung zur Einstellung einer Zellzahl von 1,0 x 107 Zellen/ml verdünnt.
Die Zellsuspension wurde subkutan auf den Rücken 5 Wochen alter männlicher Balb/C-Mäuse in einer Dosis von 25 0,1 ml pro Tier mittels einer Spritze transplantiert. Die Zahl der transplantierten Zellen pro Tier beträgt 1,0 x 106. Das Testmaterial wurde auf die gleiche Weise wie in den Testbeispielen 2 und 3 hergestellt und wurde an einem vorbestimmten Tag intraperitoneal appliziert. Die Auswertung 30 erfolgte durch Ausschneiden des Sarkomgewebes am 21. Tag nach der Sarkomzellentransplantation und Messung des Gewichtes. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 6.
Tabelle 6
Wirkung auf Meth A Fibroblastsarkom (Mäuse)
Testmaterial
Dosis (mg/kg)
Tag der Applikation
Gewicht des
Sarkoms (g)
Inhibierungsgrad (%)
Gewicht des
Sarkoms (g)
Inhibierungsgrad (%)
Gewicht des
Sarkoms (g)
Inhibierungsgrad
(%)
Polysaccharid
100
4,04
39 (P<0,01)*
3,31
47
4,56
28 (P < 0,05)
N9GI
25
4,74
29 (P < 0,02)
5,49
12
5,08
19 (P <0,02)
5
5,16
22
6,08
3
5,07
20 (P <0,05)
Kontrollgruppe 6,64 - 6,27 - 6,31 -
* Signifikanzzahl im t-Test.
Wie in Tabelle 6 gezeigt, besitzen die erfindungsgemässen Polysaccharide auch gegenüber Meth A Fibroblastsarkom, einem isogenen Tumor, bei 8- bis 10-maliger Applikation in einer Dosis von 100 mg/kg eine deutliche wachstumshemmende Wirkung.
Testbeispiel 8
Akute Toxizität
Mit den Polysacchariden N9GI, N9GIa und N9GIb wurden unter Verwendung männlicher ICR-Mäuse vom Gewicht 20 ± 1 g Tests zur akuten Toxizität durchgeführt. Die LD50-Werte waren bei jedem der Polysaccharide bei intraperitonealer Applikation grösser als 600 mg/kg, bei oraler Applikation grösser als 1000 mg/kg.
Wie durch die obigen pharmakologischen Tests deutlich gezeigt wurde, kann von den erfindungsgemässen Polysacchariden, die ausgeprägte Anti-Tumor-Wirkungen und eine sehr niedrige Toxizität besitzen, erwartet werden, dass sie hervorragende Antikrebsmittel sind. Aufgrund ihrer speziellen hohen Inhibitorwirkungen bei fixierten festen 55 Tumoren kann auch erwartet werden, dass die erfindungsgemässen Polysaccharide Anti-Tumor-Wirkungen vom Immuno-Aktivierungstyp besitzen.
Die erfindungsgemässen Polysaccharide sind bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen wirkungsvoll, insbesondere 60 bei fixiertem festem Krebs, wie zum Beispiel Magenkrebs, Dickdarmkrebs oder Mastdarmkrebs. Die Dosierung hängt von den Symptomen, dem Alter, Körpergewicht und anderen Bedingungen ab, und die tägliche Dosis beträgt bei Erwachsenen 100 bis 2500 mg und kann in 1 bis 4 Einzeldosen verab-65 reicht werden.
Für die orale oder parenterale Applikation werden die erfindungsgemässen Polysaccharide gegebenenfalls mit pharmazeutischen Trägern oder Exzipienten formuliert.
Die Formulierungen für orale Applikation, wie zum Beispiel Tablette, Pulver, Kapseln und Granulate, können übliche Träger enthalten, zum Beispiel Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Maisstärke, Kartoffelstärke, Sucrose, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Gummi Arabicum und dergleichen. Die flüssigen Zubereitungen für orale Applikation können wässrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Sirupe, Elixiere und dergleichen sein.
Die injizierbaren Zubereitungen liegen in Form einer Lösung oder Suspension vor und können Exzipienten, wie zum Beispiel Schwebemittel, Stabilisatoren oder Dispergiermittel enthalten. Sie können auch sterilisiertes destilliertes
9 653349
Wasser, gereinigtes Öl wie zum Beispiel Erdnussöl oder Maiskeimöl enthalten, oder nicht-wässrige Lösungsmittel wie zum Beispiel Polyäthylenglykol oder Polypropylenglykol. Für die rektale Applikation ist die Form einer Zäpfchenzu-5 sammensetzung vorgesehen, die bekannte pharmazeutische Träger wie zum Beispiel Äthylenglykol, Lanolin und Kokosöl enthalten kann.
Eine bevorzugte Formulierung ist eine pharmazeutische Zubereitung in Form von Dosierungseinheiten, die pro
10 Dosierungseinheit 10 bis 500 mg der erfindungsgemässen Polysaccharide und ein pharmazeutisches Streckmittel enthalten.
B
3 Blatt Zeichnungen

Claims (17)

653349
1) Struktur
Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette <x-(l— 4)-Glucan enthält, das mit ß-(l— 3)-Fucose durchsetzt und mit a-(l— 6)-Arabinose verzweigt ist und aus Glukose, Araso binose und Fucose im Verhältnis ca. 5:2:1 zusammengesetzt ist.
1) Struktur
Neutrales Polysaccharid, das als Hauptkette a-(1^4)-Glucan enthält, das über eine a-(l—-6)-Bindung mit Arabi-nose verknüpft ist und aus Glukose und Arabinose im Verhältnis ca. 5:1 zusammengesetzt ist.
1) Farbe und Aussehen
Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weisses oder blassgelblich bis braunes Pulver.
1. Polysaccharid N9GI mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
2) Farbe und Aussehen
Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weisses Pulver.
2) Farbe und Aussehen
Das gefriergetrocknete Produkt ist ein weisses Pulver.
2. Therapeutische Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit enthaltend pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg des Polysaccharids nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisches Streckmittel.
2) Infrarot-Absorptionsspektrum
Wie in Fig. 1 gezeigt.
IRv^cm-': 3400,1630,1030.
2
PATENTANSPRÜCHE
3
653 349
3) Löslichkeit
55 Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.
3) Löslichkeit
Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.
3. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GI nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Rinde von Melia azadirachta L. mit heissem Wasser extrahiert, den Extrakt mittels Alkoholfällung oder einer permeablen Membran reinigt, das so erhaltene gereinigte Produkt in Wasser löst, die wässrige Lösung mit einem Molekularsiebagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von 1 x 103-1 x 105bis 1 x 103-1,5 x 105 behandelt und die erste Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert, wobei das erhaltene Polysaccharid N9GI die in Anspruch 1 beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In wässriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.
4) Farbreaktion
Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind 60 positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
4) Farbreaktion
Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv. Bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularsiebbehandlung eine Gelfiltration ist und das Molekularsiebagens ein Gelfiltrationsagens ist.
4) Löslichkeit
Löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan und dergleichen.
5) Molekulargewicht
Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von Dextrangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbe-65 reich von lxl 03 - 2x105 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000.
5) Molekulargewicht
Säulen-Gelchromatographie unter Verwendung von Dex trangel mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbe-
reich von 1 x 103 - 2 x 105 ergibt einen einzelnen Peak mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelfiltrationsagens Dextrangel, Polyacryl-amidgel, hydrophiles Polyvinylgel oder poröse Glasperlen bedeutet.
5) Farbreaktion
Phenolsulfat-Reaktion und Anthronsulfat-Reaktion sind positiv; bei Zugabe von Jod tritt Farbänderung nach grünlich-blau ein.
6) Spezifische Drehung
[alo2: -46° (c=0,28, H2O).
6) Spezifische Drehung Md2: -35° (c=0,4, H2O).
6. Polysaccharid N9GIa, das die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:
7) Infrarot-Absorptionsspektrum
Wie in Fig. 4 gezeigt.
IRvS. cm-': 3400,2930,1630.
7) Infrarot-Absorptionsspektrum 5 Wie in Fig. 2 gezeigt.
IRVmax. cm-1:3400,2930,1620.
8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In wässriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.
8. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIa 20 nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das
Heisswasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. mit einem Molekularsieb behandelt, um eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 94 000 zu isolieren, die die in Anspruch 6 beschriebene Struktur und Eigenschaften 25 besitzt.
8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In wässriger Lösung kein Absorptionsmaximum, nur Endabsorption beobachtet.
io, 9) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum
Ein 100 MHz-kernmagnetisches Resonanzspektrum gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 4.
ls 7. Therapeutische Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit enthaltend pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg des Polysaccharids gemäss Anspruch 6 und ein pharmazeutisches Streckmittel.
9) l3C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum
Ein 100 MHz 13C-kernmagnetisches Resonanzspektrum, gemessen in Deuteriumoxid mit TMS (Tetramethylsilan) als externer Standard zeigt Fig. 5.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularsiebbehandlung anfänglich unter Verwendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekularge-wichts-Fraktionierungsbereich von ca. 1 x 103- 1 x 105bis
30 1 x 103 - 1,5 x 105 durchgeführt wird, und für die erste Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen weiters unter Verwendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. 1 x 103-2 x 105 bis 1 x 103 - 8 x 105 und die erste Polysaccharidfraktion 35 der zwei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularsiebbehandlung eine Gelfiltration ist und das Molekularsiebagens ein Gelfiltrationsagens.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekenn-
40 zeichnet, dass das Gelfiltrationsagens Dextrangel, Polyacryl-amidgel, hydrophiles Polyvinylgel oder poröse Glasperlen bedeutet.
12. Polysaccharid N9GIb, welches die folgende Struktur und Eigenschaften besitzt:
45
13. Therapeutische Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit enthaltend pro Dosierungseinheit 10 bis 500 mg des Polysaccharids nach Anspruch 12 und ein pharmazeutisches Streckmittel.
14. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid N9GIb nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Heisswasserextrakt der Rinde von Melia azadirachta L. einer Behandlung mit einem Molekularsieb unterwirft und dabei eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ca. 21 000 isoliert, die die in Anspruch 12 beschriebene Struktur und Eigenschaften besitzt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularsiebbehandlung anfänglich unter Verwendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. 1 x 103-1 x 105 bis 1 x 103- 1,5 x 105 durchgeführt wird und für die erste Fraktion der drei getrennten Polysaccharidfraktionen weiters unter Verwendung eines Molekularsiebagens mit einem Molekulargewichts-Fraktionierungsbereich von ca. Ixl03-2xl05bislxl03-8xl05 und die zweite Polysaccha-ridfraktion der zwei getrennten Polysaccharidfraktionen isoliert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularsiebbehandlung eine Gelfiltration und das Molekularsiebagens ein Gelfiltrationsagens ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelfiltrationsagens Dextrangel, Polyacry-lamidgel, hydrophiles Polyvinylgel oder poröse Glasperlen bedeutet.
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