CH653893A5

CH653893A5 - Derivati di ferro biodisponibile esenti da gastrolesivita, procedimento di preparazione e relative composizioni farmaceutiche.

Info

Publication number: CH653893A5
Application number: CH922/83A
Authority: CH
Inventors: Giancarlo Sportoletti; Pier Giuseppe Pagella; Pietro Cremonesi
Original assignee: Italfarmaco Spa
Priority date: 1982-03-02
Filing date: 1983-02-18
Publication date: 1986-01-31
Also published as: ES8403493A1; BE896051A; ES519944A0; HK56086A; DE3306622C2; FI77574B; JPS58159421A; NO163859B; AR229805A1; SE8301129L; AU548034B2; BR8301005A; NL190399B; JPH0470317B2; PT76318B; PH18538A; LU84672A1; GR78470B; GB2115821B; NL190399C

Description

La presente invenzione ha per oggetto proteine succinilate, a gradi di succinilazione compreso tra il 20 e il 100%, contenenti da 0,1 a 20% in peso di ferro, ottenute per trattamento di proteine succinilate con sali di ferro in opportuni intervalli di pH. I composti in oggetto, perfettamente tollerati, sono caratterizzati da un'ottima biodisponibilità del ferro.

Il ferro, presente in tutti i tessuti dell'organismo, riveste un ruolo fisiologico insostituibile. Esso fa parte, come componente essenziale, dell'emoglobina, della mioglobina e degli enzimi: ca-talasi, fumarico-deidrogenasi, perossidasi, citrocromi, DPN-citocromoreduttasi e metalloflavoproteine, quale le ferroflavi-na. I tessuti di un essere umano adulto contengono da 1,5 a 5 grammi di ferro di cui, il 60-65% è concentrato nei globuli rossi, mentre il 18-30% risulta legato alle proteine ferritina ed emosiderina, localizzate nel fegato, milza, midollo osseo e cellule del sistema reticoloendoteliale. Il restante è distribuito nei vari sistemi enzimatici suddetti, nella mioglobina (circa il 4%) e nella transferrina (circa lo 0,1%), la ßi globulina deputata alla veicolazione ematica del ferro di origine intestinale. Essa è in grado di legare, in modo praticamente indissociabile ai valori fisiologici di pH, due atomi di ferro.

Il fabbisogno di ferro viene soddisfatto, in parte, mediante l'utilizzo di ferro endogeno (derivante dalla demolizione di globuli rossi invecchiati) e, in parte, dall'assunzione di ferro esogeno. L'assorbimento del ferro esogeno avviene lungo tutto il duodeno e la parte alta del digiuno ed è accumulato prevalentemente nel fegato. La prima manifestazione patologica della carenza di ferro è l'anemia ipocromica sideropenica le cui cause primarie possono essere svariate: emorragie croniche quali si hanno con ulcere gastroduodenali o neoplasie; insufficiente apporto dietetico, ovvero cattivo assorbimento come negli stati diarroici; aumentato fabbisogno, ad esempio in stati di gravidanza, allattamento, malattie infettive, ecc.; imperfetta utilizzazione metabolica; particolari terapie come ad esempio quella con ACTH e cortisonici.

La terapia più idonea è l'apporto di ferro; essa risulta efficace nel ridurre lo stato anemico quando, ovviamente, esso derivi da un'effettiva carenza di ferro; in genere è, però, accompagnata da effetti collaterali indesiderati connessi con il tipo di vettore utilizzato per il ferro. Le preparazioni «per os» farmaceutiche maggiormente diffuse risultano essere a base dei più diversi sali di acidi organici ed inorganici, via via introdotti in terapia con la speranza di ridurre i suddetti effetti collaterali. Sono così commerciate specialità «per os» a base di sali inorganici tipo: cloruro ferrico, solfato ferroso, fosfato ferrico, oppure organici, quali: citrato, colinato, aspartato, fumarato, gluco-nato, glicinato, lattato, ossalato, succinato. Per via intramuscolare profonda è proposto il complesso ferro-destrano mentre, per trattamenti i.v. (per le anemie sideropeniche in cui la terapia «per os» è fallita) è utilizzato il complesso ferro-destrina.

Per questi ultimi tipi di complessi gli effetti collaterali possono consistere in reazioni allergiche, rialzi termici, tachicardia, leucocitosi, linfoadenopatia, per il trattamento intramuscolare, ed addirittura shock di tipo anafilattico, tromboflebiti e collasso circolatorio per il trattamento i.V.; nella terapia «per os» con formulazioni a base dei composti sopra riportati si manifestano in genere danni gastrointestinali, con necrosi e perforazione delle mucose nei casi più gravi, diarrea e vomito. Inoltre la scarsa tollerabilità rende difficile la somministrazione delle giuste quantità di ferro. Per minimizzare gli effetti collaterali è suggerita l'assunzione contemporanea di alimenti, ma ciò è in contraddizione con la dimostrata variabilità di assorbimento del ferro in funzione della composizione degli alimenti stessi. È infatti assodato che l'assorbimento del ferro da preparati è ottimale quando il soggetto è digiuno. All'irritazione gastrica, inoltre, segue l'uso di antiacidi i quali, a loro volta, riducono l'assorbimento con aggravamento dello stato anemico.

Un notevole progresso nella terapia marziale, «per os» ovviamente, si è realizzato con l'introduzione sul mercato di specialità a base di ferritina.

La ferritina è una globulina ferrica e negli organismi dei mammiferi rappresenta la più importante proteina di riserva del ferro. Il prodotto commerciale, come materia prima, è estratto da milza di cavallo.

Il suo contenuto di ferro è il 20% sulla base del peso secco; la parte proteica, apoferritina, ha un peso molecolare di circa 445.00 e circonda un «core» di ferro ossidofosfato cristallino. Solubile in acqua, essa risulta atta alla somministrazione «per os».

La terapia a base di ferritina non presenta gli effetti collaterali gastrointestinali riscontrati durante l'uso dei derivati del ferro, sopra indicati. Una grave limitazione all'uso deriva sia dal costo molto elevato della materia prima sia, soprattutto, dalla limitata disponibilità di sorgenti estrattive.

Quanto finora noto sembra dimostrare che il carrier ottimale del ferro ai fini di un'assunzione scevra da effetti collaterali possa essere un veicolante proteico. Molte proteine presentano una certa affinità per il ferro. Si è quindi provato ad utilizzare come veicolanti alcuni tipi di proteine di origine animale (siero-proteine, proteine da organo, ovoalbumina, lattoproteine) o vegetale (proteine da soia).

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L'interazione tra sali ferrici inorganici e le suddette proteine conduce alla formazione di derivati ferroproteici il cui interesse terapeutico è però invalidato da una serie di caratteristiche negative, tra cui:

— la non solubilità dei derivati ottenuti quando la percentuale di ferro legato alla proteina raggiunga valori superiori allo 0,5%;

— la difficoltà o addirittura la impossibilità di valutare in tali condizioni di insolubilità quale frazione del ferro totale sia realmente legata alla proteina e quale semplicemente copre-cipitato in forma di ossidi idrati, altamente gastrolesivi;

— la mancata omogeneità e costanza di composizione in ferro di tali derivati.

Inoltre per talune proteine, tra cui quelle derivate dal latte, si è riscontrata la presenza di derivati di ferro solubili accanto ad una notevole quantità di derivati insolubili, a vari valori di pH, ma la composizione di tali frazioni solubili risulta estremamente variabile in funzione di variazioni minime dei parametri sperimentali.

Si è ora sorprendentemente trovato che succinilando in opportune condizioni le proteine suddette (processo normalmente utilizzato per ottenere succinilderivati proteici ad uso alimentare e mangimistico) è possibile ottenere, per reazione di esse con ferro, derivati ferroproteici anche ad alto tenore di ferro che risultano essere: stabili; solubili a valori di pH maggiori di 5; con tenori di ferro diversi ma riproducibili; in grado di apportare ferro in organismi a sangue caldo, quando somministrati per via orale, senza indurre effetti collaterali di gastrolesività. Infatti nei ratti la somministrazione quotidiana, per via orale e per 20 giorni consecutivi, non ha evidenziato alcuna manifestazione di gastrolesività ed è stata ben tollerata.

Inoltre sempre nello stesso tipo di animali, il confronto delle sideremie, dopo somministrazione «per os», di equivalenti quantità di ferro sotto forma di solfato ferroso, ferritina da milza equina (Sigma, Saint Louis, Missouri) e derivato ferro-proteico da proteine succinilate da latte, preparato come riportato nell'esempio 1, evidenzia che:

a) i livelli ematici di ferro indotti dal derivato, oggetto della presente invenzione, rispetto a quelli da solfato ferroso, sono più prolungati nel tempo (vedi tabella IX);

b) i livelli ematici di ferro indotti dal derivato, oggetto della presente invenzione, rispetto a quelli da ferritina controllo, sono più elevati (circa 1,5 : 1 in media) nell'arco delle sei ore di durata dell'esperimento (vedi tabella X).

Considerando l'ottima tollerabilità del prodotto, la sua bassissima tossicità (maggiore di 4.000 mg/kg nel topo Swiss), gli elevati tassi ematici in ferro ottenibili e la facilità di reperimento della materia prima, l'utilizzo dei derivati, oggetto della presente invenzione, costituisce un netto miglioramento nello stato dell'arte della terapia marziale.

Le caratteristiche chimico-fisiche di tali derivati succinilfer-roproteici, come sopradetto, risultano essere riproducibili e costanti come riportato negli esempi che non vogliono essere limitativi. L'assenza di ferro non legato è dimostrata dalla totale solubilità in ambiente alcalino (condizioni in cui il ferro ione precipita come ossido idrato) dei preparati ottenuti da proteine succinilate e da un sale di ferro.

Oggetto della presente domanda di brevetto sono quindi i derivati, sino ad ora non noti, caratterizzati dal fatto di contenere quantità di ferro variabile percentualmente, di proteine animali o vegetali succinilate a vari livelli di succinilazione, e che si dimostrano essere adatti all'apporto di ferro, biodisponibile, in organismi a sangue caldo, senza effetti di lesività gastrointestinale se somministrati per via orale, come mostrano gli esempi sotto riportati, indicativi e non limitativi.

Tali derivati risultano essere atti, come principi attivi, all'approntamento di preparati farmaceutici utilizzabili nel trattamento delle anemie da carenza di ferro negli animali a sangue caldo ed è, quindi, ulteriore oggetto di tale brevetto qualsiasi s forma farmaceutica di somministrazione contenente tali derivati come principio attivo, per uso umano o veterinario.

È inoltre oggetto dell'invenzione un procedimento per la preparazione dei derivati succinilferroproteici in oggetto, procedimento caratterizzato dal fatto che si fanno reagire proteine io succinilate (in modo di per sé noto) con ioni ferro a pH compresi tra 2 e 10, di preferenza a pH attorno alla neutralità, in solventi acquosi, e che i prodotti ottenuti vengono isolati dall'ambiente di reazione per precipitazione a pH dell'ordine di 2-4, quest'ultimo intervallo di pH essendo realizzato spontanea-i5 mente o mediante acidificazione. In alternativa, il prodotto dì reazione può essere isolato per allontanamento del solvente dopo aggiustamento del pH a valori prossimi alla neutralità.

Esempio 1

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Preparazione di derivati di ferro al 5%, da proteine succinilate del latte in polvere intero

I kg di polvere di latte viene sospeso in litri 6 di sodio bicarbonato 0,3M e, sotto agitazione meccanica e controllo di pH, si

25 addizionano g 500 di anidride succinica a porzioni successive, mantenendo il pH in un intervallo compreso tra 7,5 e 8 mediante addizione di NaOH 4N. Alla fine dell'aggiunta si lascia sotto agitazione per 2-3 ore a temperatura ambiente; durante tale periodo la sospensione passa totalmente in soluzione. La soluzio-30 ne opalescente viene centrifugata o filtrata sino a quasi limpidezza e quindi acidificata con HCl, lentamente, sino a pH 3.

II precipitato che si forma viene separato per centrifugazione o filtrazione e risospeso in acqua (circa litri 8); si addiziona una soluzione di NaOH sino a completa dissoluzione (pH circa

35 7,5); si centrifuga e la soluzione limpida è riacidificata a pH 2,5-3 mediante aggiunta di HCl.

Il precipitato è recuperato per filtrazione o centrifugazione e lavato con soluzione di HCl a pH 3. Il residuo, costituito dalle proteine succinilate (il cui grado di succinilazione può essere 40 variato in funzione della quantità di anidride succinica utilizzata; per l'esempio qui riportato esso risulta essere del 90% rispetto ai gruppi succinilabili presenti nella proteina di partenza come sotto riportato) viene, dopo essiccamento sotto vuoto, disperso in acqua distillata; esso è dissolto per addizione di 45 NaOH sino a pH 7,5 diluendo la soluzione in modo che la concentrazione finale di proteina si aggiri intorno a 0,04 g/ml. A ' tale soluzione viene aggiunta una soluzione di un sale di ferro (esempio: FeCU) con un rapporto di Fe3+/proteina succinilata di 1:10 in peso. Si ottiene una sospensione che viene finemente so dispersa mediante agitazione meccanica mentre il pH scende a circa 2,5. Si lascia in agitazione per 3 ore a temperatura ambiente e quindi la sospensione viene filtrata; il sodio viene sospeso in acqua (circa tre volumi) e viene dissolto per addizione di NaOH (pH 7,5).

55 La soluzione non perfettamente limpida viene filtrata e il recupero del prodotto allo stato solido può essere indifferentemente effettuato per due vie:

a) si acidifica la soluzione e il precipitato ottenuto a pH 2,5 60 viene filtrato ed essiccato sotto vuoto;

b) la soluzione limpida viene dializzata contro acqua per eliminare il cloruro di sodio e quindi liofilizzata o essiccata per spray-dryer.

65 In entrambi i casi le rese in prodotto finito sono equivalenti e si aggirano intorno al 20% in peso del latte in polvere di partenza. Caratteristiche del prodotto descritte in tabella I (esempio lb).

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Esempio 2

Preparazione di derivati del ferro al 5% da proteine.succinilate del latte

Come descritto nell'esempio 1, con la variante che il prodotto di partenza è costituito da g 350 di proteine del latte, previamente precipitato da polvere di latte per dispersione della polvere in acqua (circa litri 5), acidificazione a pH 2,5 con un acido minerale e quindi filtrazione o centrifugazione del solido proteico e suo essiccamento.

Il tenore in ferro, come sotto riportato (tabella I), per i derivati ottenuti negli esempi 1 e 2, si aggira intorno al 4-5% in peso.

Esempio 3

Preparazione di derivati di ferro da proteine succinilate del latte a diverso tenore inferro

Operando come descritto negli esempi 1 e 2 per quanto concerne la metodica e la quantità di polvere di latte o le proteine dello stesso previamente precipitate, ma modificando il rapporto in peso Fe3+/proteina succinilata ai valori di 0,1:10, 0,2:10; 0,5:10 e 1,5:10 si ottengono derivati di ferro le cui caratteristiche sono riportate nella tabella I.

Esempio 4

Preparazione di derivati di ferro da proteine succinilate di uovo (Ovoalbumina)

Grammi 5 di ovoalbumina sono dissolti in 100 mi di acqua contenente grammi 3 di KHCO3, alla soluzione limpida sono addizionati 2,5 g di anidride succinica a porzioni successive e controllando il pH a valori compresi tra 5 e 8, mediante aggiunta di NaOH; si lascia reagire per 2 ore a temperatura ambiente; dopo acidificazione della soluzione a pH 3,4 si ottiene un precipitato che viene isolato per centrifugazione, purificato per dissolvimento a pH 7,5, mediante NaOH, e successiva riprecipitazione a pH 3,4. Il solido viene recuperato per centrifugazione, ed essiccato sotto vuoto. Il solido secco viene sospeso in acqua distillata e dissolto per aggiunta di NaOH (pH 8) in modo da ottenere una soluzione finale di g 0,04 di proteina/ml.

Alla soluzione molto viscosa si addiziona una soluzione di sale di Fe3+ (ad esempio cloruro ferrico) in modo da avere un rapporto, in peso, proteine succinilate/Fe3+ di 10:1. In tali condizioni il pH scende a 2,6 con formazione di un precipitato che è recuperato per filtrazione. Tale precipitato è ridisciolto in acqua e addizionato di NaOH sino a dissoluzione completa (pH 7,5). Dopo dialisi contro acqua, per asportare il cloruro di sodio, il prodotto solido è recuperato per liofilizzazione o spray-dryer. La resa in derivato è pari al 33% in peso della proteina di partenza. Contenuto in ferro e caratteristiche sono riportate in tabella I.

Esempio 5

Preparazione di derivati del ferro da proteine succinilate di siero bovino

Millilitri 50 di soluzione di sieroproteine bovine (tenore in proteine circa g 4) sono addizionati di 1,5 g di NaHCOs e quindi trattati con 6 g di anidride succinica, a porzioni successive, controllando il pH tra i valori di 7,5 e 8 mediante aggiunta di NaOH. A fine aggiunta si lascia procedere la reazione per 2 ore a temperatura ambiente e quindi si precipita acidificando a pH 2,4 mediante acido minerale; il precipitato è recuperato per centrifugazione e purificato come descritto nell'esempio 4.

Il prodotto solido è sospeso in acqua e portato a pH 7,5 mediante NaOH; la soluzioone così ottenuta è addizionata di una soluzione di sale di ferro III (ad esempio cloruro ferrico) sino a raggiungere un rapporto, in peso, proteina succinilata/Fe3+ di 10:1. Il pH scende spontaneamente a 2,4 e si ottiene un precipitato che, portato a pH 7,5, in parte non si dissolve. Si separa la soluzione del residuo per centrifugazione, si dializza contro acqua per eliminare il cloruro di sodio e quindi si liofilizza. La resa ponderale in derivato di ferro, rispetto alla proteina di partenza, risulta del 30% circa. Per contenuto in ferro e caratteristiche si veda la tabella I.

Esempio 6

Preparazione di derivati del ferro da proteine succinilate da fegato suino

Grammi 400 di fegato suino, fresco, vengono omogeneizzati mediante omogeneizzazione Silverson in presenza di 800 mi di soluzione 0,2M di KHCO3, pH 8,3; dopo centrifugazione a 9000 r.p.m. a 5°C, il surnatante viene raccolto e filtrato per membrana di acetato di cellulosa 0,45 \i. A millilitri 50 di soluzione limpida si addizionano con g 1,2 di anidride succinica, a porzioni successive, controllando che il pH resti tra 7,5 e 8 mediante aggiunta di NaOH. Dopo riposo di 1 ora a temperatura ambiente la soluzione viene acidificata con acido minerale a pH 3 ottenendosi un precipitato che viene lavorato come nell'esempio 4, con la variante che il recupero finale è effettuato per liofilizzazione della soluzione, dializzata contro acqua.

Il residuo della liofilizzazione viene sospeso in acqua e portato a pH 8, mediante soda. Si ottiene una soluzione non perfettamente limpida che viene centrifugata; al surnatante limpido viene addizionata una soluzione di ferro (ad esempio cloruro ferrico) in modo che il rapporto (stimato) tra proteina succinilata e Fe3+ risulti essere circa 10:1. Il pH della soluzione scende a 2,6 e si ottiene un precipitato che viene purificato come negli esempi precedenti. Il solido ottenuto dalla liofilizzazione della soluzione finale, dializzata contro acqua, ha caratteristiche e tenore in ferro come riportato in tabella I.

Esempio 7

Preparazione di derivati del ferro da proteine succinilate di soia

Grammi 5 di proteine di soia sono sospesi in 100 mi di acqua contenente g 3 di NaHCOs; si lascia in agitazione sino a completo dissolvimento; controllando il pH tra 7,5 e 8 per aggiunta di NaOH si addizionano a porzioni successive g 2,5 di anidride succinica. Si lascia in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente e per aggiunta di acido minerale si porta a pH 3,4, ottenendosi un precipitato che viene purificato come descritto negli esempi precedenti. Il residuo solido della liofilizzazione finale è sospeso in 100 mi di acqua, si corregge il pH a 8 mediante addizione di soda e quindi si centrifuga la soluzione non perfettamente limpida.

Il surnatante limpido è trattato con una soluzione di ferro (ad esempio cloruro ferrico) in modo che il rapporto tra proteina succinilata e Fe3+ risulti essere 10:1 in peso. Il pH della soluzione scende spontaneamente a 2,6 e si forma un precipitato che viene trattato come negli esempi precedenti. Il solido ottenuto dalla liofilizzazione della soluzione finale presenta tenore di ferro e caratteristiche come riportato in tabella I. Resa in peso rispetto alla proteina di partenza 22%.

CARATTERIZZAZIONE CHIMICO-FISICA DEI DERIVATI DI FERRO DA PROTEINE SUCCINILATE OTTENUTI SECONDO GLI ESEMPI 1-7

I derivati ottenuti secondo gli esempi sopra riportati sono stati analizzati seguendo metodologie qui sotto precisate:

a) grado di succinilazione

Tale caratteristica è espressa come percentuale di gruppi succinilati rispetto ai gruppi succinilabili della proteina di par-

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tenza. Si è applicata la metodica descritta da S. Moore e W.H. Stein, J. Biol. Chem., 211, 907, 1954, per reazione alla ninidri-na dei gruppi amminici liberi. I risultati sono riportati in tabella I.

b) contenuto di ferro

Il contenuto di ferro è stato determinato, sia dopo estrazione a caldo con HCl 2N sia dopo digestione completa della proteina con acido solforico, secondo quanto descritto in Standard Methods, 14th ed., 1975, pag. 208, APHA-AWWA-WPCF (reazione con o-fentrolina). I valori sono riportati in tabella I.

c) dati spettroscopici

1) Spettroscopia EPR

Tutti i derivati descritti negli esempi sopra riportati presentano lo stesso comportamento spettroscopico. Si descrive, ad esempio, lo spettro EPR del derivato succinilferroproteico preparato secondo l'esempio 1. Lo spettro è stato registrato in polvere liofilizzata e presenta un segnale molto largo, centrato intorno a g = 2,0, con un'ampiezza di segnale di circa 2000 G. È presente un altro segnale, molto ben risolto, anch'esso centrato a circa g = 2,0. La forma di entrambi i segnali è caratteristica di centri paramagnetici di Fe3+ interagenti (F. Reid e altri - Inorg. Chem. 7, 119, 1968). L'insieme di tali dati indicherebbe la presenza di strutture proteiche chiuse intorno al legante.

2) Dicroismo circolare

Anche qui il comportamento dei vari derivati descritti è similare; si descrive, come esempio, lo spettro di dicroismo circolare del derivato succinilferroproteico ottenuto secondo l'esempio 1. Lo spettro è caratterizzato da un'attività negativa nella zona U.V.; è presente un'intensa banda negativa con un massimo intorno a 200 nm, con una spalla, sempre negativa, centrata intorno a 225 nm. Queste caratteristiche spettrali indicherebbero la prevalenza di una struttura proteica «random» (inter alia: F. Ciardelli e P. Salvadori - Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism - Heyden & Son Ltd., London, 1973 - Capitolo 4.5).

3) Spettri di assorbimento U. V. - Visibile

Il comportamento allo spettro elettronico dei vari derivati descritti è similare; si riporta in fig. 1 lo spettro U.V.-Visibile per il derivato succinilferroproteico preparato come descritto nell'esempio 1.

Lo spettro (linea continua) non presenta massimi di assorbimento nel visibile ma solo una spalla molto debole intorno a 450 nm. Nell'ultravioletto è presente una spalla abbastanza definita centrata intorno a 270 nm e un assorbimento molto intenso con massimo al di sotto dei 220 nm. In fig. 1 è riportato (linea tratteggiata) anche lo spettro della ferritina da milza di cavallo, come confronto (Boehringer-Mannheim).

Gli spettri di assorbimento nel visibile sono riportati in fig. 1 e sono stati effettuati in acqua, pH 7. È riportato anche lo spettro nelle stesse condizioni della ferritina da milza di cavallo, come confronto (Boehringer-Mannheim).

4) Spettro di emissione in fluorescenza

Gli spettri di emissione in fluorescenza sono riportati in fig. 2, nella quale la linea continua corrisponde ai derivati succinil-ferroproteici dell'invenzione, quella a punto e tratto alle latto-proteine tali e quali, e la linea tratteggiata alle lattoproteine succinilate.

Si nota un quenching della fluorescenza della proteina, dovuto alla presenza di metallo.

d) Elettroforesi

I tracciati elettroforetici su acetato di cellulosa dei vari derivati in confronto con le proteine succinilate, le proteine originali e la ferritina sono riportati nelle figg. 3, 4, 5 e 6.

La fig. 3 illustra i risultati dell'elettroforesi condotta su proteine di soia (tracciato n. 1), le proteine di soia succinilate (tracciato n. 2), derivato di ferro di proteine di soia succinilate (tracciato n. 3), derivato di ferro di proteine di soia non succinilate, frazione solubile (tracciato n. 4).

s La fig. 4 illustra i risultati dell'elettroforesi condotta su ovoalbumina (tracciato n. 1), ovoalbumina succinilate (tracciato n. 2), derivato di ferro di ovoalbumina succinilata (tracciato n. 3), derivato di ferro di ovoalbumina (tracciato n. 4).

La fig. 5 illustra i risultati dell'elettroforesi condotta su lat-ìo toproteine (tracciato n. 1), lattoproteine succinilate (tracciato n. 2), derivato di ferro di lattoproteine succinilate (tracciato n. 3), ferritina da milza di cavallo (tracciato n. 4).

La fig. 6 illustra i risultati dell'elettroforesi (lettura densito-metrica a 550 nm) condotta su derivato di ferro di lattoproteine 15 succinilate (linea continua), derivato di ferro di proteine di soia succinilate (tratto-punto) e derivato di ferro di ovoalbumina succinilata (linea tratteggiata).

e) Gel filtrazione

20 II profilo di gel filtrazione su Sephadex G 75 (Pharmacia, Uppsala), del derivato di ferro delle proteine succinilate del latte (ottenuto come descritto nell'esempio 1), in confronto con le proteine succinilate stesse è riportato in fig. 7, dove la linea continua si riferisce a lattoproteine succinilate, quella tratteg-25 giata al corrispondente derivato di ferro; in ordinata è riportato l'assorbimento a 280 nm, in ascisse il numero progressivo delle frazioni raccolte. Dal profilo si nota che la presenza di ferro origina un picco unico in uscita con tempo di ritenzione analogo a quello del void della colonna. Considerando che la esclu-30 sione molecolare del Sephadex G 75 è di circa 75.000 Daltons, il valore di peso molecolare minimo apparente di tale aggregato è superiore a tale valore. Inoltre, a differenza di esso, nelle proteine succinilate si nota uno sdoppiamento di picco con maggiore randomizzazione. Tale fatto è riscontrato anche a livello elet-35 troforetico (fig. 5). Un simile comportamento sta a indicare che il ferro presente è centro di aggregazione intermolecolare del medio proteico. Ulteriori informazioni sono evidenziabili dalla gel filtrazione su Sephadex G 200, in confronto con ferritina (fig. 8, nella quale ascisse e ordinate sono come in fig. 7, men-40 tre la linea continua corrisponde al derivato di ferro di lattoproteine succinilate e quella tratteggiata è relativa a ferritina ottenuta da milza di cavallo). Anche in tal caso il picco risulta univoco mentre il tempo di ritenzione è superiore a quello della ferritina. Ciò sembra indicare che il passo molecolare apparente 45 è inferiore a quello della ferritina da milza di cavallo.

f) Stabilità al succo gastrico

Tale prova è condotta sul derivato di ferro ottenuto secondo l'esempio 1 ed è effettuata dissolvendo mg 25 di derivato in 0,5 mi di acqua distillata e addizionando tale soluzione a 5 mi di succo gastrico di ratto. Si ottiene un precipitato e la sospensione è incubata a 37°C per 60' sotto agitazione. Dopo tale periodo il precipitato è separato per centrifugazione e il surnatante è analizzato per il contenuto di ferro. La quantità di ferro ceduto al succo gastrico era dell'1% del totale iniziale.

g) Precipitazione del derivato di ferro con solfato ammonico

A una soluzione al 10% (p/v) di derivato di ferro preparato come nell'esempio 1 si addiziona il 30% (p/v) di solfato di ammonio. Si ottiene un precipitato di derivato proteico del ferro 60 che presenta caratteristiche uguali a quello di partenza e che risulta ancora solubile in acqua. Nella soluzione non si ha presenza di ferro.

L'insieme dei dati sopra esposti dimostra che la capacità complessante delle proteine succinilate nei riguardi del ferro 65 non è tipica delle proteine succinilate del latte ma è caratteristica dei derivati succinilati di proteine di varia origine e funzione fisiologica, animali o vegetali.

Come abbiamo altrove riportato, molte proteine animali o

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vegetali non modificate sono in grado di legare ferro. Quando infatti si fanno reagire proteine non modificate del latte, ovoalbumina, proteine da soia, da siero, da estratti d'organo (fegato) con il ferro nelle condizioni simili a quelle descritte, per ottenere i corrispondenti derivati da succinil-proteine, si ottengono prodotti aventi anche tenori di ferro similari, tuttavia con caratteristiche di solubulità e di stabilità completamente diverse. Infatti, ad esempio, come è mostrato in tabella I, la proteina da soia fornisce un prodotto finale che, liofilizzato, risulta insolubile per oltre il 75% e che cede il proprio ferro per trattamento con succo gastrico. Oltre quindi alla capacità complessante nei riguardi del ferro, il comportamento dei derivati ferro-proteine succinilate, oggetto dell'invenzione (ossia solubilità in ambiente alcalino, stabilità in ambiente acido e in presenza di succhi gastrici anche per elevati tenori di ferro) non è attribuibile alle proteine di base, e quindi non era come tale prevedibile.

TOSSICITÀ

a) Si è esaminata la tossicità acuta nel topo Swiss, per os, mediante sondaggio gastrico, della ferrosuccinilproteina da proteine di latte, ottenuta come descritto nell'esempio 1, veicolata in acqua distillata. La DL50 è risultata superiore a 4.000 mg/kg.

b) La tossicità da somministrazione ripetuta nel ratto, per os, sullo stesso derivato dell'esempio 1 (qui di seguito indicato come «Ferrolat»), è stata indagata per 20 giorni di trattamento continuato su ratti maschi Wistar del peso iniziale di grammi 200, stabulati per 14 giorni prima del trattamento e quindi ran-domizzati e separati in gruppi di 10 (I gruppo: controlli, II, III e IV gruppo Ferrolat a 30-100-300 mg/kg/die).

Il preparato in esame, sciolto al momento dell'uso in H2O distillata, venne somministrato quotidianamente, senza discontinuità e alla medesima ora di ogni giorno, mediante sonda; i controlli ricevettero ugual volume (10 ml/kg) di acqua di fonte. Durante il trattamento i ratti vennero pesati quotidianamente, prima della somministrazione, e osservati per alcune ore dopo la somministrazione del prodotto. Il consumo di cibo venne misurato al termine del trattamento, 24 ore dopo l'ultima somministrazione e dopo circa 20 ore di digiuno, i ratti in anestesia eterea vennero sacrificati mediante taglio delle carotidi; una parte di sangue venne raccolta in provetta contenente EDTA (2 gocce di una soluzione al 4%), il rimanente fu lasciato sierare. Sul sangue in toto vennero effettuati gli esami emocromoci-tometrici; sul siero gli esami ematochimici.

RISULTATI Variazioni ponderali e consumo di cibo

Nella fig. 9 sono rappresentate le curve di accrescimento ponderale ottenute durante il trattamento fino al giorno antecedente il sacrificio.

Nella tabella II e nella tabella III vengono riportati rispettivamente i valori inerenti all'accrescimento ponderale e al consumo di cibo degli animali in corso di trattamento.

La curva di accrescimento del gruppo di ratti trattati con Ferrolat alla dose di 300 mg/kg risultò significativamente rallentata, rispetto alla curva di accrescimento del gruppo di ratti controllo, a partire dal 15° giorno dall'inizio del trattamento; lo stesso gruppo di ratti consumò mediamente meno cibo (—11,7%).

Differenze minori, statisticamente non significative, si osservarono a carico dei rimanenti gruppi di ratti trattati con Ferrolat,

Esami ematologici

I risultati sono riportati nella tabella IV.

Esami ematochimici

I risultati sono riportati nella tabella V. Una modesta diminuzione della fosfatasi alcalina fu osservata nei ratti trattati con Ferrolat, 300 mg/kg/die.

Esami delle urine

I risultati sono riportati nella tabella VI.

Esami degli organi

Nella tabella VII sono riportati i pesi medi assoluti dei principali organi di ratto e nella tabella Vili i corrispondenti pesi medi relativi al peso corporeo.

Nel gruppo di ratti trattati con Ferrolat 100 mg/kg/die si riscontrò un significativo incremento del peso relativo della milza e dei polmoni. Nel gruppo di ratti trattati con Ferrolat 300 mg/kg/die, accanto ad una significativa diminuzione del peso corporeo, comparve un significativo incremento del peso medio dei testicoli.

LIVELLI EMATICI DOPO SOMMINISTRAZIONE ORALE

a) Confronto Ferrolat-solfato ferroso

Si sono usati ratti maschi Wistar del peso di circa grammi 200 a digiuno da 18 ore, randomizzati e separati in gruppi di 5; ogni gruppo è stato sacrificato all'ora determinata e ad ogni animale è stato prelevato il sangue per resezione della carotide; sul sangue di ogni animale del gruppo la determinazione del ferro è stata effettuata spettrofotometricamente mediante acido betafenantrolinsolfonico (Fe-Test, Wako ). La somministrazione è stata effettuata per sondaggio in soluzione acquosa (5 ml/kg). Il derivato succinilferroproteico utilizzato era stato preparato come nell'esempio 1 (Ferrolat). Dosaggi e risultati sono riportati nella tabella IX. Si noti che la quantità di ferro/kg era uguale per entrambi i derivati (Fe: 1 mg/kg).

b) Confronto Ferrolat-ferritina

Si sono usati ratti maschi Wistar del peso di circa grammi 200 a digiuno da 18 ore, randomizzati e separati in gruppi di 9; ogni gruppo è stato sacrificato all'ora determinata e a ogni animale è stato prelevato il sangue per resezione della carotide; sul sangue di ogni animale del gruppo la determinazione del ferro è stata effettuata spettrofotometricamente tramite Iron Colorimetrie Method (Boehringer-Mannheim). La somministrazione è stata realizzata mediante sondaggio in soluzione acquosa (5 ml/kg). Dosaggi e risultati sono riportati nella tabella X. Si noti che la quantità di ferro/kg per il derivato succinilferroproteico indicato come Ferrolat era quello della ferritina (Sigma, St. Louis Missouri) e pari a 1 mg/kg.

c) Confronto tra derivati succinilferroproteici ottenuti da diversi tipi di proteine

Si sono usati ratti maschi Wistar del peso di circa grammi 200, a digiuno da 18 ore, randomizzati e separati in gruppi di 5 (uno per dose di derivato, e un gruppo di controllo). Ogni gruppo è stato sacrificato dopo 2 ore dalla somministrazione e, mediante resezione della carotide, si è prelevato il sangue di ogni animale e su di esso è stato determinato il ferro mediante l'acido betafenantrolinsolfonico (Fe-Testi, Wako). La somministrazione orale è stata effettuata per sondaggio in soluzione acquosa (5 ml/kg). Le dosi dei singoli derivati utilizzati sono state scelte in modo da somministrare sempre 1 mg/kg di Fe.

Prodotti saggiati:

1) proteine da soia succinilate + Fe (4,42%)

2) ovoalbumina succinilata + Fe (3,57%)

3) sieroproteine bovine succinilate + Fe (5,78%)

4) Proteine da latte succinilate + Fe (4,5%) (Ferrolat).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

653 893

I risultati sono riportati nella tabèlla XI.

TABELLA I

SORGENTE PROTEICA

SUCCINILAZIONE (% di gruppi succinilabili)

Fe

(%g)

RESA (% della proteina succinilata)

SOLUBILITÀ a pH > 5 0

Lattea) » b>

» c) » d> » e>

95

»

» » »

6,7 4,6 3,2 2,5 0,8

30 20 18 18 13

+ — +

+

Lattoproteine

95

4,5

+

Ovalbumina

95

3,6

33

+

Sieroproteine (bovine)

82

(5,8 «5,5

30

+ 4- —

(Soja)

92

4,4

22

+

(Organo) (fegato)

n.d.

8,4

n.d.

+ —

Latte

35

4,3

26

+

Lattoproteine

0

4,8

—

Ovalbumina

0

(7,7 <0,4

+

(Soja)

0

(4,5 (0,4

+ —

Sieroproteine (bovine)

0

0,5

+ —

(Organo) (fegato)

0

n.d.

n.d

—

a), b), c), d), e) campioni con rapporti Fe3 + : proteine succinalate comprese tra 0,1 : 1 e 5 : 1 (p : p). f) completa ( + ); parziale (H ); insolubile (—).

TABELLA II ACCRESCIMENTO PONDERALE

TABELLA III CONSUMO DI CIBO

TRATTAMENTO mg/kg/di

Peso medio iniziale

Peso medio finale

Incremento ponderale media ± ES

Controlli

224,10 ±2,83

343,60+ 8,87

119,50±7,66

Ferrolat 30

224,40 + 3,03

325,50+ 4,56

101,20 ±4,35

Ferrolat 100

224,40 + 2,30

326,10+ 8,06

101,70 ±8,08

Ferrolat 300

224,30 ±3,71

307^00 ±10,15

ì|c

82,77 ±8,28

mg/kg/di

50

* p < 0,05 ** p < 0,01

Significatività verso i controlli (calcolata con il «t» di Student)

Consumo medio totale

Variazione %

Controlli

32,33

—

Ferrolat 30

30,42

- 5,91

Ferrolat 100

30,98

— 4,18

Ferrolat 300

28,54

—11,72

653 893

TABELLA IV DATI EMATOLOGICI

TRATTAMENTO

Controlli

Ferrolat 30

mg/kg/di

Ferrolat 100

Ferrolat 300

Emoglobina g % Ematocrito % Leucociti 103/mm3 Eritrociti 106/mm3

12,11+0,47 66,88 ±2,06 16,95 ±2,25 5,76±0,51

11,77 ±0,37 61,44 ±1,96 16,55 ±1,65 6,12 ±0,68

12,39 ±0,30 66,90 ±2,77 23,46 ±2,16 5,91 ±0,68

12,93 ±0,25 64,16± 1,80 19,93 ±2,58 6,22 ±0,31

TABELLA V DATI EMATOCHIMICI

TRATTAMENTO

mg/kg/di

Controlli

Ferrolat 30

Ferrolat 100

Ferrolat 300

Glucosio mg°7o

55,33 ± 5,75

52,81 ± 4,38

63,61± 5,58

60,74 ± 4,97

Azotemia mg%

32,73 ± 1,33

34,59 ± 2,25

28,68 ± 2,34

32,33 ± 2,52

GOT mp./ml

110,51 ± 7,10

130,81 ± 8,59

109,09± 5,21

113,36± 7,29

GPT m|j./ml

19,58 ± 1,52

26,86± 3,43

30,14± 6,02

23,15 ± 2,57

Fosfatasi alcalina mfi/ml

255,65 ±13,82

229,53 ±17,03

257,53 ±22,35

213,80+12,72

Proteine totali g<%

6,19± 0,12

6,02 ± 0,17

6,37 ± 0,12

6,21 ± 0,16

Significatività * p < 0,05

** p < 0,01

*** p < 0,001

TABELLA VI ESAMI URINE

TRATTAMENTO mg/kg/di

Controlli

Ferrolat 30

Ferrolat 100

Ferrolat 300

pH

8,15±0,17

8,55 ±0,14

8,40±0,18

8,50 + 0,12

proteine

21,00±3,78

24,00 ±3,05

**

63,00 ±12,47

53,33 ±11,66

glucosio ass.

ass.

corpi chetonici ass.

ass.

bilirubina.

ass.

sangue ass.

ass.

Significatività * p < 0,05

** p < 0,01

*** p < 0,001

9 653 893

TABELLA VII PESO FRESCO ASSOLUTO DEGLI ORGANI DI RATTO

TRATTAMENTO

mg/kg/di

Controlli

Ferrolat 30

Ferrolat 100

Ferrolat 300

Peso corporeo

310,60 ±7,53

300,33 ±3,64

296,80±6,16

278,44 ±8,89

Cuore g

1,15±0,05

1,10 ±0,03

1,14 ±0,04

1,09 ±0,07

Polmoni g

1,55 ±0,05

1,70 ±0,20

1,68 ±0,05

1,57 ±0,12

Fegato g

9,14 ±0,35

8,89 ±0,35

8,78 ±0,28

8,35±0,44

Milza g

1,38±0,13

1,36 ±0,08

1,65±0,12

1,37 ±0,09

Reni g

2,28 ±0,07

2,21 ±0,09

2,22 ±0,08

2,09 ±0,10

Surreni g

50,30 + 4,55

56,33 ±7,69

51,80 ±6,07

37,44 ±5,56

Cervello g

1,77 ±0,03

1,70 ±0,03

1,67 ±0,05

1,68 ±0,06

Testicoli g

3,30 ±0,05

3,12±0,10

3,08±0,16

3,25 ±0,07

Stomaco g

1,77 ±0,09

1,77 ±0,05

1,75 ±0,07

1,53 ±0,09

Significatività * p < 0,05

** p < 0,01

*** p < 0,001

TABELLA VIII PESO FRESCO RELATIVO DEGLI ORGANI DI RATTO

TRATTAMENTO

mg/kg/di

Controlli

Ferrolat 30

Ferrolat 100

Ferrolat 300

Peso corporeo

310,60 ±7,53

300,33 ±3,64

296,80 ±6,16

278,44 ±8,89

Cuore g

0,37 ±0,01

0,37 ±0,08

0,39 ±0,09

0,39 ±0,02

Polmoni g

0,50 ±0,02

0,56 ±0,06

*

0,57 ±0,02

0,57 ±0,06

Fegato g

2,94 ±0,04

2,96 ±0,10

2,96 ±0,06

2,99 ±0,08

Milza g

0,44 ±0,03

0,45 ±0,03

0,56 ± 0,04

0,49 ±0,03

Reni g

0,73 ±0,01

0,74 ±0,02

0,75 ±0,03

0,75 ±0,02

Surreni g

0,016 ±0,001

0,019 ±0,003

0,017 ±0,002

0,014 ±0,002

Cervello g

0,57 ±0,02

0,57 ±0,01

0,57 + 0,02

0,60 ±0,01

Testicoli g

1,06 ±0,02

1,04 ±0,03

1,04 ±0,05

1*18 ± 0,04

Stomaco g

0,56 ±0,02

0,59 ±0,02

0,54 ±0,02

Significatività * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001

653 893

10

TABELLA IX

LIVELLI EMATICI: CONFRONTO FERROLAT - SOLFATO FERROSO

TRATTAMENTO Ferro serico ng%

ore dopo il trattamento

30'

1

2

4

6

Controlli H2O 5 ml/kg

99,22 ±24,92

59,91 ± 6,85

98,23 ±13,28

80,17 ± 6,37

74,00 ±10,10

' (5)

(5)

**

***

**

Ferrolat; 22,37 mg/kg

227,45 ±16,40

275,28 ±18,91

269,61 ±22,51

203,16 ±27,74

148,18 ±16,73

(Fe pari a 1 mg/kg)

(5)

***

**

***

FeS047H20: 4,98 mg/kg

336,27 ±27,79

272,14 ±24,09

273,56 ±19,32

129,50 ± 6,21

80,52 ± 5,65

(Fe pari a 1 mg/kg p. os)

(5)

Significatività verso i controlli: * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 Significatività tra i due preparati di ferro: 30': p < 0,01; 4H: p < 0,05; 6h: p < 0,01

TABELLA X

LIVELLI EMATICI: CONFRONTO FERROLAT-FERRITINA

TRATTAMENTO

Ferro serico p.g/100 mi ore dopo il trattamento

1

2

4

6

Ferritina (F-4503 Sigma diluizione 1,08% v/v, 5 ml/kg pari a 1 mg/kg di Fe)

168,79± 15,35

170,66 ±14,70

148,08 ±18,69

89,22 ±12,75

Ferrolat 21,46 mg/kg (pari a 1 mg/kg di Fe) in 5 ml/kg

302*07 ± 15,59

269,81 ±29,94

223,72± 18,51

106,24 ±11,30

Controlli, acqua distillata 5 ml/kg

***

80,40 ± 6,39

* p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001

La significatività è calcolata con il «t» di Student verso Ferritina

TABELLA XI

LIVELLI EMATICI: CONFRONTO TRA DERIVATI SUCCINILFERROPROTEICI OTTENUTI DA DIVERSI TIPI DI PROTEINE

TRATTAMENTO

Ferro serico in jig/100 mi valori medi ± ES

Controlli

83,99± 7,56

Soia succ.

260,68 ±29,52***

Ovalbumina succ.

235,82 ±46,06*

Sieroproteina succ.

277,63 ±49,35**

Ferrolat

305,81 ±23,20***

Significatività verso i controlli * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001

La presente invenzione si riferisce anche a tutti gli aspetti industrialmente applicabili connessi all'impiego dei derivati succi-nilferroproteici qui descritti e rivendicati, in qualità di agenti

45 atti alla terapia di anemie sideropeniche. Pertanto, un aspetto essenziale dell'invenzione è costituito da formulazioni farmaceutiche per uso umano o veterinario contenente quantità predeterminate di tali derivati. Questi ultimi possono essere somministrati per via orale, per esempio sotto forma di compresse,

so capsule, fialoidi; bustine contenenti granulati; sciroppi; polveri da aggiungere a mangime per animali; ecc.

A puro titolo di esempio si citano le seguenti formulazioni:

— fialoidi contenenti 5-10-40 mg di ferro sotto forma di ferro-succinilproteine, oltre a solvente acquoso, stabilizzanti,

ss aromatizzanti ecc. comunemente impiegati in tecnica farmaceutica;

— compresse da 5-10-40 mg di ferro sotto forma di ferrosucci-nilproteine, oltre a eccipienti, disgreganti ecc. comunemente usati in tecnica farmaceutica;

60 — capsule da 5-10-40 mg di ferro sotto forma di ferrosuccinil-proteine;

— bustine monodose contenenti un granulato effervescente pari a 5-10-40 mg di ferro sotto forma di ferrosuccinilproteine, oltre a zucchero, aromatizzanti, stabilizzanti ecc. comune-

65 mente impiegati in tecnica farmaceutica;

— polvere di latte da aggiungere a mangime di svezzamento per animali al 5%-20% in peso di principio attivo.

v

2 fogli disegni

Claims

653 893

1. Proteine succinilate contenenti ferro.

2. Proteine succinilate secondo la rivendicazione I, caratterizzate dal fatto che contengono da 0,1 a 20% in peso di ferro.

2

RIVENDICAZIONI

3. Proteine succinilate secondo le rivendicazioni 1-2, caratterizzate dal fatto che il grado di succinilazione è compreso tra il 20 e il 100%.

4. Proteine succinilate secondo le rivendicazioni 1-3, caratterizzate dal fatto che la proteina di partenza è una proteina di origine vegetale o animale.

5. Proteina succinilata secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzata dal fatto che si tratta di proteina di latte con grado di succinilazione superiore al 70%, contenente più del 4% in peso di ferro.

6. Proteina succinilata secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzata dal fatto che si tratta di ovoalbumina con grado di succinilazione superiore al 70%, contenente più del 4% in peso di ferro.

7. Proteina succinilata secondo le rivendicazioni 1-4 caratterizzata dal fatto che si tratta di proteina di soia con grado di succinilazione superiore al 70%, contenente più del 4% in peso di ferro.

8. Procedimento per la preparazione di proteine succinilate contenenti ferro secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che si fa reagire una proteina succinilata con sali di ferro in ambiente acquoso, a pH compresi fra 2 e 10, e che si isola il prodotto ottenuto mediante precipitazione a pH dell'ordine di 2-4, quest'ultimo intervallo di pH essendo realizzato spontaneamente o mediante acidificazione.

9. Procedimento secondo le rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che la reazione fra proteina succinilata e sali di ferro avviene a pH attorno alla neutralità.

10. Procedimento per la preparazione di proteine succinilate contenenti ferro secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che si fa reagire una proteina succinilata con sali di ferro in ambiente acquoso a pH compresi tra 2 e 10, e che si isola il prodotto di reazione per allontanamento del solvente dopo aggiustamento del pH a valori prossimi alla neutralità.

11. Composizioni farmaceutiche per la terapia di anemie si-deropeniche nell'animale e nell'uomo, caratterizzate dal fatto che in qualità di principio attivo contengono proteine succinilate contenenti ferro secondo le rivendicazioni 1-7.