JPS62166891A - 細胞培養による有用物質の製造方法 - Google Patents
細胞培養による有用物質の製造方法Info
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- JPS62166891A JPS62166891A JP61007998A JP799886A JPS62166891A JP S62166891 A JPS62166891 A JP S62166891A JP 61007998 A JP61007998 A JP 61007998A JP 799886 A JP799886 A JP 799886A JP S62166891 A JPS62166891 A JP S62166891A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生きた細胞の培養による有用物質の生産を効
率的に行うための方法に関する。
率的に行うための方法に関する。
ｌ米且及班
近年、細胞生物学の発達に伴い、種々の有用物質がイン
ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での細胞培養により生産さ
れるようになってきた。例えば、ハイブリドーマの培養
による各種モノクローナル抗体の生産等が挙げられる。
ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での細胞培養により生産さ
れるようになってきた。例えば、ハイブリドーマの培養
による各種モノクローナル抗体の生産等が挙げられる。
因に、モノクローナル抗体は、腫瘍はじめ各種疾患の診
断薬やホルモン、リンホカイン、増殖因子、酵素等の微
量成分の検出、あるいはモノクローナル抗体を用いたｍ
ｌ成分の精製等、その利用分野は多岐にわたっている。
断薬やホルモン、リンホカイン、増殖因子、酵素等の微
量成分の検出、あるいはモノクローナル抗体を用いたｍ
ｌ成分の精製等、その利用分野は多岐にわたっている。
而して、ハイプリドーマ等のような生きた細胞を培養す
る方法としては、従来、通常の浮遊培養のほかにマイク
ロキャリアー法やホローファイバー法等がある。
る方法としては、従来、通常の浮遊培養のほかにマイク
ロキャリアー法やホローファイバー法等がある。
しかし、これらの従来法による培養では細胞の生産する
有用物質が培地中に拡散してその濃度が低くなるので、
その後の有用物質の分離、精製のための操作が煩雑とな
り、且つそのためにコスト高となる問題点がある。
有用物質が培地中に拡散してその濃度が低くなるので、
その後の有用物質の分離、精製のための操作が煩雑とな
り、且つそのためにコスト高となる問題点がある。
また、最近、細胞をカプセル化して培養する方法が提案
されているが（特開昭５７−３８２３８号）、この方法
では細胞を一次的にゲル粒子に閉じ込め、そのゲル粒子
のまわりに界面重合反応による恒久膜を形成し、その後
ゲルを溶解して有用物質を回収するものであるため、細
胞のカプセル化工程が多段にわたっていて煩雑であると
いう欠点がある。
されているが（特開昭５７−３８２３８号）、この方法
では細胞を一次的にゲル粒子に閉じ込め、そのゲル粒子
のまわりに界面重合反応による恒久膜を形成し、その後
ゲルを溶解して有用物質を回収するものであるため、細
胞のカプセル化工程が多段にわたっていて煩雑であると
いう欠点がある。
日が解° しようとする。 占
本発明は、上述したような細胞の培養による有用物質の
生産上の問題点に鑑みなされたものであって、生きてい
る細胞を簡易な操作でカプセル化してカプセル内で培養
を行うことにより、細胞の生産する有用物質をカプセル
内に高濃度に蓄積して回収することにより、細胞の培養
による有用物質の生産を効率的に行うための方法を提供
することを目的とする。
生産上の問題点に鑑みなされたものであって、生きてい
る細胞を簡易な操作でカプセル化してカプセル内で培養
を行うことにより、細胞の生産する有用物質をカプセル
内に高濃度に蓄積して回収することにより、細胞の培養
による有用物質の生産を効率的に行うための方法を提供
することを目的とする。
本発明者らは、細胞のカプセル化について研究している
過程で、キチン誘導体の一種であるキトサンと、カルボ
キシメチルセルロース或はアルギン酸ナトリウム、にカ
ラキチン等のポリアニオン多糖類とを接触させると生物
学的に温和な条件下で細胞のカプセル化ができ、そのカ
プセル化細胞の培養により、細胞の生産する有用物質が
カプセル内に高濃度に蓄積するという知見を得て、本発
明をなすに至った。
過程で、キチン誘導体の一種であるキトサンと、カルボ
キシメチルセルロース或はアルギン酸ナトリウム、にカ
ラキチン等のポリアニオン多糖類とを接触させると生物
学的に温和な条件下で細胞のカプセル化ができ、そのカ
プセル化細胞の培養により、細胞の生産する有用物質が
カプセル内に高濃度に蓄積するという知見を得て、本発
明をなすに至った。
以下本発明の詳細な説明する。
又里皇盪底
本発明の特徴は、生きた細胞をカプセル化して培養を行
って該細胞の生産する有用物質をカプセル内に高濃度に
蓄積し、次いで該有用物質を回収することにある。
って該細胞の生産する有用物質をカプセル内に高濃度に
蓄積し、次いで該有用物質を回収することにある。
間 声を解決するための
本発明では、まず、対象とする生きた細胞を、その培地
と、ポリアニオン多糖類又はその塩類もしくはそれらの
混合物を主材として含む溶液中に懸濁し、この懸濁液を
カプセル体の芯部とする。
と、ポリアニオン多糖類又はその塩類もしくはそれらの
混合物を主材として含む溶液中に懸濁し、この懸濁液を
カプセル体の芯部とする。
次いで、この懸濁液を小滴形態で可溶性キチン誘導体の
溶液と生物学的に温和な条件下に接触させてゲル皮膜を
形成させて細胞のカプセル化を行う。
溶液と生物学的に温和な条件下に接触させてゲル皮膜を
形成させて細胞のカプセル化を行う。
本発明においてカプセル体のゲル皮膜を形成するのに用
いるポリアニオン多Ｉ！類またはその塩は水溶液中でポ
リアニオン重合体となる多Ｉｉ類またはその塩であって
、低メトキシルペクチン、カラキチン、カルボキシメチ
ルセルロース、アルギン酸ナトリウム、コンドロイチン
硫酸等を例示し得る。これらの多糖類は単独または混合
物として用い得る。
いるポリアニオン多Ｉ！類またはその塩は水溶液中でポ
リアニオン重合体となる多Ｉｉ類またはその塩であって
、低メトキシルペクチン、カラキチン、カルボキシメチ
ルセルロース、アルギン酸ナトリウム、コンドロイチン
硫酸等を例示し得る。これらの多糖類は単独または混合
物として用い得る。
一方、同じゲル皮膜の形成に用いられる可溶性キチン誘
導体は、本来不活性な物質であるキチンに化学的処理を
施してその反応活性を高めたものであって、キチンを脱
アセチル化処理して得られるキトサンが代表的なものと
して例示し得る。
導体は、本来不活性な物質であるキチンに化学的処理を
施してその反応活性を高めたものであって、キチンを脱
アセチル化処理して得られるキトサンが代表的なものと
して例示し得る。
因に、キチンはカニ、オキアミ、昆虫等の甲皮微生物の
細胞壁、きのこ類等に含まれるＮ−アセチル−０−グル
コサミンがβ（ｌ→４）結合した直鎖ホモ多糖体であっ
て、天然に豊富に生産されるものであるが、その不活性
の故にそのままでは利用できない未利用天然資源といえ
る。
細胞壁、きのこ類等に含まれるＮ−アセチル−０−グル
コサミンがβ（ｌ→４）結合した直鎖ホモ多糖体であっ
て、天然に豊富に生産されるものであるが、その不活性
の故にそのままでは利用できない未利用天然資源といえ
る。
しかし、キチンを脱アセチル化処理して得られるキトサ
ンのようなキチン誘導体は稀酸に可溶となり、反応活性
を有するようになる。すなわち、キトサンは下記一般式
（１）で表わされる構造単位を有し、 式中のアミノ基により正に帯電し、ポリカチオンを示す
。
ンのようなキチン誘導体は稀酸に可溶となり、反応活性
を有するようになる。すなわち、キトサンは下記一般式
（１）で表わされる構造単位を有し、 式中のアミノ基により正に帯電し、ポリカチオンを示す
。
したがって、上述したような可溶性キチン誘導体として
のキトサンの溶液に、細胞と培地を含む上記ポリアニオ
ン多Ｉｉ類またはその塩もしくはそれらの混合物の水溶
液を接触させると、ポリアニオン多＊ｉとキトサンとの
間に荷電による架橋反応、すなわち架橋結合を起してゲ
ル状物質を生成し、瞬時に細胞のカプセル化が達成され
る。
のキトサンの溶液に、細胞と培地を含む上記ポリアニオ
ン多Ｉｉ類またはその塩もしくはそれらの混合物の水溶
液を接触させると、ポリアニオン多＊ｉとキトサンとの
間に荷電による架橋反応、すなわち架橋結合を起してゲ
ル状物質を生成し、瞬時に細胞のカプセル化が達成され
る。
本発明において、細胞と培地を含む上記ポリアニオン多
糖類及びまたはその塩を含む懸濁液を小滴形態で可溶性
キチン誘導体の溶液と接触させるには、上記懸濁液をデ
ボジッターなどによりキトサン溶液中に攪拌下に滴下さ
せるとよく、その際上記架橋反応が起る。この架橋反応
により一旦ゲル皮膜が形成されると、該皮膜に内包され
て芯部を構成する溶液のゲル化は全くみられなくなるの
で所望の細胞を含むカプセル体が得られるようになる。
糖類及びまたはその塩を含む懸濁液を小滴形態で可溶性
キチン誘導体の溶液と接触させるには、上記懸濁液をデ
ボジッターなどによりキトサン溶液中に攪拌下に滴下さ
せるとよく、その際上記架橋反応が起る。この架橋反応
により一旦ゲル皮膜が形成されると、該皮膜に内包され
て芯部を構成する溶液のゲル化は全くみられなくなるの
で所望の細胞を含むカプセル体が得られるようになる。
このような現象は、ゲル皮膜が形成されると、該皮膜に
内包された溶液（すなわち、芯液）中のポリアニオン重
合体およびキトサン分子がもはや上記皮膜を通過できな
（なって、反応が芯液中で進行しなくなることに因るも
のと考えられる。
内包された溶液（すなわち、芯液）中のポリアニオン重
合体およびキトサン分子がもはや上記皮膜を通過できな
（なって、反応が芯液中で進行しなくなることに因るも
のと考えられる。
本発明では、カプセル体の芯部を構成する流動体として
用いる溶液の調製に当ってはポリアニオン多Ｗ類または
その塩もしくはそれらの混合物を０．３〜１．０重量％
含む水溶液とすることが適当であり、特にポリアニオン
多Ｉｌ類としてカルボキシルメチルセルロースを用いる
のがゲル皮膜形成上好ましい。
用いる溶液の調製に当ってはポリアニオン多Ｗ類または
その塩もしくはそれらの混合物を０．３〜１．０重量％
含む水溶液とすることが適当であり、特にポリアニオン
多Ｉｌ類としてカルボキシルメチルセルロースを用いる
のがゲル皮膜形成上好ましい。
また、上記水溶液を接触させるキトサン溶液は、酢酸の
ような弱酸に０．５〜１６０重量％の濃度に溶解したも
のが適当である。
ような弱酸に０．５〜１６０重量％の濃度に溶解したも
のが適当である。
上述したとおり、本発明では、カプセル体のゲル皮膜を
有機溶剤などを使用することなく、極めて温和な条件、
すなわち、生物学的に温和な条件下で短時間に形成し得
るので不安定な細胞を有利にカプセル化できる。
有機溶剤などを使用することなく、極めて温和な条件、
すなわち、生物学的に温和な条件下で短時間に形成し得
るので不安定な細胞を有利にカプセル化できる。
又、本発明は、ゲル皮膜の形成によるカプセル化を１段
階で行い得るので、例えば特開昭５７−１９７０３１号
にみられるポリアニオンとイソカチオン間の塩架橋を利
用した公知のカプセル化法に比し製造上有利であるとい
える。
階で行い得るので、例えば特開昭５７−１９７０３１号
にみられるポリアニオンとイソカチオン間の塩架橋を利
用した公知のカプセル化法に比し製造上有利であるとい
える。
更に、本発明ではカプセル体のゲル皮膜の形成条件をコ
ントロールすることにより、該皮膜の膜透過性を変化さ
せることも可能であるので、カプセル体の皮膜に分画機
能を付与することも可能となって、細胞の生産する有用
物質をカプセル内に高濃度に蓄積でき、その後の分離、
回収も容易となる。また、細胞をカプセル化することに
より、細胞を培養中の機械的剪断力から保護することが
可能となる。更に、培養後、細胞と培養液の分離を容易
に行うこともできる。
ントロールすることにより、該皮膜の膜透過性を変化さ
せることも可能であるので、カプセル体の皮膜に分画機
能を付与することも可能となって、細胞の生産する有用
物質をカプセル内に高濃度に蓄積でき、その後の分離、
回収も容易となる。また、細胞をカプセル化することに
より、細胞を培養中の機械的剪断力から保護することが
可能となる。更に、培養後、細胞と培養液の分離を容易
に行うこともできる。
畝上のとおり、本発明によると、容易に入手し得る原材
料を用いて而易な手段でしかも短時間で細胞をカプセル
化し得るので、このカプセル化細胞を培養することによ
り細胞が産生ずる有用物質、例えば抗体等の生理活性物
質をカプセル内に高純度で蓄積することが可能となる。
料を用いて而易な手段でしかも短時間で細胞をカプセル
化し得るので、このカプセル化細胞を培養することによ
り細胞が産生ずる有用物質、例えば抗体等の生理活性物
質をカプセル内に高純度で蓄積することが可能となる。
更に、このようにしてカプセル内に蓄積された有用物質
は簡単に採取して回収できる利点がある。
は簡単に採取して回収できる利点がある。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実施例
細胞として公知の細胞融合手法を用いて作成されたモノ
クローナル抗体ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ：ＨＢ ８８
５２）を用いて、そのカプセル化とカプセル内培養を行
った。因に、上記ハイブリドーマは分子量約１５０，０
００の抗体蛋白質を生産する。
クローナル抗体ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ：ＨＢ ８８
５２）を用いて、そのカプセル化とカプセル内培養を行
った。因に、上記ハイブリドーマは分子量約１５０，０
００の抗体蛋白質を生産する。
上記ハイブリドーマのカプセル化：
上記ハイブリドーマの細胞を２Ｘ１０’個ｃｅｌｌｓ／
ｍ ｅになるように、０．３％カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ）を含む培地中に懸濁させ、この懸濁液を
カプセル体の芯液とした。
ｍ ｅになるように、０．３％カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ）を含む培地中に懸濁させ、この懸濁液を
カプセル体の芯液とした。
キトサンを０．７％濃度になるように１／ｌＯ酢酸及び
１／ＩＯＭ酢酸ナトリウムを用いて調製した酢酸緩衝液
に溶解してキトサン溶液を得た。
１／ＩＯＭ酢酸ナトリウムを用いて調製した酢酸緩衝液
に溶解してキトサン溶液を得た。
このキトサン溶液中へ、上記芯液としての懸濁液を直径
約２１Ｉｌ１１１のノズルより小滴として滴下してカプ
セル化を行った。この際、芯液中に含まれるＣＭＣはキ
トサン溶液と接触すると直ちに反応して瞬時にゲル皮膜
を形成して細胞のカプセル化が行われる。
約２１Ｉｌ１１１のノズルより小滴として滴下してカプ
セル化を行った。この際、芯液中に含まれるＣＭＣはキ
トサン溶液と接触すると直ちに反応して瞬時にゲル皮膜
を形成して細胞のカプセル化が行われる。
カプセル化細胞の培養：
上述のようにして得られたカプセルはキトサン溶液中で
数分間開いて反応を進行させた後、キトサン溶液から分
離、採取し、リン酸緩衝液で洗浄し、次いでカプセルを
培地に移して培養を開始した。
数分間開いて反応を進行させた後、キトサン溶液から分
離、採取し、リン酸緩衝液で洗浄し、次いでカプセルを
培地に移して培養を開始した。
カプセル化細胞の培養は、スピンナーボトルを用いイン
キュベータ内で５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で１０
日間行った。
キュベータ内で５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で１０
日間行った。
上記培養におけるカプセル内の細胞密度と培養時間との
関係は添付の第１図に示すとおりである。
関係は添付の第１図に示すとおりである。
第１図にみられるとおり、培養時間の経過とともに細胞
は増殖し、１０日後には３ Ｘ １０６個ｃｅｌ Ｉｓ
／ｍ Ｉｌまで増殖した。
は増殖し、１０日後には３ Ｘ １０６個ｃｅｌ Ｉｓ
／ｍ Ｉｌまで増殖した。
また、上記培養によりカプセル内に生産し、蓄積した抗
体蛋白質濃度を酵素結合免疫吸着体測定法（ＥＬＩＳＡ
）で測定してその吸光度で示した。その結果は第２図に
示すとおりである。
体蛋白質濃度を酵素結合免疫吸着体測定法（ＥＬＩＳＡ
）で測定してその吸光度で示した。その結果は第２図に
示すとおりである。
第２図にみられるとおり、抗体蛋白質の生産量は培養時
間の経過に伴い増加し、培養１０日目ではカプセル内の
抗体蛋白濃度がカプセル外に比べて約６倍の高濃度であ
った。
間の経過に伴い増加し、培養１０日目ではカプセル内の
抗体蛋白濃度がカプセル外に比べて約６倍の高濃度であ
った。
第１図は本発明の方法における培養時間とカプセル内の
細胞密度との関係を示したものであり、第２図は培養時
間とカプセル内／外の生産された抗体蛋白質の濃度との
関係を示したものである。
細胞密度との関係を示したものであり、第２図は培養時
間とカプセル内／外の生産された抗体蛋白質の濃度との
関係を示したものである。
Claims (2)
- （１）生きている細胞を培養することにより有用物質を
生産させるに際し、細胞をカプセル化して培養を行い、
該細胞の生産する物質をカプセル内に蓄積し、次いで該
生産物質を回収することを特徴とする細胞培養による有
用物質の製造方法。 - （２）カプセル化は、細胞を培地とポリアニオン多糖類
又はその塩もしくはそれらの混合物とから成る溶液中に
懸濁させ、次いで該細胞を含む該懸濁液の小滴を可溶性
チキン誘導体の溶液と温和な生物学的条件下に接触させ
て上記小滴の周りにゲル皮膜を形成することにより行う
特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61007998A JPS62166891A (ja) | 1986-01-20 | 1986-01-20 | 細胞培養による有用物質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61007998A JPS62166891A (ja) | 1986-01-20 | 1986-01-20 | 細胞培養による有用物質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62166891A true JPS62166891A (ja) | 1987-07-23 |
Family
ID=11681060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61007998A Pending JPS62166891A (ja) | 1986-01-20 | 1986-01-20 | 細胞培養による有用物質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62166891A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999047186A1 (en) * | 1998-03-18 | 1999-09-23 | University Of Pittsburgh | Chitosan-based composite materials containing glycosaminoglycan for cartilage repair |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57197031A (en) * | 1981-03-13 | 1982-12-03 | Damon Corp | Reversible micro-encapsulation |
| JPS5816693A (ja) * | 1981-03-13 | 1983-01-31 | デイモン・バイオテック・インコ−ポレ−テッド | 細胞により産生される物質の製造方法 |
| JPS6111139A (ja) * | 1984-06-27 | 1986-01-18 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 不安定な機能性物質を内包したカプセル体およびその製造法 |
-
1986
- 1986-01-20 JP JP61007998A patent/JPS62166891A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57197031A (en) * | 1981-03-13 | 1982-12-03 | Damon Corp | Reversible micro-encapsulation |
| JPS5816693A (ja) * | 1981-03-13 | 1983-01-31 | デイモン・バイオテック・インコ−ポレ−テッド | 細胞により産生される物質の製造方法 |
| JPS6111139A (ja) * | 1984-06-27 | 1986-01-18 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 不安定な機能性物質を内包したカプセル体およびその製造法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999047186A1 (en) * | 1998-03-18 | 1999-09-23 | University Of Pittsburgh | Chitosan-based composite materials containing glycosaminoglycan for cartilage repair |
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