JPH02504221A - 細胞培養法、培養物及び培養製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養法、培養物及び培養製品 本発明は哺乳動物の細胞、特に上皮細胞を培養基質上で培養する方法及び培養物 、特に培養物を創傷用包帯として使用することに関する。

固形質器官から誘導した通常の哺乳動物細胞の大半は固定依存性である。すなわ ち、これらは懸濁培養液では実質的に増殖できないが、該細胞を含有する成長培 地に接触している培養基質上では増殖できる。

上皮細胞は固定依存性である。細胞を培養基質面を存在させて培養すると、この 面に付着し、層化したコロニーで増殖し、最終的に全面成長状態になる。この段 階で培養は定常状態に入り、分裂細胞が基底層で増殖し、そして上部の細胞が培 養基質面から溢れだす。

すなわち、分化が生じ、ある程度までは、培養物は元のままの皮膚と同じように 挙動する。この種の細胞培養は皮膚の成長検査、皮膚細胞の分化、この分化の制 御に有用だけでな（、創傷を永久的に修復するものとして皮膚に移植するために 使用できるシート材を得るためにも有用である。Ｒｏｌｂｒｏｏｋ及びＩｌｅｎ ｎｉｎｇｓは表皮細胞の試験管内成長を考察している（　Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、 　Ｄｅｒ蒙ａＬｄ。

８１；１１５〜２４５．１９８３）。

固定依存性細胞力を増殖できるかは、培養基質面だけでな（、成長培養液の成分 や培養条件に依存する。細胞を付着・増殖させる培養基質の性質については、現 在、も完全に理解されていない。通常、培養は、固形容器、例えばガラス製や通 常はこれよりも硬質なポリスチレン等の透明プラスチック材製のベトリ皿やフラ スコ等で行い、一般的には、吐乳動物の細胞をこのような面に十分に付着させ、 増殖させる。

多くの場合、細胞を培養してから、細胞の一部又は全部を、時には成長した層を 破壊せずに、別な場所に移すことが望ましい。これは、サンプルの性質を異なる 試験か、多（の場合には顕微鏡検査することによって調べなければならない場合 に必要になることがある。上皮細胞や線維芽細胞の層は、火傷やその他の創傷を 治療するするために適用する皮膚移植片として必要な場合がある。

通常は、細胞の表面吸着及び細胞付着に必要なファクターを決定する手段として 、細胞付着に関して必要な基質面の性質を調べる研究が発表されている。例えば 、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｃｈｅｔｉｓＬｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　８．１１５〜１２６　（１９８３）には、吉井等がダリア細胞、下垂体 腫瘍細胞や肝臓細胞内細胞系統の細胞培養について記載している。各種のアクリ ル酸エステルモノマーの溶液を流延して、フラスコの内面に皮膜を形成し、重合 を開始することによってポリマーを被覆したフラスコで培養を行う。ポリマーは 少量膨潤するので、純水で膨潤したゲルの最大含水率は２５重皿％である。培養 器面にポリマーを被覆すると、培養器から付着細胞を剥がすのは容易ではない。

他の固定依存性細胞を培養する方法では、各種コラーゲン、フィブロネクチンや ラミニンを使用して、通常の周囲環境において細胞の細胞外間質に存在する分子 で硬質の培養面を被覆する。Ｊ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ８３ ．３７９〜３７９（１９７３）では、Ｍａｃｉｅｉｒａ−Ｃｏｅｌｈａが、ポリ （アミノ酸）ヒストンやヘパリン等の荷電材料で被覆したポリマー系の牛血清ア ルブミンの皮膜を備えた容器で線維芽細胞を培養している。これら方法はいずれ も細胞の成長を促進するが、硬質容器面について上記したような欠点が依然とし である。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　１４３、ｐ、 １５〜２５（１９８３）では、　Ｐａｒｉｓ等が、培地中ポリ（ヒドロキシエチ ルメタクリレ−））（ＨＨＭＡ）のシート面上で内皮細胞及び線維芽細胞の培養 を行うことについて記載している。ポリマーの調製は、場合によっては、例えば コラーゲンやエラスチン等の蛋白質を存在させた状態で行う。このＩＩＥＭ八ホ モへリマーは膨潤性が小さく、０．９％生理的食塩水を吸収して、生理的食塩水 の最大含有率が３８％のゲルを形成できる。

Ｃｅ１ｌ　（１９７７）　１１．　Ｐｐ、４０５〜４１６にＧｒｅｅｎが発表し た論文＝Ｔｅｒｓ＋１ｎａｌ　Ｄｅｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｖａｌ　Ｃｅ１１ｇ”では、ヒト新生児の 包皮からのケラチノサイトを培養して、層化全面コロニ′−を形成している。培 養物は、分化の検査に使用する。ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　（１９８０）　１２５、ｐｐ、１４１−１５２にＪｅｐｓｅｎ等が発 表した“Ｆｉｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｒ　Ｓｕｂ　Ｃｕ１ｔｉｖａｔｅｄ 　５Ｌｒａｔｉｒｉｅｄ　５ｑｕａｓｏｕｓ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕ＋ｓ”では、 ラットの舌上皮を培養し、プラスチック製の培養フラスコ面上で一次体外移植組 織を継代培養して、長期間持続培養物を産生じている。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　 ＩｎｖｅｓｔｉｇａＬｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　１９ｇ７．８８：３１ ４〜３１９には、Ａｒｅｎｈｏｌｔ−Ｂｉｎｄｓｌｅｖ等が、ヒドロ腔ケラチノ サイトを硬質プラスフチク製フラスコで培養・継代培養した実験について記載し ている。

上皮細胞の成長及び分化を促進するために、供給細胞を使用することが多い。例 えば、Ｇｒｅｅｎは上記文献において、致死量を照射した３Ｔ３細胞を供給細胞 として使用している。Ｃｅ１ｌ　（１９７５）　ｊ２、ｐｐ、　３３１−３４４ にＲｈｅｉｎｗａｌｄ等が発表した５ｅｒｉａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏ ｒ　５ｔｒａｉｎｓｏｒ　　ｈｕｍａｎ　　ｅｐｉｄｅｒ＋ｓａｌ　　ｋｅｒａ ｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：　　ｔｈｅ　　ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｒ　ｋｅｒａＬｉｎ ｉｓｉｎｇ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌｓ”には、 線維芽細胞を供給細胞として使用することが記載されている。

培養上皮細胞を皮膚移植片として使用することについては各種の開示がある。Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｔｒａｕｍａ　（１９８６）２６、ｐｐ、　９５５〜９６ ２では、Ｍａｄｄｅｎ等が培養異型的表皮（すなわち、対象患者以外の人から得 た表皮）を１１度又は１１１度の火傷の移植片として使用することについて記載 している。火傷の結果は同種移植片の初期拒否反応を阻止する免疫抑制であるが 、結局薬剤を免疫抑制剤として使用しない限りは、これら同種移植片は拒否反応 を受ける。さらに、他者の組織を使用することは、特にＨＩＶ等のウィルス感染 等の感染の危険が大きいので、避けるのが望ましいのはいうまでもない。

従って、自己由来の培養上皮を使用するのが好ましい・Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　１ｌｅｄｉｃｉｎｅ（１９８４年８月１６日）、ｐｐ 、　４４８−４５１では、Ｇａ１ｌｉｃｏ等が自己由来の上皮細胞の培養シート を皮膚移植片として使用することについて記載している。また、Ｌａｎｃｅｔ　 （１９８６）　！、ＰＰ、　１１２３〜１１２４では、Ｃｕｏｎｏ等が火傷の移 植法の第１段階として全皮膚の同種移植片使用し、次に、同種移植片の表皮層を 皮膚同種移植片の自己由来表皮培養物によって置き換えることについて記載して いる。この方法は成功した。というのは、真皮の免疫反応性は表皮よりも低いか らである。ただし、ウィルス感染の危険は依然として高い。

硬質プラスチックやガラス面を表皮細胞培養の培養基質面として使用することに 伴う問題の一つは、培地の供給が該面の上から行われるため、基底細胞の培地に 対するアクセス度が低くなることである。このため、成長速度が遅くなる。なぜ なら、分裂できる細胞はｙ！底細胞であるためである。細胞シートを皮膚移植片 として使おうとす−る場合の別な欠点は、機械的強度がそれ程強くないシートを 培養基質面から外して、支持のない状態で取り扱う必要がある点であり、これは 不便であり、またシートを傷付けることもになる。

取り扱いを容易にするために、培養基質面からシートを外した後、これを支持す ることは知られている。例えば、Ｇａ１ｌｉｃｏ等は（前掲文献で）シートをガ ーゼにクリ・ツブで留めることを記載している。また、Ｃｕｏｎｏ等は（前掲文 献で）支持材“トターフェース（Ｔｅｒｒａｃｅ）”を培地上に設けている。こ れら方法はシートを取り扱うさいの問題を幾つかを解決するものであるが、依然 として、硬質面成長に伴う欠点を持つだけでなく、シートを基質面から取り外す 必要がある。硬質面からの取り外しは、米国特許第４３０４８６６号公報に開示 されているジスバーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）等の酵素を適用すれば、簡単にできる 。

また、上皮細胞の成長はコラーゲンゲル上で行っていた。この場合、上皮細胞の 層と共にコラーゲンを表皮代替物として直接使用していた。例えば、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ１ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７９）　７６、Ｉ）ｐ、　１２７４−１２７ ６では、Ｅｌ等が上皮細胞の培養基質としてコラーゲンゲルを使用することにつ いて記載している。ヒト線維芽細胞を供給細胞として使用すべきフラーゲン格子 に接種する。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩｎｖｅｓｔｉｇａＬｉｖｅ　Ｄｅｒｓ＋ ａＬｏｌｏｇｙ　（１９８３）　８１％　ｐｐ、２Ｓ〜ＩＯＳでは、Ｂｅ１１等 がコラーゲンマトリックス中の線維芽細胞からなる皮膚等価物とコラーゲンマト リックス上で“平板培養（ｐｌａｔｉｎｇ）”しだケラチノサイトから成長させ た表皮等価物とからなる生皮膚の再構成について記載している。

幾つかの研究が示すところによれば、生体内条件に近似させた空気／液体界面で 上皮細胞を成長させると、培養時培養液中に完全に浸漬した細胞よりも、コラー ゲンゲル上で成長させた細胞の方が、層化（分化）がすぐれたものになることが ある。

コラーゲンゲル上の上皮細胞の成長はすぐれたものであるが、コラーゲンの使用 については幾つかの問題がある。コラーゲンは、特に分離した形ではコストが高 く、また溶解して、ゲル化する必要がある粉末の場合には、構成するのに時間が かかる。天然源から実験室でゲルを分離し、かつ構成するのも時間がかかる。

さらに、コラーゲンについては、まだ完全には理解されていない。というのは、 天然物質であるため、その挙動がバッチ毎に異なり、標準化方法が難しいからで ある。これは、コラーゲンを皮膚移植片として適用しようとする場合には、臨床 的な点から非常に望ましくない。さらに、コラーゲンは実験室で取り扱うのが難 しく、問題の一つは、ゲルの大きさ、従ってその含水率が、供給細胞として使用 される他の細胞、特に線維芽細胞の存在に左右される点である。ゲルの大きさは 使用中に変化するが、これは、ゲルを皮膚代替物の主要部として使用する場合に 特に大きな欠点になる。含水率をあるレベルまで低くすると、ゲルが不透明にな り、このゲルからなる移植片下部の創傷治癒度を観察するのが容易でなくなる。

さらに別な問題は、蛋白質コラーゲンの場合、蒸気殺菌が不可能であるため、微 生物の殺菌は抗生物質やその他の殺菌手段によってのみ可能である点にある。天 然物質コラーゲンゲルの場合、いずれも望ましくない微生物の成長にとって都合 のよい基質であり、創傷にこれを使用すると、感染の恐れが強くなる。さらに別 な欠点は、ゲルを上皮細胞培養物と共に皮膚代替物として使用した場合、上皮細 胞培養物の上に直接別なバリヤを設ける必要がある点である。

本発明は、水性培地を存在させた状態で、該培地で膨潤した、水不溶性及び水膨 潤性を示す親水性合成ポリマーからなるゲルである着脱可能な基質の表面で固定 依存性の哺乳動物細胞を培養する新規な方法を提供するものである。この方法は 、該ポリマーが、０．９重１％生理的食塩水を少なくともその乾燥自重だけ吸収 できるような膨潤性を示すことに特徴がある。

本発明方法は、ヒト細胞、特に上皮細胞及び線維芽細胞の培養に特に使用できる ものであるが、ポリマー基質の使用は広範囲にわたる吐乳動物の固定依存性細胞 の培養にも有利である。

この新規な方法では、培養過程の少な（とも一部において、水性培地の上方で基 質面上の細胞を気体状培地に暴露することができる。細胞の暴露は培養過程の初 期又は後期に実施してもよ（、培養過程全体を通じて行ってもよい。

培養過程全体を通じて、合成ポリマーゲルを水性培地で膨潤し、栄養素をゲル基 質を介して細胞に供給する。培養過程における細胞の気体状培地への暴露は、周 囲の空気やその他の気体状培地に接触させた状態で細胞を成長させると同時に、 水性培地をゲルに連続供給する基質面を維持することにより行う。

例えば、固形支持体を使用して、基質面上にゲルを支持するか、またはゲルを水 性培地の水面に浮遊させることによって水性培地中にゲルを部分浸漬することが できる。

この方法は、皮膚の下から栄養素を供給しながら、皮膚の表面層を大気に暴露す る生体内条件に近似させることによって試験管内の上皮細胞の成長及び分化を調 べる研究手段として有用である。

特定基質を使用することは別にして、通常の栄養素及び成長速度を制御する成分 を含む細胞培地を使用するのが便利である。従って、上皮細胞については、培地 には、上皮細胞の成長を促進することが知られている物質を配合することができ る。これらは、例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）等の成長因子であればよく、通常 は、供給細胞から誘導した物質、例えば通常のヒト線維芽細胞、３Ｔ３−細胞、 グリア細胞やその他の脳細胞と併用する。

好適な方法では、培地容器の表面で供給細胞を成長させ、そしてこの細胞が成長 の定常状態に達した時点で、上皮細胞を導入する。膨潤合成ポリマーゲルは成長 した供給細胞層に導入すればよい。これにより、供給細胞が存在した状態で、し かもこれから物理的に分離した状態で、上皮細胞が成長する。あるいは、膨潤合 成ポリマーゲルの表面で供給細胞を成長させ、成長が定常状態に達した後、上皮 細胞を導入してもよい。

時には、供給細胞と同じ表面で上皮細胞を成長させるが、前述したように、異な る細胞種は異なる表面上で成長させる。供給細胞が線維芽細胞の場合には、Ｇｒ ｅｅｎの米国特許第４０１６０３６号公報に記載されているように、線維芽細胞 を処理して、増殖しないようにすることができる。さらに、培養が２工程からな り、工程間で細胞を凍結する場合には、フランス特許第２５８９１６５号公報に 記載されている方法によって細胞を成長させてもよ（、第２工程は本発明に従っ て実施する。

培地には、例えば前記文献及び公報に記載されているような、当業者にとって公 知な従来成分のいずれも配合することができる。従って、培地には、他の成長作 用物質、血清、栄養素、酵素、金属イオン封鎖剤、緩衝液及び／又は抗生物質や その他の従来物質を配合することができる。また、基質には、蛋白質やその他の 天然物質を配合してもよく、または基質をこれらで被覆して、細胞の成長に作用 を与えてもよい。例えば、エラスチンやコラーゲンなどの蛋白質がある。これら 成分により、Ｐａｒｉｓ等が（前掲文献に）記載しているように、特定種の細胞 を成長について選択できる。

本方法で使用するポリマーゲルは完全な合成体であるのが好ましい。これは、一 般に膨潤シートの形を取り、その厚さは、例えば０．１〜５■、好ましくは０゜ ５〜２閣である。

ポリマーに栄養素及び水を十分に浸透させるためには、このポリマーは、少なく ともその自重だけ０．９重量％生理的食塩水を吸収できるような膨潤性を備えて いなければならない。すなわち、該ポリマーは０゜９％生理的食塩水に膨潤して 、少なくとも５０重量％の生理的食塩水からなるゲルを形成する。通常、このポ リマーは０．９％生理的食塩水を吸収して、６０％以−１−１好ましくは７０〜 ９５％の生理的食塩水からなるゲルを形成できる。基質を形成するポリマーはし ばしば、その乾燥重量について水を１００倍まで吸収できるポリマーである。水 性培地は溶解物質、例えば前記物質のいずれかを含有しているため、該培地にお けるポリマーの膨潤性は純水中では低くなる傾向があるが、通常膨潤性は０．９ ％生理的食塩水中では同じである。好ましいポリマーは、その乾燥自重の１〜５ ０倍の範囲にある里、好ましくは１．５倍、より好ましくは２倍、又は３〜２０ 倍、例えば約１０倍の量で水性培地を吸収できるポリマーである。酸素及び上皮 細胞成長に必要な物質に対するポリマーの浸透性を改善するためには、該ポリマ ーの膨潤性はできるだけ高い方がよい。ポリマー基質の好ましいガス浸透性につ いては、そのＤＫ値が少なくとも２０、好ましくは２０〜３５の範囲にあればよ い。また、膨潤性の高いゲルは、ゲルを最初に培地に導入した時に、ゲルと液体 培地内で液相の平衡が速（達成されるので、細胞成長にとって有利である。

ポリマーは、好ましくはアクリルモノマーからなる、エチレン系不飽和モノマー から形成する。最も好適なモノマーは、例えばアルキル基の炭素原子数が２〜４ のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレートである。このようなモノマーの例に は、ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、ヒドロキエチルメタアクリレー ト（ＨＥＭＡ）　、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルア クリレートやヒドロキシトリメチレンアクリレートがある。該モノマーは好まし くはＨＥＡ及び／又はＨＥＭＡからなる。このようなヒドロキシアルキル（メタ ）アクリレートは、一般に、親水性か疎水性のいずれかで、生成するコポリマー に特定の化学的及び物理的特性を与えるように選択された１種かそれ以上のコモ ノマーと共重合する。コモノマーの例には、アルキル（メタ）アクリレート、ア ルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリアルキレングリコール（メタ）ア クリレート、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、スチレン、Ｎ−ビ ニルラクタム、例えばＮ−ビニルピロリドンがある。一般に、親水性モノマー、 例えば（メタ）アクリル酸を配合すると、ポリマーの膨潤性が高くなる。

好ましいポリマーは多量、即ち５０〜１００％のヒドロキシアルキル（メタ）ア クリレートと少量、即ち５０〜０％のコモノマーとから形成する。最も好ましい 混合物は５０〜１００％、好適には７５〜９９％、より好適には９０〜９８％の ＨＥＭＡ及び／又はＨＥＡと少量のコモノマー、好適には親水性コモノマーとか らなる。

ポリマーは好ましくは架橋する。架橋により、ポリマーは不溶化し、ポリマーの 膨潤性が制御され、かつポリマーに物理的強度が付与される。架橋は好ましくは 共有結合であり、一般には、重合混合物に２−又は多−官能性エチレン系不飽和 化合物を適当な■、一般にはモノマー混合物の２重量％未満の量、例えば０゜０ １〜２％、好ましくは０．０５〜１．５％、一般には０．０５〜１％の範囲にあ る量で配合することにより行う。この種の架橋剤の例は公知であり、（メタ）ア クリル酸のジー又はトリーエステルである。例示すれば、一般にアルキレンの炭 素原子数が２〜４のアルキレンジー（メタ）アクリレート、又は一般にアルキレ ン基の炭素原子数が２〜４のジー又はポリ−アルキレングリコール（メタ）アク リレート、及びアルキレンビス（メタ）アクリルアミド、通常はメチレンビス（ メタ）アクリルアミドがある。

重合は公知方法によって希釈剤を存在させずに行ってもよく、あるいは水又はそ の他の適当な希釈剤を存在させて行ってもよい。モノマー水溶液の重合について は、米国特許第２９７６５７６号公報に記載されている。液体希釈剤を実質的に 存在させないで行う重合は米国特許第３５２０９４９号公報に記載されている。

非水性希釈剤を存在させた状態で行う重合はＧＢ−Ａ−２０９７８０５に記載さ れている。この公報では、硼酸と３個以上のヒドロキシル基とから形成したエス テルを存在させて重合を行っている。ＥＰ−Ａ−０１８２６５９では、カルボン 酸又は無水物及びポリオール、時には２官能性カルボン酸のエステル反応物やポ リオール自体又は混合物を始めとする水排除性溶剤の存在下で重合を行っている 。本発明で使用するポリマーを形成するためには、上記公報に記載された方法は いずれもが使用できる。重合は、蛋白質やその他の天然化合物の存在下でも実施 することができる。蛋白質は、例えばコラーゲンやエラスチンであればよい。

重合は公知手段、例えば熱的開始剤やレドックス開始剤によって、及び／又は適 宜放射線感応触媒を含む放射線照射によって開始すればよい。放射線照射は紫外 線照射、電子ビーム照射、放射線源からの放射線照射であればよい。これら放射 線照射と共に使用するのに適当な硬化剤は公知である。

時には、細胞への付着を補強して、ゲル表面を粗面化又は多孔化もてもよく、こ れは重合混合物に適当な希釈剤を配合して、実施すればよい。

ポリマーは、重合後、所望形状に成形してもよいが、一般には、所望形状に、即 ち、シート状に重合する。従って、重合混合物を金型内で重合する。あるいは、 通常、保護シート物質で適宜被覆した平坦面に重合混合物を流延してから、重合 する。混合物層の厚さは０．１〜２−９好適には０．２〜ｌ　ｍ、より好適には やく０．５−である。

重合終了後、ポリマーを洗浄して、過剰の未重合物からなる低分子量不純物を除 去する。このポリマーは細胞に接触した状態で使用するので、過剰なモノマーを これから洗浄によって除去することが非常に重要である。洗浄は、このために適 当な公知方法のいずれかによって実施できる。洗浄方法は、脱イオン水を使用す る幾つかの継続的な洗浄工程や導電度が異なる水を使用する継続的な洗浄工程か らなっていればよい。一つの適当な方法では、ポリマーを導電度が漸増する水に 浸漬する。

ポリマーは、上記のようなポリマーを詰めたパッケージとして提供することがで き、このパフケージは、細胞培地の成分を含んでいる。このパッケージは本発明 による新規な方法に好適である。該パフケージは上記物質を含む乾燥ポリマーを 含有していればよいが、好適には、上記成分を含む水溶液で膨潤してゲルとした ポリマーからなる。従って、該パッケージは血清、成長作用物質、栄養素、酵素 、金属イオン封鎖剤、緩衝液及び／又は抗生物質からなっていればよい。

また、ゲルは本発明方法における培地の容器として直接使用するのに好適な容器 として提供することもできる。しかし、より便利には、実験室での使用が簡単な 、箔、一般には金属箔又はプラスチック箔の殺菌密封パッケージとしてポリマー を提供する。密封パフケージは好適には、破裂を防ぐために外圧をかけた状態で 、蒸気殺菌を使用して殺菌する。外圧はパフケージを金型内に保持することによ って印加してもよいが、ガス圧力による方が一層便利である。好適には、オート クレーブ、好ましくは都度及び圧力が独立して変更できるオートクレーブを使用 して、殺菌を行う。

また、本発明は、水溶液で膨潤した、水不溶性及び水膨潤性を示す合成親水性ポ リマーからなり、かつその表面に培養した哺乳動物細胞を備えたゲル基質からな る新規製品を提供するものでもある。この新規製品は本発明の新規方法による製 品であり、従って、細胞は好ましくは線維芽細胞又は上皮細胞である。

本製品の特に有用な用途は、例えば動物又はヒトの表皮移植片である。このよう な用途では、上皮細胞又は線維芽細胞の層（一般には実質的に単層）で被覆した ゲルを創傷、例えば火傷に細胞側を下にして設ける。このゲルは特に細菌に対し てバリヤとして作用すると共に、酸素浸透性が十分なため、治癒作用を持続して 発揮する。さらに保護するために、またゲルを所定位置に維持する共に、ゲルを 湿った状態に維持するためには、包帯を別な被覆物で被覆するのが好適である。

一般には、細胞が創傷に移植するまで、ゲルを数日間そのままにしておいてから 、ゲルを剥がし、同種の別な膨潤ゲルか、または通常の創傷用被覆物で被覆する 。ゲルを膨潤させた水溶液には、患者に適用する前か後に、栄養素、成長因子、 抗生物質、鎮痛剤や抗炎剤等を配合することができる。

線維芽細胞層を担持した製品を創傷に適用する場合、線維芽細胞は創傷部位に存 在する自然上皮細胞の供給細胞として作用し、これらを刺激して、増殖・分化を 誘導し、これによって創傷を治癒をもたらす。上皮細胞は刺激を受けて、ゲルの 創傷接触側の下で成長するため、後でゲルを創傷から引き剥がすことできる。− Ｉ−皮細胞の栄養素に対してゲルは浸透性であるため、これらはゲルを介して細 胞に拡散できる。好ましくは、線維芽細胞培養は患者の創傷から生じる。この用 途は特に有用である。というのは、線維芽細胞は試験管内での培養が比較的簡単 で、また上皮細胞の成長は培養線維芽細胞によって生体内で刺激を受けるので、 」二皮細胞を試験管内で培養する必要がないからである。これは、試験管内で上 皮細胞を成長させるさいの大きな困難を考えるなら、特に有利である。特に重度 の火傷に対しては、この創傷に上皮細胞を接種するか、あるいは培養線維芽細胞 を担持したゲルを使用すると同時に、培養上皮細胞を使用する。

培養上皮細胞を備えた製品は別な手段でも創傷に適用できた。

このような製品を使用すれば、前記文献に記載されている方法のいずれかに使用 されている上皮細胞培養物を担持したコラーゲンゲルからなる培養上皮又は皮膚 細胞のシートの代わりにすることができる。必要ならば、創傷に適用した直後か 、あるいは後で、米国特許第４０１６０３６号公報に開示されているように、ジ スパーゼを使用することによってゲルを付着細胞から分離できる。

本発明で使用するゲルは従来使用されている基質に比較して数多くの長所を備え ている。また、硬質面と比較した場合、浸透性であるため、培地の栄養素やその 他の成分が培地の基底細胞に供給され、従って成長がより効率的になる利点があ る。コストはコラーゲンよりもはるかに低く、よく理解されていることから、臨 床上極めて有利である。さらに、物理的な取り扱いが非常に簡単で、化学的によ く理解されているので、標準化及び制御もいっそう容易である。加えて、合成体 であるため、微生物細胞の成長にとっては都合の悪い基質であり、これは培養過 程だけでなく、最終製品からみても有利であり、細菌感染やその他の感染の恐れ が少な（なる。膨潤ゲルは酸素に対して比較的浸透性があるため、細菌やその他 の望ましくない成分に対するバリヤとして作用しながら、治癒を持続させる。

また、ゲルは、使用前に、蒸気殺菌でき、極めて有利である。さらに、ゲルは透 明なので、このゲルを介して創傷の治癒状態を観察できる。

創傷治療補助剤として本発明製品を使用すると、異物組織やコラーゲンなどの天 然物質などの使用を避けることができ、従って、感染や免疫拒否反応の恐れを最 小限にできる。

本発明方法の別な用途は、特に継代培養が必要な場合や、培養細胞のサンプルに ついて多数の異なる試験を行う必要がある場合に実施する細胞それ自体の検査で ある。

以下、実施例により本発明を説明する。

９７．５部（７）ＨＥＭＡ　（２００ｐｐｍのヒドロ牛ノンモノメチルエーテル ＨＱＭＥを含有）、１部のＨＥＡ　（２００ｐｐｍのＨＱＭＥを含有）及び０． ７５部のメタクリル酸をエチレングリコールジ−メタクリレートからなる０、５ 部の架橋モノマーと共に混合した。重合混合物に０．２５部の硬化剤（ＤＡＲＯ ＣＵＲ１１７３）を加えてから、平坦面に０．５−の厚さで流延した。２００　 ｍＷ／ｃｍ”の強さのＵＶを３６５ｎｍの波長で約６０分間照射して、混合物を 硬化した。

重合後、平坦面からポリマーを引き剥がし、導電率が７５０μＳ／ｃｍ’１７） 水に約１２時間浸漬した。次に、導電率が１５５０μＳ　／　ｃｓ″の水にさら に約１２時間浸漬してから、数時間、０．９％の塩化ナトリウムの再蒸留水溶液 にポリマーを浸漬した。次に、過剰の含浸剤塩化ナトリウム溶液を含むポリプロ ピレン箔容器にゲルシート片を充填した。この袋を熱密封してから、１２１℃の 温度で１５〜２０分間オートクレーブ中で殺菌した。

この方法で製造したポリマーにより、０．９％生理的食塩水を吸収して、７０重 量％の含浸剤液体を含んだゲルを形成できた。

培養基質としての使用 上記のようにして形成したポリマーゲルのシートを、実験前に、３４℃で３日間 殺菌ＭＥＭ　（最小必須培地）中でインキユベーシヨンした。気体雰囲気は空気 と５％ＣＯ１とであった。

ポリマーシートを１平方Ｃ腸片に切断し、培養フラス：２　（Ｎｕｎｃ　Ｊｏｎ 　　Ｒ）に容れ、ポリマーシートの浮遊を防ぐために、殺菌シリコーン脂肪の小 りロフトで培養フラスコ面に固定した。３つのゲル片を各培養フラスコに容れた 。

ａ　）　Ｊｅｐｓｅｎ等が（前掲文献に）記載している方法に従ってラットの口 蓋上皮（ＲＰ　Ｅ）細胞の培養物を作り、維持し、モして継代培養した。本研究 には、２０回継代培養した細胞を使用した。

ｂ）非腫瘍形成性ＲＰＥ細胞と同じ方法に従って、前記のＲＰＥ細胞系統から誘 導した形質転換腫瘍形成性細胞系統を維持し、継代培養した。

ｃ　）　Ａｒｅｎｈｏｌｄｔ−Ｂｉｎｄｓｌｅｖ等が（前掲文献に）記載してい る方法に従って、通常のヒドロ腔上皮細胞の培養物を作り、維持し、モして継代 培養した。

培養フラスコにゲルフラグメントを導入した直後に、合計で５ＸＩＯ”細胞数の 細胞懸濁液７．　５ｍｌ’を各フラスコに容れた。

各細胞をそれぞれ２つのフラスコに導入した。４日間細胞を放置して、付着させ た。細胞付着後、位相差顕微鏡検査を行い、生検材料を取り出し、６日目に光学 顕微鏡で調べた。６日目に、撮影を行った。

４日後に、３種類の細胞すべてがゲルフラグメント面に付着していた。次の日以 降、ゲル上に細胞増殖が認められた。６日目に、腫瘍形成性及び非腫瘍形成性の ラット口腔上皮細胞の両者と共にインキュベーションしたゲルは全面が上皮細胞 層で覆われていた。ヒトｌ皮細胞も増殖したが、速度は遅かった。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成１年１０月２０日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．水性培地を存在させた状態で、該培地で膨潤した、水不溶性及び水膨潤性を 示す親水性合成ポリマーからなるゲルである着脱可能な基質の表面で固定依存性 の哺乳動物細胞を培養する方法において、該ポリマーが、０．９重量％生理的食 塩水を少なくともその乾燥自重だけ吸収できるような膨潤性を示すことを特徴と する上記方法。
2. ２．該ゲルが、０．９％生理的食塩水で膨潤した時に、７０重量％〜９５重量％ からなるような膨潤性を示すことを特徴とする請求項第１項記載の方法。
3. ３．該ゲルを形成する該ポリマーが完全な合成ポリマーである請求項第１項又は 第２項に記載の方法。
4. ４．好ましくはアクリルモノマーからなるエチレン系不飽和モノマーから該ポリ マーを形成した請求項第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
5. ５．該細胞が線維芽細胞及び／又は上皮細胞からなる請求項第１〜４項のいずれ か１項に記載の方法。
6. ６．該細胞が上皮細胞で、そして該培地が、好ましくは供給細胞から誘導される 物質からなる、該上皮細胞の成長を促進する１種かそれ以上の物質を含む請求項 第５項記載の方法。
7. ７．該供給細胞が腦細胞、線維芽細胞又は３Ｔ３細胞からなる請求項第６項記載 の方法。
8. ８．該培地が、成長作用物質、血清、栄養素、酵素、金属イオン封鎖剤、緩衝液 及び抗生物質からなる選択した成分を含む請求項第１〜７項のいずれか１項に記 載の方法。
9. ９．該固定依存性細胞が、過程全体を通じて該水性培地の下方にある請求項第１ 〜８項のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．水溶液で膨潤した、水不溶性及び水膨潤性を示す合成親水性ポリマーから なり、かつ培養した固定依存性を示す哺乳動物細胞を備えたゲル基質からなる製 品。
11. １１．該ゲルがシートの形を取る請求項第１０項記載の製品。
12. １２．請求項第１０項又は第１１項の製品及び／又は請求項第１〜９項のいずれ か１項に記載の方法による製品である創傷用包帯。