CH656800A5 - Immunomodulierendes mittel. - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein immunomodulierendes Mittel, welches ein Phenylessigsäurederivat der allgemeinen Formel (I)

r

R2 I

CCOOR4 l r3

30

35

(I)

in der R1 ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

5"

R C-

in der R5 für eine Alkylgrupe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe steht, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff atome oder Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R4 ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff enthält.

Der hierin verwendete Ausdruck «immunomodulierende Wirkung» umfasst sowohl die immunosuppressive Wirkung als auch die immunostimulierende Wirkung.

Die Erfindung sei im folgenden näher unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung erläutert.

Die einzige

Fig. 1 verdeutlicht anhand einer Kurvendarstellung die Ergebnisse der Untersuchung der Adjuvans-Arthritis an Ratten, wobei auf der horizontalen Achse die Anzahl der Tage nach der Injektion des Adjuvans und auf der senkrechten Achse das relative Schwellungsvolumen (%) gegenüber dem Wert am 9. Tag aufgetragen sind.

Die als Wirkstoff verwendeten Verbindungen entsprechen der nachfolgenden allgemeinen Formel (I)

45

50

55

60

O II

U5C2CN-// y—C-COOCH;

h \=/ -

O H

(CH3) 3c-0N-// M-c-coon

H \=/

~-C-N-^"^Vc-COOCii-

=ZJ H V=/

11

3

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H

i o ^ c-cooh n5c2-c-N-f) H

h3c-c-cooh H2N-// ^

0 il

CH2-COOC2lI«3

(cl!3 ) 2ch-c-n-(/ ^

cil3 (cii2ì 5

o h

::u7) ^-C-N-^~^Vc-C 11 W H

coocu-

''—(y

R

c — coor'

I •>

r"

in der R2, R3 und R4 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, reduziert, und gegebenenfalls in dem Fall, da R4 der Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (II) ein Wasserstoffatom bedeutet, das erhaltene Anilinderivat mit einem Alkohol der allgemeinen Formel R4OH, in der R4 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, verestert oder das erhaltene Anilinderivat der allgemeinen Formel (II) mit einem Säureanhydrid der allgemeinen Formel (V)

r'

r*

0

II

-C

\

c

./

0

(V)

20

0

oder einem Säurechlorid der allgemeinen Formel (VI)

R-

O

II

C-

•Cl

(VI)

Die Salze dieser Phenylessigsäurederivate der allgemeinen Formel (I) sind pharmazeutisch annehmbare Salze und schliessen beispielsweise in dem Fall, da R1 eine Gruppe der Formel

0

5 "

R-C-

und R4 ein Wasserstoffatom bedeuten, Salze mit einer anorganischen Base, wie einem Alkalimetall oder einem Erdalkalimetall, beispielsweise Natrium, Kalium, Calcium etc. und Salze mit einer organischen Base, wie Procain, N,N'-Diben-zylethylendiamin etc.; und in dem Fall, da R1 ein Wasserstoffatom und R4 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, Additionssalze mit anorganischen oder organischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Ameisensäure etc. ein.

Zur Herstellung der Phenylessigsäurederivate der obigen allgemeinen Formel (I) eignet sich ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Nitrobenzolderi-vat der allgemeinen Formel (IV)

in denen R5 die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, umsetzt, unter Bildung eines Phenylessigsäurederivats der allgemeinen Formel (III)

30

35

R

I

_ë_NHH0r r

-COOR

(III)

in der R2, R3, R4 und R5 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und gegebenenfalls die erhaltene Verbindung mit einer anorganischen oder organischen Base oder einer anor-40 ganischen oder organischen Säure in das gewünschte pharmazeutisch annehmbare Salz umwandelt.

Die erwähnte Verfahrensweise zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sei im folgenden näher mit der Massgabe erläutert, dass die Verbindungen der 45 allgemeinen Formel (I) in die nachfolgenden Gruppen der Verbindungen der allgemeinen Formeln (II) und (III)

50

H2N

(IV)

-//

Rz c-coor4 I

R3

( II )

in der R2, R3 und R4 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, zur Bildung eines Anilinderivats der allgemeinen Formel (II)

55

60

R'

O c II

rb-c-nh-

c-coor4 1

R3

(III)

R'

aufgeteilt werden, in welchen Formeln (II) und (III) R2 bis R5 die bezüglich der allgemeinen Formel (I) angegebenen . ,4 Bedeutungen besitzen.

COOK (II)65 Die Anilinderivate der obigen allgemeinen Formel (II)

kann man in verschiedenartiger Weise herstellen. Beispiele für solche Synthesewege sind im folgenden Schema dargestellt:

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h2N-/^~V^"

r2o i H C COH

\— / r3

+ hor4 Veresterung

Reduktion

O

\=J r3

r2o t u

C-COH I

+ hor

Veresterung

H2N

-ar r20 c cor^

Ì3

I

Reduktion OtN~v

r20

1 " A

Qr cor4 R3

Die Reduktion kann durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Palladium, Palladiumschwarz oder Palladium-auf-Aktivkohle durchgeführt werden. Alternativ kann man eine Reduktion-mit Eisenpulver/NH4C1 oder dergleichen durchführen.

Die Veresterung kann man in der Weise bewirken, dass chenfalls eine azeotrope Entwässerung bei gleichzeitiger An-2o Wesenheit eines azeotropen Entwässerungsmittels, wie Benzol, durchführt, wodurch man ohne weiteres den gewünschten Ester erhält.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Nitrobenzolderi-vate können in verschiedenartiger Weise synthetisiert wer-

man das Ausgangsmaterial mit dem entsprechenden Alkohol 25 den. Nachfolgend sind Beispiele solcher Syntheserouten darin Gegenwart von Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder p-Toluolsulfonsäure erhitzt, wonach man erforderli-

(1)

COOC2HI3 I

R-CH 1

COOC2H5

Na!«

gestellt:

ci ^~~VNO-

02n

'/ Vr-

COOC2H5

C-R 1

COOC2H5

(worin R für eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe steht)

„ COOH , , .x

1) NaOII fT\ 1 A /71\ . EtOH

Q2N-y y-C-R * O2N-</ y-CH-COOH >

2) 11+

Veresterung

COOU ^

cooc-jh

2' 5

(2)

ch3

/T~\V 1) Mai: /n\ 1

°2N CII2~COOC2h5 ~2 Ic[[ » 02N-^/>-C-C00C2H5

3 CH3

Den 2-Alkyl-2-(4-nitrophenyl)-malonsäurediethylester für das obige Verfahren (1) kann man dadurch herstellen, dass man einen 2-Alkylmalonsäureester mit einer starken Base, wie Natriumhydrid, in N,N-Dimethylformamid und dann mit p-Halogennitrobenzol umsetzt.

Die Hydrolyse des erhaltenen Esters kann durch Umsetzen mit Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder dergleichen in Wasser oder einem Alkohol (Methanol, Ethanol, etc.) oder einer Mischung davon erfolgen.

Die a-Alkyl-nitrophenylessigsäure kann man dadurch erhalten, dass man einen 2-Alkyl-2-(4-nitrophenyl)-malonsäu-rediethylester mit überschüssigem Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in Wasser oder einem Alkohol (Methanol.

Ethanol, etc.) oder einer Mischung davon erhitzt oder indem man eine 2-Alkyl-2-(4-nitrophenyl)-malonsäure mit einer geeigneten Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder p-Toluolsulfonsäure, in einem geeigneten Lösungsmit-60 tel, wie einem Alkohol (Methanol, Ethanol, etc.), Benzol oderToluol erhitzt.

Die anschliessende Veresterung kann in der Weise bewirkt werden, dass man das Material in Gegenwart von Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder p-Toluolsulfon-65 säure mit Ethanol erhitzt.

Den für das obige Verfahren (2) erforderlichen 2-Methyl-2-nitrophenylpropionsäureethylester kann man dadurch herstellen, dass man Nitrophenylessigsäureethylester mit einer

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starken Base, wie Natriumhydrid, in N,N-Dimethylform-amid und dann mit überschüssigem Methyljodid umsetzt.

Die Carbonsäure der allgemeinen Formel (III), in der R4 ein Wasserstoffatom darstellt, kann man ohne weiteres aus dem entsprechenden Ester, wie dem Methyl- oder Ethylester mit Hilfe einer üblichen Hydrolyse bilden.

Die Verbindung der allgemeinen Formel (III), in der R4 eine Alkylgruppe darstellt, kann man mit Hilfe irgendeiner üblichen Verfahrensweise herstellen. Beispielsweise kann man die Verbindung der allgemeinen Formel (III) dadurch herstellen, dass man ein Säureanhydrid, wie Essigsäureanhydrid oder Propionsäureanhydrid, mit einem Anilinderivat der allgemeinen Formel (II)

u2N

.// -V

R-

C-COOR4

(II)

_/ R3

umsetzt.

Man kann die Verbindung der allgemeinen Formel (III) auch dadurch herstellen, dass man ein Anilinderivat der allgemeinen Formel (II) mit einem Carbonsäurechlorid um-10 setzt.

Das folgende Reaktionsschema umfasst zwei Synthesewege zur Herstellung von 4-Acetylaminophenylessigsäure-ethylester:

O

(1) H5C2OCCH2

+

/

N

0

II

C-CH3 C-CÜ3

II

0

o

II

u5c20cch2

-o o

II

nhcch3

0

II

(2) H5C2OCCII2

-Q-

0 11

0

nh2 + c1ccii3

H5C20CCH2-

// \N

0

II

NIICCH3

Die mit Hilfe dieser Verfahrensweisen erhaltenen gewünschten Verbindungen können durch Umkristallisation, durch eine Ionenaustauschbehandlung, durch Chromatographie, durch Behandlung mit Aktivkohle oder dergleichen mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweise der organischen Chemie gereinigt werden.

Die in dieser Weise erhaltenen Verbindungen werden als Wirkstoffe der erfindungsgemässen immunomodulierenden Mittel zur therapeutischen und vorbeugenden Behandlung von verschiedenen Erkrankungen eingesetzt, die durch Immunreaktionen verursacht sind.

Die erfindungsgemässen immunomodulierenden Mittel können oral oder parenteral (beispielsweise intramuskulär, subkutan, intravenös oder rektal) als solche oder in verschiedenartiger Verabreichungsform verabreicht werden.

Als feste Präparate kann man Tabletten, mit Zucker umhüllte Tabletten, filmbeschichtete Tabletten (Dragees), mit eine verzögerte Wirkstofffreisetzung sicherstellenden Umhüllung versehene Tabletten, harte oder weiche Gelatinekapseln, Pastillen, Pillen, Granulate, feine Granulate oder Pulver herstellen. Als halbharte Präparate kann man Supposito-rien, endermal zu verabreichende Mittel (transdermale Systeme) oder Salben herstellen. Als flüssige Präparate kann man Injektionsflüssigkeiten, Sirupe, Lösungen, zu inhalierende Materialien, Emulsionen, Suspensionen etc. bereiten.

Als Hilfsstoffe für die festen Präparate kann man Verdünnungsmittel (beispielsweise Lactose, Stärken, Mannit, Calciumhydrogenphosphat etc.), Bindemittel (beispielsweise

Cellulosederivate, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Gelatine, Gummi arabicum, kristalline Cellulose, etc.), Sprengmittel (beispielsweise Carboxymethylcellulose, kristalline Cellulose, Hydroxypropylcellulose mit niedrigem Substitu-45 tionsgrad etc.), Gleitmittel (beispielsweise Magnesiumstea-rat, Talkum, leichtes Kieselsäureanhydrid, synthetisches Aluminiumsilikat, etc.), die Wirkstofffreisetzung verzögernde Mittel (beispielsweise Paraffine etc.), Beschichtungsmate-rialien (beispielsweise Polyvinylacetaldiethylaminoacetat, so HA (Warenzeichen), Hydroxypropylmethylcellulose und dessen Phthalat, Eudragit (Rohm & Haas), Schellack, Saccharose, gefälltes Calciumcarbonat, Talkum, Calciumhydrogenphosphat, etc.), Weichmacher (beispielsweise Rizinusöl und Polyethylenglykol), Glanzbildner (beispielsweise Car-55 naubawachs), etc. verwenden.

Als Grundlage für die Suppositorien verwendet man Polyethylenglykol, verschiedene Arten von Pflanzenfetten und gehärteten Pflanzenfetten, Witepsol (Glycerinfettsäureester der Firma Dynamit Nobel AG), etc., wobei man 60 oberflächenaktive Mittel in diese Grundlagen einarbeiten kann.

Als Salbengrundlage kann man Fettgrundlagen und Öl-grundlagen (beispielsweise Fette und Öle von Tieren und Pflanzen, Wachse, Vaseline, etc.), wasserlösliche Grundlagen 65 (beispielsweise Polyethylenglykol, Cetylalkohol etc.) oder Emulsionsgrundlagen (beispielsweise Ol-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionsgrundlagen aus tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen oder Mineralölen oder synthe

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tischen Fetten und Ölen, einem Wasserbestandteil und oberflächenaktiven Mitteln) etc. verwenden.

Die flüssigen Präparate kann man dadurch herstellen, dass man einen niedrigmolekularen aliphatischen Alkohol, wie Ethylalkohol, einen mehrwertigen Alkohol, wie Polyethylenglykol und Polypropylenglykol, etc., Dimethylacet-amid oder Fette und Öle oder Mischungen davon in destilliertem Wasser löst, emulgiert oder suspendiert. In diesem Fall kann man als lösungsvermittelnde Mittel, als Emulgiermittel oder als Suspendiermittel verschiedenartige oberflächenaktive Mittel, Gummi arabicum, Gelatine oder Cellulosederivate in Abhängigkeit von dem angestrebten Zweck verwenden, wobei man zusätzlich isotonische Mittel, wie Natriumchlorid, Konservierungsmittel wie p-Hydroxybenzoesäurederiva-te, umgekehrte Seifen (reversed soap) etc. und schliesslich Puffer, Lokalanästhetika, etc. einsetzen kann.

Zur Steigerung der Stabilität kann es beispielsweise von Vorteil sein, ein gefriergetrocknetes Pulver aufzubewahren und es erst unmittelbar vor der Verwendung zu lösen.

Die oben angesprochenen festen, halbfesten oder flüssigen Präparate können Farbstoffe, Duftstoffe, Aromastoffe, Süssungsmittel und Stabilisatoren enthalten. Diese Präparate können in an sich bekannter Weise zu Mitteln mit langer Wirkungsdauer oder zu Mikrokapseln modifiziert werden. Im allgemeinen sind einer oder mehrere Wirkstoffe der Formel I in einer Menge von 0,1 bis 99% und im allgemeinen von 0,5 bis 90%, bezogen auf das gesamte Mittel, in dem Präparat enthalten. In den erfindungsgemässen Mitteln oder Präparaten kann man zusammen mit den erwähnten Wirkstoffen einen oder mehrere andere Arzneimittelwirkstoffe, beispielsweise ein Nichtsteroidanalgetikum, ein antiinflammatorisches Mittel, wie Acetylsalicylsäure, Indomethacin oder Phenylbutazon etc. zum Zwecke der Kombinationstherapie verwenden.

Der orale Verabreichungsweg ist der übliche Verabreichungsweg, wenngleich man die Mittel auch rektal oder transdermal verabreichen kann.

Die Dosis des Wirkstoffs beträgt im allgemeinen 1 bis 3000 mg pro Tag bei parenteraler Verabreichung und 1 bis 3000 mg pro Tag bei oraler Verabreichung, wenngleich die angewandten Dosierungen auch kleiner oder grösser sein können in Abhängigkeit von dem Alter, dem Körpergewicht, der Art der Erkrankung oder dem Ausmass der Symptome des zu behandelnden Patienten. Im Fall der Verabreichung einer wesentlich grösseren Dosis kann es von Vorteil sein, die Dosis in mehrere Einzeldosierungen aufzuteilen.

Das erfindungsgemässe immunomodulierende Mittel besitzt eine geringe Toxizität und kann in der Therapie, beispielsweise zur Behandlung der folgenden Erkrankungen verwendet werden: Autoimmunerkrankungen, wie chronische rheumatische Arthritis, systemische Schmetterlingsflechte (SLE), Collagenerkrankung, etc.; allergischen Erkrankungen, wie Asthma, etc.; Krebs; Bakterieninfektionserkrankungen und dergleichen.

Die Erfindung sei im folgenden näher anhand der folgenden Herstellungsbeispiele und Beispiele erläutert. Es versteht sich, dass diese Beispiele nur der weiteren Verdeutlichung der Erfindung dienen sollen und diese nicht einschränken sollen.

Herstellungsbeispiel 1 p-Aminophenylessigsäureethylester: Verbindung 1

Man erhitzt p-Aminophenylessigsäure in 15% Chlorwasserstoff enthaltendem Ethanol zum Sieden am Rückfluss. Nach dem Abtrennen des Ethanols durch Destillation extrahiert man den Rückstand mit Ethylacetat, wäscht den Extrakt nacheinander mit Wasser, einer gesättigten Natriumbi-

carbonatlösung und Wasser und trocknet ihn. Dann destilliert man das Ethylacetat ab und erhält den p-Aminophenyl-essigsäureethylester.

Herstellungsbeispiel 2 2-(4-Aminophenyl)-propionsäureethylester: Verbindung 2

Man wäscht 30,3 g Natriumhydrid (in Form einer 50%-igen Suspension in Mineralöl) mit n-Hexan, suspendiert es in 370 ml N,N-Dimethylformamid und rührt unter Eiskühlung. Dann gibt man tropfenweise 100 g (0,574 Mol) Me-thylmalonsäurediethylester zu und rührt die Mischung, bis die Freisetzung von Wasserstoff beendet ist. Anschliessend gibt man eine Lösung von 90,5 g (0,574 Mol) p-Chlornitro-benzol in 145 ml N,N-Dimethylformamid tropfenweise zu und erhitzt die Mischung während 10 Stunden auf einem Ölbad auf 80 C. Anschliessend destilliert man N,N-Dimethyl-formamid unter vermindertem Druck ab und extrahiert den Rückstand mit Ethylacetat. Man wäscht die Ethylacetat-schicht mit 5%-iger Chlorwasserstoffsäure und einer gesättigten Natriumchloridlösung und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Dann destilliert man das Ethylacetat unter vermindertem Druck ab und erhält 148 g 2-Methyl-2-(4-nitrophenyl)-malonsäurediethylester.

Man löst 147 g des rohen 2-Methyl-2-(4-nitrophenyl)-malonsäurediethylesters in 600 ml Ethanol, gibt eine Lösung von 42,4 g (0,846 Mol) 93%-igen Natriumhydroxids in 400 ml Wasser zu und setzt die Lösung während 3 Stunden bei 50 °C um. Anschliessend gibt man 1 Liter Wasser zu der Reaktionsmischung und trennt die gebildete ölige Substanz von der wässrigen Schicht ab. Man säuert die wässrige Schicht mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure an und extrahiert mit 700 ml Ethylacetat. Man wäscht die Ethylacetat-schicht mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats destilliert man das Ethylacetat ab und erhält 66,8 g rohe 2-(4-Nitrophenyl)-propion-säure.

Man löst 23,3 g der rohen 2-(4-Nitrophenyl)-propionsäu-re in 100 ml einer 22%-igen Chlorwasserstoffsäurelösung in Ethanol, wonach man die Lösung während 2 Stunden auf einem Ölbad zum Sieden am Rückfluss erhitzt. Nach dem Ab-destillieren des Ethanols unter vermindertem Druck neutralisiert man den Rückstand mit einer gesättigten Natriumbi-carbonatlösung und extrahiert mit Ethylacetat. Die Ethyl-acetatschicht wird mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats unter vermindertem Druck unterwirft man den Rückstand einer Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von Chloroform als Lösungsmittel, wobei man 55 g 2-(4-Nitro-phenyl)-propionsäureethylester erhält.

Man löst 48,3 g (0,216 Mol) 2-(4-Nitrophenyl)-propion-säureethylester in 400 ml Ethanol und hydriert die Lösung während 6 Stunden unter Verwendung von 1 g eines Palla-diumschwarz-Katalysators. Dann filtriert man den Palladiumschwarz-Katalysator ab und destilliert das Ethanol ab, wobei 48,3 g einer öligen Substanz zurückbleiben. Die ölige Substanz wird unter vermindertem Druck destilliert und ergibt 38,6 g 2-(4-Aminophenyl)-propionsäureethylester in Form einer Destillationsfraktion, die bei 124 bis 126 "C/1,3 bis 2,7 mbar (1 bis 2 mmHg) übergeht.

Herstellungsbeispiel 3 2-(4-Aminophenyl)-2-methylpropionsäureethylester: Verbindung 3

Man wäscht 10,56 g (entsprechend 0,22 Mol) Natriumhydrid (in Form einer 50%-igen Suspension in Mineralöl) mit n-Hexan, suspendiert es in 100 ml N,N-Dimethylform-

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amid und rührt unter Eiskühlen. Dann gibt man tropfenweise eine Lösung von 20,9 g (0,1 Mol) 4-Nitrophenylessigsäure-ethylester in 100 ml N,N-Dimethylformamid zu und rührt die Mischung unter Eiskühlen während 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur während 2 Stunden. Nach dem Abde-stillieren des N,N-Dimethylformamids unter vermindertem Druck, dem Extrahieren mit Ethylacetat und dem Waschen mit einer 5%-igen Chlorwasserstoffsäurelösung und dem weiteren Waschen mit einer gesättigten Natriumchloridlösung trocknet man die Ethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat. Dann destilliert man das Ethylacetat unter vermindertem Druck ab und erhält 20,33 g (0,086 Mol) 2-Methyl-2-(4-Nitrophenyl)-propionsäureethylester (Ausbeute: 86%).

Man löst 20,33 g des in dieser Weise erhaltenen Esters in 120 ml Ethanol und hydriert in Gegenwart von 0,3 g Palladiumschwarz als Katalysator. Nach dem Abfiltrieren des Palladiumschwarzes und dem Abdestillieren des Ethanols löst man den Rückstand in einer 5%-igen Chlorwasserstoffsäurelösung und wäscht mit Ethylacetat. Man neutralisiert die wässrige Schicht mit Natriumcarbonat und extrahiert mit Ethylacetat. Dann trocknet man die Ethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat, destilliert das Ethylacetat unter vermindertem Druck ab und unterwirft den Rückstand einer Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von Chloroform als Lösungsmittel, wobei man 8,31 g (0,04 Mol) 2-(4-Aminophenyl)-2-methylpropionsäureethyl-ester erhält (Ausbeute: 47%).

Herstellungsbeispiel 4 4-Acetylaminophenylessigsäureethylester: Verbindung 4

Zu 179,2 g (1 Mol) p-Aminophenylessigsäureethylester gibt man 800 ml Ethylacetat und bildet durch Rühren bei Raumtemperatur eine homogene Lösung. Zu der Lösung gibt man eine gemischte Lösung aus 103,4 ml (1,05 Mol) Essigsäureanhydrid (96%) und 100 ml Ethylacetat, wonach man die Lösung während 3 Stunden rührt. Nach Beendigung der Reaktion wäscht man die Reaktionsmischung mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung. Nach dem Trocknen der Ethylacetatschicht über wasserfreiem Magnesiumsulfat destilliert man das Ethylacetat ab und kristallisiert den Rückstand aus einer Ethylacetat/n-Hexan-Mischung um, wobei 206,6 g 4-Acetyl-aminophenylessigsäureethylester anfallen (Ausbeute: 93,4%). Schmelzpunkt: 77 bis 78 °C.

Herstellungsbeispiel 5 2-(4-Acetylaminophenyl)-2-methylpropionsäureethylester: Verbindung 5

Man löst 5,0 g 2-(4-Aminophenyl)-2-methylpropion-säureethylester in 50 ml Ethylacetat, gibt tropfenweise unter Rühren 2,5 ml Essigsäureanhydrid zu und rührt die Mischung unter diesen Bedingungen während weiterer 3 Stunden. Dann wäscht man die Reaktionsmischung mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und anschliessend mit einer gesättigten Natriumchloridlösung, wonach man die Ethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat trocknet, das Ethylacetat unter vermindertem Druck abdestilliert und den Rückstand aus einer Ethylacetat/n-Hexan-Mischung umkristallisiert, wobei 4,61 g 2-(4-Acetylamino-phenyl)-2-methylpropionsäureethylester anfallen (Ausbeute: 76%). Schmelzpunkt = 76,0 bis 76,5 °C.

Herstellungsbeispiel 6 4-(Isobutyrylamino)-phenylessigsäureethylester:

Verbindung 6

Man löst 10 g 4-Aminophenylessigsäureethylester in 100 ml Benzol und gibt 25 ml Wasser zu. Zu der Lösung gibt man unter Rühren im Verlaufe von 15 Minuten tropfenweise eine Lösung von 6 g Isobutyrylchlorid in 20 ml Benzol und gleichzeitig eine Lösung von 2,4 g 93%-igem NaOH in 25 ml Wasser. Nach Beendigung der tropfenweisen Zugabe rührt man die Reaktionsmischung während 3 Stunden und lässt sie dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Nach dem Abtrennen der Benzolschicht, dem Waschen mit einer In HCl-Lösung und dem weiteren Waschen mit einer gesättigten Natriumchloridlösung trocknet man die Benzolschicht über wasserfreiem Natriumsulfat. Nach dem Abtrennen des Natriumsulfats durch Filtrieren destilliert man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, löst den Rückstand in 30 ml Benzol und kristallisiert ihn aus 90 ml n-Hexan um. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und bei einer Temperatur unterhalb 60 °C unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 12,3 g4-(Isobutyrylamino)-phenylessigsäu-reethylester anfallen (Ausbeute: 88,3%). Schmelzpunkt = 92,5 bis 93,5 °C.

Herstellungsbeispiel 7 4-(n-Butyrylamino)-phenylessigsäureethylester:

Verbindung 7

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 6 setzt man 10 g 4-Aminophenylessigsäureethylester mit 6 g n-Butyrylchlorid um und erhält nach der Isolation 8,5 g 4-(n-Butyrylamino)-phenylessigsäureethylester. Schmelzpunkt = 72,5 bis 73,5 °C.

Herstellungsbeispiel 8 4-(4-Methylbenzoylamino)-phenylessigsäureethylester: Verbindung 8

Man löst 10 g 4-Aminophenylessigsäureethylester in 120 ml Benzol und gibt weiterhin 25 ml Wasser zu. Zu dieser Lösung gibt man im Verlaufe von 15 Minuten unter Rühren gleichzeitig tropfenweise eine Lösung von 8,6 g p-Toluoyl-chlorid in 20 ml Benzol und eine Lösung von 2,4 g 93%-igen NaOH in 25 ml Wasser zu. Nach Beendigung der tropfenweisen Zugabe rührt man die Lösung während 3 Stunden und lässt sie dann über Nacht stehen. Nach der Zugabe von 200 ml Ethylacetat trennt man die Ölschicht ab, wäscht sie mit einer In HCl-Lösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung, trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat, destilliert das Lösungsmittel ab und kristallisiert den Rückstand aus einer Benzol/n-Hexan-Mischung um, wobei 12 g 4-(4-Methylbenzoylamino)-phenylessigsäureethylester anfallen.

Herstellungsbeispiel 9 2-(4-Acetylaminophenyl)-propionsäureethylester: Verbindung 9

Zu 10 g (0,0517 Mol) 2-(4-Aminophenyl)-propionsäure-ethylester gibt man unter Rühren 50 ml Ethylacetat, worauf man tropfenweise eine gemischte Lösung aus 5,81 g Essig-säureanhydrid und 10 ml Ethylacetat zu der erhaltenen Lösung zusetzt und während 3 Stunden rührt. Nach Beendigung der Umsetzung wäscht man die Reaktionsmischung mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung. Nach dem Trocknen der Ethylacetatschicht über wasserfreiem Magnesiumsulfat destilliert man das Ethylacetat unter vermindertem Druck ab, kristallisiert den Rückstand aus einer Ethylacetat/n-hexan-Mischung um und erhält 10,3 g 2-(4-Acetylaminophenyl)-propionsäureethylester (Ausbeute: 85%). Schmelzpunkt = 94,5 bis 95,5 °C.

Herstellungsbeispiel 10 4-Acetylaminophenylessigsäure: Verbindung 10

Zu 110,6 g (0,5 Mol) 4-Acetylaminophenylessigsäure-ethylester gibt man 500 ml Wasser und rührt die Mischung

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bei Raumtemperatur. Zu der Lösung gibt man 300 ml einer 2n NaOH-Lösung und rührt die Mischung während 3 Stunden.

Nach Beendigung der Reaktion kühlt man das Reaktionssystem mit Eis und bildet durch Zugabe von 100 ml ei- 5 ner 20%-igen Chlorwasserstoffsäurelösung Kristalle. Nach dem Rühren während 30 Minuten unter Eiskühlen filtriert man die gebildeten Kristalle ab, wäscht sie mit kaltem Wasser und trocknet sie, so dass man 93,6 g 4-Acetylaminophe-nylessigsäure erhält (Ausbeute: 96,8%). Schmelzpunkt = 173 bis 175"C.

Herstellungsbeispiel 11 2-(4-Acetylaminophenyl)-2-methylpropionsäure: Verbindung 11

Man löst 3,87 g 2-(4-Acetylaminophenyl)-2-methylpro-pionsäureethylester in einer gemischten Lösung aus 16,6 ml einer 2n-Natriumhydroxidlösung und 30 ml Ethylalkohol, wonach man die Lösung während 8 Stunden bei 50 °C rührt. Nach dem Abdestillieren des Ethylalkohols unter vermindertem Druck extrahiert man die wässrige Schicht mit Ether und trennt die nichtumgesetzten Materialien ab. Nach dem Ansäuern der wässrigen Schicht mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure sammelt man die gebildeten Kristalle durch Filtration, wäscht sie mit Wasser und kristallisiert sie aus einer Aceton/Wasser-Mischung um, wobei 2,15 g 2-(4-Acetyl-aminophenyl)-2-methylpropionsäure anfallen (Ausbeute: 62%). Schmelzpunkt = 169,7 bis 170,8 °C.

Herstellungsbeispiel 12 Nach der Verfahrensweise von Beispiel 10 bildet man die folgenden Carbonsäuren durch Hydrolysieren der Ethylester der entsprechenden Säuren: 2-(4-Acetylaminophenyl)-propion-säure:

4-Isobutyrylaminophenylessig-säure:

4-n-Butyrylaminophenylessigsäure: 4-(4-Methylbenzoylamino)-phenyl-essigsäure:

Beispiel 1

Wirkung gegen plättchenbildende Zellen in der Milz gegen Schaferythrozyten in Mäusen

Man immunisiert Mäuse (Balb/c) mit einem Alter von 5 Wochen inravenös mit 1 x 108 Schaferythrozyten/Maus. Pro Gruppe verwendet man jeweils 5 Mäuse. Das Arzneimittel wird oral während 4 Tagen beginnend mit dem Tag der Immunisierung der Mäuse verabreicht. Die Mäuse werden am 5. Tag getötet und es wird die Anzahl der plättchenbil-denden Zellen (PFC) in der Milz gegen Schaferythrozyten nach der durch Fujiwara modifizierten Methode von Cunningham bestimmt («Method in Immunological Experiment A» herausgegeben von der Japanese Society for Immu-nology, (1974), Seite 1272).

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen I und II zusammengestellt.

15

20

Verbindung 12

Verbindung 13 Verbindung 14

Verbindung 15

Tabelle I

Arzneimittel Dosis PFC ( x 2500/MiIz) Prozent der

(mg/kg) Mittelwert ± Standardabweichung Kontrolle

Physiologische

Salzlösung

-

64,2+ 5,66

—

Verbindung 10

30

116,4+ 8,64**

181

Verbindung 10

100

107,2 + 10,5**

167

Verbindung 10

300

82,2+ 7,0

182

**P < 0,01

Tabelle!!

Arzneimittel Dosis PFC ( x 2500/Milz) Prozent der

(mg/kg) Mittelwert + Standardabweichung Kontrolle

Physiologische

Salzlösung

-

66,4 + 3,6

_

Verbindung 1

30

89,4 + 10,4

135

Verbindung 1

100

60,6 + 8,6

92

Verbindung 1

300

82,0 + 5,2*

123

*P < 0,05

Beispiel 2

Wirkung auf die durch Schaferythrozyten induzierte verzögerte Hypersensibilität

Man injiziert 40 jj.1 Schaferythrozyten, deren Konzentration 1 x 107/40(il beträgt, subkutan in die rechte Pfotensohle von Mäusen (ddY, mit einem Gewicht von 25 bis 30 g), worauf man das Arzneimittel oral während insgesamt 4 Tagen einschliesslich des Tages, an dem die Schaferythrozyten verabreicht worden sind, gibt.

Am 4. Tag nach der Verabreichung der Schaferythrozyten injiziert man in die linke Pfotensohle 40 (il Schaferythrozyten mit einer Konzentration von 5 x 108/40 |xl auf subkutanem Wege. Nach 24 Stunden misst man die Dicke der lineo ken bzw. rechten Pfotensohle. Die Pfotensohlenschwellung als Folge der verzögerten Hypersensibilität ist als Unterschied in der Dicke der linken Pfotensohle gegenüber der rechten Pfotensohle feststellbar. Das Schwellen der Pfotensohle der mit dem Arzneimittel behandelten Gruppe wird es mit jenen der Gruppe verglichen, die nur mit einer physiologischen Salzlösung behandelt worden ist (Kontrollgruppe). Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III angegeben.

9

Tabelle III

656 800

Arzneimittel

Dosis

(mg/kg)

Prozentuale Kontrolle d. Pfotensohlenschwellung

Physiologische Salzlösung

—

—

Azathioprine

100

49,0**

Verbindung 10

30

77,0*

100

85,7

300

71,6**

Verbindung 16

30

78,5**

100

81,4

300

90,8

Verbindung 1

30

79,8*

100

85,9

300

77,9*

Verbindung 4

30

91,5

100

93,8

300

68,4*

*P < 0,05

**P<0,01

Beispiel 3

Wirkung gegen die durch methyliertes Humanalbumin induzierte verzögerte Hypersensibilität

Man injiziert auf subkutanem Wege 100 |il einer 0,25%-igen wässrigen Lösung von methyliertem Humanalbumin an Mäuse (C3H) mit einem Alter von 5 Wochen. Das Arzneimittel wird oral während vier aufeinanderfolgender Tage einschliesslich des Immunisierungstags verabreicht. Am 4. Tage seit dem Immunisierungstag injiziert man subkutan in die Pfotensohle 25 p.1 einer 0,1 %-igen wässrigen Lösung von methyliertem Humanalbumin. 24 Stunden später misst man die Dicke der linken und der rechten Pfotensohle und bestimmt die Pfotensohlenschwellung als Folge der verzöger-25 ten Hypersensibilität über den Unterschied zwischen der Dicke der linken Pfotensohle und der rechten Pfotensohle. Die Pfotensohlenschwellung der mit dem Arzneimittel behandelten Gruppe wird mit derjenigen einer Gruppe verglichen, die nur mit einer physiologischen Salzlösung behandelt 30 worden ist.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Arzneimittel

Experiment 1 Physiologische Salzlösung Verbindung 10 Verbindung 6

Verbindung 13 Verbindung 15

Experiment 2 Physiologische Salzlösung Azathioprine Verbindung 10

Verbindung 12 Verbindung 9 Verbindung 11

Dosis (mg/kg)

300 30 100 300 30 100 300 30 100 300

100 30 100 300 30 100 300 30 100 300 30 100 300

Tabelle IV

Pfotensohlenschwellung ( x 0,01 mm) Mittelwert ± Standardabweichung

63.3 +

44.5 ± 59,0 ±

55.6 ± 56,8 ± 57,2 ± 58,2 ± 58,5 ± 54,2 ±

56.7 ±

57.4 +

1,6 1,6**

1.8 1,2** 2,2* 1,9*

1.9 2,4

1 7** l'8**

1,5*

58,4 ±

41.4 + 46,1 ± 41,8 ±

42.3 ±

54.5 ± 52,1 ±

52.4 ±

51.4 ±

55.3 + 56,0 ±

54.5 ±

55.4 ± 51,3 ±

1.6

1,5** 1,7** 2,5** 1,8**

1.7 1,5* 1,9* 1,8** 2,0 2,0

1.7

1.8 2,3*

% Kontrolle

70.3 93,2

87.8 89,7

90.4

91.9 92,4 85,6

89.6

90.7

70,9 78,9-

71.6 72,4 93,2

89.2

89.7 88,0

94.7 95,9

93.3 94,9

87.8

656800

10

Tabelle IV (Fortsetzung)

Arzneimittel

Dosis (mg/kg)

Pfotensohlenschwellung ( x 0,01 mm) Mittelwert + Standardabweichung

% Kontrolle

Verbindung 14

Experiment 3 Physiologische Salzlösung Verbindung 16

Verbindung 4

*P < 0,05

30 100 300

30 100 300 30 100 300

50,9 ± 2,0** 51,8 ± 1,4** 56,7 ± 1,5

64,0 ± 1,7

57.2 ± 2,8*

62.6 ± 3,1

50.7 ± 2,3**

48.3 ± 2,6**

49.4 ± 3,5**

56.5 ± 2,9*

**P < 0,01

87,2 88,7 97,1

89.4 97,8 79,2

75.5

77.2

88.3

Beispiel 4

Wirkung auf die Adjuvansarthritis bei Ratten

Experimentelle Methode

Man verwendet pro Gruppe 10 männliche Ratten (Spraque Dawley) mit einem Alter von 8 Wochen und verabreicht den Ratten 0,6 mg/0,05 ml in flüssigem Paraffin suspendiertes Mycobacterium butyricum intradermal in die rechte hintere Pfotensohle.

Vom Vortag der Adjuvansinjektion an verabreicht man 1 mg/kg bis 125 mg/kg der Verbindung 10 auf oralem Wege während 27 Tagen, worauf man das Pfotenvolumen misst.

Ergebnisse

Etwa 10 Tage nach der sogenannten Adjuvansinjektion erscheint eine Sekundärentzündung. Dies führt zu einem Schwellen des Glieds, in das das Adjuvans injiziert worden ist, und auch zu einem Schwellen des Glieds, in das kein Adjuvans injiziert worden ist, ebenso wie einer Schwellung der Herzohrknoten, des Schwanzes und der Glieder.

Die Verbindung 10 zeigt eine inhibierende Wirkung ins25

35

40

besondere bei einer geringen Dosis gegenüber dieser Sekundärentzündung.

Da die inhibierende Wirkung der Verbindung 10 gegenüber der Primärentzündung sehr gering ist als Folge der direkten Wirkung des Adjuvans, sind die Änderungen der relativen Schwellung des Glieds (%) gegenüber dem Wert am 9. Tag in der beigefügten Fig. 1 dargestellt. In dieser Zeichnung sind auf der horizontalen Achse die Anzahl der abgelaufenen Tage nach der Adjuvansinjektion und auf der senkrechten Achse die relative Schwellung (%) gegenüber der Schwellung am 9. Tag dargestellt.

Beispiel 5

Akute Toxizität

Das Arzneimittel wird in einer 3%-igen «Tween-80»-Lösung suspendiert, worauf die Suspension oral bzw. intraperitoneal in der in der nachstehenden Tabelle V angegebenen Dosis an Mäuse (ddY, Gewicht 20 bis 25 g) verabreicht wird. Die Todesfalle der mit dem Arzneimittel behandelten Mäuse am 7. Tag nach der Verabreichung sind in der Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Arzneimittel Dosis Verabreichungsweg Anzahl der getöteten Tiere/Anzahl

(mg/kg) der eingesetzten Tiere

Verbindung 6

5000

oral

1/5

1000

intraperitoneal

0/5

Verbindung 13

5000

oral

0/5

1000

intraperitoneal

1/5

Verbindung 15

5000

oral

5/5

1000

oral

0/5

1000

intraperitoneal

5/5

300

intraperitoneal

0/5

Verbindung 12

5000

oral

0/5

1000

intraperitoneal

0/5

Verbindung 9

1500

oral

0/5

1000

intraperitoneal

0/5

Verbindung 11

5000

oral

0/5

1000

intraperitoneal

0/5

Verbindung 14

1000

intraperitoneal

0/5

Verbindung 10

5000

oral

0/5

1000

intraperitoneal

0/5

Verbindung 1

3000

oral

0/5

1000

intraperitoneal

1/5

s

1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. 656 800

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Immunomodulierendes Mittel enthaltend als Wirkstoff ein Phenylessigsäurederivat der allgemeinen Formel (I)

   R2

   , v ^ CCOOR4

   ;>

   in der R1 ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

   O

   worin R5 für eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe steht,

   R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder

   Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und

   R4 ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6

   Kohlenstoffatomen bedeuten,

   oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
2. 2. Verfahren zur Herstellung des immunomodulierenden Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Phenylessigsäurederivat der allgemeinen Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon mit für die beabsichtigte Verabreichungsform geeigneten Hilfsstoffen vermischt.

   R2 I

   ,—,/CCOOR4 (I

   ;■

   In dieser allgemeinen Formel (I) können als Alkylgruppen R1 bis R5 irgendwelche geradkettigen oder verzweigten io Alkylgruppen vorliegen, wie Methylgruppen, Ethylgruppen, n-Propylgruppen, Isopropylgruppen, n-Butylgruppen, Iso-butylgruppen, tert.-Butylgruppen, n-Pentylgruppen etc. Die Arylgruppe R5 umfasst Phenylgruppen, Tolylgruppen, Xylylgruppen, Naphthylgruppen etc.

   15 Beispiele für Phenylessigsäurederivate der allgemeinen Formel (I) sind die folgenden Verbindungen: