CH658131A5

CH658131A5 - Reagenz und verfahren fuer immunologische analyse.

Info

Publication number: CH658131A5
Application number: CH969/82A
Authority: CH
Inventors: Takashi Kudo; Toshiyuki Sugawara; Ei Mochida
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1981-02-18
Filing date: 1982-02-17
Publication date: 1986-10-15
Also published as: GB2095831A; SE8200978L; JPS57136165A; GB2095831B; FR2500166A1; FR2500166B1; IT8247814A0; IT1147626B; DE3205849A1; DE3205849C2; NL8200631A

Description

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Reagenz für die immunologische Analyse zu schaffen, welche eine bemerkenswerte Verkürzung der für die Analyse erforderlichen Zeit, ohne Verminderung der Empfindlichkeit und der Genauigkeit, ermöglicht.

Die Erfindung betrifft deshalb ein Reagenz gemäss Anspruch 1.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Sandwichverfahren gemäss Anspruch 9, welches eine merkbare Verkürzung der erforderlichen Analysezeit, ohne Verminderung der Empfindlichkeit und der Genauigkeit, ermöglicht.

5 Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Reaktionsweise nach dem konventionellen Sandwichverfahren;

Fig. 2 und 3 sind graphische Darstellungen, welche das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Konkurrenz zwischen Antikörpern zeigt;

io Fig. 4 ist eine schematische Darstellung der Reaktionsweise nach der vorliegenden Erfindung;

Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich zwischen der vorliegenden Erfindung und dem konventionellen Verfahren zeigt;

15 Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Resultate von Beispiel 1;,

Fig. 7 ist die graphische Darstellung der Resultate von Beispiel 2;

Fig. 8 ist die graphische Darstellung der Resultate von 20 Beispiel 8.

Die gestellten Aufgaben werden durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern für die Herstellung des unlöslich gemachten Antikörpers und des markierten Antikörpers, welche verschiedene antigene Determinante auf dem 25 gleichen Antigen unterscheiden und sich mit verschiedenen antigenen Determinanten verbinden, gelöst, währenddem nach der konventionellen Methode sogenannte polyklonale Antikörper, welche von Tieren, die mit dem gleichen Antigen immunisiert wurden, erhalten wurden, für die Herstel-30 lung der beiden Antikörper verwendet wurden, so dass sie um die gleichen antigenen Determinanten des Antigens konkurrenzieren.

Das erfindungsgemässe Reagenz beruht auf dem Prinzip, dass der unlöslich gemachte Antikörper und der markierte 35 Antikörper jeweils Antikörper enthalten, welche verschiedene antigene Determinanten erkennen und sich mit verschiedenen antigenen Determinanten des zu bestimmenden gleichen Antigens verbinden können, oder sie enthalten Antikörper, die die verschiedenen antigenen Determinante des 40 Antigens unterscheiden, so dass die zwei Antikörper an verschiedenen antigenen Stellen auf dem gleichen Antikörper binden können, die genügend voneinander entfernt sind, um sich beim Binden nicht zu stören.

Monoklonale Antikörper sind für diesen Zweck ausser-45 ordentlich geeignet.

Die monoklonalen Antikörper werden durch Zellfusion zwischen Myelomazellen und Antikörper bildenden Zellen nach der Methode von Milstein et al. Nature, 256,495 (1975) hergestellt. Da diese Antikörper von den Antikörper so bildenden Zellen eines einzelnen Klons gebildet werden, sind sie vollständig homogen und ihre Spezifitäten für antigene Determinanten sind vollständig identisch. Da die zu bestimmenden Antigene im allgemeinen mehrere antigene Determinanten haben, entsteht bei der Verwendung monoklonaler 55 Antikörper, die verschiedene antigene Determinante erkennen und sich mit verschiedenen antigenen Determinanten des Antigens verbinden, als unlöslich gemachte Antikörper und als markierte Antikörper verwendet werden, keine Konkurrenz zwischen diesen Antikörpern und eine starke spezifi-60 sehe Analyse des Antigens kann erzielt werden. Somit kann auch ein Gemisch von zwei oder mehreren monoklonalen Antikörpern, die an verschiedenen antigenen Determinanten binden, als unlöslich gemachter Antikörper und/oder markierter Antikörper eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass 65 diese Antikörper nicht miteinander konkurrieren.

Die Analyse mit den erfindungsgemässen Reagenzien kann in der gleichen Weise wie nach dem Stand der Technik ausgeführt werden. Es muss jedoch betont werden, dass der

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Reaktionsmechanismus einfacher als nach dem bekannten mit dem markierten Antikörper konkurriert, wie das nach-Verfahren ist, da der unlöslich gemachte Antikörper nicht folgend gezeigt wird.

ffÄkl -Ag) + (Ak*)

+ (Ag) + (Ak*)

CoeD+ CAg " Ak*D

Ya

Äkl "Ag- Ak*)

, Ag, Ak* und — haben die gleiche Bedeutung wie weiter oben und p, p', q, q', r, r', s, und s' stehen jeweils für Gleichgewichtskonstanten.

Da zwischen dem unlöslich gemachten Antikörper und dem markierten Antikörper, wenn sie verschiedene Bindungsstellen an einem Antigen haben, keine Konkurrenz besteht, verläuft die Reaktion derart, dass die Komponenten in der Reaktionslösung einen «unlöslich gemachten Antikör-per-Antigen-markierten Antikörper» Komplex bilden.

Dies kann durch den nachfolgenden Versuch bewiesen werden: Im gleichen Reaktionssystem wie bei dem konventionellen Sandwichverfahren wurden zwei verschiedene monoklonale Anti-HCG-Antikörper, die verschiedene antigene Determinante von HCG erkennen konnten, als der unlöslich gemachte Antikörper und als markierter Antikörper verwendet und ein ähnlicher Versuch wurde ausgeführt. Das Resultat zeigt, wie in Fig. 3 dargestellt, dass, wenn das Antigen einmal an den unlöslich gemachten Antikörper gebunden ist, es vom unlöslich gemachten Antikörper (feste Phase) nicht mehr dissoziiert, wenn ein Anti-HCG-Antikörper, der einem anderen antigenen Determinanten entspricht, zugegeben wird. Dadurch wird gezeigt, dass zwischen den Antikörpern keine Konkurrenz für die gleichen Antigenstellen besteht. Mit dem erfmdungsgemässen Reagenz werden ähnliche Resultate erhalten, wenn der unlöslich gemachte Antikörper,

das zu bestimmende Antigen und der markierte Antikörper 20 gleichzeitig umgesetzt werden oder, wenn der unlöslich gemachte Antikörper und das Antigen zuerst vermischt und dann mit dem markierten Antikörper umgesetzt werden oder, wenn der unlöslich gemachte Antikörper mit dem Antigen umgesetzt wird und nach einer Weile das Gemisch mit 2s dem markierten Antikörper umgesetzt wird. Somit besteht keine Beschränkung bezüglich der Reihenfolge der Reaktionen.

Die erfindungsgemässe Umsetzung wird in einer schematischen Darstellung in Fig. 4 gezeigt. Da der unlöslich ge-30 machte Antikörper 2 und der markierte Antikörper 1 nicht miteinander konkurrieren, kann während einer kürzeren Zeit eine grössere Menge des markierten Antikörpers 1 an das Antigen 3 gebunden werden und nicht nur die Reaktionszeit kann verkürzt, sondern auch die Genauigkeit und 35 die Empfindlichkeit der Analyse kann vergrössert werden.

In Tabelle 1 sind die Vorteile des erfmdungsgemässen Verfahrens gegenüber dem konventionellen Verfahren unter Verwendung polyklonaler Antikörper in der Bestimmung von a-Fetoprotein (AFP) zusammengestellt. Aus der Tabelle 40 geht klar hervor, dass mehrere Vorteile, wie merkliche Kürzung der Analysezeit, Vereinfachung des Analyseverfahrens und Erhöhung der Analysegenauigkeit und Empfindlichkeit, erzielt werden können.

Tabelle 1

Erfmdungsgemässes Verfahren

Bekanntes Verfahren

Vorgehen

Verwendete Antikörper erforderliche Zeit Empfindlichkeit

'53 Versuchsinterne Fehler C.V. bei

.m 10-maliger Wiederholung '3

c Versuchsinterne Fehler C.V. bei Ü 5-maliger Wiederholung

Reaktion Waschen -» Enzymreaktion

Monoklonale Antikörper 30 Minuten 3 ng/ml 1,2%

3,7%

1. Reaktion -

2. Reaktion -reaktion

• Waschen ->•

• Waschen -* Enzym-

Polyklonale Antikörper 270 Minuten 10 ng/ml 2,5%

5,6%

Die Analyse wurde unter Verwendung eines Fluorphotometers mit dem Serum einer schwangeren Frau als Analysemuster, einem Polystyrol Reagenzglas als feste Phase, Mer-rettichperoxidase als Markierungsenzym und Phloretinsäure als Substrat ausgeführt.

Es ist auch möglich, nur eines der Antikörper, d.h. entweder den unlöslich gemachten oder den markierten Antikörper aus monoklonalem Antikörper und den anderen, aus gewöhnlichem polyklonalem Antikörper herzustellen. In diesem Fall jedoch entsteht Konkurrenz an der antigenen Determinante, welche beiden, dem monoklonalen und dem po-lyklonalen Antikörper, gemeinsam ist und in manchen Fäl-

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en kann die Affinität der antigenen Determinante für den jolyklonalen Antikörper stärker sein, wodurch eine vermin-lerte Genauigkeit und Empfindlichkeit resultiert, nicht nur /erglichen mit dem Verfahren bei dem beide Antikörper monoklonal sind, sondern sogar mit dem bekannten Verfahren.

Fig. 5 zeigt Standardkurven der Bestimmung con CEA 'Carcinoembryones Antigen), wenn der unlöslich gemachte Antikörper und der markierte Antikörper, wie in Tabelle 2 gezeigt, kombiniert werden. Es ist klar ersichtlich, dass das Analysesystem, welches auf der erfmdungsgemässen Kombination beruht, die besten Resultate erzielt.

Tabelle 2

Unlöslich gemachter Markierter

Antikörper Antikörper

Erfmdungsgemässes Verfahren

Vergleichsverfahren 1

Vergleichsverfahren 2

Konventionelles Verfahren monoklonal monoklonal polyklonal polyklonal monoklonal polyklonal monoklonal polyklonal

Die verwendeten monoklonalen Antikörper wurden durch Zellfusionstechnik unter Verwendung von Myeloma-zellen der Maus, wie es weiter unten in Beispiel 2 beschrieben wird, erhalten und von Klonen, welche verschiedenen antigenen Stellen entsprachen, gewonnen. Bei den polyklonalen Antikörpern hat es sich um im Handel erhältliche Produkte der Dako Company (Dänemark) gehandelt. Als unlösliche Träger wurden Polystyrolreagenzgläser eingesetzt; als Enzym wurde Meerrettichperoxidase und als Substrat o-Pheny-lendiamin verwendet.

Jede gewünschte Kombination von Myelomazellen und Antikörper produzierenden Zellen kann für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern eingesetzt werden und die Wahl der Tierart, von der die Zellen gewonnen werden, ist nicht beschränkt, so lange als beide Zellen in Kombination zusammen Hybridoma und während des Wachsens Antikörper bilden können.

Für die erfmdungsgemässen Reagenzien können alle für Immunanalysen üblichen unlöslichen Träger eingesetzt werden.

Beispiele für solche unlöslichen Träger sind Polystyrol, Polyäthylen, Acrylharze, Polytetrafluoräthylen («Teflon»), Papier, Glas und Agarose. Der unlösliche Träger kann in Form einer Rolle, Perle, eines Zahnrades, Stabes, einer Scheibe oder Küvette vorliegen. Beispielsweise kann er eine optische Zelle, ein Reagenzglas usw. sein. Er kann aber auch in anderer Form vorliegen.

Markierungsmittel, die üblicherweise verwendet werden, sind beispielsweise Peroxidase, ß-D-Galactosidase und Alka-liphosphatase für EIA und Fluoresceinisothiocyanat für FIA.

Wenn das Markierungsmittel ein Enzym ist, ist ein Substrat zur Messung ihrer Aktivität erforderlich. Als Substrat kann ein solches verwendet werden, dass bei der Umsetzung mit dem entsprechendem Enzym die Menge des entstandenen Produktes oder die Abnahme oder die Menge des verbleibenden Substrates leicht gemessen werden kann. Beispielsweise können als Substrate für Peroxidase genannt werden: 5-Aminosalicylsäure-H202, o-Phenylendiamin-H202, Phloretinsäure-H202 usw.; für ß-D-Galactosidase können als Substrate genannt werden: Fluorescein-di-(ß-D-galactopyranosid), o-Nitrophenol-ß-D-galactopyranosid, 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D-galactosid usw..

Antigene, welche mit dem erfmdungsgemässen Reagenz bestimmt werden können, müssen mindestens zwei antigene Determinante im Molekül haben. Da Substanzen, welche nach dem Sandwichverfahren bestimmt wurden, zwei oder 5 mehrere antigene Determinante haben, können im wesentlichen alle Substanzen, die nach dem bekannten Verfahren bestimmt werden können, auch nach dem erfmdungsgemässen Verfahren analysiert werden. Beispiele für solche Substanzen sind Enzyme wie y-Glutamyltranspeptidase (y-GTP), Alkali-io phosphatase und Transglycosidase; Proteinhormone wie Schilddrüsen stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschlisches choriones Gonadotropin (HCG), Insulin, Sekretin und Wachstumshormon (GH); Plasmaproteine wie Fibrinabbauprodukte (FDP), C-reakti-15 ves Protein (CRP), arsaures Gylcoprotein(ai-AG), arAnti-trypsin(arAT), a2-Plasmininhibitor(a2-PI), ß2-Mikroglobu-lin-(ß2-MG) und Immunoglobulin; carcinoembryonisches Antigen wie a-Fetoprotein (AFP), carcinoembryonisches Antigen (CFA) und embryonisches Ferritin; und Lymphocy-20 ten und bakterielle Zellen, Zelloberflächenantigene, Zellbruchstücke usw.

Da bei der Verwendung des erfmdungsgemässen Reagenzes die Reihenfolge der Reaktionen zwischen dem unlöslich gemachten Antikörper, dem zu bestimmenden Antigen und 25 dem markierten Antikörper in keiner Weise beschränkt ist, ist es auch möglich, den unlöslich gemachten Antikörper und den markierten Antikörper im voraus zu mischen. Ins-besonder ist es möglich, dass der an einen Träger, z. B. Kunststoffperlen usw., gebundene unlöslich gemachte Anti-30 körper und der markierte Antikörper im gleichen Gefass enthalten sind, z.B. in einem Reagenzglas oder es ist auch möglich, den Antikörper an die Innenwand eines geeigneten Gefässes, z.B. eines Reagenzglases, zu binden, das selber als unlöslichr Träger dient und in dem der markierte Antikörper 35 enthalten ist. Der markierte Antikörper kann in Form einer Lösung eines lyophilisierten Produktes der Lösung wie auch in Form von Tabletten, Körnchen oder Stäuben vorliegen.

Neben dem unlöslich gemachten Antikörper und dem markierten Antikörper kann das erfindungsgemässe Rea-40 genz verschiedene Hilfsstoffe zur Erhöhung seiner Nützlichkeit enthalten. Sie können beispielsweise Lösungsvermittler, Lösungsmittel für den markierten Antikörper, wenn letzterer als lyophilisiertes Produkt eingesetzt wird, eine Waschflüssigkeit zum Waschen der festen Phase nach der Reaktion des 45 unlöslich gemachten Antikörpers und des zu bestimmenden Antigens und nach der weiteren Reaktion mit dem markierten Antikörper, ein Substrat für die Bestimmung der enzy-matischen Aktivität des Markierungsmittels (sofern dieses ein Enzym ist) und ein Mittel zur Beendigung der enzymati-50 sehen Reaktion enthalten.

Beispiele für die Erfindung werden nachfolgend gegeben.

Beispiel 1

Ein Reagenz für die Bestimmung von AFP 55 a) Herstellung von gereinigtem AFP

16,2 g rohes AFP-Extrakt wurden aus 51 der Ascites von Hepatoma-Patienten durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat erhalten (die Fraktion mit einem Sättigungsgrad zwischen 45 und 70% wurde gesammelt). Der rohe Extrakt wurde durch 60 Affinitätschromatographie unter Verwendung von 50 ml Se-pharose 4 B, an das Kaninchen anti-AFP Antikörper gebunden war (1 mg/ml Sepharose), gereinigt, wobei 924 mg gereinigtes AFP erhalten wurden.

65 b) Herstellung von monoklonalem anti-AFP Antikörper Eine weibliche BALB/C Maus wurde durch subkutane Injektion von 50 \ig des gemäss a) erhaltenen gereinigten AFP zusammen mit komplettem Freund Adjuvans immuni-

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siert. Die Immunisierung wurde 4-mal, in Abständen von einer Woche, wiederholt. Die Milz wurde am 4. Tag nach der letzten Immunisierung entfernt und die Milzzellen wurden gesammelt. Die Milzzellen wurden mit Dulbecco's modifiziertem MEM Kulturmedium gewaschen (im folgenden als D-MEM abgekürzt). 1 x 108 dieser Zellen wurden gezählt und mit 1 x 107 Myelomazellen der Maus (P3-NSI/l-Ag4.1) gemischt. Sie wurden während einer Minute bei 37 °C in 1 ml D-MEM, enthaltend 42,5% Polyäthylenglycol Nr. 1540 und 7,5% Dimethylsulfoxid, der Zellfusion unterworfen. Zu den derart der Zellfusion unterworfenen Zellen wurden 20 ml HAT Medium (RPMI-1640 Medium enthaltend Hypoxan-thin, Aminopterin, Thymidin und 10% fetales Rinderserum) gegeben. Nachem Aliquoten von 0,2 ml des Zellgemisches in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen gegeben und während zwei Wochen bebrütet wurden, wurden die Antikörpertiter der überstehenden Flüssigkeiten in den Vertiefungen bestimmt.

Dann wurden die Zellen aus jenen Vertiefungen, in denen Antikörper beobachtet wurden, jeweils zu 40 ml RPMI-1640 Medium, enthaltend 10% fetales Rinderserum und Thymo-cyte von BALB/C Mäusen, gegeben. Aliquote Teile der erhaltenen Zellsuspension wurden in zwei Mikroplatten mit 96 Vertiefungen gegeben und während einer Woche bebrütet, wobei 9 Klone von anti-AFP Antikörper-produzierenden Hybridoma erhalten wurden. Sie wurden in Grossmassstab-kulturen übergeführt und je 10 lder entstandenen überstehenden Flüssigkeit wurden unter Verwendung von 50 ml Se-pharose 4B, welches mit gereinigtem AFP (0,5 mg AFP/ml Sepharose) fixiert wurde, der Affinitätschromatographie unterworfen. Es wurden 4,2 bis 11,6 mg monoklonale Antikörper die mit den Probenummern 1 bis 9 versehen wurden, erhalten.

iii) Identifikation der Antigen erkennenden Stellen

Zu jedem der anti-AFP Antikörper sensibilisierten Reagenzgläser, welche gemäss i) erhalten wurden, wurden 1,5 ml PBS, 0,1 ml der unter a) erhaltenen Standardlösung von 5 AFP, welche mit PBS auf 100 ng/ml verdünnt wurde, und 0,4 ml HRPO-markierte anti-AFP Antikörper, welche gemäss ii) erhalten und 100-fach verdünnt wurden, gegeben und das Gemisch wurde während 30 Minuten umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reagenzglas mit Waschflüs-10 sigkeit gewaschen und 3 ml Substratlösung, enthaltend 100 mg/dl o-Phenylendiamin und 0,01% Wasserstoffperoxid wurden zugegeben. Die Enzymreaktion wurde während 30 Minuten ausgeführt und dann wurden 0,05 ml 4M Schwefelsäure zugegeben, um die Enzymreaktion zu beenden. Die 15 Extinktion des Reaktionsgemisches bei 450 nm wurde gemessen. In Tabelle 3 werden jene Kombinationen, welche positive Reaktionen verursacht haben, mit 4- und jene, die keine Reaktion verursacht haben, mit — bezeichnet.

20

Tabelle 3

Mit HRPO-markierter Antikörper 1 2 3 4 5 6 7

25

■s cd

1

2

3

- - + - - + - - +

+ + +

+ + + + + +

0) bû

rC

30 .y

& 4 + + + - + + +'--

m 5 — — — + - + — + +

n'6 + + + + -l- — + + +

< 7 — — — + — + — + +

8 + + + — + + + — —

9 + + + - + + + — —

c) Identifikation von Antigen erkennenden Stellen i) Herstellung von mit anti-AFP Antikörper sensibilisierten

Reagenzgläsern

Eine physiologische Salzlösung, die mit 0,05M Phosphat (pH 6,4; nachfolgend als PBS abgekürzt) gepuffert war und jeweils 0,2 mg der monoklonalen anti-AFP Antikörper der Probenummern 1 bis 9 enthielt, wurden in einer Menge von 2 ml in ein mit PBS gewaschenes Reagenzglas gegeben. Die Reagenzgläser wurden während 20 Minuten bei 56 °C bebrütet und mit PBS gewaschen, wodurch die sensibilisierten Reagenzgläser erhalten wurden.

ii) Herstellung von mit Enzym markierten anti-AFP Antikörpern

5 mg Merrettichperoxidase (Grad 1 von Boehringer Mannheim GmbH; nachfolgend als HRPO abgekürzt) wurden in 1,0 ml von 0,3M Natriumbicarbonatpuffer gelöst und zur erhaltenen Lösung wurden 0,1 ml 1 %-ige Äthanollösung von l-Fluor-2,4-dinitrobenzol gegeben und das Gemisch wurde während 1 Stunde umgesetzt.

Nachfolgend wurden 1,0 ml 0,06M Natriumpeijodatlö-sung zum Gemisch gegeben und während 30 Minuten umgesetzt. Dann wurden 1,0 ml 0,16M Äthylenglycollosung zugegeben und die Umsetzung während 1 Stunde weitergeführt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen 0,0IM Natriumcarbo-natlösung beim pH-Wert 9,5 dialysiert. Je 5 mg der neuen Proben von gemäss b) hergestellten anti-AFP Antikörpern wurden zur erhaltenen Lösung gegeben und das Gemisch wurde während 3 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Dann wurden 5 mg Natriumborhydrid zugegeben und die Reaktion über Nacht ausgeführt. Die Reaktionsgemische wurden jeweils gegen 0,01M PBS bei einem pH-Wert von 7,2 dialysiert, wobei HRPO-markierte anti-AFP Antikörper erhalten wurden.

35 Gemäss den Unterschieden in den Antigen erkennenden - Stellen, können die neuen Proben von monoklonalen anti-AFP Antikörpern, die gemäss b) erhalten wurden, in drei Gruppen unterteilt werden, nämlich die erste Gruppe, bestehend aus den Proben 1,2, 3, 5 und 7, die zweite Gruppe, be-4o stehend aus Probe 6 und die dritte Gruppe, bestehend aus den Proben 4, 8 und 9. Diese Gruppen von Antikörpern werden jeweils als anti-AFP Antikörper (A), (B) und (C) bezeichnet.

45 d) Herstellung eines Reagenzes für die Bestimmung von

AFP

Mit anti-AFP Antikörper sensibilisierte Reagenzgläser wurden nach den Methoden c)—i), wie oben beschrieben, unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers (A) her-50 gestellt.

Der monoklonale Antikörper (C) wurde mit HRPO gemäss den oben beschriebenen Methoden c) bis ii) markiert und mit PBS 1:10 verdünnt. 2 ml des verdünnten markierten Antikörpers wurden in das sensibilisierte Reagenzglas gege-55 ben. Nachdem der Inhalt des Reagenzglases lyophilisiert wurde, wurde es dicht verschlossen und ergab ein Reagens zur Bestimmung von AFP.

e) Bestimmung von AFP 60 1,8 ml PBS wurden in das gemäss d) mit anti-AFP Antikörper sensibilisierte Reagenzglas gegeben. Dann wurden 0,1 ml der gemäss a) hergestellten Standardlösung von AFP auf Konzentrationen von 1000,100,10,1 undO ng/mmit dem Serum einer gesunden Person verdünnt zugegeben, ge-65 folgt von einer weiteren Zugabe von 0,1 ml einer Lösung des mit HRPO-markierten anti-AFP Antikörpers, der gemäss d) hergestellt wurde, in 2 ml destilliertem Wasser. Die Umsetzung wurde während 20 Minuten ausgeführt. Nach der Um-

Setzung wurde das Reagenzglas mit einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 0,005% Tween 20 (wird weiter unten als Waschmittel bezeichnet) gewaschen. Dann wurden 3 ml Enzymsubstratlösung, enthaltend 5 mg/ml o-Phenylen-diamin und 0,01 % Wasserstoffperoxid zugegeben und während 10 Minuten umgesetzt. Zur Beendigung der Enzymreaktion wurden 0,05 ml 4N Schwefelsäure zum Reaktionsgemisch gegeben. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 450 nm mit einem Photometer gemessen. Die resultierende Eichkurve wird in Fig. 6 gezeigt.

Beispiel 2

Reagenz für die Bestimmung von CEA

a) Herstellung von gereinigtem CEA

40 g Krebsgewebe des Dickdarms wurden nach Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser in einem Homogenisator homogenisiert. Die gleiche Menge von 1,2M Perchlorsäure wurde zum Homogenisat gegeben und während 30 Minuten unter Rühren extrahiert. Die nach dem Zentrifugieren überstehende Flüssigkeit wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, wodurch der rohe CEA Extrakt erhalten wurde.

Der rohe Extrakt wurde auf 10 ml konzentriert und auf Sepharose 4B, das mit physiologischer Salzlösung eingestellt wurde, der Gelfiltration unterworfen und die erste Fraktion wurde gesammelt. Diese wurde der Gelfiltration auf Sepha-dex G-200, welche in der gleichen Weise eingestellt war, unterworfen und die zweite Fraktion wurde gesammelt. Sie wurde auf 2 ml konzentriert, indem 135 (ig gereinigtes CEA erhalten wurden.

b) Herstellung von monoklonalen anti-CEA Antikörpern

8 Klone von anti-CEA Antikörper produzierenden Hybridoma wurden unter Verwendung des unter a) erhaltenen gereinigten CEA nach einer ähnlichen Methode wie in Beispiel lb beschrieben, erhalten.

Mäuse wurden unter Verwendung 30 jxg gereinigtem CEA pro Immunisation immunisiert. Einer weiblichen BALB/C Maus, der intraperitonal 0,5 ml Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan von Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) verabreicht wurden, wurden 1 x 106 Hybridoma intraperitonal inokuliert. Zwei Wochen später wurde der Ascites gesammelt. Der Ascites wurde auf DEAE-Cellulose, die mit 0,0 IM Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurdé, chromatographiert und eine nichtabsorbierte Fraktion wurde als ein monoklonaler anti-CEA Antikörper erhalten.

Durch einen im wesentlichen mit Beispiel lc übereinstimmenden Test zur Identifizierung der Antigen erkennenden Stellen konnten die erhaltenen Antikörper in drei Gruppen, d.h. 5 Proben, 2 Proben und einer Probe, welche als anti-CEA Antikörper (A), (B) und (C) bezeichnet wurden, unterteilt werden.

c) Herstellung von mit anti-CEA Antikörper sensibilisierten Reagenzgläsern

Polystyrolreagenzgläser wurden mit PBS gewaschen und 2 ml des anti-CEA Antikörpers (A) (lmg/ml), welcher gemäss b) hergestellt wurde, wurden in das Reagenzglas gegeben und während 20 Minuten bei 56 °C umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reagenzglas mit PBS gewaschen, wodurch ein mit anti-CEA Antikörper (A) sensibilisiertes Reagenzglas erhalten wurde.

d) Herstellung eines Reagenzes für die Bestimmung von

CEA

Mit HRPO-markierter anti-CEA Antikörper (B) wurde unter Verwendung von anti-CEA Antikörper (B), der gemäss b) erhalten wurde, in Übereinstimmung mit Beispiel lc

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ii) erhalten. Der markierte Antikörper wurde mit physiologischer Kochsalzlösung 1:50 verdünnt und 0,2 ml der verdünnten Antikörperlösung wurde je in ein mit anti-CEA Antikörper (A) gemäss c) sensibilisiertes Reagenzglas gegeben 5 und zur Bildung des Reagenzes für die Bestimmung von CEA lyophilisiert.

e) Bestimmung von CEA

Das gemäss a) hergestellte gereinigte CEA wurde mit io dem Serum einer gesunden Person auf Konzentrationen von 100, 30,10, 3 und 1 ng/ml verdünnt. Je 0,2 ml des verdünnten CEA und 0,8 ml destilliertes Wasser wurden gleichzeitig zum Reagenz für die CEA-Bestimmung, das gemäss d) hergestellt wurde, gegeben und während 20 Minuten unter Rüh-15 ren umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reagenzglas mit Waschmittel gewaschen, danach wurden 3 ml einer Substratlösung, enthalten 300 mg/dl Phloretinsäure und 0,01% Wasserstoffperoxid zugegeben. Die Reaktion wurde während 10 Minuten ausgeführt und danach wurden 0,1 ml 5%-20 iges Natriumsulfit zur Beendigung der Reaktion zugegeben. Nachfolgendwurde die Fluoreszenzintensität bei der Anregungswellenlänge von 323 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 420 nm mit einem Fluorphotometer gemessen. Die resultierende Eichkurve wird in Fig. 7 gezeigt.

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Beispiel 3

Reagenz für die Bestimmung von HCG-ß

a) Herstellung der HCG-ß Untereinheit

I g HCG (2000 iu/mg) wurden in 2 ml eines 0,025M

30 Phosphatpuffers (pH 5,6) gelöst und die Lösung wurde chromatographisch auf DEAE-Sephadex A-50 (3 g), das vorgängig mit dem gleichen Puffer eingestellt wurde, fraktioniert. Eine mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 5,6) eluierte Fraktion wurde gesammelt und gegen destilliertes Wasser dialysiert, 35 wobei eine Lösung, enthaltend 308 mg gereinigtes HCG, erhalten wurde, das dann lyophilisiert wurde. 300 mg des lyophilisierten HCG wurden in 10 ml einer 10M (pH 4,5) Harnstofflösung gelöst und während 1 Stunde bei 40 °C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Chromatographie 40 auf DEAE-Sephadex A-50 (2 g), das vorgängig mit einer Lösung, enthaltend 0,03M Glycin und 10M Harnstoff, eingestellt wurde, fraktioniert. Eine Fraktion, die mit einer Lösung, enthaltend 0,2M Glycin, IM NaCl und 8M Harnstoff, eluiert wurde, wurde gegen physiologische Kochsalzlösung 45 dialysiert und ergab 147 mg HCG-ß Untereinheit.

b) Herstellung von anti-HCG-ß Antikörper

II Proben von anti HCG-ß Antikörper wurden nach dem Verfahren von Beispiel 2b) hergestellt, mit dem Unter-

50 schied, dass anstelle von BALB/C Mäusen Ratten vom Wi-star-Stamm das Antigen veabreicht wurde. Die Antigen erkennenden Stellen dieser Antikörper wurden im wesentlichen in Übereinstimmung mit der Methode von Beispiel lc) identifiziert. Die erhaltenen Antikörper wurden in zwei 55 Gruppen unterteilt, nämlich eine Gruppe von 8 Proben von anti-HCG-ß Antikörpern (A) und eine andere Gruppe, bestehend aus 3 Proben von anti-HCG-ß Antikörpern (B).

c) Herstellung von mit anti-HCG-ß Antikörpern sensibili-60 sierten Perlen (unlösliche Träger)

100 Polyäthylenperlen wurden zu 100 ml PBS, enthaltend 50 mg des gemäss b) hergestellten anti-HCG-ß Antikörpers (A) gegeben und während 20 Minuten bei 56 °C umgesetzt. Die Polyäthylenperlen wurden, um anti-HCG-ß Anti-65 körper (A) sensibilisierte Perlen zu erhalten, gewaschen.

d) Herstellung von enzymmarkierten anti-HCG-ß Antikörpern

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Das Verfahren von Beispiel lc—ii) wurde unter Verwendung von anti-HCG-ß Antikörpern (B), die gemäss b) erhalten wurden, wiederholt. Nach dem Verdünnen auf das 200-fache des Volumens mit PBS wurden HRPO-markierte anti-HCG-ß Antikörper (B) erhalten.

e) Herstellung des Waschmittels

9 g NaCl und 50 (il Tween 20 wurden genau abgewogen und in entionisiertem Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt. Die Lösung wurde in eine Glasflasche abgefüllt und mit einem Zapfen verschlossen. Auf diese Art wurde ein Waschmittel hergestellt.

f) Herstellung des Enzymsubstrates

26,40 g 5-Aminosalicylsäure, 54,34 g Monokaliumphos-phat und 5,72 g Dinatriumphosphat wurden vermischt und in einem Mörser pulverisiert. 550 mg des Gemisches wurden genau abgewogen und in ein Glasfläschchen gegeben. 1,5 ml 30%iges Wasserstoffperoxid wurden mit entionisiertem Wasser auf 100 ml verdünnt. 1 ml dieser Lösung wurde in eine Ampulle gegeben, die dann zugeschmolzen wurde. Das Enzymsubstrat wurde auf diese Weise erhalten.

g) Herstellung eines Mittels zur Beendigung der Enzymreaktion

2 g Natriumazid wurden genau gewogen und in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. 2 ml der Lösung wurden in eine Ampulle gefüllt, die dann zugeschmolzen wurde und das Mittel zur Beendigung der Enzymreaktion ergab.

h) Herstellung eines Reagenzes zur Bestimmung von HCG Ein Reagenz zur Bestimmung von HCG wurde durch

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Kombination der gemäss c) bis g) hergestellten Materialien auf die nachfolgende Weise hergestellt.

1. Mit anti-CHG-ß Antikörper (A) sensibilisierte Perlen

2. HRPO-markierter anti-HCG-ß Antikörper (B) 5 3. Waschmittel (10-fach konzentrierte Lösung)

4. Enzymsubstrat (5-Aminosalicylsäurehydogenperoxid)

5. Mittel zur Beendigung der Enzymreaktion i) Bestimmung von HCG io Die nachfolgende Analyse wurde unter Verwendung des Reagenzes für die HCG-Analyse, hergestellt nach h), eingesetzt. 0,4 ml des HRPO-markierten anti-HCG-ß Antikörpers (B) wurden in ein Reagenzglas gegeben und eine mit anti-HCG-ß Antikörper (A) sensibilisierte Perle wurde zugege-15 ben. Dann wurden 0,1 ml einer Standardlösung, die durch Verdünnen von HCG nach dem in der Japanese Pharmaco-poeia beschriebenen Verfahren, mit dem Serum einer gesunden Person auf eine Konzentration von 10 000,1000,100,10 und 1 miu/ml erhalten wurde, zugegeben und während 15 20 Minuten umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das

Waschmittel mit destilliertem Wasser auf das 10-fache seines Volumens verdünnt und die Perle wurde mit dem verdünnten Waschmittel gewaschen. Darauf wurden 3 ml der Substratlösung, die durch Auflösen des ganzen Enzymsubstrates 25 in 100 ml destilliertem Wasser erhalten wurde, zugegeben und die Umsetzung wurde während 30 Minuten ausgeführt. Dann wurden 0,025 ml des Mittels zur Beendigung der Reaktion zugegeben und die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 500 nm gemessen. Die erhaltene Eichkurve 30 wird in Fig. 8 gezeigt.

B

4 Blatt Zeichnungen

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE

1. Reagenz für auf dem Sandwichverfahren beruhende immunologische Analyse von Antigenen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen unlöslich gemachten monoklonalen Antikörper und einen markierten monoklonalen Antikörper enthält, welche beide verschiedene antigene Determinante eines zu bestimmenden Antigens unterscheiden und sich mit verschiedenen antigenen Determinanten eines zu bestimmenden Antigens verbinden können.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Perlen oder ein Gefass aus Kunststoff oder Glas als Träger für den unlöslich gemachten Antikörper aufweist.
3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der markierte Antikörper mit einem Enzym markiert ist.
4. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der markierte Antikörper mit einer fluoreszierenden Substanz markiert ist.
5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es den markierten Antikörper und den -unlöslich gemachten Antikörper in einem Gefass enthält.
6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es den markierten Antikörper in einem Kunststoff- oder Glasgefäss, das gleichzeitig Träger für den unlöslich gemachten Antikörper ist, enthält.
7. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es einen lyophilisierten markierten Antikörper enthält.
8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ein bis vier Hilfsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Lösungsvermittler, Waschmittel, Substrat und Mittel zur Beendigung der Reaktion, enthält.
9. Sandwichverfahren zur immunologischen Analyse von Antigenen mittels eines Reagenzes gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zu bestimmendes Antigen gleichzeitig mit unlöslich gemachtem Antikörper und markiertem Antikörper umsetzt.

Die Fortschritte in der Immunchemie haben in den letzten Jahren zu ausgedehnten Untersuchungen von Antikörpern geführt, über die in der Vergangenheit nur wenig bekannt war, und der Kontrollmechanismus für die Antikörperproduktion sowie der biochemischen Strukturen und Eigenschaften der Antikörper wurden in Einzelheiten untersucht.

Im Jahre 1975 gelang es C. Milstein et al. durch Zellfusion von Myelomazellen der Maus mit Antikörper produzierenden Zellen aus der Milz, einen monoklonalen Antikörper zu bilden. Es wird erwartet, dass der monoklonale Antikörper stark zur Entwicklung der Grundlagenforschung in der Immunologie beiträgt und Untersuchungen in diesem Feld wurden bereits aktiv unternommen.

Die Enzymimmunanalyse (EIA) wurde bereits als hochsensibles und quantitatives immunologisches Analyseverfahren angewendet. Insbesondere wird das auf dieser Analyse basierende Sandwichverfahren wegen seiner Einfachheit und hoher Empfindlichkeit oft angewendet. Da jedoch das Sandwichverfahren 1 bis 4 Tage für die Reaktion erfordert, ist es erwünscht, die erforderliche Reaktionszeit zu minimalisie-ren. Wegen des in der letzten Zeit erreichten Fortschrittes in der klinischen Medizin, wird ausserdem die schnelle Auswer-5 tung der Testresultate gefordert, um eine sofortige Behandlung des Patienten zu ermöglichen. Auch von diesem Standpunkt wird ernsthaft die Verkürzung der Reaktionszeit gewünscht. Die Verkürzung der Reaktionszeit resultiert jedoch beim bekannten Sandwichverfahren in einer Verminderung io der Empfindlichkeit und der Genauigkeit der Analyse, wie weiter unten gezeigt wird, so dass keine wesentliche Verkürzung der Reaktionszeit erreicht werden kann.

Nachfolgend wird das konventionelle Sandwichverfahren im einzelnen beschrieben. Obwohl das Verfahren ein-15 fachheitshalber in der ganzen Beschreibung in bezug auf EIA beschrieben wird, kann die Erklärung auch auf das auf FIA (Fluorimmunanalyse) basierende Verfahren angewendet werden.

Das konventionelle Sandwichverfahren wird, wie in der 20 schematischen Darstellung in Fig. 1 gezeigt wird, in der folgenden Reihenfolge ausgeführt.

i) Ein unlöslich gemachter Antikörper 2', der durch Binden des Antikörpers für ein zu bestimmendes Antigen 3 an einen unlöslichen Träger (feste Phase) 4 erhalten wurde,wird

25 mit dem Antigen 3 umgesetzt, wobei das Antigen 3 mit dem Antikörper 2' auf der festens Phase verbunden wird (Erstreaktion).

ii) Um nicht umgesetzte Substanzen zu entfernen, wird die feste Phase 4 gewaschen.

30 iii) Öie gewaschene feste Phase 4 wird mit dem markierten Antikörper Y umgesetzt, wobei der markierte Antikörper Y mit der nicht umgesetzten Antigenstelle auf dem Antigen 3, das an die feste Phase gebunden war, gebunden wird (zweite Reaktion).

35 Der markierte Antikörper wird durch Bindung eines Enzyms 5 an einen Antikörper für das zu untersuchende Antigen 3 erhalten.

iv) Um den Unterschuss an markiertem Antikörper 1' zu entfernen, wird die feste Phase gewaschen und ein Substrat 40 für das Enzym wird zugegeben und der Enzymreaktion unterworfen.

Da das Antigen 3 und der markierte Antikörper Y an die feste Phase 4 gebunden wurden, findet die Enzymreaktion proportional zu der Menge des vorhandenen Enzyms statt. 45 Die Menge des zu analysierenden Antigens 3 wird aus der Menge des erhaltenen Reaktionsproduktes bestimmt.

Da das Sandwichverfahren im allgemeinen als nicht-kompetitive Analyse betrachtet wird, kann angenommen werden, dass dabei keine konkurrenzierende Reaktion statt-50 findet. Diese Betrachtung drückt jedoch nicht unbedingt die genauen Reaktionszustände aus. Somit kann bei der Durchführung des Sandwichverfahrens eigentlich ein Gleichgewichtszustand vorliegen, der nachfolgend schematisch dargestellt wird.

55 Erste Reaktion a

lAk Q + CA*P^~T~ C lAk I ~ AgD a"

-Ag-Ak*}

(Œ3 -Ag) +(am3

Zweite Reaktion fi a* 11 + (Ag-Ak*)

HEED +l>gj +(Ak*)

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In der obigen Darstellung steht 1 Ak 1 für den unlöslich gemachten Antikörper; Ag für das zu bestimmende Antigen; Ak* für den markierten Antikörper; a, a', b, b', c, c', d, d', e und e' für Gleichgewichtskonstanten und — bedeutet, dass das Antigen und der Antikörper miteinander verbunden sind.

Wenn der Komplex des unlöslich gemachten Antikörpers und des zu bestimmenden Antigens in der zweiten Reaktion mit dem markierten Antikörper umgesetzt wird, verbinden sich der unlöslich gemachte Antikörper und der markierte Antikörper konkurrenzierend mit dem zu bestimmenden Antigen entsprechend ihrer Affinität für das Antigen. Da die Eigenschaften des unlöslich gemachten Antikörpers und des markierten Antikörpers annähernd die gleichen sind, werden ihre Affinitäten zum zu bestimmenden Antigen als annähernd äquivalent betrachtet. Infolge der konkurrenzierenden Reaktion dissoziiert der in der ersten Reaktion gebildete unlöslich gemachte Antikörper-Antigenkomplex und Komplexe verschiedener Kombinationen werden, wie oben gezeigt, gebildet.

Der Beweis wird durch den nachfolgenden Versuch erbracht.

Ein an ein Kunststoffreagenzglas gebundener Anti-HCG-ß-Untereinheitantikörper wird mit, mit Peroxidase markiertem, HCG-ß umgesetzt und dann gewaschen. Das enzymmarkierte HCG-ß, das an die feste Phase gebunden war, dissoziiert bei der Reaktion mit einem Anti-HCG-ß-Antikörper schrittweise von der festen Phase und gelangt in die flüssige Phase. Fig. 2 zeigt diesen Vorgang.

Wenn jedoch die Reaktionszeit für die erste Reaktion genügend lang ist, wird die Bindung zwischen Antigen und Antikörper zum Teil irreversibel und der Antigen-Antikörperkomplex dissoziiert nicht mehr leicht, nicht einmal, wenn der markierte Antikörper zugegeben wird. Andererseits wird behauptet, dass, wenn die Reaktionszeit der zweiten Reaktion genügend lang ist, die Reaktion in Richtung der Bildung eines Komplexes des (unlöslich gemachten Antikörpers, des zu bestimmenden Antigens und des markierten Antikörpers» verläuft. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Reaktion nach dem konventionellen Sandwichverfahren während einer genügend langen Zeit durchzuführen. Wenn deshalb das Sandwichverfahren ohne erste Reaktion ausgeführt wird oder wenn die Reaktionszeit der ersten Reaktion ausserordentlich verkürzt wird; beispielsweise, wenn der unlöslich gemachte Antikörper und der markierte Antikörper mit dem zu bestimmenden Antigen gleichzeitig umgesetzt werden; muss die zweite Reaktion verlängert werden und trotzdem werden die Empfindlichkeit und die Genauigkeit der Analyse vermindert. Wenn die Reaktionszeit der zweiten Reaktion verkürzt wird, werden die Empfindlichkeit und die Genauigkeit noch mehr vermindert. Aus diesen Gründen war es unmöglich, beim konventionellen Verfahren die Reaktionszeit ohne Verminderung der Empfindlichkeit und der Genauigkeit zu kürzen. In diesem Zusammenhang beschrieben Ichi-hara et al. The Japanese Journal of Clinical Pathology, 26, 1027 (1978), dass eine solche konkurrenzierende Reaktion existiert und nur wenn die Reaktion während einer genügend langen Zeit ausgeführt wird, sie teilweise irreversibel ist.

Deshalb ist das Reaktionssystem des konventionellen Verfahrens kompliziert, ineffizient und erfordert eine lange Reaktionszeit.