CH662821A5 - Vecteur plasmide ayant un gene synthetique codant pour l(aspartyl-phenylalanine)n. - Google Patents

Vecteur plasmide ayant un gene synthetique codant pour l(aspartyl-phenylalanine)n. Download PDF

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CH662821A5
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phenylalanine
plasmid vector
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CH585/81A
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Norman Henry Carey
John Spencer Emtage
Michael Terence Doel
Michael Anthony William Eaton
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Description

La présente invention concerne un vecteur plasmide permettant la prépartion du polypeptide récurrent (aspartyl-phénylalanine)n par la mise en œuvre de techniques à ADN de recombinant en utilisant un codage à gène synthétique pour le polymère récurrent.
La synthèse de peptides par des moyens chimiques est un procédé laborieux qui devient progressivement moins eficace avec l'accroissement de la longueur du peptide. D'autre part, la préparation de peptides par des micro-organismes au cours d'un procédé de fermentation ne varie pas d'efficacité en fonction de la longueur du peptide produit. Cependant, dans les organismes utilisés lors de la mise en œuvre de procédés à ADN de recombinant, les peptides courts sont métaboliquement instables. Par exemple, il est connu que le peptide appelé somatostatine, qui se compose de 14 aminoaci-des, n'est pas stable lorsqu'il est directement produit dans E. coli. On parvient à la stabilité dans ce cas en liant le peptide à une protéine d'E. coli normale et en scindant ensuite ce produit de fusion [Itakura K. et coll., Science, 198,1056-1063 (1977)].
Dans le procédé conforme à la présente invention, on parvient à la stabilité et à un rendement accru par l'utilisation d'un gène synthétique contenant de multiples répétitions de la séquence codant pour le peptide aspartyl-phénylalanine. Le produit est, par conséquent, une grosse molécule qui est métaboliquement plus stable dans E. coli que le peptide. La scission subséquente de la grosse molécule engendre le peptide plus petit qu'il contient et avec un rendement molaire supérieur à celui que l'on obtiendrait si le peptide avait été directement préparé en utilisant un gène monomère, même si le peptide était métaboliquement stable.
La présente invention concerne donc un vecteur plasmide tel que défini dans la revendication 1.
Le brin complémentaire ou non codant du vecteur plasmide contient une séquence spécifiée par la séquence du brin codeur, conformément aux règles acceptées de l'appariement de bases d'acides nucléiques.
La présente invention concerne également un procédé de production du vecteur plasmide, dans lequel on a inséré, au site d'insertion du plasmide, un gène synthétique qui code pour l'(aspartyl-phényl-alanine)„, de manière que le gène soit sous contrôle d'un promoteur bactérien.
La présente invention concerne encore une cellule qui a été transformée par le fait que l'on y a inséré un vecteur plasmide tel que décrit ci-dessus.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation de la cellule transformée pour l'expression de r(aspartyl-phénylalanine)„.
D'une façon générale, les brins du gène synthétique se préparent à partir d'une série d'oligonucléotides courts que l'on prépare eux-mêmes en unissant mutuellement les nucléotides voulus par mise en œuvre de procédés connus, dans un ordre spécifié, par les codons des aminoacides du peptide souhaité et en suivant les règles décrites avec de plus amples détails ci-dessous.
Les oligonucléotides du brin codeur et du brin complémentaire du gène forment un jeu chevauchant correspondant à la structure générale suivante:
5 a » I b ' c a ' e . i . y i i i 1 . J
; , ! ! 1
1 i i i 1 \
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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La structure montrée dans cette illustration se compose de six oligonucléotides, trois dans chaque brin. Cependant, la structure peut être assemblée à partir de n'importe quel nombre de paires d'oligonucléotides à partir d'une paire vers le haut, à condition que:
(1) les régions appariées désignées a1 et a2, b1 et b2, c1 et c2,..., contiennent des séquences de bases de nucléotides qui sont complémentaires dans la paire, mais non des séquences de n'importe quelle autre paire,
(2) chacune de ces régions a1, a2, b1 b2, c1, c2,..., contienne au moins quatre bases de nucléotides, et
(3) la somme des bases de nucléotides dans chaque brin qui, à l'état assemblé, comprend éventuellement la longueur récurrente du polymère, soit divisible par trois.
Lorsque l'on mélange un jeu d'oligonucléotides de ce caractère, les régions complémentaires des paires d'oligonucléotides s'hybri-dent de manière à engendrer des structures de poids moléculaire élevé dans lesquelles les séquences des oligonucléotides (a^f1 dans l'illustration susmentionnée) se répètent en tandem, de quelques fois à de nombreuses fois, dans des molécules différentes. Dans le procédé subséquent, il est souhaitable de maximiser le nombre de polymères qui possèdent, dans la séquence, a1 à leurs extrémités 5'. Cela s'obtient en mélangeant les oligonucléotides a1 b1, c1 d1, e1 f1, b2 c2 et d2 e2 de l'illustration ci-dessus en quantités équimolaires et en ajoutant subséquemment l'oligomicléotide f2 a2 en une quantité inférieure à la quantité équimolaire. Etant donné que les compléments de a1 et f1 sont présents en quantités submolaires, la plupart des polymères se terminent en a1 et f1. Dans le cas général, l'oligo-nucléotide terminal 5' du jeu complémentaire s'ajoute au mélange de polymérisation en une quantité qui est inférieure à la proportion équimolaire par rapport aux autres oligonucléotides qui sont tous présents en quantités équimolaires.
Les «coupures» dans les chaînes, où des oligonucléotides adjacents dans la chaîne se juxtaposent, peuvent être unies par l'emploi de l'enzyme qu'est l'ADN ligase (EC 6.5.1.1), qui constitue un procédé connu.
Les molécules ainsi préparées comporteront des extrémités monocaténaires. Celles-ci peuvent être transformées en la forme appelée «extrémité émoussée» par l'utilisation de l'enzyme qu'est l'ADN-polymérase I (EC 2.7.7.7), par mise en œuvre d'un procédé connu.
Les molécules ainsi obtenues peuvent être clonées en cellules microbiennes compétentes, en particulier E. coli, en utilisant un vecteur souhaité. Plus spécialement, on peut utiliser un vecteur plasmide choisi dans la série appelée «pWT» (voir, par exemple, Tacon et coll., Molec. Gen. Genet., 177, All, 1980), le choix du vecteur étant réalisé de telle manière que le gène synthétique, lorsqu'il est inséré dans l'orientation correcte, soit lu dans le cadre de lecture de traduction voulu.
La figure 1 des dessins annexés illustre un schéma de production d'un plasmide de recombinant (pWT 121 (asp-phe)n) qui contient le gène récurrent pour (asp-phe)„ dans le phasage d'ADN correct pour l'expression d'une protéine à (asp-phe)n. L'ADN du plasmide, représenté au sommet du schéma, est coupé avec l'enzyme de restriction Hind III et est ensuite réapparié avec l'ADN-polymérase I d'E. coli pour engendrer une molécule à extrémité émoussée. Le codage de polymère pour (asp-phe)„, montré à la partie inférieure du schéma, comporte son extrémité 5' initialement saillante réappariée de manière similaire, de façon à engendrer une autre molécule à extrémité émoussée. L'union de ces deux espèces d'extrémités émoussées avec la T4 ADN ligase engendre l'ADN de recombinant, montré au centre du schéma, comportant le phasage d'ADN correct pour l'expression de (asp-phe)„.
Le clonage de ce gène, le choix des colonies bactériennes, la détection du polypeptide produit de l'expression du gène et l'extraction et la purification du polypeptide peuvent tous se réaliser par mise en œuvre de procédés connus.
Ce polypeptide peut ensuite être clivé soit de manière enzymati-que en utilisant des enzymes spécifiques, soit par voie chimique, par exemple par l'emploi de bromure de cyanogène de façon à scinder ou cliver les chaînes polypeptidiques à des résidus de méthionine.
Ainsi que les spécialistes de la technique le comprendront parfaitement bien, la présente invention trouve de nombreuses applica-5 tions, entre autres, pour la préparation de l'édulcorant appelé As-partame ou de la phénylalanine directement.
L'Aspartame est un édulcorant artificiel à faible teneur en calories que l'on peut décrire chimiquement comme étant l'ester méthyli-que de l'aspartyl-phénylalanine. L'Aspartame est couramment io produit par une synthèse chimique à étapes multiples.
En raison de son emploi comme édulcorant, la consommation totale d'Aspartame est potentiellement très importante et il existe par conséquent un intérêt considérable à la mise au point de préparations par l'intermédiaire desquelles on puisse commodément 15 obtenir cette matière à grande échelle.
On a trouvé que l'on pouvait préparer l'Aspartame par la mise en œuvre d'un procédé à échelle potentiellement importante, fondé sur des techniques à ADN de recombinant, conformément auxquelles on insère un codage ou code de gène synthétique pour l'(aspartyl-2o phénylalanine),, dans un vecteur de clonage possédant un promoteur bactérien maîtrisable en amont du et sensiblement adjacent au site d'insertion, et on peut utiliser le vecteur pour transformer des cellules bactériennes à partir desquelles le polypeptide exprimé peut être obtenu, polypeptide que l'on peut ensuite scinder de façon à obtenir 25 l'aspartyl-phénylalanine et, par conséquent, l'Aspartame.
Le gène synthétique pour l'expression du polypeptide récurrent (aspartyl-phénylalanine)„ comprend une molécule d'ADN à double brin ou bicaténaire comportant, dans le brin codeur, au moins deux trimères de nucléotides codant pour l'expression de l'acide asparti-30 que (Asp) et, en alternance avec ceux-ci, au moins deux trimères de nucléotides codant pour l'expression de la phénylalanine (Phe) et, dans l'autre brin, des séquences nucléotidiques récurrentes et alternantes, complémentaires des séquences codant (Phe) et (Asp).
Le brin codeur du gène synthétique, c'est-à-dire celui qui code 35 pour le polypeptide récurrent (Asp-Phe)„- peut par conséquent être représenté comme codant:
5'-(Asp-Phe-Asp-Phe)„-3'
où n représente un nombre entier, par exemple allant jusqu'à plu-40 sieurs centaines.
Il existe deux codons possibles pour Phe, à savoir (T-T-T) et (T-T-C) et deux codons possibles pour Asp, à savoir (G-A-T) et (G-A-C), et on peut utiliser ces codons en n'importe quelle permutation avec des séquences complémentaires correspondantes dans l'autre 45 brin. Par exemple, le brin codeur peut être une séquence de nucléotides comme suit:
Phe Asp Phe Asp Phe Asp 5'-T-T-T-C-G-A-C-T-T-C-G-A-T^T-T-C-G-A-C-T-T-3 ' 50 avec un brin complémentaire comportant la séquence
3'-A-A-A-G-C-T-G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-T-G-A-A-5'
Dans ce cas, on utilise le (T-T-C) comme séquence codant pour la phénylalanine et les deux codons (G-A-C) et (G-A-T) alternent pour l'acide aspartique.
Les autres permutations et combinaisons possibles de la séquence des nucléotides pour les brins codeur et complémentaire apparaîtront clairement aux spécialistes de la technique. 60 Le «gène d'Aspartame» synthétique peut être préparé par la polymérisation d'un fragment bicaténaire d'ADN constitué de deux brins dodécanucléotidiques, l'un comportant la séquence pour l'expression de (Asp-Phe)2, le brin codeur et l'autre lui étant complémentaire, à savoir le brin complémentaire.
65 Par conséquent, selon une autre de ses formes de réalisation, la présente invention concerne un procédé, caractérisé en ce que l'on réalise une première séquence dodécanucléotidique codant pour l'aspartyl-phénylalanine, en liant mutuellement des nucléotides mo
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nomères appropriés, en réalisant une seconde séquence dodécanu-cléotidique complémentaire à la première séquence, en phosphory-lant les deux dodécanucléotides en utilisant la T4-polynucléotide-kinase et en mélangeant mutuellement les première et seconde séquences de façon à former une structure d'ADN à double brin.
Les brins dodédanucléotidiques peuvent être synthétisés chacun à partir des monomères respectifs qui sont protégés par les groupes bloqueurs de manière connue et liés par la méthodologie classique au phosphotriester [voir, par exemple, Hsiung et coll., Nucleic Acids Research, 6, 1371-1385 (1979)], les dodécamères ainsi obtenus étant débloqués et subsêquemment purifiés. Après la purification et la phosphorylation à l'aide de la T4-j)olynucléotide-kinase (E.C. 2.7.1.78), les brins codeur et complémentaire sont mutuellement mélangés avec, pour résultat, la formation de structures bicaténaires par liaison hydrogène. On a constaté qu'en utilisant le dédocamère codant pour (Asp-Phe)2 pour le brin codeur et un brin complémentaire dodécanucléotidique correspondant, on obtenait des structures bicaténaires extrêmement stables résultant du chevauchement de six bases des brins, qui, pour l'exemple précédemment donné, se représentent comme suit:
5'-pT-T -T-C-G-A-C-T-T-C-G-A-3'
3'-G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-Tp-5'
La polymérisation linéaire des structures bicaténaires susmentionnées s'obtient par incubation avec la T4-ADN ligase (EC 6,5.1.1) de manière à engendrer de longs polymères de longueur stochastique. Après la séparation de la matière non liée, on constate que l'on obtient une gamme de polymères contenant de 2 à 500 et plus de 500 répétitions des unités de base.
Dans un procédé pour l'expression de l'(aspartyl-phénylala-nine)„, on insère un gène synthétique tel que décrit plus haut dans un site d'insertion d'un vecteur plasmide lisant dans la phase correcte pour le gène inséré, le site d'insertion étant adjacent à un promoteur bactérien et en aval d'un site de liaision de ribosome procaryote, on transforme des cellules microbiennes compétentes en utilisant le vecteur plasmide ainsi obtenu, on cultive les cellules transformées et on récolte le peptide exprimé. Au surplus, le produit polymère est considéré comme nouveau et la portée de l'invention s'y étend également.
Pour la préparation de l'Aspartam (l'ester méthylique de l'aspartyl-phénylalanine), on insère le gène synthétique susmentionné dans un vecteur de clonage de plasmide, par exemple pWT 121, conçu pour lire dans la phase correcte pour l'expression du gène inséré et possédant un promoteur bactérien en amont du et adjacent au site d'insertion. On peut utiliser le vecteur plasmide pour transformer des cellules d'E. coli HB 101, le (Asp-Phe)n exprimé peut être récolté et soumis à une scission enzymatique en utilisant une enzyme spécifique pour les aminoacides avec des chaînes latérales aromatiques, comme la subtilisine (E.C. 3.4.4.16), la chymotrypsine (E.C. 3.4.4.5) ou la protéinase K (E.C. 3.4.21.14), de manière à obtenir l'aspartyl-phénylalanine qui est méthylée de façon à engendrer l'Aspartame. L'enzyme utilisée peut se présenter sous une forme soluble ou, de préférence, elle peut être immobilisée sur un support solide. La mé-thylation peut s'effectuer par mise en œuvre de moyens chimiques classiques, ou bien elle peut s'effectuer par une réaction d'échange avec l'enzyme en présence de méthanol, ou bien encore par la mé-thanolyse enzymatique directe du polymère.
Il faut bien comprendre que, étant donné la nature triplet du code génétique, le gène peut être lu dans n'importe laquelle de trois phases et qu'il est, par conséquent, essentiel pour un gène d'utiliser, à titre de vecteur plasmide, un vecteur plasmide qui assure la traduction dans le châssis ou cadre de lecture correct.
Il a été découvert qu'un vecteur plasmide préféré à utiliser pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention était un vecteur plasmide choisi dans la série appelée «pWT» susmentionnée.
Fondamentalement, les plasmides de la série pWT comprennent un site de restriction d'Hind III (E.C. 3.1.23.21) adjacent à un promoteur de tryptophane d'E. coli cloné. Par la restriction à l'Hind III
et l'insertion de liants d'Hind III, il est possible de construire, dans la série pWt, des plasmides capables de traduire dans tous les châssis ou cadres de lecture, ces plasmides étant pWt 111, pWt 121 et pWT 131, comme décrit dans la référence susmentionnée. 5 La transcription et la traduction de l'ADN inséré dans les plasmides de la série pWT s'effectuent sous le contrôle direct et puissant du tryptophane; ainsi, en présence de typtophane, l'opéron est réprimé, tandis qu'en l'absence de tryptophane, il est déréprimé.
Les plasmides de la série pWT possèdent également, dans la io région suivant immédiatement le site Hind III, le gène pour la résistance à la tétracycline, si bien qu'après l'insertion de l'ADN, la transcription et la traduction puissent aisément être confirmées,
étant donné que, lorsqu'elle s'est produite, la résistance à la tétracycline est maintenue.
îs Dans une forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, on insère par conséquent le gène synthétique dans le plasmide approprié de la série pWT, c'est-à-dire le plasmide appelé «pWT 121 ». Ce plasmide est schématiquement illustré sur la figure 2 des dessins ci-annexés et possède les caractéristiques qui suivent: 20 longueur moléculaire de 4837 bp; un site Hpa I (E.C. 3.1.23.23); un site Hind III à 206 bp du site Hpa I; un site Barn HI (E.C. 3.1.23.6) à 353 bp du site Hind III; un site Sai I (E.C. 3.1.23.37) à 275 bp du site Barn HI; un site Pst I (E.C. 3.1.23.31) à 2958 bp du site Sai I et à 1045 bp du site Hpa I; le gène pour la résistance à la tétracycline 25 s'étendant de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline se situant dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région située entre le promoteur et la première partie du gène E entre les sites Hpa I et Hind III.
30 Le gène d'Aspartame synthétique a été cloné dans du pWT 121 comme suit:
On a soumis le plasmide pWT 121 à une restriction avec l'enzyme Hind III de façon à obtenir une molécule linéaire que l'on a ensuite traitée par de l'ADN polymérase et tous les quatre désoxy-35 ribonucléosides-triphosphates de façon à produire des «extrémités émoussées» totalement appariées à des bases. On a ensuite traité la molécule à extrémités émoussées par de la phosphatase alcaline bactérienne (E.C. 3.1.3.1) de façon à enlever les 5'-phosphates. On a alors préparé le plasmide pour l'insertion dans le gène synthétique 40 que l'on a préalablement traité comme suit:
On a traité le gène synthétique par de l'ADN-polymérase d'E. coli et tous les quatre désoxyribonucléosides-triphosphates de façon à produire des extrémités émoussées et on a séparé les gènes «réappariés» de l'enzyme et des petites molécules. 45 On a mélangé l'ADN de vecteur à extrémités émoussées et le gène à extrémités émoussées dans un rapport variant de 1:1 à 1:2 et on les a mutuellement liés avec de fortes concentrations de T4-ADN-ligase, de façon à obtenir la série de plasmides «pWT 121/(asp-phe)„». Les calibres des entités insérées clonées, déterminées par diso gestion à l'enzyme de restriction, se sont révélés être de 60 à 900 bp (c'est-à-dire de 5 à 75 répétitions de l'unité dodécanucléotidique).
On utilise les plasmides pWT 121/(asp-phe)n, préparés de la manière décrite plus haut, pour transformer des cellules d'E. coli, de manière connue, par exemple par l'exposition de cellules traitées par 55 du chlorure de calcium au plasmide pWT/(asp-phe)n. On cultive les cellules transformées de manière connue dans un milieu ne contenant pas de tryptophane et contenant, de préférence, l'inducteur qu'est l'acide ß-indole-acrylique, on exprime une protéine constituée essentiellement d'(asp-phe)„ qui, après scission enzymatique et mé-60 thylation, produit l'ester méthylique de l'aspartyl-phénylalanine voulu, à savoir l'Aspartame.
Comme on l'a mentionné plus haut, on obtient classiquement l'Aspartame par une synthèse chimique à étapes multiples. On utilise la L-phénylalanine comme intermédiaire pour la mise en œuvre de 65 cette synthèse classique. La préparation de la L-phénylalanine est intéressante pour cette synthèse classique. Lorsque l'on produit la phénylalanine par l'intermédiaire d'une synthèse chimique, on obtient ce produit sous la forme racémique qui doit être résolu avant que l'on
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puisse obtenir l'isomère L, et cette résolution constitue une étape supplémentaire et coûteuse de la mise en œuvre du procédé en question. Lorsqu'on l'obtient par la mise en œuvre du procédé suivant l'invention, on obtient directement la phénylalanine sous la forme de l'isomère L.
Pour la préparation de la L-phénylalanine, on traite le peptide (asp-phe)„, isolé d'une culture de cellules d'E. coli portant des plasmides incoporant le gène d'Aspartame synthétique, par un agent d'hydrolyse acide ou enzymatique et on sépare la L-phénylalanine voulue de l'hydrolysat.
Ce procédé engendre par conséquent aussi l'acide L-aspartique et la portée de la présente invention s'étend également à un tel procédé.
Les agents d'hydrolyse préférés comprennent l'acide chlorhydri-que ou la carboxypeptidase (E.C. 3.4.12.x), l'aminopeptidase (E.C. 3.4.11.x) ou des endopeptidases aspécifiques.
La séparation des produits d'hydrolyse peut se réaliser par mise en œuvre de procédés connus.
Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans pour autant limiter cette dernière.
Exemple 1 (asp-phe)„:
Synthèse de dodécanucléotides
On a synthétisé les deux dodécanucléotides, TpCpGpApAp-ApTpCpGpApApG et TpTpTpCpGpApCpTpTpCpGpA, par une méthodologie classique au triester, telle que décrite, par exemple, par Hsiung, loc. cit., et conformément au schéma réactionnel illustré sur la figure 3 des dessins ci-annexés où N représente G'sobu, T, Cbz ou Abz. Les dodécanucléotides totalement protégés furent débloqués avec de l'acide benzènesulfonique à 2% p/v, du fluorure de tétra-éthylammonium 0,1 M dans un mélagne de tétrahydrofuranne, de Pyridine et d'eau (8:1:1 en volume), puis par traitement à l'ammoniac. On a purifié les dodécanucléotides débloqués par Chromatographie en phase liquide sous haute pression sur du «Partisil 10 SAX» [silice microparticulaire qui a été dérivée à l'aide de groupes ammonium quartenaire (Whatman)].
Polymérisation de dodécanucléotides
On a phosphorylé chaque dodécanucléotide synthétique (2 (ig) dans un milieu de réaction de 10 jj.1 contenant de 10 à 50 nCi de y ~32P-ATP, 50 mM de Tris-Cl de pH 7,8, 5 mM de chlorure de magnésium, 0,25 mM d'ATP non marqué, 10 mM de mercaptoéthanol et 3 unités (1 unité est la quantité qui provoque le transfert de 1 na-nomole de 32P-phosphate de y~32P)-ATP vers l'extrémité 5'-hydroxy d'un polynucléotide, en 30 min, à 37° C, dans les conditions d'essai normales (voir, par exemple, Richardson, Nucleic Acids Research, 2, 815) de T4 polynucléotide kinase (E.C. 2.7.1.78). Après 60 min à 37° C, on a mélangé les deux dodécanucléotides, on a ajouté de l'ATP non marqué pour amener l'ATP jusqu'à 1 mM, en même temps que 0,1 unité; 1 unité est la quantité qui convertit 100 nano-mole de d(A-T)100o en une forme résistant à l'exonucléase III, en l'espace de 30 min, à 30° C, dans des conditions d'essai normales [voir, par exemple, Modrich et Lehman, J. Biol. Chem., 245, 3626 (1970)] de T4 ADN-ligase (E.C. 6.5.1.1) et on a incubé le mélange réactionnel pendant 24 h à 25°C. On a enlevé l'ATP et les nucléotides monomères non liés par descente à travers ime colonne (20 cm x 0,8 cm) de «Sephadex G-50» (polymère de dextrane modifié, réticulé, particulaire, superfin (Pharmacia)) dans du chlorure de sodium 50 mM, du Tris-Cl 10 mM de pH 7,5, et du dodécylsulfate de sodium (SDS) 0,2% p/v. On a concentré les polymères bicaténaires par précipitation à l'éthanol. Après séparation, on a constaté que le produit était un mélange de polymères d'une longueur stochastique contenant de 2 à plus de 500 répétitions des unités de base.
Clonage du gène synthétique
(a) Réappariement de l'extrémité émoussée du gène synthétique
On a incubé 2 |xg de polymère préparé de la manière décrite plus haut dans un mélange de 40 [il de 50 mM de Tris-Cl de pH 7,8, de
5 mM de chlorure de magnésium, de 1 mM de mercaptoéthanol, de 0,125 mM de chacun des quatre désoxynucléotides triphosphates et de 2 unités; 1 unité est la quantité qui provoque l'incorporation de 10 nanomoles de nucléotide dans une forme précipitable à l'acide, en 30 min, à 37° C, dans des conditions d'essai normales en utilisant du poly d (A-T) à titre de gabarit [voir, par exemple, Richardson et coll., J. Biol. Chem., 239, 222, (1964)] d'E. coli ADN polymérase I (E.C. 2.7.7.7). On a incubé le mélange pendant 20 min à 10°C et on a utilisé le mélange sans autre purification.
(b) Préparation du vecteur de change pWT 121
On a provoqué la digestion de 50 |ig d'ADN de pWt 121 par un excès double d'Hind III (E.C. 3.1.23.21). On a extrait le mélange deux fois avec un égal volume de phénol et on l'a précipité à l'éthanol.
On a procédé au réappariement avec de l'ADN-polymérase d'E. coli pour engendrer des extrémités émoussées de la manière décrite en (a) ci-dessus.
On a ensuite traité l'ADN à extrémités émoussées par de la Phosphatase alcaline bactérienne (E.C. 3.1.3.1), de façon à enlever les phosphates terminaux et à empêcher la recircularisation de l'ADN au cours de la liaison subséquente. On a incubé l'ADN pendant 30 min à 37° C, en présence d'un excès double de l'enzyme dans 10 mM de Tris-Cl de pH 7,5 et du SDS 0,1 %. On a ensuite extrait le mélange de manière exhaustive à l'aide de phénol, on l'a lavé à plusieurs reprises avec du chloroforme et on l'a ensuite précipité à l'éthanol.
(c) Liaison des extrémités émoussées
Le dodécanucléotide polymère à extrémités émoussées de (a) ci-dessus et l'ADN de pWT 121 à extrémités émoussées de (b) ci-dessus ont été mélangés en une proportion pondérale de 1:1 et liés à 15 C à 0,2 unités de T4 ADN-ligase dans un mélange de 20 (il contenant 50 mM de Tris-Cl de pH 7,8, 50 mM de chlorure de magnésium, 1 mM d'ATP et 10 mM de mercaptoéthanol. Après 24 heures, les plasmides de recombinaison pWT 121/(asp-phe)„ étaient prêts à l'emploi pour transformer des cellules d'E. coli.
Transformation et expression de gène
On a transformé des cellules d'E. coli K12 HB 101 (génotype gal", lac"", ara", pro", arg", strr, ree A~, rk~, Mk~; Boyer H.W. et Roullard-Dussoix D., J. Mol. Biol., 41, 459-472) par mise en œuvre du procédé de Katz et coll. (1973) J. Bacteriol., 114, 577-591, et on les a étalées sur des plaques de L-gélose comportant un supplément d'ampicilline (100 p.g/ml).
On a purifié les clones de recombinant par striage de manière à obtenir des colonies uniques. On a examiné les clones ainsi isolés par hybridation de colonie sur des filtres de nitrocellulose (Grunstein et Hogness (1975) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961-3965) en utilisant un dodécanucléotide synthétique marqué à la kinase comme sonde d'hybridation. On a élevé des colonies uniques positives par hybridation de colonie jusqu'à un Aaoo de 0,6 dans 25 ml de milieu M9 (Miller, (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, page 433) complété d'ampicilline (100 (ig/ml) et de tryptophane (40 (ig/ml). On a prélevé un échantillon de 1 ml de cette culture réprimée et on l'a marqué pendant 10 min avec 5 jiCi de 14C-aminoacides avant d'être traité pendant 10 min par 200 (il de «casaminoacides» à 20% p/v (Difco). On a centrifugé («pastillé») les cellules (10000 x g pendant 10 min), on les a lavées à plusieurs reprises avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 100 ng/ml de gélatine de façon à éliminer l'excès de marqueur et on a lysé la partie finale dans 50 fiI d'un tampon (FSB) contenant 10% v/v de glycérol, 0,01 % p/v de bleu de bromophénol, 5% v/v de 3-mercaptoéthanol, 3% p/v de SDS et 65 mM de Tris-Cl de pH 8 par chauffage jusqu'à 90 C pendant 2 min. On a pastillé le reste de la culture initiale de 25 ml (10 000 x g pendant 10 min) et on l'a remis en suspension dans un égal volume
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de milieu M9 complété d'ampicilline (100 |ig/ml) et d'acide ß-indole-acrylique (5 (ig/ml). Après diverses périodes d'induction, on a prélevé des échantillons de 1 ml et on les a marqués de la manière décrite plus haut. On a séparé des fractions aliquotes de 5 à 10 |il des lysats finals sur les gels d'acrylamide [12,5% de Polyacrylamide + 0,1% de SDS, voir, par exemple, Laemmli, Nature, 227, 680-685, (1970)].
On a séché les gels et on les a autoradiographiés de façon à localiser les positions des protéines marquées. En comparant les motifs provenant de cellules non induites et induites, on a pu identifier les protéines synthétisées sous le contrôle du tryptophane promoteur.
La figure 4 de dessins annexés au présent mémoire représente une autoradiographie d'un gel de 12,5% d'acrylamide: 0,1 % de SDS sur lequel sont séparées des protéines marquées au 14C synthétisées dans des cellules d'E. coli portant des plasmides de pWT 121 (asp-phe)„ de recombinant. La piste 1 montre des protéines marquées avec des 14C-amino-acides en présence de 40 |xg/ml de L-trypto-phane, c'est-à-dire que n'importe quels gènes insérés au site Hind III seront réprimés et qu'aucune protéine ne sera produite. La piste 2 montre des protéines marquées avec des 14C-amino-acides en l'absence de L-tryptophane et en présence de 5 jig/ml d'acide 3-indole-acrylique, c'est-à-dire que les gènes insérés seront totalement induits et pourront exprimer la protéine codée par le produit inséré. (On a montré que la protéine qui apparaît fortement sur la piste 2 était un polymère récurrent d'(asp-phe).) Les pistes 3 et 4 correspondent aux pistes 1 et 2 respectivement, sauf que l'on a utilisé deux fois la quantité de protéines. Les poids moléculaires des protéines standard montrés sur la droite de l'illustration sont ceux d'un mélange standard de protéines obtenu à partir du centre radiochimique d'Amer-sham, Buckinghamshire, Angleterre.
Isolement des protéines marquées à partir de gels
On a isolé des bandes particulières de protéines de gels d'acrylamide en séparant le lysat de protéine dans une série de pistes parallèles. On a coupé l'une de ces pistes du gel à l'aide d'un scalpel et on l'a colorée à l'aide de bleu brillant Coomassie R (Gurr, Searle Dia-gostics), cependant que l'on trempait le reste du gel pendant 20 min dans du glycérol 15% v/v et qu'on l'a conservé à — 70° C. On a séché la tranche de gel coloré et on l'a autoradiographiée pendant 24 à 48 h de façon à définir la position des bandes marquées. Cela a permis d'exciser la partie pertinente du gel congelé. On a brisé les tranches de gel en forçant leur passage à travers une seringue à jeter de 1 ml, sans aiguille, et on a élué les protéines marquées avec du bicarbonate de triéthylammonium 10 mM de pH 7,5 pendant 24 h. On a enlevé les fragments de gel par centrifugation et on a dialysé la couche surnageante vis-à-vis de bicarboante de triéthylammonium 10 mM. De cette manière, on a obtenu des récupérations de 50 à 75% de bandes de protéines marquées.
Digestion à l'aide d'enzymes
On a provoqué la digestion de lysats de cellules bruts ou de bandes isolées de gels d'acrylamide soit à l'aide d'enzymes protéoly-
tiques en solution en concentrations de 1 à 10 mg/ml, soit à l'aide de quantités équivalentes d'enzyme immobilisée sur un support solide, pendant des périodes allant jusqu'à 72 heures. On a utilisé du bicarbonate de triéthylammonium 10 mM dans la gamme de pH variant de 7 à 8, tandis que l'on a utilisé des tampons à l'hydroxyde de sodium/glycine 10 mM jusqu'à un pH de 10,5.
Chromatographie en couche mince
On a séparé les produits de digestion à l'enzyme de protéines marquées sur des plaques de Chromatographie en couche mince de gel de silice Merck avec une zone de concentration (20 x 20 cm), en utilisant soit un mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (8:2:2 en volume), soit un mélange de n-propanol et d'ammoniaque concentrée (0,880) (7:3 en volume), à titre de solvant. Après le développement, on a séché les plaques et on les a autoradiographiées en utilisant un film de rayons X Kodak «Kodirex» pour déceler les produits peptidiques marqués. Les digestions avec de la chymotryp-sine (E.C. 3.4.4.5) ou delà subtilisine (E.C. 3.4.4.16) immobilisées sur un support solide, ou avec de la subtilisine ou de la protéinase K (E.C. 3.4.21.14) sous forme soluble ont toutes donné un mélange de produits. Parmi ceux-ci, se trouvait, dans chaque cas, un composé qui se cochromatographia avec de l'aspartyl-phénylalanine authentique. (La figure 5 des dessins ci-annexés représente une autoradiographie d'une plaque de Chromatographie en couche mince de silice sur laquelle sont séparés les produits de la digestion enzymatique de protéine (asp-phe)n. On a digéré la protéine (asp-phe)n marquée au 14C isolée d'un gel d'acrylamide à 12,5% : SDS à 0,1 % pendant 16 heures à 37° C avec de la subtilisine immobilisée sur un support solide. On a développé la plaque de Chromatographie en couche mince avec un mélange de n-propanol et d'ammoniaque 0,880 (7:3 v/v). Les flèches indiquent les positions des marqueurs de (asp-phe) et de (phe-asp) authentiques. Le composé, récupéré de la plaque de Chromatographie en couche mince et hydrolysé dans de l'acide chlorhydrique, ne donna que de l'acide aspartique et de la phénylalanine.
Hydrolyse de protéines induites pour engendrer l'acide L-aspartique et de la L-phénylalanine
Pour l'hydrolyse, on a utilisé la protéine (asp-phe)„ marquée au 14C, isolée d'un gel d'acrylamide, ou un lysat de cellules brut préparé en lysant des cellules d'E. coli marquée au 14C induites, portant des plasmides pWT 121/(asp-phe)n dans un tampon contenant 5% v/v de P-mercaptoéthanol, 3% p/v de SDS et 65 mM de Tris-Cl de pH 8. On a scellé un lysat préparé à partir de 1 ml d'une culture de cellules induites, ou la protéine induite isolée d'un volume similaire de culture, dans un tube avec 1 ml d'acide chlorhydrique 6M et on a chauffé le tube à 110°C pendant 16 heures. Après cette période, on a ouvert le tube et on a enlevé son contenu pour l'évaporer ensuite jusqu'à siccité. L'examen de l'hydrolysat par Chromatographie en couche mince a révélé la présence de L-phénylalanine et d'acide L-aspartique marqué en 14C, en même temps que de petites quantités d'autres aminoacides.
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4 feuilles dessins

Claims (11)

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    2
    REVENDICATIONS
    1. Vecteur plasmide comprenant un plasmide ayant, inséré à un site d'insertion adjacent à un promoteur bactérien et en aval d'un site de liaison de ribosome procaryote, un gène synthétique présentant, dans le brin codeur, des codons pour le polypeptide récurrent (aspartyl-phénylalanine)„, où n est égal au moins à deux, le site d'insertion étant tel qu'il place le gène sous le contrôle d'un promoteur bactérien.
  2. 2. Vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide est un dérivé de pWT 121 ayant une longueur moléculaire totale de 4837 bp, un site Hpa I, un site Hind III à 206 bp dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport au site Hpa I, un site Barn HI à 353 bp dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport au site Hind III, un site Sai I à 275 bp dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport au site Barn HI, un site Pst I à 2958 bp dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport au site Sai I et 1045 bp dans le sens contraire des aiguilles d'une montre par rapport au site Hpa I, le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant de la région du site Hpa I dans le sens des aiguilles d'une montre jusqu'au-delà du site Sai I, le gène pour la résistance à l'am-picilline se situant dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région située entre le promoteur et la première partie du gène E entre les sites Hpa I et Hind III.
  3. 3. Vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend le plasmide pWT 121 ayant, inséré au site Hind III, un gène synthétique pour l'expression du polypeptide récurrent (as-partyl-phénylalamne)„ où n représente un nombre entier égal au moins à deux, le gène comprenant une molécule d'ADN bicaténaire présentant, dans le brin codeur, au moins deux séquences de nucléo-tides codant pour l'expression de l'acide aspartique et, en alternance avec elles, au moins deux séquences de nucléotides codant pour l'expression de la phénylalanine et, dans l'autre brin, des séquences de nucléotides récurrentes et alternantes complémentaires de celles codant pour l'acide aspartique et la phénylalanine.
  4. 4. Vecteur plasmide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène synthétique a la structure:
    5'pT-T-T-C-G-A-C-T-T-C-G-A 3'
    3' G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-Tp 5'
  5. 5. Procédé de production d'un vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on insère au site d'insertion du plasmide un gène synthétique qui code pour le polypeptide récurrent (as-partyl-phênylalanine)n où n est égal au moins à deux, de façon que le gène soit sous le contrôle d'un promoteur bactérien.
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on insère le gène synthétique au site Hind III>du pWT 121.
  7. 7. Procédé pour la transformation d'une cellule transformable, caractérisé en ce qu'on y insère un vecteur plasmide selon l'une des revendications 1 à 4.
  8. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on insère le gène synthétique pour l'expression du polypeptide récurrent (aspartyl-phénylalanine)„, où n est égal au moins à deux, le gène comprenant une molécule d'ADN bicaténaire comprenant, dans le brin codeur, au moins deux séquences de nucléotides codant pour l'expression de l'acide aspartique et, en alternance avec elles, au moins deux séquences de nucléotides codant pour l'expression de la phénylalanine et, dans l'autre brin, des séquences de nucléotides récurrentes et alternantes complémentaires de celles codant pour l'acide aspartique et la phénylalanine, dans un site d'insertion d'un vecteur plasmide lisant dans la phase correcte pour le gène inséré, le site d'insertion étant adjacent à un promoteur bactérien et en aval d'un site de liaison de ribosome procaryote, puis qu'on transforme la cellule transformable à l'aide du vecteur plasmide obtenu.
  9. 9. Cellule transformée par le procédé selon la revendication 7 ou 8.
  10. 10. Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une E. coli.
  11. 11. Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 9 ou 10, pour l'expression du polypeptide récurrent (aspartyl-phényl-alanine)„, où n est égal au moins à deux.
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