CH669395A5

CH669395A5 -

Info

Publication number: CH669395A5
Application number: CH5667/83A
Authority: CH
Inventors: David F Mark; Leo S Lin; Shi-Da Yu Lu
Original assignee: Cetus Corp
Priority date: 1982-10-19
Filing date: 1983-10-18
Publication date: 1989-03-15
Also published as: PH23702A; JPS6128392A; DK105892D0; IE56026B1; DK168767B1; PH20343A; LU90413I2; GB2130219A; NL930119I2; DE3382528D1; DE3382197D1; LU88357I2; EP0192811A1; FI82266B; ES542829A0; AU563962B2; BE898016A; ES533053A0; KR840006369A; FR2534594B1

Description

DESCRIPTION

L'invention est du domaine général de la technologie de l'ADN recombinant. Plus précisément, elle concerne des protéines biologiquement actives, modifiées par mutation, qui diffèrent de leurs analogues parents par une ou plusieurs substitutions/suppressions de reste cystéine.

L'invention a pour objet une mutéine synthétique d'une protéine biologiquement active ayant au moins un reste cystéine capable de former une liaison disulfure, le reste ou les restes cystéine n'étant pas essentiel à l'activité biologique.

L'invention a également pour objet un gène structural qui code pour la mutéine synthétique, un procédé de production de la mutéine, et un oligonucléotide pour la mise en œuvre du procédé producteur du gène.

L'invention a finalement pour objet des compositions contenant la mutéine synthétique.

Des protéines biologiquement actives qui sont produites par voie microbienne selon la technologie de l'ADN recombinant (ADNr), peuvent contenir des restes cystéine qui ne sont pas essentiels à leur activité, mais sont libres de former des liaisons intermoléculaires ou intramoléculaires indésirables. Une telle protéine est le béta-interféron humain produit par voie microbienne (IFN-ß). Au cours de la préparation de l'IFN-ß par des techniques avec l'ADNr, on a observé la formation de dimères et d'oligomères d'IFN-ß, produit par voie microbienne, dans des extraits de E.coli contenant des concentrations élevées en IFN-ß. Cette formation de multi-mères rend la purification et la séparation de l'IFN-ß très laborieuses et longues et nécessite plusieurs autres opérations dans les procédés de purification et d'isolement, tels que la réduction de la protéine pendant la purification et la ré-oxydation pour lui redonner sa conformation originale, augmentant ainsi la possibilité d'une formation incorrecte de liaison disulfure. De plus, on a également trouvé que l'IFN-ß produit par voie microbienne montrait une activité spécifique constamment faible, due peut-être à la formation de multimères ou de ponts disulfure intramoléculaires désordonnés. Il serait donc souhaitable de pouvoir modifier les protéines biologiquement actives, produites par voie microbienne, telles que l'IFN-ß, d'une manière qui n'affecte pas leur activité, mais qui réduise ou élimine leur aptitude à former des réticulations intermoléculaires ou des liaisons intramoléculaires qui obligent la protéine à adopter une structure tertiaire indésirable (par exemple, une conformation qui diminue l'activité de la protéine).

L'invention a pour but de produire par des techniques de mutagénèse dirigée des protéines biologiquement actives, modifiées par mutation (ces protéines sont appelées «mutéi-nes», Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4ème édition, p. 381, Springer-Verlag (1976)), qui conservent l'activité de leurs analogues parents, mais ne sont plus capables de former des liaisons intermoléculaires ou des liaisons disulfure intramoléculaires indésirables. A cet égard, Shepard

H.M., et al., Nature (1981) 294, 563 — 565, décrit une mutéine d'IFN-ß dans laquelle la cystéine en position 141 de sa séquence d'acides aminés (il y a trois cystéines dans l'IFN-ß humain natif en les positions 17, 31 et 141, Gene (1980) 10,11-15 et Nature (1980) 285, 542-547) est remplacée par la tyrosine. Cette mutéine a été obtenue par expression bactérienne d'un gène hybride construit à partir d'un clone d'ADNc d'IFN-ß partiel ayant une transition G-> A sur le nucléotide 485 du gène IFN-ß. La mutéine ne possédait pas l'activité biologique de l'IFN-ß natif, ce qui a autorisé les auteurs à conclure que la cystéine remplacée était essentielle à l'activité.

Les techniques de mutagénèse dirigée sont bien connues et ont été revues par Lather R.F. et Lecoq J.P. dans Genetic Engineering, Academic Press (1983), pages 31 — 50. La mutagénèse dirigée sur oligonucléotide a fait l'objet d'une revue spécifique par Smith M. et Gillam S. dans Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981), 3,1-32.

L'invention fournit une mutéine synthétique d'une protéine biologiquement active ayant au moins un reste cystéine, capable de former une liaison disulfure et qui n'est pas essentiel à l'activité biologique, caractérisée en ce que la mutéine a au moins un des restes cystéine remplacé par un autre acide aminé.

Les autres objets de l'invention sont définis dans les revendications indépendantes 18, 19, 20, 27,28, 30 et 31.

Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit donc des gènes structuraux synthétiques possédant des séquences d'ADN, spécifiquement conçues («gènes construits») pour coder pour les mutéines synthétiques décrites ci-dessus. Des aspects secondaires de cet aspect concernent des vecteurs d'expression qui comprennent des gènes construits structuraux, et des procédés pour produire la mutéine synthétique par culture des produits de transformation ou de leur descendance et récupérer la mutéine à partir de la culture. Dans le cas de mutéines qui présentent une utilité thérapeutique, des compositions thérapeutiques qui contiennent des quantités thérapeutiquement efficaces des mutéines constituent un autre aspect de l'invention.

Selon encore un autre de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour la production du gène structural synthétique, décrit ci-dessus, par une mutagénèse dirigée sur oligonucléotide, lequel procédé comportant les opérations suivantes:

(a) hybridation d'un ADN mono-caténaire comprenant une chaîne d'un gène structural qui code pour la protéine parente, avec un primaire oligonucléotide mutant qui est complémentaire d'une région de la chaîne qui comprend le codon pour la cystéine ou le triplet «non-sens» apparié avec le codon, selon le cas, à l'exception d'un mauvais assortiment avec le codon ou le triplet «non-sens» qui code pour l'autre acide aminé;

(b) allongement du primaire avec l'ADN polymérase pour former un hétéroduplex de mutation; et

(c) réplication de l'hétéroduplex de mutation, suivi de l'isolement final du gène.

Aux dessins annexés, on a représenté:

figure 1, un diagramme de la séquence d'acides aminés de IFN-ß;

figure 2, un schéma illustrant la préparation d'un gène IFN-ß mutant par mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide;

figure 3, un diagramme d'un plasmide pßltrp comprenant le gène IFN-ß;

figure 4, un diagramme du clonage du phage vecteur M13mp8;

figure 5, la carte de restriction du clone M13-ßl;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

669 395

4

figure 6, l'image sur gel du gène IFN-ßseri7 mutant, montrant un seul changement de base dans la région codante;

figure 7, un diagramme du plasmide d'expression pTrp3; figure 8a, le mode de restriction Hinfl du clone pSY2501 et figure 8b, les deux fragments résultant 169bp et 28bp; figure 9, une carte de restriction du clone pSY2501;

figure 10, la séquence d'ADN codant pour la mutéine IFN-ßseri7 avec la séquence d'acides aminés correspondante;

figure 11, la simple bande de la protéine à 18 000 daltons correspondant à IFN-ßseri7 dans les extraits des clones pSY2501 et pßltrp;

figure 12, un diagramme du plasmide pLWl qui contient le gène interleukine-2 (IL-2) humaine, sous le contrôle du promoteur E.Coli trp;

figure 13, une carte de restriction du clone du phage M13-IL2;

figure 14, une carte de restriction du plasmide pLW46; figures 15a et 15b, la séquence de nucléotides de la chaîne codante du clone pLW46 et la séquence des acides aminés correspondants de la mutéine IL-2 appelée IL-2seri25.

Modes opératoires pour appliquer l'invention L'invention fournit des mutéines de protéines biologiquement actives dans lesquelles les restes cystéine qui ne sont pas essentiels à l'activité biologique ont été délibérément remplacés par d'autres acides aminés pour éliminer des sites de réticulation intermoléculaire ou de formation incorrecte de liaison disulfure intramoléculaire; des gènes mutants codant pour ces mutéines; et des procédés pour produire ces mutéines.

Des protéines qui peuvent être modifiées par mutation selon l'invention peuvent être identifiées à partir d'une information concernant la teneur en cystéine des protéines biologiquement actives et les rôles joués par les restes cystéine quant à l'activité et à la structure tertiaire. Dans le cas de protéines au sujet desquelles on ne dispose pas d'une telle information dans la littérature, cette information peut être obtenue en modifiant systématiquement chaque reste de cystéine de la protéine par les modes opératoires décrits ici et en déterminant l'activité biologique des mutéines résultantes et leur tendance à former des liaisons disulfure intermoléculaires ou intramoléculaires indésirables. En conséquence, bien que l'invention soit décrite spécifiquement et illustrée par les exemples ci-dessous concernant des mutéines d'IFN-ß et de IL-2, il est évident que les enseignements suivants s'appliquent également à toute autre protéine biologiquement active qui contient un reste cystéine fonc-tionnellement non essentiel qui rend la protéine capable de former une liaison disulfure indésirable. Comme exemples de protéines autres que IFN-ß et IL-2 qui peuvent subir une modification par mutation selon l'invention, on citera la lympho toxine (facteur de nécrose tumorale) et le facteur-1 stimulant les colonies, et IFN-al. Ces protéines ont normalement un nombre impair de restes cystéine.

Dans le cas de IFN-ß, on a rapporté dans la littérature que les IFN glycosylé et non glycosylé montrent des activités spécifiques qualitativement semblables et qu'en conséquence, les parties glycosylé ne sont pas impliquées dans et ne contribuent pas à l'activité biologique d'IFN-ß. Mais l'IFN-ß produit par voie bactérienne, qui ne contient pas d'unités glycosylé, montre constamment une activité spécifique quantitativement inférieure à celle d'IFN- qui est glycosylé. L'IFN-ß est connu pour posséder trois restes cystéine en les positions 17, 31 et 141. Shepard et al., ci-dessus, ont démontré que la cystéine 141 est essentielle pour l'activité biologique. Dans l'IFN-ß, qui contient quatre restes cystéine, il y a deux liaisons -S-S- intramoléculaires;

l'une entre cys 29 et cys 138 et l'autre entre cys 1 et cys 98. A partir de l'homologie entre IFN-ß et IFN-a, cys 141 d'IFN-ß pourrait être impliqué dans une liaison -S-S- intramoléculaire avec cys 31, laissant cys 17 capable de former des réticulations intermoléculaires. En supprimant cys 17 ou en le remplaçant par un autre acide aminé, on peut alors déterminer si cys 17 est essentiel à l'activité biologique et quel est son rôle dans la formation de liaison -SS-. Si cys 17 n'est pas essentiel pour l'activité biologique de la protéine, la protéine sans cys 17 ou dans laquelle on a remplacé cys 17, résultante, pourrait montrer une activité spécifique proche de celle d'IFN-ß natif et ceci pourrait faciliter également l'isolement et la purification de la protéine.

En utilisant le procédé de mutagénèse dirigé sur oligonucléotide, avec un primaire oligonucléotide synthétique complémentaire de la région du gène IFN-ß au codon pour cys 17, mais qui contient des modifications de base simple ou multiple dans ce codon, il est possible de produire un gène «construit» en remplaçant cys 17 par un autre acide aminé choisi. Lorsqu'on désire une suppression, le primaire oligonucléotide ne possède pas de codon pour cys 17. La conversion de cys 17 en des acides aminés neutres tels que la glycine, la valine, l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la tyrosine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la sérine, la thréonine et la méthionine constitue l'approche préférée. La sérine et la thréonine sont les acides aminés de remplacement particulièrement préférés en raison de leur analogie chimique avec la cystéine. Lorsque la cystéine est supprimée, la mutéine mature est plus courte d'un acide aminé que la protéine parente native ou l'IFN-ß produit par voie microbienne.

L'IL-2 humaine est connue pour avoir trois restes cystéine en les positions 58,105 et 125 de la protéine.

Comme dans le cas d'IFN-ß, IL-2 se présente sous une forme oligomère agrégée après isolement à partir de cellules bactériennes et doit être réduite par des agents réducteurs pour obtenir un bon rendement à partir des extraits bactériens. De plus, la protéine IL-2 réduite, purifiée, est instable et se réoxyde facilement au stockage en une forme oligomère inactive. La présence de ces trois cystéines signifie que par réoxydation la protéine peut former au hasard l'un des trois ponts disulfure intramoléculaires possibles, l'un seulement d'entre eux étant le pont correct trouvé dans la molécule native. Etant donné qu'on ne connaît pas la structure disulfure de la protéine 11-2 native, il est possible d'utiliser l'invention pour créer des mutations aux codons 58,105 et 125 du gène IL-2 et identifier les résidus de cystéine qui sont nécessaires pour l'activité, et par conséquent les plus probables à impliquer dans la formation du pont disulfure natif. De la même manière, le reste cystéine qui n'est pas nécessaire pour l'activité, peut être modifié de manière à éviter la formation de ponts disulfure intramoléculaires incorrects et minimiser le risque de ponts disulfure intermoléculaires en remplaçant le résidu cystéine libre.

La dimension du primaire oligonucléotide est déterminée par la nécessité d'une hybridation stable du primaire dans la région du gène où la mutation doit être induite et par les limites des procédés actuellement disponibles pour synthétiser des oligonucléotides. Les facteurs à considérer dans la constitution d'oligonucléotides utilisables dans la mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide (par exemple dimension globale, dimensions des portions adjacentes au site de mutation) sont décrits par Smith M. et Gillam S., ci-dessus. De manière générale, la longueur totale de l'oligonucléotide doit permettre d'optimiser une hybridation unique, stable sur le site de mutation, les extensions 5' et 3' à partir du site de mutation ayant une dimension suffisante pour éviter que la mutation ne soit dirigée par l'activité exonucléase de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

669 395

l'ADN polymérase. Les oligonucléotides utilisés pour la mutagénèse selon l'invention contiennent normalement environ de 12 à 24 bases, de préférence environ de 14 à 20 bases et avantageusement environ de 15 à 18 bases. Ils contiennent normalement au moins environ trois bases 3' du codon modifié ou manquant.

Le procédé pour préparer le gène IFN-ß modifié implique de manière générale l'induction d'une mutagénèse spécifique d'un site dans le gène IFN-ß au codon 17 (TGT) au moyen d'un primaire oligonucléotide synthétique qui omet le codon ou le modifie de manière à ce qu'il code pour un autre acide aminé. Lorsque la thréonine remplace la cystéine et que le primaire est hybridé avec la chaîne «non-sens» du gène IFN-ß, le nucléotide primaire préféré est GCAATTTTCACTCAG

(la partie soulignée représente le codon modifié). Lorsqu'il est souhaitable de supprimer la cystéine, le primaire préféré est

AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG

qui omet le codon TGT pour cys. Lorsque la cystéine est remplacée par la sérine, on choisit de préférence un primaire

à 17 nucléotides,

GCAATTTTCAGAGTCAG,

qui comprend un codon AGT pour la sérine. La transition T->A de la première base dans le codon 17 cys se traduit par le remplacement de la cystéine par la sérine. Il faut reconnaître que lorsqu'on introduit des suppressions, le système de lecture convenable pour la séquence d'ADN doit être maintenu pour l'expression de la protéine désirée.

Le primaire est hybridé avec un phage mono-caténaire tel que M13, fd ou 0X174 dans lequel on a cloné une chaîne du gène IFN-ß. Il faut noter que le phage peut porter la chaîne «qui a un sens» ou la chaîne «non-sens» du gène. Lorsque le phage porte la chaîne «non-sens», le primaire est identique à la région de la chaîne «qui a un sens», qui contient le codon à muter, si ce n'est un mauvais assortiment avec ce codon, qui définit une suppression du codon ou un triplet qui code pour un autre acide aminé. Lorsque le phage porte la chaîne «qui a un sens», le primaire est complémentaire de la région de la chaîne «qui a un sens», qui contient le codon qui doit être muté, si ce n'est un mauvais assortiment approprié dans le triplet qui est apparié avec le codon à supprimer. Les conditions utilisables dans l'hybridation sont décrites par Smith M. et Gillam S., ci-dessus. La température est normalement comprise entre 0 et 70 °C, de préférence entre 10 et 50 °C. Après l'hybridation, le primaire est prolongé sur l'ADN du phage par réaction avec l'ADN polymérase I, la T4 ADN polymérase, la reverse transcriptase ou d'autres ADN polymérases appropriées. L'ADN bicaténaire résultant est converti en ADN bicaténaire circulaire fermé, par traitement avec une ADN ligase telle que la T4 ADN ligase. Les molécules d'ADN contenant des régions mono-caténai-res peuvent être détruites par un traitement avec la SI endonucléase.

Une mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide peut être également utilisée pour produire un gène IL-2 mutant qui code pour une mutéine ayant une activité IL-2, mais dont cys 125 est changé en sérine 125. Le primaire oligonucléotide utilisé dans la production de ce gène IL-2 mutant lorsque le phage porte la chaîne «qui a un sens» du gène, est GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC. Cet oligonucléotide comporte un changement C—>G sur la base centrale sur le triplet qui est apparié avec le codon 125 du gène IL-2.

L'hétéroduplex de mutation résultant est alors utilisé pour transformer un organisme ou une cellule hôte compétent. La réplique de l'hétéroduplex par l'hôte fournit des descendants à partir des deux chaînes. Après la réplique, le gène mutant peut être isolé à partir des descendants de la chaîne mutante, inséré dans un vecteur d'expression approprié, puis le vecteur utilisé pour transformer un organisme ou cellule hôte approprié. Comme vecteurs appropriés, on citera les plasmides pBR322,pCRl et leurs variantes, des vecteurs synthétiques et autres. Des organismes hôtes appropriés sont E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, différentes souches de levures, Bacillus ther-mophilus, des cellules animales telles que des cellules de souris, de rat ou d'ovaires d'hamster de Chine (CHO), des cellules végétales, des hôtes animaux et végétaux et similaires. Il faut noter que lorsqu'un hôte choisi est transformé avec le vecteur, des séquences promoteur-opérateur appropriées sont également introduites de manière à exprimer la mutéine. Les hôtes peuvent être procaryotes ou eucaryotes (des procédés pour l'insertion d'ADN dans des cellules eucaryotes sont décrits dans les «PCT applications», n° US81/00239 et US81/00240, publiés le 3 septembre 1981). Les hôtes préférés sont E.coli et les cellules CHO. Les mutéines obtenues selon l'invention peuvent être glycosylées ou non glycosylées, selon la glycosylation se produisant dans la protéine parente native et l'organisme hôte utilisé pour produire la mutéine. Si cela s'avère souhaitable, ime mutéine non glycosylée obtenue lorsque l'organisme hôte est E.coli ou un Bacillus, peut être éventuellement glycosylée in vitro par voie chimique, enzymatique ou par d'autres types de modifications connus dans la technique.

Dans le mode de réalisation préférée de l'invention relative à IFN-ß, le reste cystéine en position 17 dans la séquence d'acides aminés d'IFN-ß, tel que représenté sur la figure 1 des dessins annexés, est changé en sérine par une transition T->A de la première base du codon 17 de la chaîne «qui a un sens» de la séquence d'ADN qui code pour IFN-ß mature. La mutagénèse spécifique du site est induite au moyen d'un primaire à 17 nucléotides GCAATTTTCAGAGTCAG,

identique à la séquence de 17 nucléotides de la chaîne «qui a un sens» d'IFN-ß dans la région du codon 17, si ce n'est un mauvais assortiment d'une simple base sur la première base du codon 17. Le mauvais assortiment est sur le nucléotide 12 dans le primaire. Il faut noter que le code génétique est dégénéré et que de nombreux acides aminés peuvent être codés par plus d'un codon. Le code de base pour la sérine, par exemple, est dégénéré de 6 manières, et donc les codons TCT, TCG, TCC, TCA, AGT et ACG codent tous pour la sérine. Le codon AGT a été choisi par convenance pour le mode de réalisation préféré. De même, la thréonine est codée par l'un quelconque des codons ACT, ACA, ACC et ACG. Il est entendu que lorsqu'un codon est spécifié pour un acide aminé particulier, il comprend tous les codons dégénérés qui codent pour cet acide aminé. Le merl7 est hybridé avec un ADN provenant d'un phage M13 mono-caténaire qui porte la chaîne «non-sens» du gène IFN-ß. Le primaire oligonucléotide est alors allongé sur l'ADN au moyen d'un fragment Klenow de l'ADN polymérase I et l'ADN bicaténaire résultant est converti en ADN circulaire fermé avec la T4 ligase. Une réplique de l'hétéroduplex de mutation résultant donne des clones à partir de la chaîne d'ADN contenant le mauvais assortiment. Des clones mutants peuvent être identifiés et sélectionnés par l'apparition ou la disparition de sites de restriction spécifiques, la résistance ou la sensibilité aux antibiotiques ou par d'autres procédés connus dans la technique. Lorsque la cystéine est remplacée par la sérine, la transition T-» A, représentée sur la figure 2 des dessins annexés, se traduit par la création d'un nouveau site de restriction Hinfl dans le gène structural. Le clone mutant est identifié en utilisant l'oligonucléotide primaire comme un modèle dans une sélection par hybridation des

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

669 395

6

plaques de phages mutés. Le primaire comporte un seul mauvais assortiment lorsqu'il est hybridé avec le parent,

mais montre un assortiment parfait lorsqu'il est hybridé avec l'ADN du phage muté, tel que représenté sur la figure 2. Les conditions d'hybridation peuvent alors être choisies de telle sorte que le primaire oligonucléotide hybride de préférence avec l'ADN muté, mais pas avec l'ADN parent.

Le nouveau site engendré Hinfl sert également comme moyen de confirmation de la simple mutation de base dans le gène IFN-ß.

L'ADN du phage M13 portant le gène muté est isolé et adjoint à un vecteur d'expression approprié tel que le plasmide pTrp3, et la souche MM294 de E.coli est transformée avec le vecteur. Des milieux de développement appropriés pour la culture des produits de transformation et de leur descendance sont connus des spécialistes de le technique. La mutéine de IFN-ß exprimée est isolée, purifiée et caractérisée.

Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Les exemples 1 à 9 décrivent la préparation d'une mutéine de IFN-ß. Les exemples 10 à 15 décrivent la préparation d'une mutéine de IL-2.

Exemple 1

Clonage du gène IFN-ß dans le vecteur M13

L'utilisation du vecteur du phage M13 comme source de. copie d'ADN mono-caténaire a été démontrée par G.F. Temple et al., Nature (1982) 296, pages 537 — 540. On fait digérer le plasmide pßltrp (figure 3) contenant le gène IFN-ß sous contrôle du promoteur trp de E.coli, avec les enzymes de restriction HindIII et XhoII. On fait digérer l'ADN de la forme répliquée (RF) M13mp8 (figure 4) (J. Messing, «Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA», Ed. A. Walton, Elsevier Press, 143 —153 (1981) avec les enzymes de restriction HindIII et BamHI, et on mélange avec l'ADN pßltrp qu'on a préalablement fait digérer avec HindIII et XhoII. On relie le mélange avec la T4 ADN ligase et l'ADN lié est transformé dans des cellules compétentes de E.coli souche JM 103 et appliqué sur des plaques d'indicateur Xgal(J. Messing et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9, pages 309—321). On rassemble les plaques contenant le phage recombinant (plaques blanches), on inocule dans une culture fraîche de JM 103 et à partir des cellules infectées on obtient des mini-préparations de molécules RF (H.D. Birn-boim et J. Doly, Nucleic Acid Res. (1979) 7,1513 -1523). On fait digérer les molécules RF avec différentes enzymes de restriction pour identifier les clones contenant l'insert IFN-ß. La carte de restriction d'un tel clone (M13-ßl) est reproduite sur la figure 5 des dessins annexés. On prépare l'ADN mono-caténaire provenant du phage à partir du clone M13-ßl pour servir de copie pour une mutagénèse spécifique d'un site en utilisant un oligonucléotide synthétique.

Exemple 2 Mutagénèse spécifique d'un site

On traite 40 picomoles de l'oligonucléotide synthétique GCAATTTTCAGAGTCAG (primaire) avec la T4 kinase en présence de 0,1 mM d'adénosine triphosphate (ATP), 50 mM de chlorhydrate d'hydroxyméthylaminométhane (Tris-HCl) de pH 8,0,10 mM de MgCl2, 5 mM de dithiothréitol (DTT) et 9 unités de T4 kinase, dans 50 jo.1 à 37 °C pendant 1 heure. On hybride le primaire traité avec la kinase (12 pmoles), avec 5 |ig d'ADN M13-ßl mono-caténaire dans 50 ni d'un mélange contenant 50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl de pH 8,0, 10 mM de MgClî et 10 mM de ß-mercapte^thanol, en chauffant à 67 °C pendant 5 minutes et à 42 °C pendant 25

minutes. On refroidit le mélange ainsi traité sur de la glace et on ajoute 50 |il d'un mélange réactionnel contenant 0,5 mM de chacun des désoxynucléoside triphosphates (dNTP), 80 mM de Tris-HCl de pH 7,4, 8 mM de MgCl2,100 mM de NaCl, 9 unités d'ADN polymérase I, fragment Klenow, 0,5 mM d'ATP et 2 unités de T4 ADN ligase, on incube à 37 °C pendant 3 heures et à 25 °C pendant 2 heures. On termine alors la réaction par une extraction au phénol et une précipitation avec de l'éthanol. On dissout l'ADN dans 10 mM de Tris-HCl de pH 8,0,10 mM d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), 50% de sucrose et 0,05% de bleu de bromophénol et on soumet à une électrophorèse sur un gel d'aragose à 0,8% en présence de 2 ng/ml de bromure d'éthidium. On élue les bandes d'ADN correspondant aux formes RF de M13-ßl à partir de découpes de gel par le procédé au Perchlorate (R.W. Davis et al., «Advanced Bacterial Genetics», Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. pages 178 —179 (1980)). On utilise l'ADN élué pour transformer des cellules compétentes de JM 103, on laisse se développer pendant une nuit et on isole l'ADN mono-caté-naire à partir du produit surnageant de la culture. On utilise cet ADN mono-caténaire comme copie dans un second cycle d'extension du primaire, on transforme les formes RF purifiées sur gel, de l'ADN dans des cellules compétentes JM 103, on dépose sur des plaques de gélose et on incube pendant une nuit pour obtenir des plaques de phage.

Exemple 3 Mutagénèse spécifique d'un site On répète l'expérience de l'exemple 2 ci-dessus, si ce n'est qu'on utilise comme primaire oligonucléotide synthétique GCAATTTTCAGACTCAG

pour changer le codon 17 du gène IFN-ß en partant d'un codon qui code pour la cystéine pour arriver à un codon qui code pour la thréonine.

Exemple 4 Suppression de la spécificité d'un site On répète l'expérience de l'exemple 2 ci-dessus, si ce n'est que le primaire oligonucléotide synthétique utilisé est AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG pour supprimer le codon 17 du gène IFN-ß.

Exemple 5 Sélection et identification des plaques obtenues par mutagénèse On refroidit à 4 °C des lames contenant des plaques de M13-ßl muté (exemple 1) ainsi que deux lames contenant des plaques de phage M13-ßl non muté et on transfère des plaques de chaque lame sur deux ronds de papier-filtre en nitrocellulose en plaçant un filtre sec sur la lame de gélose pendant 5 minutes pour le premier filtre et 15 minutes pour le second filtre. On place alors les filtres sur des papiers filtres épais imbibés dans NaOH 0,2 N, NaCl 1,5 M et 0,2% de Triton X-100 pendant 5 minutes, puis on neutralise en recouvrant avec des papiers filtres imprégnés de 0,5 M de Tris-HCl de pH 7,5 et 1,5 M de NaCl pendant 5 autres minutes. On lave deux fois les filtres de la même manière sur des filtres imprégnés dans SSC x 2 (solution saline de citrate standard, on sèche et on cuit dans une étuve à vide à 80 °C pendant 2 heures. On pré-hybride les filtres en double à 55 °C pendant 4 heures avec 10 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN (SSC x 5) de pH 7,0, une solution de Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine, 1 fois = 0,02% de chacune des substances), 0,1 % de dodécyl sulfate de sodium (SDS), 50 mM de tampon de phosphate de sodium de pH 7,0 et 100 |xg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. On prépare un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

669 395

modèle marqué à 32p en traitant par une kinase le primaire oligonucléotide avec ATP marqué à 32P. On hybride les filtres avec 3,5 x 105 cpm/ml de primaire marqué à 32p dans 5 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN à 55 °C pendant 24 heures. On lave les filtres à 55 °C pendant 30 minutes chacun dans des tampons de lavage contenant 0,1 % de SDS et des quantités décroissantes de SSC. On lave initialement les filtres avec un tampon contenant du SSC x 2 et on examine les filtres témoins contenant des plaques de M13-ßl non muté, quant à la présence d'une radioactivité quelconque, en utilisant un compteur de Geiger. On abaisse progressivement la concentration en SSC et on lave les filtres jusqu'à disparition de toute radioactivité détectable sur les filtres témoins avec des plaques de M13-ßl non muté. La plus faible concentration en SSC utilisée est de SSC x 0,1. On sèche les filtres à l'air et on les soumet à une autoradiographie à — 70 °C pendant 2 à 3 jours. Avec le modèle d'oligonucléotide traité par une kinase, on sélectionne 480 plaques de M13-ßl muté et 100 plaques témoins de M13-ßl non muté. Aucune des plaques témoins n'hybride avec le modèle, alors que 5 plaques de M13-ßl muté hybrident avec le modèle.

On recueille une des 5 plaques de M13-ßl muté (M13-SY2501) et on inocule dans une culture de JM 103. On prépare un ADN mono-caténaire à partir du liquide surnageant et un ADN bicaténaire à partir du culot de cellules. On utilise l'ADN monocaténaire comme copie pour la séquence didésoxy du clone avec le primaire universel M13. Le résultat de l'analyse de la séquence est reproduit sur la figure 6, confirmant que le codon cys TGT a bien été converti en un codon ser AGT.

Exemple 6 Expression d'IFN-ß muté dans E.coli

On fait digérer l'ADN RF de M13-SY2501 avec les enzymes de restriction HindIII et XhoII et on purifie le fragment d'insert 520 bp sur un gel d'agarose à 1 %. On fait digérer le plasmide pTrp3 contenant le promoteur trp E.coli (figure 7) avec les enzymes HindIII et BamHI, on mélange avec le fragment d'ADN M13-SY2501 purifié et on relie en présence de T4 ADN ligase. L'ADN ligaturé est transformé dans une souche MM294 de E.coli. On sélectionne les produits de transformation résistant à l'ampicilline, quant à leur sensibilité au médicament de tétracycline. On fait digérer l'ADN plasmique provenant de 5 clones résistant à l'ampicilline, sensibles à la tétracycline, avec Hinfl pour déterminer la présence de l'insert M13-SY2501. La figure 8a reproduit le mode de restriction par Hinfl d'un des clones (pSY2501), le comparant au mode de restriction par Hinfl du clone d'IFN-ß original, pßltrp. Comme attendu, on observe un site supplémentaire Hinfl dans pSY2501, coupant le fragment interne 197 bp IFN-ß en un fragment 169 bp et un fragment 28 bp (figure 8b). Une carte de restriction du clone pSY2501 est reproduite sur la figure 9. La séquence totale d'ADN du gène IFN-ß mutant est reproduite sur la figure 10 avec la séquence des acides aminés prévue.

Le plasmide désigné comme le clone pSY2501 est déposé auprès de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Center, Science and Education Administration, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 60604 et a reçu les numéros d'immatriculation CMCC n° 1533 et NRRL n° B-15356.

Les cultures de pSY2501 et pßltrp, qui comprennent leur descendance, sont poursuivies jusqu'à une densité optique (DOeoo) de 1,0. On prépare des extraits sans cellules et on détermine l'activité antivirale d'IFN-ß sur des cellules de GM2767 dans un micro-titrage. Les extraits du clone pSY2501 montrent une activité de 3 à 10 fois supérieure à celle de pßltrp (Tableau I), indiquant que le clone pSY2501 a synthétisé plus de protéine montrant une activité IFN-ß ou que la protéine obtenue a une activité spécifique supérieure.

Tableau I

Extrait Activité antivirale (U/ml)

pSY2501 6 x 105

pßltrp 1 x IO5

ptrp3 (témoin) 30

Pour déterminer si le clone pSY2501 a synthétisé plusieurs fois une protéine plus active, on soumet les extraits des deux clones à une électrophorèse sur un gel de Polyacrylamide SDS avec un extrait témoin et on colore le gel avec du bleu de Coomassie pour visualiser les protéines. Comme montré sur la figure 11, on n'observe qu'une seule bande de-protéine correspondant à une protéine apparente à 18 000 daltons, présente dans les extraits des clones pSY2501 et pßltrp, mais non dans l'extrait témoin ptrp3. Cette protéine qui a une masse moléculaire d'environ 20 000 daltons, mais montre un mode de migration sur gel d'une protéine de 18 000 daltons, s'est montrée au préalable être IFN-ß par purification de cette protéine à partir d'extraits de pßltrp. Etant donné qu'il y a une moindre quantité de cette protéine dans les extraits de pSY2501 que dans les extraits de pßltrp, l'activité spécifique de la protéine dans des extraits du clone pSY2501 est supérieure à celle du clone pßltrp.

Exemple 7 Purification de IFN-ßseri7

On recueille IFN-ßseri7 à partir de E.coli qu'on a transformé pour produire IFN-ßseri7- On cultive E.coli dans le milieu de culture suivant à une DO de 10 — 11 à 680 nm (poids sec 8,4 g.l).

Ingrédient Concentration

NH4C1 20 mM

K,S04 16,1 mM

KH2P04 7,8 mM

Na.HP04 12,2 mM

MgS04-7H20 3 mM

Citrate trisodique, di-hydraté 1,5 mM

MnS04 • 4HiO 30 nM

ZnS04 • 7HnÒ 30 nM

CuS04 • 5H20 3 nM

L-tryptophane 70 mg/1

FeS04 • 7H20 72 nM

Thiamine • HCl 20 mg/1

Glucose 40 g/1

Ajustement du pH avec NH4OH

On refroidit à 20 °C 9,9 litres (9,9 kg) de culture de E.coli transformé et on concentre en faisant passer la culture sur un filtre à écoulement transversal sous une chute de pression moyenne d'environ 110 kPa et un débit de filtrat constant de 260 ml/mn jusqu'à ce que le filtrat pèse 8,8 kg. On verse le produit concentré (environ un litre) dans une cuve et on refroidit à 15 °C. On rompt les cellules dans le produit concentré en le faisant passer sur un homogénéiseur de Manton-Gaulin à 5 °C, environ 69 000 kPa. On lave l'ho-mogénéiseur avec un litre de solution saline tamponnée au phosphate, de pH 7,4 (PBS) et on ajoute l'eau de lavage au produit de cellules brisées pour obtenir un volume final de 2 litres. On centrifuge ce volume en continu à 12 000 x g à un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

669 395

8

débit de 50 ml/mn. On sépare le solide du produit surnagent et on remet en suspension dans 4 litres de PBS contenant 2% en poids de SDS. On agite cette suspension à la température ambiante pendant 15 minutes, après quoi il n'y a plus de matériau visible en suspension. On extrait alors la solution avec du 2-butanol dans un rapport volumique 2-butanol/ solution de 1:1. On effectue l'extraction dans un séparateur de phases liquide-liquide avec un débit de 200 ml/mn. On sépare alors la phase organique et on évapore à sec pour obtenir 21,3 g de protéine. On remet cette dernière en suspension dans de l'eau distillée dans un rapport volumique de 1:10.

Dans le produit recueilli, on détermine l'activité IFN-ß humain au moyen d'un essai basé sur la protection contre l'effet cytopathique viral (CPE). L'essai est effectué sur des plaques de micro-titrage. Dans chaque puits, on introduit 50 |il de milieu essentiel minimum et dans le premier puits on place 25 (il de l'échantillon, dans les puits suivants on fait des dilutions en série selon un rapport volumique de 1:3. Sur chaque plaque, on dépose des témoins de virus (stomatite vésiculaire), de cellules (lignée de fibroplastes humains GM-2767) et d'IFN-ß. Le témoin IFN-ß est utilisé à raison de 100 unités par ml. On irradie ensuite les plaques avec une lumière UV pendant 10 minutes. Après l'irradiation, on ajoute 100 (il de la suspension de cellules (1,2 x 105 cellules/ml) dans chaque puits et on incube les plateaux pendant 18 à 24 heures. Dans chaque puits, à l'exception du témoin de cellules, on ajoute une solution de virus à raison d'une unité formant une plaque/cellule. On incube les plateaux jusqu'à ce que le témoin de virus montre un CPE de 100%. Ceci se produit généralement 18 à 24 heures après avoir ajouté la solution de virus. On interprète les résultats de l'essai quant à l'emplacement du puits à 50% de CPE du témoin IFN-ß de référence. On détermine à partir de ce point le titre en interféron pour tous les échantillons sur la plaque. L'activité spécifique du produit recueilli est évaluée à 5 x 107U/mg.

Exemple 8

Précipitation avec un acide et purification chromatographique

On répète le procédé de l'exemple 7, si ce n'est qu'après l'extraction et la séparation des phases aqueuse et organique et le mélange de la phase organique avec du PBS selon un rapport volumique de 3:1, on abaisse le pH du mélange vers 5 par addition d'acide acétique glacial. On sépare le précipité résultant par centrifugation à 10 000 —17 000 x g pendant 15 minutes et on redissout le culot dans du SDS à 10% en poids/volume, 10 mM de DTT, 50 mM de tampon d'acétate de sodium de pH 5,5 et on chauffe à 80 °C pendant 5 minutes.

On verse ensuite la solution sur une colonne «Aquapore» de Brownlee RP-300,10 |iM en utilisant un système de gradient de Beckman. Le tampon A est 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) dans H2O, le tampon B est 0,1% de TFA dans l'acétonitrile. La détection se fait par absorbance ultraviolette à 280 nm. Le solvant est programmé selon un gradient linéaire de 0% de tampon B à 100% de tampon B en 3 heures. On rassemble les fractions contenant les plus fortes activités en interféron et on détermine l'activité spécifique de la préparation d'interféron rassemblée comme étant de 9,0 x 107à3,8 x 108 unités internationales/mg de protéine, comparée à environ 2 x 108 U/mg pour IFN-ß natif.

Exemple 9

Caractérisation biochimique de IFN-ß sern

On détermine les compositions en acides aminés après une hydrolyse de 24 à 72 heures d'échantillons de 40 [il d'IFN dans 200 jil de HCl 5,7 N et 0,1% de phénol, à 108 °C. On détermine la proline et la cystéine de la même manière après une oxydation à l'acide performique; dans ce cas, on omet le phénol pour l'hydrolyse. On analyse le tryptophane après une hydrolyse de 24 heures d'échantillons de 400 |il dans HCl 5,7 N et 10% d'acide mercaptoacétique (sans phénol). On effectue l'analyse sur un analyseur pour acides aminés Beckman 121MB en utilisant une simple colonne de résine AA10.

La composition en acides aminés calculée à partir d'hydrolyses acides représentatives de 24,48 et 72 heures de IFN-ßSern purifié concorde bien avec celle prédite par la séquence d'ADN des clones du gène IFN, moins la méthionine N-terminale absente.

On détermine la séquence d'acides aminés des 58 premiers résidus de la terminaison acide aminé d'IFN purifié sur un échantillon de 0,7 mg dans un «Sequanator» Beckman 890C avec un tampon de Quadrol 0,1 M. On détermine les acides aminés de PTH par Chromatographie en phase liquide sous haute pression, en phase inversée, sur une colonne d'ultrasphères ODS Altex (4,6 x 250 mm) à 45 °C en éluant à 1,3 minute avec 40% de tampon A et à 8,4 minutes avec de 40 à 70% de tampon B, le tampon A étant constitué de 0,0115 M d'acétate de sodium et 5% de tétrahydrofuranne (THF), de pH 5,11, et le tampon B de 10% de THF dans l'acétonitrile.

La séquence d'acides aminés N-terminaux d'IFN-ßSern, déterminée, correspond à la séquence attendue, prédite à partir de la séquence d'ADN, si ce n'est l'absence de méthionine N-terminale.

Tel qu'indiqué ci-dessus, la préparation d'IFN-ßseri7 montre des taux d'activité spécifique très proches de, ou supérieurs à ceux d'IFN-ß natif. IFN-ßseri7 ne contient pas de groupes sulfhydryle libres, mais montre une liaison -S-S-entre les seules cystéines restantes en les positions 31 et 141. La protéine ne forme pas facilement d'oligomères et semble être pratiquement sous la forme monomère. IFN-ßsern obtenu selon l'invention peut être formulé comme un simple produit ou comme des mélanges de diverses formes, dans des préparations pharmaceutiquement acceptables avec des milieux de véhicules non toxiques, non allergisants, physiologi-quement acceptables, pour des utilisations cliniques et thérapeutiques dans la thérapie du cancer ou dans des conditions où une thérapie par l'interféron est indiquée, et dans le cas d'infections virales. Comme exemples de ces milieux, on citera sans que la liste en soit exhaustivée, l'eau distillée, une solution saline physiologique, une solution de Ringer, une solution de Hank et similaires. D'autres adjuvants de stabilisation et de solubilisation tels que le dextrose, la HSA (albumine sérique humaine) et autres peuvent être incorporés de manière optimale. Les formulations thérapeutiques peuvent être administrées par voie orale ou parentérale, tel que des administrations intraveineuses, intramusculaires, intrapéritonéales ou sous-cutanées. Les préparations d'IFN-ß modifié de l'invention peuvent également être utilisées pour des applications topiques dans des milieux appropriés, normalement utilisés dans ces cas.

Les principaux avantages de la mutéine de IFN-ß décrite ci-dessus résultent de l'élimination d'un groupe sulfhydryle libre en position 17 dans IFN-ß, forçant-ainsi la protéine à former des liaisons disulfure correctes entre cys 31 et cys 141 et à assumer la conformation ostensiblement requise pour une activité biologique totale. L'activité biologique plus élevée de IFN-ßseri7 permet l'emploi de plus faibles doses dans des administrations thérapeutiques. En supprimant la cystéine en position 17 et en éliminant le groupe -SH libre, la protéine IFN-ßsern ne forme pas de dimères, ni d'oligomères aussi facilement que l'IFN-ß produit par voie microbienne.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

669 395

Ceci facilite la purification de la protéine et augmente sa stabilité.

Exemple 10

La séquence de nucléotides pour un clone d'ADNc codant pour la IL-2 humaine, des modes opératoires pour préparer des registres d'ADNc de IL-2 et pour leur sélection quant à IL-2 sont décrits par Taniguchi T. et al., Nature (1983) 24, pages 305 et suivantes.

On obtient des registres d'ADNc enrichis en clones d'ADNc de IL-2, potentiels, à partir de fractions d'ARNm enrichies en IL-2 provenant de lymphocytes sanguins périphériques (PBL) et de cellules de Jurkat, par des procédés classiques. On enrichit l'ARNm quant au message IL-2 par un fractionnement de l'ARNm et une identification de la fraction ayant une activité ARNm de IL-2 par injection des fractions dans des oocytes de Xenopus laevis et en déterminant l'activité en IL-2 des lysats d'ooocytes sur des cellules HT-2 (J. Watson, J. Exp. Med. (1979) 150, pages 1570 — 1579 et S. Gillis et al., J. Immun. (1978) 120, pages 2027 - 2032).

Exemple 11 Sélection et identification de clones d'ADNc de IL-2 On sélectionne les registres d'ADNc de IL-2 en utilisant le procédé d'hybridation de colonies. On réplique chaque plaque de micro-titrage sur des papiers filtres en nitrocellulose (S & S type BA-85) (essais en double) et on laisse se développer des colonies à 37 °C pendant 14 à 16 heures sur de la gélose L contenant 50 ng/ml d'ampicilline. On lyse les colonies et on fixe l'ADN sur le filtre par un traitement séquentiel pendant 5 minutes avec 500 mM de NaOH, 1,5 M NaCl, on lave deux fois pendant 5 minutes chaque fois avec la solution saline de citrate standard (SSC) 5 fois concentrée. On sèche les filtres à l'air et on cuit à 80 °C pendant 2 heures. On pré-hybride les filtres en double à 42 °C pendant 6 à 8 heures avec 10 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN (50% de formamide, SSC x 5, pH de 7,0, solution de Denhardt x 5 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine; 1 fois = 0,2% de chacune de ces substances), 50 mM de tampon de phosphate de sodium à un pH de 7,0, 0,2% de SDS, 20 |ig/ml de Poly U et 50 ng/ml d'ADN dé sperme de saumon dénaturé.

On prépare un modèle d'oligonucléotide 20-mère marqué à 32p d'après la séquence du gène IL-2 rapportée par Taniguchi T. et al., voir ci-dessus. La séquence de nucléotides du modèle est GTGCCTTCTTGGGCATGTA.

On hybride les échantillons à 42 °C pendant 24 à 36 heures avec 5 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN contenant le modèle d'ADNc marqué à 32P. On lave les filtres avec 2 fois SSC x 2 et 0,1% de SDS à 50 °C pendant 30 minutes chaque fois, puis on lave avec deux fois SSC x 1, 0,1 % de SDS à 50 °C pendant 90 minutes chaque fois, on sèche à l'air et on autoradiographie à — 70 °C pendant 2 à 3 jours. On identifie les clones positifs et on les sélectionne de nouveau avec le modèle. On identifie de pleines longueurs de clones et on confirme en établissant une carte d'enzymes de restriction et par comparaison avec la séquence du clone d'ADNc de IL-2 rapportée par Taniguchi T. et al., ci-dessus.

Exemple 12 Clonage du gène IL-2 dans le vecteur Ml3 On clone le gène IL-2 dans M13mp9 tel que décrit dans l'exemple 1 en utilisant le plasmide pLWl (figure 12) contenant le gène IL-2 sous le contrôle du promoteur trp E.Coli. Un échantillon de pLWl est déposé dans l'American

Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mary 20852 US, depuis le 4 août 1983 et a reçu le numéro ATCC 39 405. La carte de restriction d'un clone (appelé M13-IL2) contenant l'insert de 11-2 est reproduite sur la figure 13. On prépare un ADN de phage mono-caténaire à partir du clone M13-IL2 pour servir de copie pour la mutagénèse dirigée sur oligonucléotide.

Exemple 13 Mutagénèse dirigée sur oligonucléotide Tel qu'indiqué précédemment, IL-2 contient des résidus cystéine sur les positions des acides aminés 58,105 et 125. A partir de ces séquences de nucléotides des portions du gène IL-2 qui contiennent les codons pour ces trois résidus cystéine, on construit trois oligonucléotides primaires et on les synthétise pour une mutation des codons pour ces résidus en codons pour la sérine. Ces oligonucléotides ont les séquences suivantes:

CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (DM27)

pour changer cys 58, CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM 28)

pour changer cys 105 et GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM 29)

pour changer cys 125.

On traite séparément avec une kinase 40 picomoles de chaque oligonucléotide en présence de 0,1 mM d'ATP, 50 mM de Tris-HCl, de pH 8,0,10 mM de MgCb, 5 mM de DTT et 9 unités de T4 kinase dans 50 (0.1 à 37 °C pendant 1 heure. On hybride chacun des primaires traités avec une kinase (10 pmoles), avec 2,6 jag d'ADN M13-IL2 monocaténaire dans 15 (il d'un mélange contenant 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl de pH 7,9,20 mM de MgCl2 et 20 mM de ß-mercaptoethanol, en chauffant à 67 °C pendant 5 minutes et à 42 °C pendant 25 minutes. On refroidit les mélanges ainsi traités sur de la glace et on ajuste à un volume final de 25 |xl d'un mélange de réaction contenant 0,5 mM de chaque dNTP, 17 mM de Tris-HCl de pH 7,9,17 mM de MgCl2, 83 mM de NaCl, 17 mM de p-mercaptoéthanol, 5 unités d'ADN polymérase I, fragment Klenow, 0,5 mM d'ATP et 2 unités de T4 ADN ligase, on incube à 37 °C pendant 5 heures. On termine les réactions en chauffant à 80 °C et on utilise les mélanges réactionnels pour transformer des celluloses de JM103 compétentes, on dépose sur des plaques de gélose et on incube pendant une nuit pour obtenir des plaques de phages.

Exemple 14 Sélection et identification des plaques de phages ayant subi une mutagénèse On refroidit à 4 °C des lames contenant des plaques de M13-IL2 ayant subi une mutagénèse ainsi que 2 lames contenant des plaques de phage. M13-IL2 non soumis à une mutagénèse et on transfère les plaques de phages de chaque lame sur deux filtres circulaires en nitrocellulose en déposant un filtre sec sur la plaque de gélose pendant 5 minutes pour le premier filtre et pendant 15 minutes pour le second filtre. On place alors les filtres sur des papiers filtres épais imprégnés dans NaOH 0,2 N, NaCl 1,5 M et 0,2% de Triton pendant 5 minutes, puis on neutralise en déposant sur les filtres des papiers filtres imprégnés avec 0,5 M de Tris-HCl de pH 7,5 et 1,5 M de NaCl pendant 5 autres minutes. On lave deux fois les filtres d'une manière analogue sur des filtres imprégnés de SCC x 2, on sèche et on cuit dans une étuve à vide à 80 °C pendant 2 heures. On pré-hybride les filtres en double à 42 °C pendant 4 heures avec 10 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN (SSC x 5, pH de 7,0, solution de Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine, 1 fois = 0,02% de chacune de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

669395

10

ces substances)), 0,1% de SDS, 50 mM d'un tampon de phosphate de sodium de pH 7,0 et 100 |xg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. On prépare des modèles marqués à 32P en traitant par une kinase les primaires oligonucléotides avec ATP marqué. On hybride les filtres avec 0,1 x 105 cpm/ml de primaires marqués à 32P dans 5 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN à 42 °C pendant 8 heures. On lave deux fois les filtres à 50 °C pendant 30 minutes chaque fois dans des tampons de lavage contenant 0,1% de SDS et SSC x 2, et deux fois à 50 °C pendant 30 minutes chaque fois avec 0,1% de SDS et SSC x 2. On sèche les filtres à l'air et autoradiographie à — 70 °C pendant 2 à 3 jours.

Etant donné qu'on a construit les oligonucléotides primaires DM28 et DM29 pour créer un nouveau site de restriction Ddel dans les clones ayant subi une mutagénèse (figure 14), on a fait digérer ADN-RF de plusieurs clones hybridés avec chacun des primaires traités par une kinase, avec l'enzyme de restriction Ddel. On recueille une des plaques M13-IL2 ayant subi une mutagénèse, hybridée avec le primaire DM28 et ayant un nouveau site de restriction Ddel (M13-LW44) et on inocule dans une culture de JM103, on prépare un ADN monocaténaire à partir du liquide surnageant dans la culture et on prépare un ADN-RF bicaténaire à partir du culot de cellules. De la même manière, on recueille une plaque hybridée avec le primaire DM29 (M-13-LW46) et à partir de cette plaque on prépare un ADN monocaténaire et un ADN-RF. Le primaire oligonucléotide DM27 a été conçu pour créer un nouveau site de restriction au lieu d'un site Ddel. En conséquence, on sélectionne les plaques hybridées avec ce primaire quant à la présence d'un nouveau site PstI On identifie une telle plaque de phages (M13-LW42) et à partir de cette plaque on prépare un ADN monocaténaire et un ADN-RF. On analyse les séquences d'ADN de ces trois clones pour confirmer que les codons cible TGT pour la cystéine ont bien été convertis en un codon TCT pour la sérine.

Exemple 15 Reclonage du gène II—2 ayant subi une mutagénèse pour l'expression dans E.coli

On fait digérer séparément les ADN-RF de M13-LW42, M13-LW-44 et M13-LW46 avec des enzymes de restriction HindII et Banll et on purifie les fragments d'inserts à partir d'un gel d'agarose à 1 %. De la même manière, on fait digérer le plasmide pTrp3 (figure 7) avec HindIII et Banll, on purifie le grand fragment de plasmide contenant le promoteur trp sur un gel d'agarose et on le relie avec chacun des fragments d'inserts isolés à partir de M13-LW42, M13-LW44 et M13-LW46. On transforme les plasmides liés dans une souche MM294 de E.coli K 12, compétente. On analyse les ADN plasmiques provenant de ces produits de transformation en établissant la carte des enzymes de restriction pour confirmer la présence des plasmides pLW42, pLW44 et pLW46. La figure 14 reproduit une carte de restriction de pLW46. Lorsque chacun des clones individuels est développé en l'absence de tryptophane pour induire le promoteur trp et qu'on analyse les extraits libres de cellules sur des gels de SDS-polyacrylamide, ces trois clones, pLW42, pLW44 et pLW46, s'avèrent capables de synthétiser une protéine 14,5 kd semblable à celle trouvée dans le témoin positif, pLW21, qui s'est avéré capable de synthétiser une protéine 14,4 kd IL-2. Lorsque ces mêmes extraits sont examinés quant à leur activité en II —2 sur des cellules HT-2 de souris, seuls les clones pLW21 (témoin positif) et pLW46 montrent des quantités significatives d'activité IL-2 (Tableau II ci-dessous), indiquant que cys 58 et cys 105 sont nécessaires pour l'activité biologique et que leur changement en sérines (pLW42 et pLW46 respectivement) se traduit par une perte de l'activité biologique. Cys 125 d'autre part ne doit pas être nécessaire pour l'activité biologique car son changement en ser 125 (pLW46) n'affecte pas l'activité biologique.

Tableau II

Clones Activité IL-2 (u/ml)

pIL2-7 (témoin négatif) 1

pLW21 (témoin positif) 113 000

pLW42 660

pLW44 1 990

pLW46 123 000

La figure 15a reproduit la séquence de nucléotides de la chaîne codante du clone pLW46. Par comparaison avec la chaîne codante du gène IL-2 humain natif, le clone pLW46 montre un simple changement de base de G->C sur le nucléotide 374. La figure 15b reproduit la séquence d'acides aminés correspondante de la mutéine IL-2 codée par pLW46. Cette mutéine est désignée par IL-2seri25< Par comparaison avec 11—2 natif, la mutéine a une sérine au lieu d'une cystéine en position 125.

Un échantillon de la souche MM294 de E.coli K 12, transformé avec pLW46 est déposé dans l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, US depuis le 26 septembre 1983 et a reçu le numéro ATCC 39 452.

Les mutéines de IL-2 dans lesquelles la cystéine en position 125 a été supprimée ou remplacée par un autre acide aminé, telles que la mutéine II — 2seri25, conservent l'activité II —2. Elles peuvent donc être formulées et utilisées de la même manière que IL-2 natif. En conséquence, des mutéines IL-2 sont utilisables dans le diagnostic et le traitement des infections bactériennes, virales, parasitaires, protozoaires et fongiques; dans des manifestations de lym-phokine ou d'immuno-déficience; pour la reconstitution de fonctions immunes normales chez les êtres humains et les animaux âgés; dans le développement de dosages diagnostiques tels que ceux utilisés dans l'amplification des enzymes, le radiomarquage, la radiovisualisation et d'autres procédés connus dans la technique de surveillance des taux de IL-2 chez un malade; pour la promotion du développement des cellules T in vitro dans des buts thérapeutiques et de diagnostic pour le blocage des sites récepteurs pour les lymphokines; et dans diverses autres applications thérapeutiques, de diagnostic et de recherche. Les diverses applications thérapeutiques et de diagnostic de IL-2 humain ont été étudiées et rapportées par S.A. Rosenberg, E.A. Grimm et al., A. Mazumder et al., et E.A. Grimm et S.A. Rosenberg. Les mutéines de 11-2 peuvent être utilisées par elles-mêmes ou en association avec d'autres cellules B ou T immunologi-quement applicables ou d'autres agents thérapeutiques. Pour des applications thérapeutiques ou de diagnostic, elles peuvent être formulées dans des milieux de véhicules non toxiques, non allergisants, physiologiquement acceptables, tels que l'eau distillée, une solution de Ringer, une solution de Hank, une solution saline physiologique et autres. Les administrations des mutéines IL-2 à des honoutnes ou à des animaux peuvent se faire par voie orale ou intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée, selon l'avis du médecin. Comme exemples de cellules applicables, on citera les cellules B ou T, les cellules tueuses naturelles et autres, et comme réactifs thérapeutiques utilisables en association avec les pólypeptides de l'invention, on citera à titre d'exemples les divers interférons, en particulier le gamma interféron, le facteur de croissance des cellules B, IL-1 et autres.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

S

6 feuilles dessins

Claims

669 395

2

REVENDICATIONS

1. Mutéine synthétique d'une protéine biologiquement active ayant au moins un reste cystéine capable de former une liaison disulfure et non essentiel à l'activité biologique, caractérisée en ce que la mutéine a au moins un des restes cystéine remplacé par un autre acide aminé.
2. Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il y a seulement un reste cystéine capable de former une liaison disulfure et non essentiel à l'activité biologique.
3. Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que les restes cystéine sont remplacés par la sérine, la thréonine, la glycine, Falanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, l'histidine, la tyrosine, la phénylalanine, le tryptophane ou la méthionine.
4. Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que les restes de cystéine sont remplacés par la sérine ou la thréonine.
5. Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mutéine n'est pas glycosylée.
6. Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine est IFN-ß, IL-2, la lymphotoxine, le facteur 1 stimulant les colonies ou IFN-al.
7. Mutéine synthétique selon la revendication 1 qui est la mutéine interleukine-2 recombinante dans laquelle le reste cystéine en position 125, numérotée comme dans l'interleu-kine-2 native humaine, est remplacé par un acide aminé neutre, cette mutéine présentant l'activité biologique de Finterleukine-2 native humaine.
8. Mutéine synthétique selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit acide aminé neutre est la sérine.
9. Désalanyl-interleukine-2(série 125) recombinante à titre de mutéine synthétique selon la revendication 1.
10. Interleukine-2(sérine 125) recombinante à titre de mutéine synthétique selon la revendication 1 présentant l'activité biologique de l'interleukine-2 native humaine et ayant la séquence d'acides aminés dérivée, représentée dans la figure 15b.
11. Mutéine selon les revendications 7 et 10 qui est sous la forme non glycosylée.
12. Mutéine interferon-ß synthétique recombinant selon la revendication 1, caractérisée en ce que le reste cystéine en position 17, numérotée comme dans l'interferon-ß natif, est remplacé par un acide aminé neutre, la mutéine présentant l'activité biologique de l'interféron-p humain natif.
13. Mutéine synthétique selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit reste cystéine est remplacé par un acide aminé du groupe formé par la sérine, la thréonine, la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, l'histidine, la tyrosine, la phénylalanine, le tryptophane et la méthionine.
14. Mutéine synthétique selon la revendication 12, caractérisée en ce que le reste cystéine est remplacé par la sérine ou la thréonine.
15. Mutéine synthétique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme non glycosylée.
16. Mutéine IFN-ß (sérine 17) recombinante, biologiquement active, selon la revendication 12.
17. Mutéine IFN-ß (sérine 17) recombinante biologiquement active, selon la revendication 16, représentée par la séquence d'acides aminés représentée dans la fig. 10.
18. Gène structural ayant une séquence d'ADN qui code pour la mutéine synthétique selon l'une des revendications 1 à 17.
19. Procédé de production d'une mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive un organisme hôte ou sa descendance, transformé avec un vecteur d'expression comprenant le gène structural selon la revendication 18, et l'on recueille la mutéine synthétique à partir de la culture.
20. Procédé pour produire un gène selon la revendication 18, caractérisé en ce que:

(a) on hybride un ADN mono-caténaire comprenant une chaîne d'un gène structural qui code pour la protéine, avec un primaire oligonucléotide mutant qui est complémentaire de la région de ladite chaîne qui comprend le codon pour le reste cystéine ou le triplet «non-sens» apparié au codon,

selon le cas, si ce n'est un mauvais assortiment avec le codon ou le triplet «non-sens» qui code pour l'autre acide aminé;

(b) on prolonge le primaire avec l'ADN polymérase pour former un hétéroduplex de mutation;

(c) on réplique l'hétéroduplex de mutation, et

(d) on procède aux stades de l'isolement de la descendance de la chaîne mutante de l'hétéroduplex, de l'isolement de l'ADN de ladite descendance, et de l'isolement du gène à partir de l'ADN de la descendance.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le mauvais assortiment définit un triplet qui code pour la sérine ou la thréonine.
22. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'ADN mono-caténaire est un phage mono-caténaire qui comprend ladite chaîne, et l'hétéroduplex de mutation du stade (b) est converti en un hétéroduplex circulaire fermé.
23. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la réplication est effectuée en transformant un hôte bactérien compétent avec l'hétéroduplex circulaire fermé et en cultivant les produits de transformation résultants.
24. Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que la protéine est l'IFN-ß humain, le reste cystéine est en position 17 et le mauvais assortiment définit un codon pour la sérine.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la chaîne est la chaîne «non-sens» d'IFN-ß et le primaire oligonucléotide mutant est GCAATTTTCAGAGTCAG.
26. Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que la protéine est IL-2 humaine, le reste cystéine est en position 125 et le mauvais assortiment définit un codon qui code pour la sérine.
27. Oligonucléotides en tant que moyen pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 20 par une mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide, caractérisé en ce que l'oligonucléotide a une séquence de nucléotides complémentaire de la région de la chaîne du gène structural qui comprend le codon pour le reste cystéine ou le triplet «non-sens» apparié audit codon, selon le cas, si ce n'est un mauvais assortiment avec le codon ou le triplet «non-sens» qui code pour l'autre acide aminé.
28. Composition thérapeutique ou diagnostique d'infections bactériennes, virales, parasitaires, protozoaires et fongiques; pour détecter ou traiter des manifestations de lymphokine ou d'immuno-déficience; pour la reconstitution de fonctions immunes normales chez les sujets ou animaux âgés; pour le développement de dosages diagnostiques utilisés dans l'amplification des enzymes, le radiomarquage, la radiovisualisation et la surveillance générale des taux d'interleukine-2 chez un malade; pour la promotion du développement des cellules T in vitro en vue de blocage des sites récepteurs pour les lymphokines, comprenant (a) une quantité efficace d'une mutéine synthétique selon la revendication 7 et (b) un véhicule inerte, non allergénique et pharmaceutiquement acceptable.
29. Composition selon la revendication 28, caractérisée en ce que la mutéine est la désalanyl-interleukine-2(sérine 125), et que le véhicule est de l'eau distillée, la solution de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

669 395

Ringer, la solution de Hank ou une solution saline physiologique.
30. Composition, comprenant

(a) une mutéine selon la revendication 7, et

(b) un polypeptide choisi parmi le gamma interféron, le facteur de croissance des cellules B, et l'IL-1.
31. Composition thérapeutique ayant une activité d'IFN-ß humain, comprenant une quantité thérapeutique-ment efficace de la mutéine synthétique selon les revendications 12,13 ou 16, en mélange avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.