MC1424A1 - Interferons de leucocytes humains hybrides et procede pour leur preparation microbiologique - Google Patents

Description

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La présente invention concerne la production microbienne, par la technologie de l'AON recombinant, d1 interférons de leucocyte hybrides aux Fins d'application dans le traitement des maladies virales et néoplasiques, 5 et les moyens et produits Fihaux d'une telle production.

On a obtenu des interférons de leucocyte relativement homogènes à partir de leucocytes de donneurs normaux ou leucémiques. Ces interférons sont une famille de protéines caractérisées par une puissante aptitude à conférer un 10 état de résistance aux virus à leurs cellules-cibles.

En outre, l'interféron peut agir pour inhiber la prolifération cellulaire et moduler la réponse immunitaire. Ces propriétés ont incité à l'application clinique de l'interféron comme agent thérapeutique pour le traitement des 15 infections virales et des états malins.

Plus récemment, on a employé la technologie de l'ADN recombinant pour déclencher la production microbienne d'un certain nombre d*interférons de leucocyte différents dont la séquence' d'acides aminés présente une homologie de 20 l'ordre de 70% l'une par rapport à l'autre, le tout de la manière décrite par David V. Goeddel et coll. [Nature 290, 20-2S • C19B1D3• Les gènes encodant les séquences d'acides aminés de divers interférons de leucocyte appelés, entre autres, LeIF A, 3, C, D, F, G et H, respectivement, 25 s'obtiennent à partir de la lignée cellulaire K3-1 décrite •par Koeffler, H.P. et Golde, Q.W. [Science 200, 11-53-1154 C*1978} 3, par David V. Goeddel et Sidney Pestka. La lignée cellulaire KG-1 a été déposée à 1'American Type Culture Collection, ATCC n° CHL 8031. Ces gènes, correcte— 30 ment déployés.dans des véhicules plasmxdiques d'expression bactérienne, peuvent être employés pour transformer les bactéries-hôtes, de préférence £. coli K-12 souche 234,

ATCC n° 3144G, déposée le 28 octobre 1378.

La cheville ouvrière de la technologie de 1' AON 35 recombinant est le plasmide, boucle non-chromosomique

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d'ADN à deux brins quei l'on ."trouve chez les bactéries et d'autres microbes, souvent à de multiples exemplaires par cellule.. Dans l'information encodée dans l'ADN du plasmide est comprise celle qui est nécessaire pour reproduire le plasmide dans les cellules filles Ce'est-à-dire un "réplicon"} et, ordinairement, une ou plusieurs caractéristiques de sélection comme, dans le cas des bactéries, la résistance aux antibiotiques qui permet à des clones de la cellulose contenant le plasmide en question d'être reconnus et cultivés préférentiellement dans des milieux sélectifs, L'utilité des plasmides tient au fait qu'ils peuvent être spécifiquement clivés par l'une ou l'autre des endonucléases de restriction ou "enzymes de restriction", dont chacune reconnaît un site différent sur l'ADN plasmi-dique. On peut ensuite insérer des gènes ou fragments de gènes hétérologues dans le plasmide en les adjoignant à la suite au site de clivage ou aux extrémités reconstruites adjacentes au site de clivage. La recombinaison de l'ADN s'effectue à l'extérieur de la cellule, mais le plasmide "recombinant" qui en résulte peut y être introduit par un processus connu sous le nom de transformation et- l'on obtient de grandes quantités de plasmide recombinant contenant le gène hétérologue en cultivant le transformant. De plus, lorsque le gène est correctement inséré par rapport aux fractions du plasmide qui gouverne la transcription et la traduction du message d'ADN encodé, le véhicule d'expression obtenu peut être utilisé pour produire effectivemant la séquence polypeptidique pour laquelle le gène inséré code, processus appelé expression.

L'expression est amorcée dans une région connue sous le nom de promoteur qui est reconnue et liée par l'ARN polymérase. Dans certains cas, comme dans le promoteur de tryptophane ou "trp" préféré dans la pratique de l'invention, les régions promotrices se chevauchent;

avec des régions "opératrices" pour former un promoteur-

opérateur combiné. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par ce qu'on appelle des protéines répresseurs qui servent à régler la Fréquence d'initiation de transcription à un promoteur particulier. La polymérase se déplace le long de l'AON, transcrivant l'information contenue dans le brin d'encodage de son extrémité 5' à son extrémité 3' dans un ARN messager qui est à son tour traduit en un polypeptide .ayant la séquence d'acides aminés pour laquelle l'AON code. Chaque acide aminé est encodé par un triplet de nucléotides ou "codon" au sein de ce qu'on peut appeler dans l'optique présente le "gène de structure", c'est-à-dire la partie qui encode la séquence d'acides aminés du produit exprimé. Après s'être liée au promoteur, l'ARN polymérase commence par transcrire les nucléotides qui encodent un site de liaison ribosomique, puis un signal d'initiation de traduction ou signal "départe [ordinairement ATG, qui dans l'ARN messager résultant devient AUG], puis les codons de nucléotides dans le gène de structure lui-même. Ce qu'on appelle des codons d'arrêt sont transcrits à l'extrémité 'du gène de structure, après quoi la polymérase peut former une séqqspce additionnelle d'ARN messager qui, à cause de la présence du signal d'arrêt, restera non traduite par les ribosomes. Les ribo-somes se fixent au site de liaison ménagé sur l'ARN messager, chez les bactéries ordinairement au fur et à mesure que l'ARNm est formé, et produisent eux-mêmes le polypeptide encodé, en commençant au signal de départ de traduction et en finissant au signal d'arrêt mentionné ci-dessus. Le produit désiré est produit si les séquences qui encodenr le site de liaison ribosomique sont positionnées correctement vis-à-vis du codon d'initiation AUG et si tous les codons restants suivent le codon d'initiation en phase. Le produit résultant peut être obtenu en lysant la cellule-hofce et en recueillant le produit par une purification appropriée à partir d'autres protéines bactériennes.

Le.s études de séquences nucléotidiques de gènes encodant les divers interférons de leucocytes révèlent un certain degré de similitude entre plusieurs d'entre eux quant à la présence et à la localisation de sites de clivage reconnus par des endonucléases de restriction particulières. Selon l'invention, on peut tirer parti de cette similitude pour former, par recombinaison de l'AON, de nouveaux gènes hybrides utiles dans la production microbienne d*interférons de leucocytes hybrides dont on peut s'attendre qu'ils présentent dans une plus ou moins grande mesure les propriétés antivirales ou autres des interférons encodés par les gènes parentaux. Dans les modes de réalisation préférés de l'invention, de tels interférons de leucocytes hybrides peuvent présenter une activité améliorée par rapport à ceux qui sont encodés par les gènes parentaux.

Les gènes d'interférons de leucocytes parentajx, encodant la famille des protéines d'interférons de leucocytes ici considérée, présentent des variations alléliques naturelles d'un individu à l'autre. Ces variations peuvent être mises en évidence par une ou plusieurs différences d'acides aminés dans la séquence protéique globale ou par des délé-tions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'un ou de plusieurs acides aminés dans ladite séquence.

Pour chaque interféron de leucocyte parental ici envisagé, dénoté LeIF A, LeIF B ... LeIF J, etc, ces variations - alléliques sont comprises dans la portée de la désignation ou du terme définissant ainsi ces interférons, et de cette manière l'invention.

La manière dont ces objets et avantages de l'invention, ainsi que d'autres, sont obtenus, apparaîtra mieux d'après la description détaillée qui suit et d'après les dessins joints, où:

La figure 1 représente la séquence nucléotidique des régions d'encodage de huit clones d'AON complémentaire CAONc] d'interférons de leucocytes C"t-eIF"]. Parmi celles-ci,

l'une, désignée de manière correspondante par LeIF E,

est un "pseudogène" apparent n'encodant pas d'interféron de leucocyte actif tandis qu'une autre, désignée par LeIF G, ne contient pas la séquence entière de l'espèce d'interféron correspondante. Le codon d'initiation de traduction ATG et le triplet de terminaison de chaque LeIF sont soulignés.

La figure 2 représente les cartes d'endonuoléases de restriction de huit types d'ADNc clonés de LeIF CA à H}. Les plasmides contenant les clones ont été construits par le procédé d'allongement dC : dG [Goeddel] . V. et coll.

Nature 287, 411-41S [19803]. On peut donc exciser les insertions d'ADNc en utilisant Pst I, c'est-à-dire que chaque extrémité de chacune des insertions est un. .site de clivage d'endonucléqse de restriction Pst I. Les traits à l'extrémité de chaque.insertion d'ADNc représentent les queues homopo— lymériques latérales dC:dG. Les positions des si tes-de restriction Pvu II, Eco RI et Bgl II sont indiqués. Les régi ens pointillées de la figure représentent les séquences d'encodage de LeIF mursj les régions hachurées indiquent les séquences d'encodage des peptides signaux; et les régions blanches montrent les séauences non codantes 3' et 5'.

La figure 3 est une comparaison des huit séquences protéiques de LeIF prédites d'après les séquences nucléoti-diques. On utilise les.abréviations à une lettre recommandées par la Commission de nomenclature biochimique de l'UICPA-UIB ClUPAC-IUG]: A, alanine; C, cystéine; D, acide aspartique; £, acide glutamique; F, phénylalanine; G, glycine; H, his-tidine; I, isoleucine; K, lysine; L, leucinë; M, méthionine; N, asparagine; P, proline; Q, glutamine; R, arginine; S, serine; T, thréonine; V, valine; W, tryptophane; et Y, tyro-sine. Les numéros se réfèrent à la position des acides aminés [S désigne le peptide signal]. Le tiret en position 44 de la séquence de 153 acides aminés du LeIF A est introduit pour aligner la séquence du LeIF A avec les séquences à 1B6 acides aminés des autres LeIF. On détermine la

s séquence du LeIF E en négligeant le nucléotide supplémentaire [position 137 de la Figure 1} dans sa région d'encodage. Les astérisques indiquent les codons de terminaison en phase. Les acides aminés communs à tous les LeIF [non compris le ' S pseudogène LeIF E] sont également montrés. Les résidus soulignés sont des acides aminés qui sont également présents dans l'interféron de Fibroblaste. ihumain.

Si l'on se réFère à la Figure 1, les nucléotides +1 à S9 correspondent aux acides aminés S1 à S23 de la i

10 Figure 3. Le codon TGT [nucléotides 70 à_72] de la Figure 1 correspond à la cystéine [C, acide aminé 1] de la Figure 3. Dans la Figure 3, le site de clivage de 1'endonucléase de . restriction Pvu II se situe entre les codons donnant les acides aminés 92 et 93 dans LeIF A, B, D, F et G, c'est-à-15 dire les nucléotides 34S et 347 de la Figure 1.

La Figure 4 compare les séquences d'acides aminés dés interFérons de leucocytes mûrs A et Q,-une délétion ce 1'acide aminé 44 dans LeIF A étant indiquée par des tirs.s. Seuls les acides aminés du LeIF D qui diFFèrent des acides 20 aminés correspondants du LeIF A sont représentés: la séquence d'acides aminés du LeIF D est par ailleurs identique à celle du LeIF A. La Figure 4 indique également la position relative sur le gène correspondant des sites de clivage des endonucléases de restriction Bgl II et Pvu II employés 25 pour Former les gènes de leucocytes hybrides préFérés de l'invention. - '

Les Figures 5 et o illustrent les résultats d'une mesure comparative de l'activité d'un interFéron de leucocyte hybride préFéré de l'invention [."LeIF-A/D"] vis-à-»vis 30 du virus de 1 ' encéphalomyocardi te ["£MC"3 et du virus de l'a stomatite vésiculaire ["VSV"D, respectivement, dans des cellules de souris.

Les Figures 7 et Q décrivent les résultats d'expériences comparatives mettant en jeu le LeIF-A/D et d'autres 35 interFérons contre des inFections à virus l£MC chez des

S

souris et des hamsters, respectivement. Les données de la figure 7 résultent de traitements i.p. 3 h avant l'infection. Les doses de LeIF—A/0 et de LeIF-A sont telles que titrées sur cellules WISH.

La figure S fournit la séquence d'AON de cinq . protéines de LeIF de 1 invention, y compris les types I et J.

Microorganismes employés

Les travaux décrits font appel^.à deux microorganismes: E. coli x1776, tel que décrit dans le brevet américain.n° 4 190 495, et E. coli K-12 souche 294 [extrémité A, thi~ , hsr~* , ], tel que décrit: dans le brevet anglais n° 2 055 382 A. Tous deux ont été déposés à l'Ameri-càn Type Culture Collection,"n° ATCC 31527 et 31446, déposés le 3 juillet 1979 et le 2B octobre 1S7S, respectivement. Tous les travaux sur l'ADN recombinant ont été effectués selon les directives applicables des instituts nationaux de la Santé [National Instituées of Health].

L'invention, dans ses modes de réalisation les plus appréciés, est décrite avec référence à £. coli, comprenant non seulement les souches E. coli x 1776 et E. coli K-12 souche 294, définies ci-dessus, mais aussi d'autres souches d'E. coli connues comme E. coli B, ou d'autres souches microbiennes dont beaucoup sont déposées auprès d'institutions reconnues de dépôts de microorganismes, comme 1'American Type Culture Collection, ATCC, et y sont [potentiellement] disponibles. CVoir la liste du catalogue ATCC ainsi que la demande de brevet publiée en Allemagne sous le n° 2 644 432], Ces autres microorganismes comprennent, par exemple, des bacilles comme Bacillus subtilis et d'autres entérobactériacées parmi lesquelles on peut mentionner comme exemples Salmonella typhimurium et Serratia tnarcescens, utilisant des plasmides qui peuvent répliquer et exprimer les séquences de gènes hétérologues qui s'y trouvent.

Il peut être également intéressant d'employer une levure, comme Saccharomyces cerevisiae, comme organisme-hôte dans la préparation des présentes protéines d'interférons par expression de gènes qui en donnent le code sous la commande d'un promoteur de levure.

Selon l'invention, on prépare les hybrides de LeIF en tirant parti des sites de clivage d*endonucléases de restriction communément situés dans les gènes parentaux individuels et de chacune de leurs extrémités en conjonction avec les mêmes sites dans les plasmides d'expression supports [vecteurs]. Ainsi, le grand Cenv. 3900 pb] fragment d'un produit de digestion de Xba I à Pst I du plasmide d'expression de pLelF A trp 25 peut être lié avec les fragments de digestion de Xba I à Pvu II et de Pvu II à Pst I des divers gènes parentaux de..LeIF pour fournir des plasmides d'expression que l'on peut faire fonctionner pour obtenir le LeIF hybride correspondant.

Chaque plasmide d'expression de LeIF est construit indépendamment avec des fragments de digestion isolés d'après divers plasmides de LeIF, p. ex. pLelF A trp 25, pLelF B trp 7, pLelF C trp 35, pLelF D trp 11, pLelF F trp 1, pLelF 6, pLelF H, et pLelF I, etc, dont la construction est décrite dans Nature 287, 411 [1990] ou d'après pBR322, dont la construction est décrite dans Gene 2^, 95 [1977], Dans certains de ces plasmides, "trp" désigne un système promoteur-opérateur tryptophane particulièrement apprécié pour l'expression bactérienne, comme il est dit dans lé demande de brevet européen publiée sous le n°

36776.

Expression directe d'un premier interféron de leucocyte mûr

Le procédé suivi pour exprimer LeIF A directement comme polypeptide d'interféron mûr fait intervenir la combinaison des ADN de synthèse [N-terminal].et complémentaire.

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Un site d'endonucléase de restriction Sau 3a est communément situé entre les codons 1 et 2 de LeIF A. On a conçu deux désoxyoligonucléotides de synthèse qui incorporent un codon d'initiation de traduction ATG, restaurent 5 le codon de l'acide aminé 1 Ccystéine] et créent une extrémité agglutinante Eco RI. Ces oligomères sont liés à un fragment Sau 3a - Ava II à 34 pb de pL31 . Le produit à 45 pb obtenu est lié à deux fragments d'ADN supplémentaires pour construire un gène hybride synthétique-naturel à 865 paires 10 de bases qui code pour LeIF A et qui estlimité par les sites de restriction Eco RI et Pst I. Ce gène est inséré en pBR322 entre les sites Eco RI et Pst I pour donner le plasmide pLeIF-A1.

Le plasmide pGMl porte l'opéron tryptophane d'£. 15 coli contenant la délétion ^5sLEl413 CG.F. Miozzari et coll., J. Bacteriology 133, 1457-1466 [1978}] et donc exprime une protéine de fusion comprenant les six premiers acides aminés de la séquence directrice trp et environ à'e dernier tiers du polypeptide trp E [appelé ci-dessous concurrem-20 nient' LÉ'], ainsi que le polypeptide trp D dans sa totalité, le tout sous la commande du système promoteur-opérateur trp. Le plasmide, 20 ^jg, est digéré avec l'enzyme de restriction Pvu II qui clive le plasmide en cinq sites. Les fragments de gène sont alors combinés avec des protéines de liaison EcoRI 25 Ccomposées d'un oligo-nucléotide auto-complémentaire de séquence pCATGAATTCATG] fournissant un site de clivage EcoRI pour un clonage ultérieur dans un plasmide contenant un site EcoRI. On traite les 20 yg de fragments d'ADN obtenus par pGM1 avec 10 unités dtADN ligase en présence 30 de 200 picomoles de l'-oligonucléotide de synthèse pCATGAATTCATG phosphorylé en 5' et dans 20 e1 de tampon d'ADN ligase [20 mM de tris, pH 7,6, 0,5 mM d'-ATP,

10 mM de MgCl^, 5 mM de dithiothréi toi ] à 4°C pendant la nuit. On chauffe alors la solution pendant 10 minutes à 70°C pour 35 arrêter la ligation. On clive les protéines de liaison

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par digestion EcoRI et on sépare les Fragments portant maintenant des extrémités EcoRI en utilisant une électro-phorèse sur gel de polyacrylamide à 5% Coi-dessous "PAGE"} et on isole les trois plus grands Fragments du gel en colorant tout d'abord avec du bromure d'éthidium, en localisant les Fragments à la lumière ultraviolette, et en découpant dans le gel les Fractions intéressantes. Chacun des Fragments de gel, avec 300 microlitres Q,1xTBE, est disposé dans un sac de dialyse et soumis à une électrophorèse à 100 V pendant 1 h dans un tampon 0,1xTBE Cle tampon TBE_contientï 10,8 g de fccis base, 5,5 g d'acide borique, 0,03 g de Na^ EDTA dans 1 litre-d'.HgO]. On recueille la solution aqueuse à partirdu sac de dialyse, on l'extrait au phénol, on l'extrait au chloroForme et on la rend 0,2 M avec du chlorure de sodium, et on recueille k'-ADN dans l'eau après précipitation à lléthanol. On identiFie lé gène contenant le promoteur-opérateur trp à extrémités agglutinantes EcoRI dans le procédé décrit ci-dessous, qui Fait intervenir l'insertion de Fragments dans un plasmide sensible à la tétracycline qui, après insertion du promoteur-opérateur, devient résistant à la tétracycline.

Nucleic Acids Research B, 3267-3287 C197933 exprime la résistance à 1'ampicilline et contient le gène de la résistance à la tétracycline mais, comme il n'y a pas de promoteur associé, n'exprime pas cette résistance. Le plasmide est donc sensible à la tétracycline. En introduisant un système promoteur-opérateur dans le site EcoRI, on peut rendre le plasmide résistant à la tétracycline.

me par extraction au phénol suivie par extraction au chloroForme et on la recueille dans l'eau après précipitation à l'éthanol. Dans des mélanges réactionnels séparés, on combine la molécule d'ADN résultante avec chacun des trois Fragments d'ADN obtenus ci-dessus et on la lie avec l'ADN ligase comme il est dit ci-dessus. On utilise l'ADN présent dans

Le plasmide pBRHl CR • I •.-■< Rodriguez et coll.,

On digère le pBRHI avec EcoRI et on retire 1'enzy-

le mélange réactionnel pour transformer l'E. coli K-12 souche 294 compétente CK. Qackman et coll., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 73, 4174-4198 [19763 3 par des techniques classiques [V. Hershfield et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455—3459 [197433 et on étend les bactéries sur des plaques LB contehàrit 20 jjg/ml d1 ampicilline et 5 jjg/ml de tétracycline. On choisit plusieurs colonies résistant è la tétracycline, on isole l'AON du plasmide et on confirme la présence du fragment désiré par analyse à l'enzyme de restriction. Le plasmide résultant est désigné par pBRHtrp.

On obtient un produit de digestion à EcoRI et BamHI du génome viral de l'hépatite B par des moyens classiques et on le clone dans les sites EcoRI et BamHI du plasmide pGHS CD.V. Goeddel et coll., Nature 281, 544 C1979 3 3 pour former le plasmide pH332;- On clive le plasmide pHS32 avec Xbal, on l'extrait au phénol, on l'extrait au chloroforme et on le précipite à l'éthanol. On le traite alors avec 1 jjl d'E. coli polymérase I, fragment de Klenow [Bohringer-Mannheim3 dans 30 jjl de tampon de polymérase [50 mM de phosphate de potassium pH 7,4, 7 mM de MgCl_,, 1mM de

^-mercaptoéthanol3 contenant 0,1 mM de dTTP et 0,1 mM de dCTP pendant 30 minutes à 0°C puis pendant 2 h à 37°C. Ce traitement provoque l'introduction de 2 des 4 nucléotides complémentaires de l'extrémité saillante 5' du site de clivage Xbal :

5' CTAGA 5« CTAGA

3» T ^ 3' TOT

On incorpore deux nucléotides, dC et dT, donnant une extrémité avec deux nucléotides saillants en 5' . On clive avec EcoRI ce résidu linéaire de plasmide pHS32 [après extraction au phénol et au chloroforme et récupération dans l'eau après précipitation è l'éthanol3. On sépare le grand fragment de plasmide du plus petit fragment EcoRI-Xbal par PAGE et on isole après électroélution. On lie ce fragment d'AON

,*Y

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provenant de pHS32 [0,2 ug3, dans des conditions analogues à celles qui sont décrites ci-dessus, au fragment EcoRI-Taq I de l'opéron' tryptophane [env. 0,01 ug), provenant de p3RHtrp.

Dans le processus consistant à lier le Fragment provenant de pHS32 au Fragment EcoRI-Taq, comme décrit ci-dessus, on lie l'extrémité saillante Taq I à 1-* extrémité saillante restante Xba I bien qu'elle ne soit pas complètement appariée par bases selon Watson-Crick:

-T - CTAGA TCTAGA-

AGC TCT AGCTCT

On transForme une Fraction de ce mélange réactionnel de ligation dans des cellules d'E. coli 294, on la traite à la chaleur et on l'étend sur des plaques LB contenant de 1'amplcilline. On choisit vingt-quatre colonies, on les cultive dans 3 ml de milieu LB, et on isole le plasmide. On trouve que six d'entre eux ont le site Xbal régénéré par réparation et réplication de l'ADN catalysée par E. coli:

TCTAGA TCTAGA

AGCTCT AGATCT

On trouve également que ces plasmides se clivenû tant avec EcoRI qu'avec Hpal et qu'ils donnent les Fragments de restriction escomptés. Un plasmide, appelé pTrp 14, est utilisé pour l'expression de polypeptides hétérologues, comme il est dit ci-dessous.

Le plasmide pHGH 107 [D.V. Goeddel et coll.,

Nature, 281, 544, [197933 contient un gène pour 1'hormone de croissance humaine constitué de 23 codons d'acides aminés produits à partir de Fragments d'ADN de synthèse et de 153 codons d'acides aminés obtenus à partir d'ADN complémsntaire produit par transcription inverse d'ARN messager d'hormone de croissance humaine. Ce gène, bien qu'il lui manque les codons de la "pré" séquence de l'hormone de croissance

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humaine, contient bien un codon d'initiation de traduction ATG. On isole le gène à partir de 10 ug de pHGH 107 après traitement 'avec EcoRI suivi par le Fragment de Klenow de polymérase I d'E. coli et dTTP et dATP comme il est dit ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, on traite le plasmide avec BamHI.

mone de croissance humaine C"HGH"J par PAGE suivie par électroélution. Le Fragment d'ADN résultant contient également les 350 premiers nucléotides du gène de structure de résistance à la tétracycline, mais ne possède pas le système promoteur-opérateur tétracycline, si bien que, lorsqu'on le clone ultérieurement dans un plasmide d'expression, les plasmides contenant l'insertion peuvent être situés par la restauration de la résistance à la tétracycline. Etant donné que l'extrémité EcoRI du Fragment a été introduite par le procédé de la polymérase I de Klenow, 1b Fragment possède une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui assure une orientation correcte lorsqu'on l'insère ensuite dans un plasmide d'expression.

pTrpl4 à recevoir le Fragment contenant le gène HGH préparé ci-dessus.: Ainsi, on digère pTrp14 avec Xbal et on Introduit les extrémités agglutinantes obtenues par le procédé de la polymérase I de Klenow en employant dATP,. dTTP, dGTP et dCTP. Après extraction au phénol et au chloroForme et précipitation à l'éthanol, on traite l'ADN obtenu avec BamHI et on isole le grand Fragment de plasmide résultant par PAGE et électroélution. Le Fragment dérivé de pTrpl4 a une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui permet une recombinaison dans une orientation appropriée avec le Fragment contenant le gène HGH décrit ci-dessus.

On isole le Fragment contenant le gène de l'hor-

0n prépare ensuite le plasmide d'expression

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On combine et on relie l'un à l'autre le fragment de gène HGH et le Fragment pTrpl4 AXba-BamHI dans des conditions semblables à celles qui sont décrites ci-dessus. On relie l'une à l'autre les extrémités Xbal et EcoRI introduites par ligation de l'extrémité non agglutinan te pour recréer les sites Xbal. et EcoRI:

Xbal introduit EcoRI introduit Début du gène HGH " TCTAG AATTCTATG TCTAGAATTCTATG

-AGATC TTAAGATAC AGATCTTAAGATAC

" Xbal EcoRI

Cette construction recrée également le gène de résistance à la tétracycline. Comme le plasmide pHGH 107 exprime la résistance è la tétracycline à partir d'un promoteur se situant en amont à partir du gène HGH Cle promoteur*"lac] , cette construction, appelée pHGH 207, permet l'expression du gsne de la résistance à la tétracycline sous la commande du promoteur-opérateur tryptophane. Ainsi le mélange de ligation est transFormé dans E. coli 204 et des colonies choisies sur plaques t_B contenant 5 ^jg/ml dd tétracycline.

On digère le plasmide pHGH207 avec Eco RI et on recueille le promoteur trp contenant un Fragment Eco RI à 300 pb par PAGE suivie par électroélution. Le Fragment Eco RI à 300 pb contient le promoteur-opérateur trp d'E. col et le site de liaison ribosomique à directeur trp mais ne contient pas de séquence ATG pour l'initiation de la traduction. On clone ce Fragment d'ADN dans le site Eco RI de pLelF A.

Le Fragment trp qui vient d'être mentionné est un analogue de l'opéron tryptophane d'E. coli dont on a retiré ce qu'on appelle l'atténuateur trp, afin d'accroître de Façon contrôlable les niveaux d'expression. Les plasmides d'expression contenant le régulon trp modiFié peuvent être cultivés à des niveaux prédéterminés dans des milieux

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nutritifs contenant du tryptophane supplémentaire en quantités suffisantes pour réprimer le système promoteur-opérateur,

système et à occasionner l'expression du produit visé.

Plus particulièrement, on digère 250 fjg de plasmide pL3l avec Pst I et on isole l'insertion à 1000 pb par électrophorèse sur gel sur un gel de polyacrylamide S. On électroélue environ 40 fjg d'insertion à partir du gel et on divise en 3 fractions aux fins de digestion ultérieure: a} on digère partiellement un échantillon de 13 yg de ce fragment avec 40 unités de Bgl II pendant 45 minutes à 37°C et on purifie le mélange réactionnel sur un gel de polyacrylamide S. On recueille environ 2 jjg du fragment à 670 pb désiré. b] on restreint un autre échantillon C8 ug] de l'insertion Pst I à' 1000 pb avec Ava II et Bgl II. On recueille .1; jjg du fragment à 150 pb indiqué après électrophorèse sur gel. c] on traite 16 yg du fragment à 1000 pb avec Sau 3a et Ava II. Après électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 10, on recueille environ 0,25 jjg Cenv. 10 pmclss] du fragment à 34 pb. Les deux désoxyoligonucléoti-des indiqués, 5'-dAATTCATGTGT [fragment 1D et 5'—dGATCACACATG {fragment 2] sont synthétisés par le procédé du phospho-triester [Maxam et Gilbert, Methods Enzymol. 65, 499-5S0 C19803D • On phosphoryle le fragment 2 comme suit. On assèche 200 yl [env. 40 pmoles] de [ ^*^P] ATP CAmersham, 5000 Ci/ rnmole] et on remet en suspension dans 30 yl de Tris-HCl 60 mM CpH 8], 10 mM de MgCl-, , 15 mM de ^-mercaptoéthanol, contenant 100 pmoles de fragment d'ADN et 2 unités de poly-nucléotide kinase T4. Au bout de 15 minutes à 37°C, on ajoute 1 el d'ATP 10 mM et on laisse la réaction continuer pendant encore 15 minutes. On chauffe alors le mélange à 70°C pendant 15 minutes, on le combine avec 100 pmoles de fragment 1 5*-0H et 10 pmoles du fragment Sau 3a — Ava II à 34 pb. La ligation s'effectue pendant 5 h à 4°C dans 50 yl de Tris-HCl 20 mM [pH 7,5], MgCl^ 10 mM, dithiothréitol 10 mM,

puis être privés de tryptophane de manière à déréprimer le

16

ATP 0,5 mM et 10 unités d'ADN ligase T4. On électrophorèse le mélange sur un gel de polyacrylamide 6 et on recueille le produit à 45 pb par électroélution. On recueille 860 000 Cerenkov cpm [env. 30 ng, 1 pmole], on combine '5 avec 0,5 yg [5 pmoles] du Fragment Ava II - Bgl II à 150 pb et 1 ug [2 pmoles] du Fragment Bgl II - Pst I à 870 pb. La ligation s'eFFectue à 20°C pendant 16 h en utilisant 20 unités d'ADN ligase T4. On inactive la ligase en chauFFant à 65°C pendant 10 minutes. On digère alors le mélange avec 10 Eco RI et Pst I pour éliminer les polymères du gène. On puriFie le mélange par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à-6%. On isole 36 000 cpm [env. 0,04 pmole, 20 ng] de produit à 865 pb. On lie la moitié [10 ng] de ce produit dans pBR322 [0,3 yg] entre les sites Eco RI et Pst I. La 15 transFormation d'E. coli 234 "donne 70 transFormants résistant à la tétracyoline, sensibles è 1'ampicilline. On digère l'ADN de plasmide isolé à partir de 18 de ces transFormants avec Eco RI et Pst I. 16 des 18 plasmides ont un Fragment Eco RI - Pst I de 865 pb de longueur. On digère 20 1 yg de l'un d'entre eux, pLelF A1, avec Eco RI et on le lie à un Fragment Eco RI è 300 pb [0,1 yg]_ contenant le promoteur trp d'E. coli et le site de liaison ribosomique du directeur trp, préparé comme il est dit ci-dessus. On iden-

tiFie les transFormants contenant le promoteur trp en

32

25 utilisant uri échantillon P-trp en conjonction avec le procédé de tri des colonies de Grunstein-Hogness —Grunstein et coll. [Proc. Natl. Acad. Sci. [USA] 72, 3961 [1975]. Un site Xba I situé de Façon asymétrique dans le Fragment trp permet la détermination de recombinants où le promoteur trp 30 est orienté dans la direction du gène de LeIF A.

On prépare les extraits pour le dosage IF comme suit. On cultive des cultures d'1 ml dans un bouillon L contenant 5 yg/ml de tétracycline jusqu'à un d'envirCn

1,0, puis on dilue dans 25 ml le milieu M9 contenant 35 5 jjg/ml de tétracycline. On recueille des échantillons

17

de 1Q ml par centrifugation lorsque A55Q atteint 1,0 et on met en suspension les pastilles cellulaires dans 1 ml de saccharose à 15%, Tris-HCl 50 mM CpH 8,0], EDTA 50 mM. On ajoute 1 mg de lysozyme et, au bout dé 5 minutes à 0°C, on disloque les cellules par traitement aux ultra-sons. On centrifuge les échantillons pendant 10 minutes à 15 000 tpm dans un rotor Sorvall SM-24. On détermine l'activité d'interféron dans les surnageants par comparaison avec les standards de LeIF par dosage de l'inhibition de l'effet cytopathique [CPE]. Pour déterminer le nombre de molécules d'IF par cellule, on utilise une activité spécifique de LeIF de 4 x 10 unités/mg [Rubinstein et coll., Proc.

Natl. Acad. Sci. [USA] 76, 640 [1379]].

Le clone pLelF A trp 25, dans lequel on a inséré le promoteur trp dans l'orientation désirée, donne de hauts g

niveaux d'activité [allantjusqu*à 2,5 x 10 unités par litre]. L'IF produit par E. coli K-12 souche 2S4/pLeIF A trp 25 se comporte comme un LeIF humain authentique; il est stable vis-à-vis du traitement à pH 2 et est neutralisé par les anticorps de leucocytes anti-humains de lapin. L'interféron a un poids moléculaire apparent d'environ 20 000.

'Isolement d'ADNc pour des interférons de leucocytes additionnels

On excise l'ADN provenant du plasmide contenant l'ADNc de LeIF A pleinement caractérisé avec Pst I, on

32

isole par electrophorèse, et on marque avec P selon un procédé publié [Taylor et coll., Biochem. Biophys. Acta. 442, 324 [197S]]. On utilise l'ADN à marquage radioactif obtenu comme échantillon pour trier des transformants supplémentaires d'E. coli 294 par un procédé de tri des colonies in situ, Grunstein et coll., supra. On isole des colonies qui s'hybrident en quantités variables à l'échantillon. On isole l'ADN de plasmi ds provenant de ces colonies et les dix colonies hybridantes mentionnées ci-dessus par

clivage à Pst et on caractérise selon trois procédés différents. On caractérise tout d'abord ces fragments Pst par leurs schémas de digestion à 1 *endonucléase de restriction avec les enzymes Bgl II, Pvu II, et £co RI. Cette analyse permet la classification d'au moins huit types différents [LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G et LeIF H], ce qui donne une approximation de la localisation de divers clivages de restriction par rapport à la pré-séquence et à la séquence de codage du LeIF A, maintenant connues. On pense que l'un d'entre eux, LeIF û, est identique à celui mentionné par Nagata et coll., Nature 284, 316 [1980]].

En second lieu, on teste certains des AON par un dosage de sélection d'hybridation publié, cf Cleveland et coll., Cell 2C3, 95 [1980], pour déterminer leur aptitude à retirer sélectivement l'ARNm de LeIF à partir d'ARN cel-lulai re KG-1 contenant du poly-A. Les LeIF A, B, C et F sont positifs selon ce dosage. Eri troisième lieu, on insère ces derniers fragments Pst dans un plasmide d'expression, E. col 294 transformé avec le plasmide, et on exprime les fragments Les produits d'expression, dont on pense qu'ils ont été des pré-interférons, sont tous positifs dans le dosage CPE de l'activité d'interféron, bien que marginalement actifs dans le cas du fragment LeIF F. Outre ce qui précède, tous les types de LeIF décrits ont été séquences.

Second interféron de leucocyte mûr

La séquence du fragment isolé comprenant le gène du LeIF B mûr présente les quatorze premiers nucléotides des types A et B è être identiques. On a donc proposé d'isoler un fragment .à partir de pLelF A25 portant le promoteur-opérateur trp, le site de liaison ribosomique et le début du gène de LeIF [A=B], et de combiner ceci avec la partie restante de la séquence B dans un plasmide d'expression.

Pour obtenir le fragment Sau 3a à Pst I à environ

19

950 pb à partir de la séquence montrée dans la Figure 7a, plusieurs étapes sont nécessaires étant donné la présence d'un ou plusieurs sites de restriction Sau 3a qui interviennent, autrement dit:

1. On isole les Fragments suivants:

a] 110 pb de Sau 3a „à Eco RI;

bD 132 pb d'Eco RI à Xba;

c] plus de 700 pb d'Xba à Pst.

2. On lie les Fragments [1a] et [1b] et on les clive avec Xba et Bgl II pour exclure une auto-polymérisation à travers les extrémités terminales Sau 3a et Xba [le site Sau 3a intéressé est compris dans un site Bgl II; Bgl II clive pour laisser une extrémité agglutinante Sau 3a}. On isole un Fragment è 242 pb.

3. On lie le produit da C2] et C1c] et on clive avec Pst I et Bgl II, là encore pour empêcher une auto-polymérisation. On isole un Fragment à environ 350 pb, Sau 3a à Pst I de la Figure 7a. Ce Fragment comprend la Fraction du gène de LeIF B qui n'est pas commune avec LeIF A.

4. On isole à partir de pLelF A25 un Fragment à environ 300 pb CHind III à Sau 3a] comprenant le promoteur-opérateur trp, le site de liaison ribosomique, le signal de départ ATG et le codon cystéine du LeIF A.

5. On isole à partir de pBr 322 un Fragment Pst I à Hind III è environ 3S00 pb. Ceci comprend le réplicon et encode la résistance à la tétracycline mais non à l'ampicilline.

6. On lie triplement les Fragments obtenus dans les étapes 3,4 et 5 et on transForme le plasmide obtenu dans E. coli K-12 souche 294.

On soumet les transFormants à un mini-tri,cF Sirnboim et coll., Nucleic Acide Research, 7, 1513 C979], et on digère les échantillons de plasmide avec Eco RI. Les produits de digestion donnent trois Fragments caractéristi-

b

20

ques du:

13 Fragment promoteur trp Eco RI - Eco RI; 2] Fragment interne Eco RI à Eco RI de pL4 ; et 33 signal de départ de traduction protéique au Fragment Eco RI de pL4.

□ans le dosage CPE, les extraits bactériens provenant de clones réalisés de la manière précédente sont typi-

0

quement dosés à environ 10 x 10 unités d'activité d1interféron par litre à = 1. Un clone représentatiF préparé de cette manière est 234/pLeIF B trp 7.

Autres interFérons de leucocytes mûrs

On peut découper d'autres Fragments, de gènes de longueur complète comprenant d'autres sites de LeIF et les placer dans des véhicules d'expression aux Fins d'expression comme dans le cas de LeIF A. La détermination complète de la séquence par des. moyens classiques révèle si un site ds restriction se situe suFFisamment près du premier codon d'acide aminé du type d'interFéron mûr de manière qu'on puisse avoir commodément recours au procédé employant l'élimination de la préséquence par clivage de restriction et remplacement de codons pour les acides aminés N-terminaux perdus dans l'élimination de la préséquence par ligation d'un Fragment d'ADN de synthèse, comme il est dit ci-dessus. Si l'on n'y parvient pas, on peut employer le procédé décrit dans Kleid et coll., supra. En breF, ceci implique de cliver le Fragment contenant la préséquence précisément avant le point auquel commence le codon du premier acide aminé du polypeptide mûr, en:

1. transformant l'ADN à deux brins en un ADN à un seul brin dans une région entourant ce point;

2. hybridant à la région à un seul brin Formée dans l'étape Ca3 une longueur d'amorce complémentaire d'ADN à un seul brin, l'extrémité 5' de l'amorce se situant à l'opposé du nucléotide adjacent au site de clivage recherché; .

3. rétablissant la Fraction du second brin éliminée dans

•h

1*é-fcape 1 qui se situe en direction 3' à partir de 1*amorce par réaction avec une AON polymérase en présence de désoxy-nucléotide-triphosphates contenant de l'adénine , de la . thymine, de la guanine et de la cytosine; et

4. digérant la longueur d'AON à un seul brin qui Fait saillie au-delà du point de clivage visé.

On peut alors lier une courte longueur d'ADN de synthèse se terminant, à l'extrémité 3' du brin de codage, par le signal de départ de traduction ATG, p. ex. par une ligation à son extrémité non agglutinante au gène découpé obtenu pour les interfér ons mûrs et on peut insérer le gène dans un plasmide d'expression et l'amener sous le contrôle d'un promoteur et de son site de liaison ribosorni qje associé.

De manière semblable à celle employée ci-dessus, on donne à des Fragments de gène encodant LeIF C e-t LeIF □ la configuration appropriée pour une expression bactérienne directe. La stratégie d'expression pour ces interFérons de leucocytes supplémentaires implique, dans chaque cas, d'avoir recours au Fragment à environ 300 pb CHind III à Sau 3a] comprenant le promoteur-opérateur trp, le site de liaison ribosomique, le signal de départ ATG et le codon cystéine de LeIF A provenant de pLelF A25. A ceci on combine des Fragments de gène provenant des gènes d'interFéron supplémentaires qui encodent leurs séquences d'acides aminés respectives au-delà de la cystéine initiale commune à tous. Chacun des plasmides obtenus est utilisé pour transFormer E. coli K-12 souche 294. Les ligations pour Former les gènes respectiFs s'eFFectuent comme suit:

LeIF C

Isoler les Fragments suivants de pLelF C:

Ca] 35 pb de Sau 3a à Sau 9ii Cb] plus de 300 pb de Sau 96 à Pst I Ce] isoler un Fragment à environ 300 pb CHind III— Sau 3a] à partir de pLelF A25 comme dans la

22

partie N [43 ci-dessus.

[d] isoler le Fragment à environ 3600 pb de la partie N[53 ci-dessus.

Construction ;

[13 Lier [a3 et [c3. Cliver avec Bgl II, Hind III et isoler le produit à environ 335 pb.

C2 3 Lier triplement [13 + [b3 + [d3 et transFormer E. coli avec le plasmide obtenu.

E. ooli K-12 souche 234/pLeIF C. trp 35 est un clone représentât!F constitué d£ cette manière.

LeIF D

Isoler à partir de pLelF D:

a3 35 pb de Sau 3a è Ava II

b3 *150 pb de Ava II à Bgl II

c3 environ 700 pb de Bgl II è Pst I

Isoler à partir de pLelF A25:

d3 300 pb de Hind III à Sau 3a

Isoler à partir de PBr 322:

e3 environ 3S00 pb de Hind III à Pst I.

Constructi on ;

[43 Lier [a3 + [b3, cliver avec Bgl II et puriFier un produit à 185 pb [13-

[23 Lier CO + [d3j cliver avec Hind III, Bgl II, et puriFier le produit à environ 500 pb [23.

[33 Lier [23 + [c3 + [e3 et transFormer E. coli avec le plasmide obtenu.

E. coli K-12 souche 294/pLeIF D trp 11 est un clone représentatiF constitué de cette manière.

S

23

LeIF F

On peut ajuster le Fragment contenant LeIF F pour l'expression directe par un réassemblage rendu commode par l'hornologie complète des acides aminés 1-13 de LeIF B et LeIF F. On obtient un Fragment contenant le promoteur -crp Ca3 ayant des Extrémités de conFiguration appropriée à partir de pHGH 207, décrit ci-dessus, en passant par une digestion è Pst I et Xba I suivie par un isolement du Fragment à environ 1050 pb. On obtient un second Fragment Cb3 sous la Forme du plus grand des Fragments "résultant de la digestion par Pst I et Bgl II du plasmide pHKY 10, dérivé de pBR322 qui contient un site Bgl II entre le promoteur de résistance à la tétracycline et le gène de structure. Le Fragment CaD contient environ la moitié du gène qui encode la résistance à 1 *ampicilline; le Fragment Cb3 contient le reste de ce gène et le gène entier de la résistance- à la tétracycline sauF le promoteur associé. On combine les Fragments [s3 et Cb3 via la T4 ligase et on traite le produit avec Xba I et Bgl II pour éliminer la dimérisation, Formant un Fragment Cc3 comprenant le promoteur-opérateur trp et les gènes de la résistance à la tétracycline et à 1 *ampicilline.

On obtient un Fragment Cd3 d'environ 580 pb par digestion avec Ava II et Bgl II de pLelF F. Ceci comprend les codons pour les acides aminés 14-1 SB de LeIF F.

On obtient un Fragment Ce3 C49 Pb] par digestion avec Xba I et Ava II de pLelF F. Le Fragment Ce3 encode les acides aminés 1-13 de LeIF F. .

Les Fragments Cc3, Cd3 et Ce3 sont triplement liés en présence de T4 ligase. Les extrémités cohésives des Fragments respectiFs sont telles que le plasmide composite se circularise correctement, amenant le gène de résistance à la tétracycline sous la commande du promoteur-opérateur trp avec le gène du LeIF F mûr, de manière que des bactéries transFormées avec le plasmide désiré puissent être choisies sur des plaques contenant de la tétracycline.

V")

24

E. coli K-12 souche 194/pLeIF F trp 1 est un clone représen tatif préparé de cette manière.

LeIF H

Dn peut donner au gène LeIF H complet la configuration permettant son expression sous forme d*interféron de leucocyte mur comme suit:

1. On soumet le plasmide pLelF H à une digestion avec Hae I et Rsa I en isolant le fragment à 816 paires de base s'éten dant de l'acide aminé 10 du peptide signal à la région de non codage 3'.

2. On dénature le fragment et on le soumet à une synthèse d réparation avec le fragment de Klenow, cf Klenow et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 168 [1970D en employant l'amorce déscxyribooligonucléotide de synthèse 5*-dATG TGT AAT CTG TCT. Ce procédé général est décrit également par Goeddel et coll., U.S. Sériai n° 190799, du 25 septembre 1980.

3. On clive le produit obtenu avec Sau 3a et on isole un fragment à 452 paires de base ["pb"] représentant les acide aminés 1 è 150.

4'. La digestion par Sau 3a et Pst I de pLelF H et l'isolement du fragment à 500 pb obtenu donnent un gène encodant les acides aminés 150 jusqu'à la fin de la séquence de codage.

5. On lie les fragments isolés dans les étapes [3]" et [4] pour former un fragment:

1 165

met cys asp . arrêt

ATG TGT . . 1 . . . GAT TGA Pst I

Sau 3a encodant les 166 acides aminés de LeIF H.

5. On digère pLelF A trp 25 avec Xba I, on lui donne une extrémité non agglutinante avec l'AON polymérase 1

25

et on digère le produit avec Pst 1. On peut isoler le grand fragment obtenu et le lier avec le produit de l'étape C5] pour former un plasmide d'expression capable, après transformation d'E. coli K-12 souche 234 ou d'autres bactéries-hôtes, d'exprimer le-LelF H mûr.

LeIF I

On trie la bibliothèque de recombinants de phage ^ Charon' 4A de génome humain construite par Lawn et coll., Cell 1_5, 1157 [1978], pour y détecter des gènes d'interférons de leucocytes par des procédés décrits par Lawn et coll., supra, et Maniatis et coll., Cell 1_5, 887 C13783. Dn utilise un échantillon de LeIF radioactif dérivé du LeIF A du clone d'AONc [Goeddel et coll., Nature 287, 411 [13BQDD pour tri er environ 50D 000 plaques. On obtient six clones de génome de LeIF dans ce tri. Après un nouveau triage et une purification de plaque, on choisit un de ces clones, AHLelFci, aux fins d'analyse ultérieure.

En utilisant le procédé décrit ci-dessus, on peut utiliser d'autres échantillons de manière intéressante pour isoler des clones de LeIF supplémentaires à partir du génome humain. Ceux-ci, è leur tour, peuvent être employés pour produire des protéines d'interférons de leucocytes supplémentaires selon l'invention.

1 . Dn subclone le fragment Eco RI à 2000 paires de base du clone génomi que [ P^HLelF 2} dans pBR32S au site Eco RI. On clive le LeIF I de plasmide obtenu avec Eco RI et on isole le fragment à 2000 paires de base. On lie le désoxyoligo-nucléotide dAATTCTGCAG [un convertisseur Eco RI > Pst 1} au fragment Eco RI à 2000 paires de base et on clive le produit obtenu avec Pst I pour donner un fragment à H0D0 paires de base contenant des extrémités Pst I. On clive ceci avec Sau 98 et on isole un fragment à 1100 paires de

as base qui possède une extrémité Pst I et une extrémité Sau 96.

2. On digère le plasmide pLelF C trp 35 avec Pst I et Xba I. On isole le grand fragment.

3. On digère le petit fragment Xba I - Pst I provenant de pLelF C trp 35 avec Xba I et Sau 98. On isole un fragment Xba I - Sau 96 à 40 paires de base.

4. On lie les fragments isolés dans les étapes 1], 23 et 33 pour former le plasmide dTexpression pLelF I trp 1.

LeIF J

1. Le plasmide pLelF J contient un fragment Hind III à

3,8 kilobase d,ADN génornique -humain qui comprend la séquence de gène de^L'elF J. On isole à partir de ce plasmide un fragment Ode I -Rsa I à 760 paires de base.

2. On clive le plasmide pLelF B trp 7 avec Hind III et Dde I et on isole un fragment Hind III - Dde I à 34Q pb.

3. On clive le plasmide pBR322 avec Pst I, on lui donne une extrémité non agglutinante par incubation avec de l'ADN Pol I [fragment de Klenow3, puis on digère avec Hind III. On isole le grand fragment [env. 3600 pb3.

.4. On lie les fragments isolés dans les étapes 13j 23 et 33 pour former le plasmide d'expression pLelF J trp 1.

Les.- «pr-océdés et matériaux employés dans les constructions suivantes sont tels que dans la description qui précède. Le Tableau 1 ci-dessous fournit les détails de constructions particulières des présents plasmides de LeIF hybrides:

Hybride de LeIF

TABLEAU 1

AD

DA

Al)

<4*

AB

AF

AG

Al

OA

UD

Total ' Plasmide acides d'expression

Partie avant aminés Çvecteur} Fragment

Ac.aminés

Partie arrière Ac.aminés

Fragment

165

166

165

166

165

105

165

16G

166

Xba I-Pvu II 1-91

de pLelF A trp 25 (205pb)

Xba I-Pvu II 1-92

de pLelF D trp 11 (288Pb)

Bgl II-Pst I 9l"ar>d j_G2

fragment de pLoIF A trp 25 . . .

Bql II-Pst I grand i_63 fragment pLelF D trp 11

Xba I-Pvu II deLelF.A 1-91 trp 25 (285 P°)

Xba I-Pvu II deLelF A 1-91 trp 25 (285'Ptî

Xba I-Pvu Ilde LeIF A 1-91 trp 25 (205 ptJ

Xba I-Bal II partiel 1-150 de pLelF A trp 25 (- 455pb)

' Hind III-Pvu Ilde pLoïF 1-92 B trp 7 (- 630 ptf

Hind III-Pvu Ilde pLelF 1-92 B trp 7 (~ 630 py*)

Pvu II-Pst I ae pLelF D trp 11 (~550Pb)

Pvu II-Pst I de pLelF A trp 25 (•*550pb)

Bgl II-Pst I de pLelF D trp 11 MiOOPb)

Bgl II partial-' Pst Ide pLoIF A trp 25 (-700 pb)

93-166

92-165

64-166

63-165

Pvu!II partiel-Pst.I 93-166 de pLelF B trp 7 f—750 P°) V

(-750 HD)

Pvu II Pst I cle pLelF F trp 1 (-700 Pb)

i Pvu II-Pst I

de p.LelF G' (-750 P ) ;

.Bq1 II-Pst 1 de LeIF 1 trp 1 (~ 650 pt)

de

93-166

93-166

151-165

92-165

Pvu II-Pst I pLelF A trp 25 (-550 pb)

Pvu II-Pst I de 93-166 pLelF 0 trp 11 (-550 Pt)

Plasmide dT expression résultant pLelF AD. trp(Pvu II)

pLelF DA ■ trp (Pvu II)

pLelF AD trp (Bgl II)

pLelF DA trp (Bgl II)

pLelF AB trp (Pvu II) pLelF AF trp (Pvu II) pLelF AG trp (Pvu 11 ) pLelF AI trp (Bgl II) pLelF BA trp (Pvu II) pLoIF BD trp (Pvu II)

IV Ni

Hybride de l0IF acides aminés

Total

:/

BF

CG DO DF or. FA

FB

FD

FG

IA

Plasmide Partie avant d'expression.

[vecteur] Fragment Ac.aminéî

Partie arrière Fragment

Ac.aminés

1G6

166 166 166 166 166

166

166

166

166

Hind III-Pvu II de pLeIF 1-92 B trp 7 (~ 630pb)

Hind III-Pvu Ilde pLelF B trp 7 (~ 630PD)

Xba I-Pvu II de pLelF D trp II (288 Pq

Xba I-Pvu II de pLelF D trp 11 (288 Pt)

Xba I-Pvu II de pLelF 0 trp 11 (208 P9

Xba I-Pvu II ptelF F trp 1 (208 pB

Xba I-Pv,u II pLelF F trp 1 (208 Pt?

de de

Xba I-Pvu II

de

SVf1

Xba I-Pvu Ilde pLelF F trp 1 (288 P^

Xba I-Bgl II de plelF I <-rp 1 (~ 458 pb)

1-92

1-92

1-92

1-92

1-92

1-92

1-92

1-32

1-151

Pvu II-Pst I de pLelF F .trp 1 (-700 Pt)

Pvu II-Pst I depLelF G (-750 Pt)

Pvu II partiel-Pst I de pLelF B trp 7 (~/50 P^

Pvu II-Pst I depLeIF F trp 1 (-700 Pt}

Pvu II-Pst I deptlelF G (-750 Pt>

Pvu II-Pst I depLeIF A trp 25 (-550 pb)

93-166

93-166 93-166 ' 93-166 93-1(56 92-165

Pvu II part1eT-Pst I de pLelF B 93-166 trp 7 (-750 pt^

Pvu II-Pst I de pLelF D tro U 93-166 (-550 Ptî

Pvu II-Pst I de pLelF G (-750

Bgl II-Pst I depLeIF A trj> 25 (~ 430P°)

93-166

152-166

Plasmide d* expression résultant ptelF BF trp (Pvu II

pLelF BG trp (Pvu II

pLelF DB trp (Pvu 11

pLelF DF trp (Pvu II

pLelF DG trp (Pvu II

pLelF FA trp (Pvu II

1 pLelF FB trp (Pvu 11

pLelF FD trp (Pvu II

pLelF FG trp (Pvu II

pLelF IA trp (Bgl II)

f\J

CD

* non compris la méthionine N-terminale a granth PW fruyi-iont dexba I à Pst I digé'éparpLelF A trp 25. b9^and(~ jooo pk} fragment dci||jmj m à pst I digort^,e,r.pUK3i!if.

29

Si l*'on se réfère encore au Tableau 1, les quatre premiers LeIF hybrides décrits ont été produits à partir de deux plasmides d'expression de LeIF. Un site Bgl II commun aux AONc de LeIF A et D a été utilisé pour 5 construire un plasmide d'expression pLelF trp AD CBgl II] qui code pour les B3 acides aminés amino-terminaux de LeIF A et les 102 acides aminés carboxy-terminaux de LeIF D. Dn utilise le même site dans la construction d'un plasmide ■ d'expression pLelF trp DA CBgl II] qui code pour 64

10 acides aminés amino-terminaux de LeIF 0 e"t 102 acides aminés carboxy-terminaux de LeIF A. Le site Pvu II est utilisé dans la construction de deux autres plasmides d'expression d'interférons hybrides: 91 acides aminés amino-terminaux de A avec 74 acides aminés carboxy-terminaux de Q CpLelF trp 15 AD [Pvu II]] et 92 acides aminés amino-terminaux de LeIF 0 avec 74 acides aminés carboxy-terminaux de LeIF A „CpLeIF trp DA CPvu II]]. En résuméi pour pLelF AD trp [Pvu II]: On lie le grand [env. 3900 pb] fragment d'un produit de digestion par Xba I et Pst I de pLelF A 20 trp 25 avec un fragment Xba I-Pvu.II à 285 pb de pLelF A trp 25 et un fragment Pvu II-Pst I à environ 550 pb de pLelF D trp 1 1 ;

pLelF DA trp [Pvu II]: On lie le grand [env. 3900 pb] fragment d'un produit de digestion par Xba I et Pst I de pLelF A 25 trp 25 avec un fragment Xba I-Pvu II è 288 pb de pLelF D trp' 11 et un fragment Pvu II-Pst I à environ 550 pb de pLelF A trp 25;

pLelF A0 trp [Bgl II]; On lie le grand fragment d'un produit de digestion par Bgl II - Pst I de pLelF A trp 25 avec 30 un fragment à environ 600 pb Bgl II-Pst I de pLelF D trp 11; et pLelF 0A trp [Bgl II]: On lie le grand fragment d'un produit de digestion par Bgl II et Pst I de pLelF D trp 11 à un fragment d'environ 700 pb obtenu par clivage à Pst I de

30

pLelF A -trp 25 suivi par une digestion partielle Bgl II.

Dans le cinquième hybride décrit:

pLelF AB trp ÇPvu II]: On lie le grand [env. 3300 pb] Fragment d'un produit de digestion par Xba I et Pst I de pLelF A'trp 25 avec un Fragment Xba I-Pvu II à 285 pb de pLelF A trp 25 et un Fragment Pvu II Cpartiel]-Pst I à environ 750 pb de pLelF B trp 7.

constructions décrites au Tableau 1. Comme autre exemple, dans la construction d'une portion de LeIF C et/ou de LeIF H contenant un hybride, on peut tirer parti des sites Bbv I communs qui se trouvent aux environs du nucléotide 294 [c1est-à-dire GCTGC] des--séquences de gènes.

appropriés à l'expression microbienne d'autres nouveaux interFérons de leucocytes hybrides en manipulant de Façon appropriée l'AON à deux brins encodant la totalité ou des Fractions des séquences diacides aminés d'interFerons de leucocytes se trouvant dans la nature. Ainsi, on choisit un premier Fragment d'ADN à deux brins qui encode la séquenc amino-terminale d'acides aminés d'un premier intarFéron de leucocyte se trouvant dans la nature et, en procédant à partir de là dans la direction 3', une Fraction substantielle de sa séquence d'acides aminés. Le Fragment comprend un site de clivage d'endonucléase de restriction positionné de manière adjacente aux codons de l'acide aminé "ri" du premier interFéron de leucocyte, n acides aminés constituant une Fraction substantielle de la séquence d'acides aminés du premier interFéron. Le clivage avec 1'endonucléase de restri tion donne un Fragment comprenant la partie amino-terminale du premier interFéron et les codons pour environ n acides aminés. On choisit un second Fragment comprenant la totalité ou une partie des codons de la séquence d'acides aminés d'un second interFéron de leucocyte, diFFérent, le Fragment compr nant un site de clivage pour une endonucléase de restriction

De manière analogue, on déFinit ainsi les autres

De manière analogue, on peut .Former des plasmides

31

identique positionné de manière adjacente aux codons pour liacide aminé du second interféron dont le numéro d'acide aminé [en partant de l'extrémité amino-terminale du second interféron] est environ 168 n. Le clivage du second fragment avec cette endonucléase de restriction donne un produit complémentaire de la partie "n" terminale du produit de digestion du premier fragment, de manière que le produit de digestion du second puisse être lié à celui du premier, en reformant le site de reconnaissance de 1'endonucléase de restriction et en reconstituant le codon de l'acide aminé n du premier interféron, lorsqu'il est perdu dans la digestion initiale. Le produit de la digestion par 1 ' endonucléase de restriction du second fragment procède de préférence à partir de l'extrémité résultant du clivage en direction 3' en passant par les nucléotides encodant l'extrémité sarboxy du second interféron de leucocyte.

On peut également former des hybrides contenant des parties substantielles des séquences d'acides aminés de plus de deux interférons de leucocytes se trouvant dans la rature, auqufsl cas, par exemple, le second fragment mentionné ci-dessus est en outre choisi de manière à contenir un second site d'endonucléase de restriction en aval à partir du premier, le second site étant identique à un site positionné de manière analogue au sein d'un fragment encodant l'extrémité carboxy d'un troisième interféron de leucocyte, etc. Dans l'exemple mentionné, on peut triplement lier les produits d'opérations successives avec une endonucléase de restriction pour former un gène hybride encodant la fraction amino-terminale d'un premier interféron, la séquence d'acides aminés moyenne du second et la partie carboxy-terminale du troisième Cou, dans une autre variante, du premier, lorsque le premier et le troisième interférons sont semblables].

Il est préférable que le premier fragment mentionné ci-dessus soit dérivé d'un p-lasmide d'expression, c'est-à-dire d'un plasmide dans lequel les codons de la partie amino-terminale du premier interféron de leucocyte sont

précédés par un codon ATG ou un autre codon d'initiation de traduction et un promoteur ou un système promoteur-opérateur II s1ensuit que le produit final des opérations de manipulation décrites ci-dessus est un plasmide capable d'exprimer le polypeptide encodé par le gène hybride dans les bactéries ou d'autres organismes microbiens transformés avec le plasmide. D'autres moyens de donner aux-.gènes hybrides une configuration appropriée à l'expression microbienne apparaîtront aux spécialistes.

Dans les modes de réalisation préférés de l'invention, les gènes hybrides encodent une nouvelle séquence d'acides aminés d'interférons de leucocytes ayant environ 165-16S acides aminés constituant un conjugué de séquences substantielles d'acides aminés tirées de deux ou plusiei_rs interférons de leucocytes différents choisis dans le groupe constitué par LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF 0, LeIF_E, LeIF F LeIF G et LeIF H tel que décrit dans la figure 3. Il est; préférable que les nouveaux interférons de leucocytes encodé par les gènes hybrides comprennent les acides aminés spécifiés st positionnés comme il est indiqué dans la séquence "A11" ds la figure 3. On peut tester de façon classique l'activité antivirale des produits d'expression de plasmides formés selon l'invention, comme dans les déterminations d'activité biologique décrites ci-dessous.

DEMONSTRATION QE L'ACTIVITE ANTIVIRALE

On transforme classiquement E. coli K-12 souche 234 avec, indépendamment, les plasmides pLelF trp 25, pLelF trp 0, pLelF trp A/Q CBgl II] et pLelF trp D/A Ct3gl 113. On cultive séparément les transformants dans des cultures de 5 ml dans du bouillon L contenant 5 mg/ml de tétracycline jusqu'à un d'environ 1,0, puis on dilue dans 1 litre de milieu M9 contenant 5 ^ig/ml de tétracycline. On récolte les cellules lorsque atteint 1,0 et on met en suspensioi les pastilles cellulaires dans 10 ml de saccharose à 15%,

33

tris-HCl 50 mM CpH 8,0], EDTA 50 mM. On ajoute 10 mg de lysozyme et, au bout de 5 minutes à 0°C, on disloque les cellules par traitement aux ultrasons. On centrifuge les échantillons pendant 10 minutes à 15 000 tpm dans un rotor Sorvall SM-24. On soumet l'activité d'interféron dans les surnageants à un test pour déterminer l'activité antivirale.

Les rendements par litre de culture de ces interférons, titrés sur une lignée cellulaire humaine CWISH]

sont donnés au Tableau 2 d'après lequel il apparaît que l'activité de LeIF A/Q est produite en plus grande quantité que celle des autres interférons. Cette différence pourrait être due à une plus grande activité intrinsèque du LeIF A/D ou à un meilleur rendement en termes de mg de protéine de cet interféron. Etant donné que le linkage génétique est identique pour tous ces interférons, il semble très probable que le LeIF A/D ait essentiellement une activité supérieure à celle des autres interférons.

Tableau 2

Rendement des interférons de leucocytes à partir de cultures d'E. coli en ballon agité

Type d'interféron Activité: Rendement/litre Cunités sur

WISH]*

„ 7

A .

8

x

10

D

5

X

10B

AD

CBgl

II]

2

X

108

DA'

CBgl

II]

1

X

10e

•Jr dosé par inhibition de l'effet cytopathique sur les cellules WISH avec VSV comme épreuve.

On détermine la puissance des divers interférons dans Une gamme de lignées de cellules de mammifères Chomme, WISH; singe vert d'Afrique, VERQ ; fibroblaste de hamster, BHK; cellules de rein de lapin, RK-13; souris L-S29; et rein de boeuf, cellules M03K]. Afin de comparer l'activité

34

relative des interférons, on calcule leur activité sur diverses cellules par rapport à leur activité sur des cellules WISH prises comme indice 100. Les résultats du Tableau 3 montrent que LeIF A/D a une activité très élevée chez les cellules VERO et L-929 tandis que LeIF D/A a une faible activité dans ces lignées cellulaiees. Ces résultats indiquent que la combinaison de la partie N-terminale de LeIF A et de la partie C-terminale de LeIF D au sein d'une seule molécule (XelF A/D] confère à la protéine hybride une puissance particulière qui est manifeste -chez plusieurs espèces de mammifères. De plus, ces propriétés ne sont pas simplement la somme des propriétés des interférons parents. On le voit clairement dans le cas de l'activité sur les cellules L-929 CTableau 3] auquel cas ni un mélange de LeIF A et de LeIF D, ni l'autre hybride, LeIF D/A, n'a d'activité significative.

Tableau 3

Titrage de divers interférons de leucocytes dans des lignées cellulaires provenant de diverses espèces de mammi fères

Interferons de leucocytes lignée couche cellulaire A q /\/q q/a A+D leucocytaire

■ WISH

100

100

100

100

100

100

VERO

250

75

1 670

20

200

200

BHK

400

200 .

833

2 000

400

20

RK-13

12

500

6

-

-

120

L-929

150

5

3 300

2

10

0,1

Interferons testés vis-à-vis de l'infection par VSV des différentes lignées cellulaires. Activités exprimées en "/. de l'activité observée dans les cellules WISH.

On examine également l'activité de LeIF A/D vis-à-vis d'autres virus. Les données de la Figure 5 montrent les eFFets antiviraux contre 1'inFection par un virus EMC des cellules L et les données dans la Figure S montrent les eFFets vis-à-vis de 1'inFection par VSV des cellules L.

Il est clair d'après ces données que la plus grande activité de LeIF A/D ne se conFine pas à un virus [VSV3 et que sa plus grande activité est vraisemblablement une propriété générale vis-à-vis de nombreux virus. Les préparations naturelles d'.dnterféron de couche leucocytaire humains n'ont pas d'.effet contre les cellules de souris Ccf Tableau 23. On examine donc 1'.activité de LeIF A/D vis-à-vis de l'.infection par le virus EMC des souris CD-1. Les résultats de la Figure 7 montrent que LeIF A/D est extrêmement puissant contre 1'inFection léthale due au virus EMC et que LeIF A présente également une activité antivirale, comme on peut s'y attendre d'après l'activité dans les lignées cellulaires [Tableau 23. Les données de la Figure 7 résultent de traitements i.p. 3 h avant 1'inFection. Les doses de LeIF A/D et LeIF A sont telles que titrées sur WISH.

L..1-inFection léthale des hamsters due au virus EMC est également affectée par LeIF A/0 et LeIF A CFigure 83, le premier étant le plus eFFicace, et LÎJLnterféron de couche leucocytaire ne présente qu'un eFFet Faible et sans signification statistique. Dans le cas de la Figure 8,

tous les interFérons sont administrés i.p. 3 h avant l.',in-_ 5

Fection à une dose de 5 x 10 ug/kg, titrée sur des cellules WISH.

Ces résultats indiquent que les eFFets antiviraux prononcés de LeIF A/D dans une série d'espèces de mammifères ne se conFinent pas aux cultures cellulaires mais s'observent également dans les infections virales léthales.

Le virus EMC peut être considéré comme un système modèle, démonstration d'effet antiviral qui peut permettre de prédire un effet antiviral contre la famille de virus représentée, p. ex. la famille des picornavirus à laquelle

36

appartiennent les virus de la Fièvre aphteuse et de la poliomyélite. Le.-virus VSV peut être considéré comme un système modèle, une démonstration d'eFFet antiviral permettant de prévoir un eFFet antiviral contre la Famille de virus représentée, c'est-à-dire la Famille des rhabdovirus dont le virus de la rage est un membre important.

Le Tableau 4 présente l'activité de plusieurs des présente hybrides de LeIF sur des cellules WISH et MD8K et leurs rapports d'activités:

6

6

6

2

2

1

4

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

o

1.

0

0

1,

37

TABLEAU 4 Uni tés/1 i jpçe^ge (PvuII) cellules WISH

2,4

x i—«

o

1,2

X 10'

6 x

107

4 x

107

3,2

x 10

1,5

6 x x 10

107

.1 x

106

2 x

107

3 x

106

2 x

106

x

. CVJ

105

2 x

105

2 x

105

2 x

106

1 x

107

1 x

106

2,4

x 101

8 x

107

8 x

107

2 x

107

5 x

106

2 x

107

1,6

x 10

Unités/1iÎÇerge cellules MOBK

4 x 10 2 x 107 1 x 107 1,5 x 10i 1,2 x 10J

1 x 107 1,5 x .io' 3,5 x 10J 6 x 107 1,2 x 10

5 x 107

4 x 106 _ 1,5 x 10y

6 x 107 8-x 107

2 x 107

,8

4 x 10i 6 x 1.0J

1,2 x 10 4 x 108 1,5 x 10J 2,5 x 10' 2 x 108 1,2 x 10y

>3

de comparaison.

38

Administration parentérale

Les-présents interférons de leucocytes hybrides peuvent être administrés par voie parentérale à des sujets nécessitant un traitement anti-tumoral, ou antiviral, et à ceux qui présentent un état d'immunosuppression. La posologi et le rythme d'administration peuvent se conformer à ce qui est actuellement utilisé dans les recherches cliniques sur des matériaux d'origine humaine, c'est-à-dire environ C1-1D] x 10 unités par jour, et dans le cas de matériaux dé pureté supérieure à 1%, vraisemblablement jusqu'à, p. ex. .5 x 107 unités par jour. Les indications préliminaires dans l'étude sur le singe décrite ci-dessus suggèrent que les doses de LeIF obtenu par voie bactérienne pourraient être augmentées de façon significatives pour avoir un effet supérieur étant donné l'absence essentielle de protéines humaines autres que les LeIF, protéines qui dans les matériaux dérivés de leucocytes peuvent jouer un rôle de pyrogène, .causant des effets nocifs, p. ex. des malaises, des élévations de température, etc.

A titre d'exemple de posologie appropriée pour un LeIF bactérien essentiellement homogène sous forme parentérale applicable ici rnutatis mutandis, on peut dissoudre

8

3 mg de LeIF d'une activité spécifique, p. ex., de 2 x 10

Lf/mg dans 25 ml de sérum-albumine Chumaine] - USP 5 N, faire passer -la solution à travers un filtre bactériologique et répartir aseptiquement la solution filtrée dans 100 flacons,

0

contenant chacun S x 10 unités d'interféron pur approprié à l'administration parentérale. Les flacons sont stockés de préférence à froid C-20°C] avant l'emploi.

Les composés de l'invention peuvent être formulés selon des procédés connus pour préparer des compositions pharmaceutiquement utiles, en combinant le présent polypeptide mélangé à un véhicule support pharmaceutiquement acceptable. Les véhicules appropriés et leur formulation sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences par b

39

E.W. Martin, ici mentionné à titre de référence. Ces compositions contiennent une quantité efficace de la présente protéine d'interféron avec une quantité appropriée de véhicule afin de préparer des compositions pharmaceuti-quement acceptables appropriées à l'administration efficace à l'hôte.

Claims (25)

40 REVENOICATIONS

1. Procédé de production d'un polypeptide antiviral d'environ 165-166 acides aminés, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide comprenant, en séquence, des sous-5-- séquences discrètes correspondantu_quant à l'identité et au nombre des acides aminés à des sous-séquences d'interférons de leucocytes différents, se trouvant dans le nature, la séquence diacides aminés dudit polypeptide différant en composition globale de la séquence d'acides aminés d'in-10 terfémns de leucocytes se trouvant dans la nature, procédé

qui implique de déployer un fragment d'ADN à double brin hybride comprenant un brin encodant ,1e polypeptide au sein d'un véhicule d'expression plasmidique réplicable, de transformer un microorganisme avec celui-ci, de cultiver le microorgani sme et d ' occasionner l'expression du polypeptide encodé, de lyser le microorganisme résultant et de recueillir à partir de celui-ci le polypeptide.

•

2. Procédé selon la revendication 1 où la partie N-terminale du polypeptide antiviral se compose essentiellement des 20 acides aminés 1-32 du LeIF D et-où sa partie carboxy-termi-

nale se compose essentiellement des acides aminés 32-165 du

LeIF A.

3. Procédé selon la revendication 1 où la partie N-terminale du polypeptide antiviral se compose essentiellement des 25 acides aminés 1—31 du LeIF A et où sa partie carboxy—termina— . le se compose essentiellement des acides aminés 33-166 du

LeIF D.

4. Procédé selon la revendication- 1 où la partie N-terminale du polypeptide antiviral se compose essentiellement des acides

30 aminés 1-63 du LeIF D et où sa partie carboxy-terminale se compose'essentiellement des acidds aminés 63-165 du LeIF A.

41

5. Procédé selon la revendication 1 où la partie N-terminale du polypeptide antiviral se compose essentiellement des Bcides aminés 1-62 du LeIF A et où sa partie carboxy-termin nale se compose essentiellement des acides Bminée 64-166

du LeIF D.

6. Procédé selon la revendication 1 où la partie N—terminale du polypeptide antiviral se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LeIF A et où sa partie carboxy-termina le se compose essentiellement des acides aminés 33-166 du LeIF B. " .

7. Procédé selon la revendication 1 où la partie N-terminale du polypeptide antiviral se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LeIF A et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 33-166 du LeIF F.

8. Procédé pour Former un ADN à deux brins codant pour "un interFéron de leucocyte humain hybride d'environ 165-166 acides aminés, procédé qui implique -

[a] de choisir un premier Fragment d'ADN à deux brins comprenant les codons encodant la totalité ou une partie de la séquence d'acides aminés d'un premier interFéron de leucocyte se trouvant dans la nature, ledit Fragment inFluant des codons pour la partie amino-terminale dudit interFéron et, espacé en direction 3' à partir de là, un premier site de clivage d'endonucléase de restriction; Cb] de cliver ledit Fragment avec ladite endonucléase de restriction;

Ce} de choisir un second Fragment d'ADN à deux brins encodant la totalité ou une partie de la séquence d'acides . aminés d'un second i nterFéron de leucocyte diFFérent, se.trouvant dans la nature, le second Fragment comprenant un site de clivage d'endonucléase de restriction

42

identique positionné de.façon essentiellement identique du point de vue de la numérotation des acides aminés des deux interférons et comprenant en outre, au-delà dudit site, des codons pour la partie carboxy-terminale du second interféron;

Cd] de cliver le second fragment_javec ladite endonucléase de restriction; et.

Ce} de lier les produits de digestion par des endonucléases de restriction des étapes b et d pour reconstituer ledit site dendonucléase de restriction et former un fragment hybride comprenant, en séquence, des codons pour la partie amino-terminale du premier interféron et la par-, tie carboxy-terminale du second.

9. Frocédé selon la revendication 8 où le premier interféron de leucocyte, se trouvant dans la natiure, est LeIF D et le second interféron de leucocyte, se trouvant dans la nature, est LeIF A. ;

10. Procédé selon la revendication B où le premier interféron de leucocyte se trouvant dans la nature est LeIF A et où le second interféron■de leucocyte, se trouvant dans la nature, est LeIF D.

11. Procédé selon la revendication 8 où le premier interféron de leucocyte, se trouvant dans la nature, est LeIF A et où le second interféron de leucocyte, se trouvant dans la nature, est LeIF D.

12. Procédé selon la revendication 8 où le premier interféron de leucocyte, se trouvant dans la nature, est LeIF A et où le second interféron de leucocyte, se trouvant dans la nature, est LeIF F..

13. Procédé de préparation'de compositions pharmaceutiques

contenant un polypeptide àntiviral d'environ 165-166 acides aminés, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide comprenant, en séquence, des sous-séquences discrètes correspondant,quant à l'identité et au nombre des acides aminés, à des sous-séquences d1interférons de leucocytes se trouvant dpns la nature, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide différant dans sa composition globale de la séquence d'acides aminés d'interférons de leucocytes se trouvant dans la nature, procédé qui implique de mélanger ledit polypeptide avec des supports non toxiques, inertes, thérapeutiquenient compatibles, et d'amener le mélange obtenu sous une forme.posologique pharmaceutique appropriée.

14. Composition pharmaceutique contenant une quantité théra-peutiquement efficace d':un polypeptide anti viral d'environ 165-166 acides aminés, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide comprenant, en séquence, des sous-séquences discrètes correspondant, quant à l'identité et au nombre des acides aminés, à des sous-séquences d'interférons de leucocytes différents, se trouvant dans la nature, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide différant en composition globale de la séquence d'acides aminés d1interférons de leucocytes se trouvant dans la nature, et un support non toxique, inerte, thérapeutiquenient compatible.

15.. ADN à deux brins comprenant un brin encodant un polypeptide d'environ 165-166 acides aminés, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide comprenant, en séquence, des sous-séquences discrètes correspondant, quant à l'identité et au nombre des acides aminés, à des sous-séquences d'interférons de leucocytes différents, se trouvant dans la nature, la séquence d'acides aminés dudit polypeptide différant dans sa composition globale de la séquence d'acides aminés d'interférons de-leucocytes se trouvant dans la nature.

44

16. ADN à deux brins selon la revendication 15 où la partie N-terminale du polypeptide encodé se compose essentiel lement des acides aminés 1-92 du LeIF D et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 92-165 du LeIF A.

17. ADN à deux brins selon la revendication 15 où la partie N-terminale du polypeptide encodé se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LeIF A et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 93-166 du LeIF D.

18. ADN à deux brins selon la revendication 15 où la partie N-terminale du polypeptide encodé se compose essentiellement des acides aminés &-63 du LeIF D et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 63-

165 du LeIF A.

19. ADN à deux brins selon la revendication 15 où la partie N-terminale du polypeptide encodé se compose essentiellement des acides aminés 1-62 du LélF A et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 64-166 du- LeIF D.

20. ADN à deux brins selon la revendication 15 où la partie N-terminale du polypeptide encodé se compose essentiellement des acides aminés 1-91 du LeIF A et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 93-

166 du LeIF B.

21. ADN à deux brins- selon la revendication 15 où la partie N-terminale du polypeptide encodé se compose essentiellement des.acides aminés 1-91 du LeIF A et où sa partie carboxy-terminale se compose essentiellement des acides aminés 93-166 du LeIF F. .

45

22. Véhicule d'expression plasmidique réplicable capable dans un microor.ganisme transformant d'exprimer un polypeptide codé par une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 15-21.

23. Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLelF AD trp [Bgl II 3 , pLelF AD trp [Pvu II}, pLelF DA trp CBgl 113 et pLelF DA trp [Pvu II3.

24.. Plasmide choisi dans le groupe constitué par pLelF AB [Pvu 113 et pLelF AF CPvu 113.

25. Microorganisme transformé avec un véhicule d'expression de la revendication 23 ou de la revendication 24.

ORIGINAL

contenant ... Renvois mot ajouté ~ mot rayé nul

26l'ls> Boul. Princesse Charlotte ' ■

MONTE-CARLO

Par procuration de