CH681080A5 - - Google Patents

Description

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CH 681 080 A5

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Protein, nämlich das Glykoprotein Amphiregulin, welches einen neuen Wachstumsregulator darstellt. Sie bezieht sich ebenso auf die Herstellung. Die erfin-dungsgemässen Proteine hemmen stark das Wachstum von gewissen tumorabgeleiteten Zellinien, während sie das Wachstum von gewissen anderen Zellinien fördern. Es ist ein breiter Bereich von therapeutischen Anwendungen dieses bifunktionellen Wachstumsregulators beschrieben, einschliesslich der Behandlung von Wunden und der Diagnose und Behandlung von Krebs.

Das zelluläre Wachstum und die Differenzierung scheint durch eine Vielzahl von Stimulatoren, Inhibitoren und synergistischen Faktoren und Hormonen eingeleitet, gefördert und aufrechterhalten zu werden. Die Änderung und/oder der Zusammenbruch des zellulären Homeostase-Mechanismus scheint eine fundamentale Ursache für solche mit dem Wachstum verbundene Leiden, einschliesslich Neoplasie, zu sein. Wachstumsregulierende Faktoren sind in einer grossen Anzahl von pathologischen und physiologischen Prozessen, welche die Signal-Transduktion, die Zellkommunikation, das Zellwachstum und die -entwicklung, die Embryogenese, die Immunantwort, die Blutbildung, das Überleben und die Differenzierung der Zellen, Entzündung, Gewebereparatur und Wiederbildung, Atherosklerose und Krebs umfassen, beteiligt. Es besteht berechtigterweise eine grosse Anzahl von Interessen für die Isolierung, Charakterisierung und Definition der funktionellen Mechanismen der wachstumsregulierenden Faktoren, wegen ihrer möglichen Verwendung bei der Diagnose, Prognose und Behandlung von Krebs. Im weiteren kann die Aneignung von Kenntnissen über diese Faktoren hilfreich für das Verständnis der Grundmechanismen sein, welche hinter der normalen Wachstumssteuerung und ihres Verlustes bei Krebszellen stehen.

Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der transformierende Wachstumsfaktor-ß (TGFß), der plättchenabgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), der Ner-venwachstumsfaktor (NGF), der transformierende Wachstumsfaktor-ß (TGFß), der Insulin-Wachstumsfaktor I und II (IGF I, IGF II), die blutbildenden Wachstumsfaktoren, wie Erythropoietin, die kolonienstimulierenden Faktoren (CSF 1 und 2), die interleukine (IL-1 bis 6), die Interferone (IFN a, ß, 7), die Tumor-Nekrosefaktoren a und ß (TNF a, ß), Leukoregulin, Oncostatin M und andere weniger definierte Faktoren sind Wachstums- und differenzierungsregulierende Proteine, welche durch eine Vielzahl von Zelltypen produziert werden, entweder unter normalen physiologischen Bedingungen oder in Reaktion auf exogene Stimulation. Die meisten dieser Faktoren scheinen in autokriner oder parakriner Weise zu agieren (zur Überprüfung siehe:

Goustin, et al., 1986, Cancer Res. 46:1015-1029: Rozengurt, 1986, Science 234:161-66 Pardee, 1987, Cancer Res. 47: 1488-1491: Sachs, 1986, Sei. Amer. 254: 40-47; Marshall, 1987, Cell 50: 5-6: Melcher und Anderson, 1987, Cell 30:715-720: Clemens und McNurlan, 1985, Biochem. J. 226:345-360: Nathan, 1987, J. Clin. Invest. 79: 319-326: Sporn und Roberts, 1986, J. Clin. Invest. 78: 329-332: Old, 1987, Nature, 326: 330-331: Beutler und Cerami, 1987, New Eng. J. Med. 316: 379-385: Weinstein, J. Cell. Biochem., 33: 213-224: Zarling, et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9739-9744: Sporn und Todaro, 1985, N. Eng. J. Med. 303: 878-880: Sporn und Roberts, 1985, Nature 313:, 745-747).

Biologisch aktive Phorbol-Ester, wie 12-0-TetradecanoylphorboI-13-acetat (TPA) sind in vivo-wirksa-me Tumorpromotoren und erzeugen und regulieren eine grosse Anzahl von biologischen und biochemischen Reaktionen in vivo, wie auch in vitro (Blumberg, 1981, Crit. Rev. Toxicol. 9:153-197; Slaga, 1983, Cancer Suv. 2: 595-612). Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass TPA das Wachstum von humanen Brust-Adeno-Karzinom-Zeilinien MCF-7 hemmt. Zusätzlich ändert TPA ebenfalls die Morphologie von MCF-7-Zellen ebenso wie TPA-behandelte Zellen, die morphologischen Charakteristiken von sekretorischen Zellen aufweisen (Osbome, et al., 1981, J. Clin. Invest. 67: 943-951; Valette et al., 1987, Cancer Res. 47:1615-1620).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Anspruch 1 aktivierte Protein. Es umfasst mit Amphiregulin einen neuen zellwachstumsregulierenden Faktor, welcher eine unübliche bifunktionelle Zellwachstumsaktivität aufweist. Amphiregulin hemmt das Wachstum von neoplastischen Zellen und verbessert dennoch das Wachstum von gewissen normalen Zellen. Amphiregulin ist ein aussergewöhnlich hydrophiles Glykoprotein mit einem mittleren Molekulargewicht von 22 500 u, welches in zwei bestimmten und dennoch funktionell equivalenten Formen vorkommt, einer verstümmelten Form und einer grösseren Form. Mit der Ausnahme der zusätzlichen sechs N-terminalen Reste, welche in der grösseren Form gefunden werden, sind die beiden Formen auf Stufe der Aminosäuren (Fig. 12) perfekt homolog. Die Erfindung beruht teilweise auf Forschungsergebnissen, welche zeigten, dass TPA-behandelte MCF-7-Zel-len ein Glykoprotein freisetzen, welches das Wachstum von epidermoiden Karzinom-Zellinien A431 und andere Tumor-Zellinien hemmt, jedoch das Wachstum von normalen humanen Fibroblasten und einigen anderen Zellinien fördert.

Die Erfindung umfasst ebenfalls das im Anspruch 19 definierte Herstellungsverfahren für die erfin-dungsgemässen Proteine, sowie die weiteren im Anspruchsteil definierten Gegenstände.

Die Erfindung wird mittels Beispielen beschrieben, in welchen Amphiregulin identifiziert und bis zur Homogenität gereinigt und bezüglich der Funktionalität und der Struktur sorgfältig bestimmt wurde. In anderen Beispielen ist die Isolierung und Sequenierung sowohl von cDNA- und genomischen Klonen, welche Amphiregulin codieren, beschrieben. Diese Klone wurden verwendet, um die Expressionsvektoren

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herzustellen, welche eine hochgradige Synthese von biologisch aktivem Amphiregulin in transformierten, bakteriellen und transvektierten, eukaryotischen Wirtszellen ermöglichen.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 Präparative Umkehrphasen-HPLC des Durchbruches und der Waschlösung, Fig. 2 semipräparative Umkehrphasen-HPLC der gepoolten Fraktionen 47 bis 62 von Fig. 1,

Fig. 3A analytische Umkehrphasen-HPLC von Pool I des vorhererwähnten Laufs,

Fig. 3B analytische Umkehrphasen-HPLC von Pool II des vorhergehenden Laufs, Fig. 4 Gelpermeations-Chromatographie der Fraktionen aus Fig. 3A und 3B auf den Bio-Sil TSK 250-Säulen. Die Chromatographie wurde durchgeführt, wie sie nachstehend im Kapitel «Herstellung von Am-piregulin» beschrieben ist. (A) HPLC der konzentrierten Fraktion 35 (Fig. 3A); (B) HPLC der konzentrierten Fraktion 36 (Fig. 3A); (C) HPLC der konzentrierten Fraktion 37 (Fig. 3A); (D) HPLC der konzentrierten Fraktionen 41 und 42 zusammen (Fig. 3B),

Fig. 5 Analyse von gereinigtem AR und S-pyridylethyliertem AR (SPE-AR) durch Gelpermeation-HPLC auf Bio-Sil TSK 250-Saeulen. Die Chromatographie wurde durchgeführt, wie sie nachstehend im Kapitel «Herstellung von Amphiregulin» beschrieben ist. Die Molekulargewichts-Markiersubstanzen waren Ovalbumin, 43 ku; Chymotrypsinogen A 25 ku; Ribonuklease, 14 ku; und Insulin 6 ku; (A) AR; (B) SPE-AR,

Fig. 6 Analyse von AR und SPE-AR auf einer Umkehrphasen-Ultraporen-RPSC C3-Säule (4,6 x 75 mm). Der Gradient wurde mittels eines primären Lösungsmittels 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel Acetonitril mit 0,1% TFA mit einer Fliessrate von 1 ml/Min. bei Zimmertemperatur aufgebaut. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt (A) AR; (B) SPE-AR,

Fig. 7 SDS-PAGE-Analyse von AR-Proteinen. (A) 15% SDS-PAGE-Gel (0,75 mm x 18 cm x 15 cm, Bio-Rad) mit einem diskontinuierlichen Puffersystem wurden unter einem konstanten Strom von 30 Milliamper gesetzt. Die Molekular-Markiersubstanzen waren Phosphorylase B, 92,5 ku; BSA, 66,2 ku; Ovalbumin, 43 ku; Kohlensäureanhydrase, 31 ku; Chymotrypsinogen A, 25,7 ku; Sojabohnentiypsin-Inhibitor, 21,5 ku; Lactoglobulin, 18,4 ku; Lysozym, 14,4 ku; Aprotonin, 6,2 ku; und Insulin-Untereinheit, 3 ku. Strecke 1: AR; Strecke 2: NG-AR; Strecke 3: SPE-AR; Strecke 4: NG-SPE-AR. (B) 20% SDS-PAGE-Minigel (0,75 mm x 10 cm x 7 cm) wurde unter eine konstante Spannung von 200 Volt gesetzt. Es wurden die gleichen Molekular-Markiersubstanzen wie oben verwendet. Strecke 1: AR; Strecke 2: NG-AR; Strecke 3: phospholipase-behandeltes NG-AR, aufgetrennt auf rp HPLC,

Fig. 8 IEF-Analyse von 125l-markiertem AR. Es wurden die folgenden Standards mit den P|-Werten zwischen 4,65 und 9,6 verwendet: Phycocyanin, 4,65; ß-Lactoglobulin B, 5,1 ; bovine Kohlensäureanhydrase, 6,1; humane Kohlensäureanhydrase, 6,5; Equinmyoglobin, 7,0; Walmyoglobin, 8,05; a-Chymo-trypsin, 8,8; und Cytochrom C, 9,6,

Fig. 9 (A) Dosis-Reaktionskurve von AR auf die Hemmung der 125|-Desoxyuridin-Einverleibung in die DNA von A431-Zellen; (B) Wirkung von AR auf die Stimulation von 125l-Desoxyuridin-Einverleibung in die DNA von humanen Vorhaut-Fibroblasten (Sadamoto),

Fig. 10 Wettbewerb der i25|-EGF-Bindung an fixierte A431-Zellen oder A431-Plasmamembrane durch Mäuse EGF und AR. Die Bindungstests wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Es wurden 100 nl oder 50 i^l-Proben pro Vertiefung für Tests mit fixierten Zellen bzw. Membranen verwendet.

Symbol Rezeptor-Quelle Konkurrenten fixierte Zellen EGF

fixierte Zellen AR

Membranen EGP

Membranen AR

O A

Fig. 11 Hydropathie-Analyse von AR und humanem EGF (Kyte und Doolittle). (A) AR (Rückstände 1 bis 84); (B) AR (Rückstände 44 bis 84); (C) EGF (Rückstände 1 bis 53); (D) AR-Vorläufer (Rückstände 1 bis 252); (E) Vergleich von humanem AR (Rückstände 1 bis 84) und EGF (Rückstände 1 bis 53) (die Anordnung entspricht derjenigen von Fig. 13, wobei Cystein, Rückstand 46, des reifen AR dem Cystein, Rückstand 6, des reifen EGF entspricht),

Fig. 12 Aminosäuresequenz des reifen AR und des verstümmelten AR. Es wird die Standard-Einbuch-stabenabkürzung für Aminosäuren verwendet: Alanin (A); Arginin (R); Asparagin (N); Asparaginsäure (D); Cystein (C); Glutamin (Q); Glutaminsäure (E); Glycin (G); Histidin (H); Isoleucin (I); Leucin (L); Lysin (K); Methionin (M); Phenylalanin (F); Prolin (P); Serin (S); Threonin (T); Tryptophan (W); Tyrosin (Y); und Valin (V),

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Fig. 13 Vergleich von Aminosäuresequenzen von Amphiregulin (AR) und Mitgliedern der EGF-Super-familie,

Fig. 14 (A) 125l-AR-Bindung an Zellulose (°-°), denaturierte DNA-Zellulose (□-□) und native DNA-Zellulose (a-a). (B) 125|-AR-Bindung an Zellulose (o-o) und an DNA-Zellulose (□-□) wird mit der 125l-

EGF-Bindung an Zellulose (a-a) und an DNA-Zellulose ( V-V ) verglichen,

Fig. 15 synthetische Amphiregulin-Peptide, welche durch die Festphasentechnik gebildet wurden. Es wurden 5 Peptide, welche den Rückständen 166-184 (Nr. 259), 108-130 (Nr. 264), 31-50 (Nr. 279), 71-90 (Nr. 280) und 221-240 (Nr. 261) entsprechen durch die Feststoffphasen-Synthese hergestellt und dann durch die Umkehrphasen-HPLC gereinigt,

Fig. 16 Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von cDNA-Klon pARI, das humanes Amphiregulin codiert,

Fig. 17 humane Amphiregulin-Genom-Sequenz,

Fig. 18 schematisches Diagramm der Exonstruktur und der Proteinbereiche des AR-Moleküls in Beziehung mit der Genomsequenz,

Fig. 19 Nukleotidsequenz des pDCHBARI-Expressionsvektors,

Fig. 20 Nukleotidsequenz von pTacAPARI,

Fig. 21 Nukleotidsequenz von pTacAPHILE.

Die vorliegende Erfindung umfasst Amphiregulin (AR), Nukleotidsequenzen, die AR codieren, die Herstellung von AR durch rekombinante DNA-Verfahren.

AR ist ein neuer Zellwachstumsregulations-Faktor und wird durch TPA-behandelte MCF-7-Zellen ex-primiert und in zwei bestimmten, jedoch äquivalenten Formen ausgeschieden. Die zwei Formen sind strukturell identisch, mit der Ausnahme von zusätzlichen 6 amino-terminalen Resten in der grösseren Form. AR zeigt eine wirksame Hemmungsaktivität bei der DNA-Synthese in neoplastischen Zellen und wirkt demzufolge als wirksame Antitumor-Verbindung. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit von AR, das Wachstum in Fibroblasten und anderen normalen Zellen zu fördern, woraus geschlossen werden kann, dass AR für die Behandlungsbedingungen nützlich sein könnte, welche für die Beschleunigung des Zellwachstums erforderlich sind, d.h. bei Verbrennungen und Wunden.

AR oder Fragmente und Derivate davon besitzen eine breite, potentielle, therapeutische Verwendung bei der Behandlung und Überwachung von Neoplasien, ebenso wie bei der Behandlung von Wunden. AR kann ebenfalls Anwendung bei Regulierung der Knochenresorption und der Immun-Antwort und bei der Stimulation der arachidonischen Säuren-Kaskade Verwendung finden. Das Amphiregulin-Gen und Genprodukte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendungen sind im einzelnen in den nachstehenden Abschnitten und Beispielen beschrieben.

Produktion und Reinigung von Amphiregulin

Amphiregulin wird durch die humane Brust-Karzinom-Zellinie MCF-7 ausgeschieden, wenn sie mit dem tumorfördernden Mittel 12-0-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA) behandelt wird. Amphiregulin kann aus den konditionierten Medien solcher kultivierter TPA-behandelten MCF-7-Zellen isoliert und anschliessend auf eine hohe spezifische Aktivität gereinigt werden. Amphiregulin kann ebenfalls aus anderen Zellinien mit oder ohne Induktion durch Behandlung mit TPA oder anderen tumorfördernden Mitteln isoliert werden. Alternativ kann Amphiregulin durch rekombinante DNA-Techniken oder durch die Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden.

Amphiregulin kann gereinigt werden, indem verschiedene bekannte Verfahren und Techniken eingesetzt werden, einschliesslich der Chromatographie (beispielsweise die Umkehrphasen-, Flüssiggel-Per-meations-, Flüssigaustausch-, Ionenaustausch-, Grössenausschluss- und Affinitäts-Chromatographie), Zentrifugation, Elektrophorese-Verfahren, unterschiedliche Löslichkeit oder durch andere Standardtechniken für die Reinigung von Proteinen.

Zur Herstellung von AR werden vorzugsweise MCF-7-Zellen mit TPA während 48 h behandelt und in frischem serumfreien Medium während 4 Tagen gezüchtet. Das resultierende, konditionierte Medium wird gesammelt und zur Herstellung eines rohen AR verwendet, wie es nachstehend beschrieben wird. Es kann eine Kombination von Umkehrphasen-Flüssig- und Gelpermeations-Chromatographie verwendet werden, um das AR auf eine äussere Homogenität zu reinigen, wie dies in einem der nachstehenden Abschnitte beschrieben ist, wobei ein gereinigtes AR erhalten wird, welches bezüglich dem rohen Aus-gangsmaterial eine 1842- bis 2270fache Reinheit aufweist. Das Verfahren ist reproduzierbar und die Ausbeuten der gereinigten AR-Zubereitungen besitzen spezifische Aktivitäten zwischen 2,7 und 3,4 x 106 Einheiten/mg Protein.

Das Amphiregulin-Gen

Isolierung und Klonieruna des Amphireaulin-Gens

In der Praxis des erfindungsgemässen Verfahrens kann das Nukleotid, welches die Sequenz für das

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humane Amphiregulin oder ein funktionelles Äquivalent davon aufweist für die Bildung von rekombinan-ten Molekülen verwendet werden, die auf die Expression des humanen Amphiregulin-Produktes gerichtet sind. Das Nukleotid, welches die AR-Sequenz codiert, kann aus Zellquellen, welche eine AR-ähnliche Aktivität aufweisen, erhalten werden. Beispielsweise wird in einer speziellen Ausführungsform die humane Brust-Karzinom-Zellinie MCF-7 als Quelle für die AR-nukleotid-codierende Sequenz verwendet. Die codierende Sequenz kann durch cDNA-Klonierung von RNA, welche aus solchen zellulären Quellen isoliert und gereinigt wurde oder durch genomische Klonierung erhalten werden. Es können cDNA- oder genomische Datenbanken von Klonen aus den DNA-Fragmenten gebildet werden, wobei bekannte Techniken eingesetzt werden können, welche Restriktionsenzyme verwenden.

Die Fragmente, welche das Gen für das AR enthalten, können auf zahlreiche Weisen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Teil der AR-Aminosäuresequenz für die Ableitung von DNA-Sequenzen verwendet werden, welche dann chemisch synthetisiert, radioaktiv markiert und als Hybridisie-rungssonde verwendet werden können.

Andere Verfahren, welche für die Isolierung des AR-Gens verwendet werden können, umfassen beispielsweise die chemische Synthese der Gensequenz selbst, aus einer bekannten Sequenz, welche z.B. aus der Aminosäuresequenz des AR abgeleitet sein können. Alternativ kann eine in vitro-Translation von ausgewähltem mRNA und gefolgt durch funktionelle oder immunologische Tests der Translationsprodukte verwendet werden. Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen zweckmässigen Klonie-rungsvektor eingesetzt werden. Es können eine Vielzahl von bekannten Vektor-Wirtssystemen eingesetzt werden. Mögliche Vektoren umfassen z.B. Plasmide oder modifizierte Viren, worin das Vektorsystem mit der Wirtszelle verträglich ist. Solche Vektoren umfassen beispielsweise Bakteriophagen, wie Lambda-Derivate oder Plasmide, wie PBR322 oder pl)C-Plasmid-Derivate. Die rekombinanten Moleküle können durch Transformation, Transvektion, Infektion, Elektroporation usw. in die Wirtszellen eingeführt werden.

In einer besonderen Ausführungsform wird das AR-Gen, welches durch MCF-7-Zellen exprimiert wird, kloniert, indem die mRNA, welche als Antwort auf die TPA-Behandlung von MCF-7-Zellen produziert werden, ausgewählt werden und eine cDNA-Bank im Bakteriophasen gt10 konstruiert wird. Da die unbehandelten MCF-7-Zellen offensichtlich kein AR-Protein synthetisieren und ausscheiden, wird angenommen, dass die Induktion von AR durch TPA auf der Stufe der Transkription festgestellt wird und dass eine solche cDNA-Bank mit AR-enthaltenden Sequenzen beträchtlich angereichert werden sollte. Der Test einer cDNA-Bank mit degenerierten und intakten Oligonukleotiden auf Basis der Verwendung von humanem Codon (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 83: 1-12 und wie nachstehend beschrieben) führte zur Isolierung von AR-cDNA-Klonen. Diese cDNA-Klone wurden dann zur Charakterisierung der AR-mR-NA und des AR-Gens verwendet. Im weiteren kann die AR-cDNA-Nukleotidsequenz (wie nachstehend beschrieben, Fig. 16) zur Ableitung der primären AR-Aminosäuresequenz verwendet werden.

Wegen der inhärenten Entartung von nukleotid-codierenden Sequenzen können andere DNA-Sequenzen, welche im wesentlichen die gleiche oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, in der Praxis der erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden. Solche Änderungen der AR-Nukleotidsequenzen umfassen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotiden, welche in der Sequenz dazu führen, dass ein gleiches oder funktionell äquivalentes Genprodukt codiert wird. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der Sequenz enthalten, was dazu führt, dass der stille Wechsel demzufolge zur Produktion eines bioaktiven Produktes führt. Solche Aminosäure-Substitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit in der Polaritätsladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilität und/oder der amphipathischen Natur der betroffenenen Reste durchgeführt werden. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren, welche ungeladene, polare Kopfgruppen oder nichtpolare Kopfgruppen aufweisen und ähnliche Hydrophilitätswerte aufweisen, umfassen die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.

Die AR-cDNA kann als Sonde zum Nachweis der AR-mRNA in TPA-induzierten MCF-7-Zellen verwendet werden. Die AR-mRNA besitzt eine Länge von ungefähr 1400 bp.

Wie nachstehend beschrieben, kann die AR-cDNA verwendet werden, um das AR-Gen zu charakterisieren. Die Chromosomen-Zuordnung des humanen AR-Genes wurde durch in situ-Hvbridisieruna von 3H-markierter AR-cDNA mit normalen Metaphasen-Chromosomen durchgeführt, was zeigte, dass sich das humane AR-Gen am Chromosom 4 in der Region 4q13-21 befindet, einer Region, von welcher angenommen wurde, dass sie in die Lymphocyten-Differenzierung involviert wird (vgl. den entsprechenden Abschnitt dieser Beschreibung). Die cDNA wurde ebenfalls zur Isolierung der genomischen DNA verwendet, welche das gesamte AR-Gen, einschliesslich der 5'-regulierenden Region umfasst. Es wurde gefunden, dass das AR-Gen eine Länge von etwa 10 kb aufweist und dass es in 6 Exons aufgeteilt ist. Die 5'-regulierende Region wurde in einen Expressionsvektor einverleibt, welcher ein promotorloses Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gen aufwies. Diese Konstruktion war fähig, die Transkription des CAT-Gens zu stimulieren, wenn es vorübergehend in MCF-7-Zelien eingeführt wird und die Aktivität wurde sechs- bis siebenmal durch Zugabe von TPA erhöht (vgl. den entsprechenden Abschnitt dieser Beschreibung). In spezifischen Ausführungsformen kann diese 5'-regulierende Region in Expressionsvektoren verwendet werden, um die Transkription des AR-Gens oder anderen Strukturgenen zu

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steuern. Die chimerische AR-CAT-Konstruktion kann ebenfalls verwendet werden, um Faktoren zu suchen, welche die Expression von AR regulieren, wie dies an späterer Stelle beschrieben ist (vgl. Beispiel: Genomische Klonierung und Ananlyse des Amphiregulin-Gens).

Konstruktion des Expressionsvektor, welcher die amphireaulincodierende Seauenz enthält

Um eine biologisch aktive, reife Form des AR zu exprimieren, sollte ein Expressionsvektor/Wirt-Sy-stem ausgewählt werden, welches nicht nur hohe Transkriptions- und Translationsgrade aufweist, sondern ebenfalls das richtige Genprodukt entwickelt. Dies ist besonders wichtig, wenn die gesamte Codierungssequenz des Amphiregulinsvorläufers in der Expressionskonstruktion codiert wird, da die reife Form von Amphiregulin aus dem Vorläuferprodukt durch zelluläre Entwicklungsvorgänge abgeleitet wird. Beispielsweise kann ein Säugetief-Zellsystem ausgewählt werden, wegen seiner Fähigkeit, dass es auf korrekte Weise in der extra-zellulären Umgebung Amphiregulin entwickelt und ausscheidet.

Es hat sich insbesondere erwiesen, dass zwei Formen von reifem Amphiregulin als mittlerer Teil eines gewöhnlichen 252-Aminosäure-Vorläufers synthetisiert werden, wobei die zwei reifen Formen über wechselnde proteolytische Verfahrensvorgänge freigesetzt werden. Zusätzlich wird Amphiregulin gly-kosyliert und kann einer Tyrosin-Sulfierung unterworfen werden, was die Wichtigkeit der Auswahl eines Expressionssystems unterstreicht, welches fähig ist, diese posttranslationalen Änderungen auszuführen, wenn es im Endprodukt erwünscht ist.

Es können verschiedene Tier/Wirts-Expressionsvektorsysteme (d.h. Vektoren, welche die nötigen Elemente für die Steuerung der Replikation, Transkription und Translation der AR-codierenden Sequenz in einer zweckmässigen Wirtszelle enthalten) gleich gut durch einen Fachmann verwendet werden. Diese umfassen unter anderem Virus-Expressionsvektor/Säugetier-Wirtszellensysteme (z.B. Cytomegal-ovirus, Vacciniavirus und Adenovirus); lnsektenvirus-Expressionsvektor/lnsektenzellsysteme (z.B. Baculovirus); oder nichtvirale Promotor-Expressionssysteme, welche von Genomen von Säugetierzellen abgeleitet sind (z.B. der Mäuse-Metallothionin-Promotor).

Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Stärke und Spezifität. Je nach dem verwendeten Wirts/Vektorsystem kann jedes einer Anzahl von zweckmässigen Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden. Beispielsweise können bei der Klonierung in Säugetier-Zellsy-stemen Promotoren, welche aus den Genomen von Säugetierzellen (z.B. der Mäuse-Metallothionon-Promotor) oder aus Viren, welche in diesen Zellen wachsen (z.B. Vaccinia-Virus oder eine lange, terminale Wiederholung des Moloney-Sarcoma-Virus von Mäusen) isoliert worden sind, verwendet werden. Es können ebenfalls Promotoren verwendet werden, welche durch rekombinante DNA- oder durch synthetische Techniken hergestellt worden sind, um eine Transkription der insertierten Sequenzen zu verursachen.

Es sind ebenfalls spezifische Startsignale für eine genügende Translation der insertierten protein-co-dierenden Sequenzen erforderlich. Diese Signale umfassen den ATG-Initialcodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, worin das gesamte AR-Gen einschliesslich des eigenen Initialcodons und der anschliessenden Sequenzen in zweckmässige Expressionsvektoren insertiert werden, sind keine zusätzlichen Translationssteuerungssignale erforderlich. In Fällen, in welchen jedoch nur ein Teil der codierenden Sequenz insertiert wird, müssen jedoch exogene Translationssteuerungssignale, einschliesslich des ATG-lnitialcodons insertiert werden. Im weiteren muss der Initialcodon in einer Phase mit dem Leserahmen der AR-codierenden Sequenzen vorliegen, um eine Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translationssteuerungssignale und Initialcodons können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl aus natürlichen wie synthetischen Quellen. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss von transkriptions-abschwächenden Sequenzen, Verbesserungselementen usw. verbessert werden.

Jedes der obenbeschriebenen Verfahren für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, welche das AR-Gen und zweckmässige Transkriptions/Translationssteuerungssignale enthalten. Diese Verfahren können rekombinante DNA-in vitro-Techniken. synthetische Techniken und Rekombinationen in vivo (genetische Rekombinationen) umfassen.

In Fällen, wo beispielsweise das Adeno-Virus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die AR-codierende Sequenz an den Adeno-Virus-Transkriptions/Translationssteuerungs-Komplex gebunden sein, z.B. die späte Promotor und dreiteilige Leitsequenz. Dieses chimerisches Gen kann dann durch jn vitro- oder in vivo-Rekombination in das Adeno-Virus-Genom insertiert werden. Die Insertion in eine nicht wesentliche Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, welcher lebensfähig ist und fähig ist, AR in einem infizierten Wirt zu exprimieren. Auf ähnliche Weise kann der Vaccinia 7,5K-Promotor verwendet werden. Ein alternatives Expressionssystem, welches zur Expression von AR verwendet werden kann, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird das Autoarapha californica nuclear polyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression von fremden Genen verwendet. Das Virus wächst in Soodoptera fruqiperda-Zellen. Die AR-codierende Sequenz kann in nicht wesentlichen Regionen kloniert werden (z.B. Polyhedrin-Gen) des Virus und dann unter Kontrolle eines AcNPV-Promotor (z.B. dem Polyhedrin-Promotor) in Position gebracht werden. Eine erfolgreiche Insertion der AR-codierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens

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und zur Produktion eines nicht abgeschlossenen, rekombinanten Virus (d.h. eines Virus ohne Proteinhülle, welcher durch das Polyhedrin-Gen codiert ist). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera fruaiperda-Zellen zu infiszieren, durch welche das insertierte Gen exprimiert wird.

Retrovirale Vektoren, welche in amphotropen Packungszellinien hergestellt worden sind, erlauben eine hocheffiziente Expression in zahlreichen Zelltypen. Dieses Verfahren erlaubt das zelltyp-spezifi-sche Verfahren, die Regulierung und Funktion der insertierten protein-codierenden Sequenz festzulegen.

Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, welcher die Expression der insertierten Sequenzen regelt oder das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise ändert und entwickelt. Die Expression von gewissen Promotoren kann in Gegenwart von gewissen Induktoren erhöht werden (z.B. Zink- und Kadmiumionen für Metallothionin-Promotoren). Demzufolge kann die Expression des genetisch manipulierten AR gesteuert werden. Dies ist wichtig, wenn das Proteinprodukt der geklonten, fremden Zellen für die Wirtszelle lethal ist. Im weiteren sind Änderungen (Glykosylierung) und Verarbeiten (Spaltung) von Proteinprodukten wichtig für die Funktion des Proteins. Verschiedene Wirtszellen besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen für posttranslationale Verfahren und Änderungen von Proteinen. Zweckmässige Zellinien oder Wirtssysteme können zur Sicherstellung der richtigen Änderung bzw. Weiterverarbeitung des fremden Proteins ausgewählt werden.

Expressionsvektoren, welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind beispielsweise folgende:

Plasmid oSV2Neo. Das Plasmid pSV2Neo ist beschrieben in Southern et al., (1982) J. Mol. Applied Genetics 1, 327—341.

Plasmid pSV2dhfr. Das Plasmid pSV2dhfr (Subramani et ai, 1981, Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) enthält das Gen der Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase (dhfr) unter Kontrolle des SV40-Promotors.

Plasmid oH3M. Das Plasmid pH3M (Aruffo et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84, 3365-3369) enthält einen chimerischen Promotor, der aus dem humanen Cytomegalovirus (CMV) AD169 zusammengesetzt ist, der unmittelbar durch den früheren Vergrösserer an den HIV LTR-Positionen -67 bis +80 verschmolzen ist. Dem LTR folgt ein Polylinker mit 5'- bis-3'-Stellen: Hindlll, Xbal, Shol, BstXI, Xhol, Pstl und Xbal. Die kleinen t-Antigen Splice/Polyadenylierungssignale des pSV2 und SV40-Ur-sprungs liegen stromabwärts vom Polylinker. Der letztere erlaubt eine Verstärkung in den Zellen, welche das grosse SV40 T-Antigen enthalten und ebenso bei COS und WOP-Zellen. Ein Suppressor-tR-NA-Gen unterstützt das Wachstum in Vektoren auf Basis von pVX und in Bakterien, welche das P3-Plasmid tragen, wie MC1061/P3.

Plasmid pH3M/bOncM. Plasmid pH3M/bOncM wurde von Najma Malik, Oncogen, erhalten. Es enthält das Affen-TGF-ß-5' untranslatiert und die Leadersequenz war mit der Oncostatin-M-codierenden Sequenz fusioniert, welche in pH3M an der Hindlll/Xhol (gefüllten)-Stellen insertiert war. die TGF-ß-Sequenz besteht aus der 85 bp 5-untranslatierten Region, welche bei Hindlll (gebildet durch pSP65-Po-lylinker) und bei einer angrenzenden Pstl-Stelle der TGF-ß-cDNA, gefolgt durch 87 bp, welche die 29 Aminosäure-Signalsequenz codiert, welche normalerweise zwischen einer Glycin-Leucin-Dipeptid-Se-quenz gespalten wird.

Plasmid pH3ARP. Das Plasmid pH3ARP ist ein Vektor, der auf pH3M basiert und für eine transiente Expression des AR-Vorläufers in COS-Zellen dient. Er enthält 13 bp der untranslatierten Region AR 5' und die gesamte codierende Region und die untranslatierten Sequenzen 3'. Dieses Plasmid wurde durch Verbinden des 4 kb-Fragmentes des pH3M-Vektors, welcher durch Hindlll und Xbal verdaut wurde, die Oligonukleotide EVSAL3 und EVSAL4 und des gelgereinigten 1,1 kb Hgal/Xbal cDNA-Fragment des pAR1 gebildet. EVSAL3 und EVSAL4 sind mit einer Stelle 5' Hindlll, EcoRV, Sali und Hgal komplementär. Die Konstruktion bewahrt ebenfalls die EcoRI bis Xbal-Polylinker-Stellen von pEMBL18 unmittelbar auf die untranslatierte 3'-Region folgend.

EcoRV Hgal Hindlll Sali EVSAL3 5' AGCTTGATATCGTCGA EVSAL4 3' ACTATAGCAGCTGACGC

Plasmid oSVDR/bOM. Das Plasmid pSVDR/bOM wurde von Jeff Kallestad von Oncogen erhalten. Es ist eine Fusion zwischen pSV2dhfr und pH3M/bOM und führt zu einem Vektor mit einer cDNA, welche durch den Promotor CMV/HIV von pH3M getrieben wird und durch die TGF-ß-Signalsequenz und die SV40 Polyadenylationssignale SV40 getrieben wird, zusätzlich zum Mäuse-dhfr-Gen, welches durch den frühen Promotor SV40 getrieben wird. Es wurde durch Verbinden des BamHI/Nrul (gefüllt) verdauten pH3m/bOM mit BamHI-verdauten pSV2dhfr gebildet.

Plasmid pHras. Das Plasmid pHras ist ein Säugetier-Expressionsvektor, welcher durch Stan McKnight, University of Washington, Dept. of Pharm'acology entwickelt wurde. Es ist ein Vektor auf Basis von pML, welcher folgende Komponenten enthält: 754 bp EcoRI bis Tthllll-Fragment von Harvey Ras

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LTR, einem Polylinker mit Smal, BamHI, Sali, Pstl, Hindlll und Clal, gefolgt durch die Mäuse-DHFR-cD-NA und dem Hepatitis B-Virus 3'-untranslatierten/Polyadenylierungssignal. Die Distanz von BamHI im Polylinker zum ATG von DHFR beträgt 54 bp.

Plasmid pHLARGE. Das Plasmid pHLARGE ist eine Säugetier-Expressionskonstruktion, welche die genomischen 10 kb AR-Sequenzen (Smal bis Hindlll) enthält, welche durch Harvey Ras LTR getrieben wird, enthält und an welches ein nichtfunktionelles, promotorloses DHFR-Gen angeschlossen wird. Es wurde durch eine Dreiwegverbindung der folgenden Fragmente gebildet: 4,6 kb pHras Smal/HINDIII-Fragment; 6,0 kb Smal/Hindlll-genomisches Fragment von pARH12; und 6,4 kb Hindlll AR-genomisches Fragment von pARH6.

Plasmid dHLARGIdcD. Das Plasmid pHLARGIpcD ist eine polycistronische Säugetier-Expressions-konstruktion. Sie enthält den AR-Vorläufer der cDNA-Sequenz, an welche sich das Mäuse-dhfr-Gen anschliesst, welches durch ein einziges Harvey Ras LTR angetrieben wird. Die primäre Transkription ist eine polycistronische Message zwischen 74 bp zwischen dem Stopcodon von AR und dem ATG-Startco-don von dhfr, wobei dem Ribosom der Wiederbeginn und die Fortsetzung der Translation ermöglicht wird. pH3ARP wurde mit EcoRV verdaut und es wurde das 700 bp-Fragment isoliert. Dieses Fragment enthielt die 13 bp AR 5'-untranslatierte Region, die gesamte den vollständigen AR-Vorläufer codierende Region und die 21 bp der 5'-untranslatierten Sequenz. Dieses Fragment wurde mit dem BamHI geschnittenen, gefüllten und phosphatasierten Vektor pHras verbunden.

Plasmid dLOSNL. Das Plasmid pLOSNL wurde von Dusty Miller, Fred Hutchison, Cancer Research Center, Seattle, WA, erhalten. Dieser retroviraie Expressionsvektor wurde für die Bildung eines hohen Titers, einen amphotropen helferfreien, viralen Vorrates entwickelt, welcher fähig ist, einen breiten Bereich von Wirten zu infiszieren, jedoch darin nicht replizierbar ist. Dieser Vektor enthält: mutiertes Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus LTR, wobei die Packungssignale deletiert sind; psi+-Sequenzen: das Or-nithin-Transcarbamylase (OTC)-Gen, welches zwei Xhol-Stellen für die Insertion von cDNA und für die anschliessende Inaktivierung des OTC-Gens enthält; SV2Neo, einem selektiven Marker; 3' LTR; und ein pBR322-Amp resistentes Gerüst.

Plasmid pLARSNL. Das Plasmid pLARSNL ist eine amphotrope, retroviraie Expressionskonstruktion, weiche die AR-Vorläufer cDNA-Codierungsregion enthält, deren Poly(A)-Schwanz fehlt, und durch virales LTR getrieben wird. SV2Neo erlaubt die Auswahl für die Expression von Transfektierungsmitteln. pLARSNL wurde durch Verbinden des 800 bp Sall-Fragmentes von pHLARGIpcD mit dem 7,8 kb Xhol-verdauten und phosphatasierten pLOSNL-Vektor-Fragment gebildet.

Die Identifikation von Transfektierungsmitteln oderTransformierunosmitteln.

welche das Amphireaulin-Genprodukt exprimieren

Die Wirtszellen, welche die rekombinante AR-codierende Sequenz enthalten und welche das biologisch aktive, reife Produkt exprimieren, können mindestens durch vier Möglichkeiten identifiziert werden: (a) DNA-DNA, DNA-RNA oder RNA-Antisinn-RNA-Hybridisierung; (b) Gegenwart oder Abwesenheit von «Markierungs»-Genfunktionen; (c) Abschätzen des Transkriptionsgrades, wie er durch die Expression des AR-mRNA-Transkriptes in der Wirtszelle gemessen wird; und (d) Nachweis des reifen Genproduktes durch Messung mittels Immunoassay und schliesslich durch seine biologische Aktivität.

In der ersten Methode kann die Gegenwart der humanen AR-codierenden Sequenz, welche in einen Expressionsvektor eingefügt worden ist, durch die DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, wobei Proben verwendet werden, welche Nukleotid-Sequénzen enthalten, welche homolog zur Sequenz sind, welches humanes AR codiert.

In einer zweiten Methode kann das rekombinante Expressionsvektor/Wirtssystem aufgrund der Gegenwart oder Abwesenheit von gewissen «Markierungs»-Genfunktionen identifiziert und ausgewählt werden (z.B. Thymidin-Kinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antikörpern und Resistenz gegen Methotrexat, Transformations-Phenotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus usw.). Wenn beispielsweise die AR-codierende Sequenz in eine Markierungssequenz des Vektors insertiert wird, können Rekombinanten, welche die AR-codierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Markierungsgenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann das Markierungsgen hinter der AR-Sequenz unter Kontrolle des gleichen oder eines verschiedenen Promotors, welcher zur Kontrolle der Expression der AR-codierenden Sequenz verwendet wird, angeordnet werden. Die Expression der Markierungssubstanzen in Reaktion zur Einführung oder Auswahl zeigt die Expression der AR-codierenden Sequenz an.

Gemäss einer dritten Methode kann die Transkriptionsaktivität für die AR-codierende Region durch Hybridisierungstests abgeschätzt werden. Beispielsweise kann polyadenyiierte RNA isoliert und durch einen Northern Blot analysiert werden, wobei eine zur AR-codierenden Sequenz homologe Probe oder besondere Teile davon venwendet werden. Alternativ können die Nukleinsäuren der Wirtszellen extrahiert und auf Hybridisierung mit solchen Proben getestet werden.

In einer vierten Methode kann das reife Proteinprodukt immunologisch abgeschätzt werden, beispielsweise durch Western Blots, Immunoassays, wie Radioimmuno-Ausfällung, enzymgebundene Immu-noassays und dergleichen. Der letzte erfolgreiche Test für das Expressionssystem umfasst jedoch den Nachweis des biologisch aktiven AR-Genproduktes". Wo die Wirtszelle das Genprodukt ausscheidet, kann das zellenfreie Medium, welches aus der kultivierten, transferierten Wirtszelle erhalten wird, auf

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AR-Aktivität getestet werden. Wenn kein Genprodukt ausgeschieden wird, können die Zellysate auf eine solche Aktivität getestet werden. In jedem Fall können biologische Tests, wie Wachstumshemmungsund Stimulationsversuche, wie sie hier beschrieben sind oder ähnliche verwendet werden.

Struktur von Amphiregulin

Die Aminosäuresequenierung von gereinigtem AR zeigte, dass die Zubereitung eine ungleiche Mischung von zwei nahezu identischen Formen von AR enthielt (vgl. Fig. 12). Eine Form, die grössere der zwei, enthielt grob 16% der Zubereitung. Die andere Form, eine verstümmelte AR, enthielt den Rest und die Mehrheit der Zubereitung und unterscheidet sich von seinem längeren Gegenstück nur darin, dass das aminoterminale Hexapeptid, SVRVEQ fehlt. Die zwei Formen sind andererseits auf Stufe der Aminosäuren perfekt homolog.

AR ist ein extrem hydrophiles Glykoprotein mit einem mittleren relativen Molekulargewicht von 22500 u. Die N-Glykanase-Behandlung, welche das N-gebundene Kohlehydrat entfernt, verursacht das AR als einzelne Bande mit einem relativen Molekulargewicht von 14000, wandert in guter Übereinstimmung mit den Molekulargewichts-Berechnungen für AR durch Gelpermeatins-Chromatographie. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wanderte das AR in ähnlicher Weise. Das AR ist demzufolge ein Einketten-Glykoprotein.

Die Primärstruktur von AR wurde mit vielen Proteinsequenzen verglichen. Diese Vergleiche zeigten, dass AR ein einheitliches Protein ist, welches keine signifikante, strukturelle Homologie mit irgeneinem verglichenen Protein aufwies. Die Primärstruktur von AR ist jedoch verwandt mit verschiedenen anderen Wachstumsfaktoren, die meisten von ihnen gehören zur EGF-Superfamilie. Es ist gerechtfertigt, das AR als Mitglied dieser Gruppe von Proteinen zu klassieren, da verschiedene der strukturellen Merkmale nahezu parallel zu den hochkonservativen Strukturmerkmalen verlaufen, wie sie in den Proteinen der EGF-Familie gefunden werden. Beispielsweise gleicht die N-Terminale AR-Sequenz den N-terminalen Sequenzen der TGF, VGF und MGF, insofern dass diese Region reich an Prolin, Serin und Threonin-Resten ist. Das AR besitzt ebenfalls Stellen für N-gebundene Glykosylierung, wie dies bei den N-terminalen Vorläuferregionen des TGF und VGF der Fall ist. Das AR zeigt im weiteren Sequenzhomologie mit anderen EGF-ähnlichen Proteinen mit der Konservierung von sechs Cysteinresten, welche in drei Disulfid-Bindungen involviert sind, welche die Sekundärstruktur der reifen Formen dieser Wachstumsfaktoren definieren. Die hydropathische Analyse zeigt jedoch signifikante Unterschiede zwischen dem homologen AR und EGF-Sequenzen. Für weitere Vergleiche zwischen dem AR und anderen Mitgliedern der EGF-Superfamilie wird auf Tabelle I, Fig. 13 und auf die weitere Beschreibung verwiesen.

Tabelle I

Art

Region Nr. 1

Region Nr. 2

EGF

Human

CLHDGVCMVIE

CNCWGYIGERC

TGF-a

Human

CFH-GTCRFLV

CVCHSGYVGARC

VGF

Vaccinia

CLH-GDCIHAR

CRCSHGYTGIRC

SGF

Shope

CLNNGTCFTIA

CVCRINYEGSRC

Faktor IX

Human

CLNXGSCKDDI

CWCPFGFEGKNC

Faktor X

Human

CQNXGKCKDGL

CTCLEGFEGKNC

Faktor XU

Human

CLHXGRCLEVE

CHCPVGYTGPFC

Protein C

Human

CCGXGTCIDGI

CDCRSGWEGRFC

AR

Human

CIH-GECKYIE

CKCQQEYFG ERC

Kombinierte Homologie-Ergebnisse für die Regionen Nr. 1 und 2.

EGF-Ergebn. Coag. Ergebn. AR-Ergebn.

Wachstumsfaktor-Familie >20 <20 <40 Koakuationsfaktoren <25 >25 <40 Amphiregulin-Unterfamilie <20 <20 >40

Ein Amphiregulin-Produkt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz enthalten, was zu stillen Änderungen führt, die zu erfindungsgemässen bioaktiven Produkten führen können. Solche Aminosäure-Substitutionen können auf Basis von Ähnlichkeiten in Polarität, Ladungen, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der

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involvierten Reste durchgeführt werden. Beispielsweise umfassen die negativ geladenen Aminosäuren die Aspartinsäure und die Glutaminsäure. Positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen, polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilizitätswerte aufweisen, umfassen folgende: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin; Phenylalanin und Tyrosin.

Eigenschaften von Amphiregulin

AR ist ein Einketten-Glykoprotein mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 22500 u und weist bifunktionelle wachstumsregulierende Aktivitäten auf eine Vielzahl von Zellen in Kulturen auf. Strukturell ist AR der EGF-Familie der Wachstumsfaktoren verwandt und zusätzlich kann es funktionelle Ähnlichkeiten mit anderen Mitgliedern dieser Familie wie angegeben teilen durch die Fähigkeit von AR mit EGF zu konkurrenzieren bezüglich der Rezeptorbindung.

AR ist ein monomeres Protein, welches für die Aktivität lntraketten-Disulfid-Brücken erfordert, jedoch für seine biologischen Aktivitäten keine Glykosylierung nötig hat, unter mässig sauren und basischen Behandlungen stabil ist und bei Wärmebehandlung bei 56°C während 30 Min. stabil ist. Das AR verliert seine gesamte biologische Aktivität, wenn es reduziert wird, wenn es während 5 Min. auf 100°C erwärmt wird, wenn es mit Trypsin, Endopeptidase Lys-C, Endopeptidase Arg und Endopeptidase Glu verdaut wird.

Die proteolytische Spaltung durch Phospholipase D scheint das AR in ein aktives Fragment oder aktive Fragmente umzuwandeln mit Molekulargewichten von etwa 5600, wie dies aus der SDS-PAGE-Analy-se hervorgeht. Die aktiven Fragmente von AR werden in der vorliegenden Beschreibung später abgehandelt.

AR hat wirksame in vitro-anti-proliferative Effekte auf verschiedene humane Krebszellinien epithe-len Ursprungs. Beispielsweise hemmt AR wirksam die DNA-Synthese von Zellen des epidermalen Karzinoms der Vulva A431, des Brust-Adeno-Karzinoms HTB132, des cervikalen, epidermoiden Karzinoms CRL 1550, des ovarialen, parillaren Adenoms HTB75, des ovarialen Teratokarzinoms HTB 1572 und des Brust-Adeno-Karzinoms HTB 26. Eine 50%-ige Hemmung der DNA-Synthese wird bei A431 beobachtet, welche mit 0,13 nM AR behandelt waren.

Normale Ratten-Leberzellen NRK-SA6 bilden normalerweise in weichem Agar keine Kolonien. Die Kombination von exogenem EGF und TGF-ß, welche zum Kulturmedium zugegeben werden, induzieren ein verankerungsunabhängiges Wachstum, was auf einen transformierten Phenotyp hinweist. Eine Kombination von exogenem AR und TGF-ß induziert ebenfalls das verankerungsunabhängige Wachstum von NRK-SA6-Zellen, unabhängig eines tieferen Niveaus (vgl. Tabelle V), was den direkten Beweis dafür darstellt, dass AR und EGF funktionell verwandt sind.

Die synergistische Wirkung von AR mit TGF-ß führt zum Schluss, dass AR ein wichtiger Faktor bei der Regulierung des Zellwachstums darstellt. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Forschungswerkzeug dar, welches vorher für die Erforschung der komplexen Geschichte der normalen Steuerung des Zellwachstums und des charakteristischen Verlustes der Steuerung des Wachstums in neoplastischen Zellen.

AR induziert ebenfalls die Proliferation von humanen Vorhaut-Fibroblasten (Tabelle IV). Eine zweifache Zunahme der DNA-Synthese in diesen Zeilen wurde bei einer Konzentration von etwa 50 pM AR beobachtet. Eine maximale Stimulation von ungefähr sechsmal bei ungefähr 5 nM.

Der Mechanismus, durch welchen das AR die Zellproliferation und die Wachstumshemmung signalisiert, ist nicht bekannt. Vorhergehende Studien, welche das Ziel hatten, die AR-Rezeptor-Bindung zu erforschen, zeigten, dass AR einen spezifischen Rezeptor aufweisen könnte. Das AR ist in Konkurrenz mit dem EGF für die Bindung des EGF-Rezeptors und kann ebenfalls in Konkurrenz mit den EGF für die Bindung an andere gewöhnliche Rezeptoren sein, möglicherweise ebenfalls mit dem AR-spezifischen Rezeptor selbst. Es ist bekannt, dass die Liganden-Bindung an den EGF-Rezeptor ein wachstumsstimulato-risches Signal bewirkt, teilweise durch die Aktivierung der Tyrosin-Kinase-Aktivität. Die Bindung von AR an den EGF-Rezeptor kann auf ähnliche Weise eine proliferative Antwort einleiten oder umgekehrt, die Einleitung eines proliferativen Signals blockieren kann, indem die Anzahl der für die EGF-Bindung zugänglichen EGF-Rezeptoren oder andere signalbildende Liganden.

Alternativ ist ein anderer Mechanismus für die Hemmung des Zellwachstums möglich und ist durch die Daten in Tabelle I vorgeschlagen. Vier Klone der A431-Zellinie, welche variable EGF-Bindungstellen pro Zelle aufweisen, wurden auf ihre Empfindlichkeit gegen die AR-Hemmaktivität getestet. Die beobachtete fehlende Korrelation zwischen der AR-Empfindlichkeit und der Anzahl EGF-Bindungstellen pro Zelle führte zum Schluss, dass das Zellwachstums-Hemmsignal, welches durch AR gebildet ist, durch ein Rezeptor-Bindungsereignis eingeleitet wird, in welchem der EGF-Rezeptor nicht involviert ist. Ein solches Ereignis kann den proliferativen Wachstumssignalen von anderen Wachstumsfaktoren, wie TGF-a entgegenwirken. Demzufolge kann AR seinen antiproliferativen Effekt durch spezifische Blockierung der mitogenischen Antwort der Zelle auf TGF-a oder andere autokrine Wachstumsfaktoren ausüben.

AR ist ein extrem hydrophiles Protein, dessen Aminosäuresequenz ein einmaliges, hydropathisches Profil bildet, welches kleine Ähnlichkeiten zu Profilen anderer Proteine der EGF-Familie aufweist (Fig. 11). AR ist ein Basisprotein mit einem PI von 7,6 bis 8,0.

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Die Charakterisierung der AR-Induktion durch TPA

Das TPA induziert eine pleiotrope Antwort auf Zellen, einschliesslich der Änderungen in der Zellmorphologie, der Zellproliferation und Differenzierung, dem Membran-Transport, der Rezeptorliganden-Wechselwirkungen, der Protein-Phosphorylierung und dem Phospholipid-Metabolismus. Die Proteinkinase C (PKC) ist eine Ca2+- und phospholipid-abhängige Protein-Kinase mit Rezeptorfunktionen für TPA. Die Bindung von TPA an PKC führt zur Phosphorylierung von zahlreichen Substraten, einschliesslich des Wachstumsfaktor-Rezeptors, des cytoskeletalen Proteins und der trans-aktivieren-den, regulatorischen Proteine.

c-AMP ist ein anderes, regulierendes Molekül, welches verschiedene Effekte auf Zellen ausübt, in erster Linie durch die cAMP-abhängige Protein-Kinase A. Die intrazellulären Stufen von cAMP werden durch eine Kombination einer rezeptorvermittelten Aktivierung und einer Adenylat-Cyclase-Hemmung reguliert. Einige Studien zeigen, dass die TPA und cAMP-induzierte Genexpression mit einem gewöhnlichen Weg zusammenlaufen können. Zum Studium der Regulierung der AR-Genexpression wurde die Beobachtung der Wirkung von verschiedenen Aktivatoren oder Inhibitoren auf den regulatorischen Weg als auch auf die Produkte der AR-spezifischen RNA in MCF-7-Zellen.

Forskolin ist eine Droge, welche die Adenylat-Cyclase aktiviert, wobei eine verbesserte intrazelluläre cAMP erhalten wird. Bei Verabreichung an MCF-7-Zellen bei 25 uM während 4 Std. konnte eine ausgeprägte Stimulation von AR mRNA beobachtet werden, woraus folgt, dass cAMP-Wege ebenso eine Rolle bei der Regulierung der AR-Expression spielen.

Amphiregulin-verwandte Derivate, Analoge und Peptide

Die erfindungsgemässen Peptide können in Derivate, Analoge und Peptide übergeführt werden, welche mit dem AR verwandt sind. Solche Derivate, Analoge und Peptide, die wachstumsregulierende Aktivitäten aufweisen, können Anwendung in der Diagnose, Prognose und Behandlung einer grossen Vielzahl von Neoplasien verwendet werden. Solche Derivate, Analoge oder Peptide können erhöhte oder verminderte biologische Aktivitäten aufweisen, wenn sie mit nativem AR verglichen werden und/oder können den AR-GIA-empfindlichen Zellbereich ausdehnen oder begrenzen. In ähnlicher Weise kann die Herstellung und die Verwendung von Derivaten, Analogen und Peptiden, welche mit AR verwandt sind, und welche eine erhöhte oder verminderte wachstums-stimulatorische Aktivität aufweisen und/oder welche den Bereich der Zellantworten der wachstums-stimulatorischen Aktivität von AR ausdehnen oder begrenzen, nützliche Anwendungen finden, einschliesslich der Behandlung von Wunden und Verbrennungen.

Peptide gemäss der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von bekannten Mitteln hergestellt werden. Verfahren der Gentechnologie und der Proteinchemie fallen unter die vorliegende Erfindung.

Betreffend Proteinchemie sind zahlreiche Änderungen möglich, um Peptide gemäss dem Stand der Technik herzustellen, z.B. spezifische chemische Spaltungen durch Endopeptidasen (z.B. Cyanogen-bromide, Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease und dgl.) oder Exopeptidasen, Acetylierung, Formylie-rung, Oxidation usw.

Amphiregulin-Antikörper-Herstellung

Es können polyklonale und monoklonale Antikörper hergestellt werden, welche das Amphiregulin bzw. das erfindungsgemässe Protein erkennen.

Es können verschiedene bekannte Verfahren für die Herstellung von gegen Epitope von AR gerichtete polyklonale Antikörper hergestellt werden. Für die Herstellung der Antikörper können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem AR-Protein oder einem synthetischen AR-Peptid immunisiert werden; Beispiele von solchen Tieren sind Kaninchen, Mäuse und Ratten. Verschiedene Zusätze können zur Verbesserung der Immunantwort verwendet werden, je nach der Art des Wirtstieres, beispielsweise Freund-Reagens (vollständig oder unvollständig), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxyd, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysoiecithin, Pluron, Polyole, Polyanione, Peptide, Öle, Keyhole-Lympet-Hämocya-nine, Dinitrophenol und potentiell nützliche Adjuvantien, wie BCG (Bazillen Calmette-Guerin) und Corvnebacterium parvum.

Ein gegen ein Epitop von AR gerichteter monoklonaler Antikörper kann hergestellt werden, indem irgendeine Technik zur Produktion von Antikörper-Molekülen verwendet werden, unter Verwendung von kontinuierlichen Zellinien in einer Kultur. Dabei wird beispielsweise die Hybridom-Technik umfasst, wie sie ursprünglich durch Köhler und Milstein beschrieben worden ist (1975, Nature, 256: 495-497) und durch die neuere B-Zellen-Hybridom-Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und durch die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96).

Antikörper-Fragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken gebildet werden. Beispielsweise umfassen solche Techniken das F(ab')2-Fragment, welches durch Pepsin-Verdauung des Antikörper-Moleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Re11

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duktion der Disulfidbrücken von F(ab')2 gebildet werden können und die zwei Fab oder Fab-Fragmente, welche durch Behandlung des Antikörper-Moleküls mit Papain und einem reduzierenden Mittel gebildet werden können.

Antikörper gegen AR können beim qualitativen und quantitativen Nachweis von reifem AR und Vorläufern und Untereinheiten davon, bei der Affinitätsreinigung von AR-Proteinen und bei der Durchführung von AR-Biosynthese, beim Metabolismus und bei der Funktion Anwendung finden. Gegen AR gerichtete Antikörper können ebenfalls als diagnostische und therapeutische Wirkstoffe nützlich sein.

Verwendungen von Amphiregulin

Die bifunktionelle Natur von AR führt zu einer grossen Vielzahl von in vitro- und in vivo-Verwendun-gen. Jede Verbindung, welche AR oder Fragmente und Derivate davon enthält, und welche eine wachstumshemmende und/oder wachstumstimulierende Aktivität aufweist, entweder allein oder in Kombination mit anderen biologisch wirksamen Wachstumsfaktoren, Inhibitoren oder immunomodulierenden Mitteln kann in der Praxis verwendet werden.

Die Lokalisierung von AR-Genen in einer Region, welche mit der Lymphocyten-Differenzierung in Verbindung steht, führt zum Schluss, dass AR eine Rolle in der blutbildenden Zellentwicklung, der Aktivierung oder der Immunosuppression spielen kann. Diese Funktion wird ebenfalls durch die Homologie zwischen der untranslatierten AR3-Region und ähnlichen Regionen von anderen Cytokinen gestützt.

Die Hauptverbindungen können bei der Regulierung von Angiogenese, der Knochenresorption, der Immunantwort und den synaptischen und neuronalen Effektor-Funktionen verwendet werden. AR kann ebenfalls bei der Regulierung der Arachidonsäure-Kaskade eingesetzt werden. Die enzymatische Oxi-dation von Arachidonsäure führt zu einer Vielfalt von wichtigen Produkten, wie Prostaglandinen, Thromboxanen, Prostacyclinen und Leukotrienen. Solche Produkte sind aussergewöhnlich wirksame ubiquitä-re Mittel mit zahlreichen physiologischen Effekten, einschliesslich beispielsweise der Muskelkontraktion, der Plättchenaggregation, der Leukocyten-Migration und der gastrischen Sekretion. AR, AR-verwandte Moleküle und Zusammensetzungen davon können besonders wirksam für die Behandlung von Wunden und bei der Diagnose und Behandlung von Krebs eingesetzt werden.

Behandlung von Wunden

AR kann in einem Verfahren zur Behandlung von Wunden, wie kutanen Wunden, kornealen Wunden und zahlreichen anderen epithelen und stromalen Schädigungen, wie dem chronischen Ulcer, Verbrennungen, chirurgische Schnitte, traumatische Wunden und Verletzungen in den hohlen, durch Epithelien begrenzten Organen, wie dem Esophagus, dem Magen, der grossen und kleinen Eingeweide, dem Mund und dem genitalen und urinalen Trakt. Das Verfahren beruht auf die topische Anwendung einer Behandlung mit einer Zusammensetzung, die AR mit einem physiologisch annehmbaren Träger enthält.

Die genannten Zusammensetzungen können für die Behandlung einer grossen Vielzahl von Wunden, einschliesslich im wesentlichen aller kutanen Wunden, kornealen Wunden und Verletzungen durch Epithelien begrenzten Hohlorganen des Körpers venwendet werden. Für die Behandlung zweckmässige Wunden umfassen diejenigen, welche von Traumen, wie Verbrennungen, Schürfungen, Schnitten und dergleichen und ebenfalls von chirurgischen Verfahren, wie chirurgischen Inzisionen und Hauttransplantationen herrühren. Andere Bedingungen, welche für die Behandlung mit den pharmazeutischen Zusammensetzungen zweckmässig sind, umfassen chronische Bedingungen, wie der chronische Ulcer, der diabetische Ulcer, und andere nicht heilende (trophische) Bedingungen.

AR kann in physiologisch annehmbare Träger für die Applikation des geschädigten Bereiches einverleibt werden. Die Natur der Träger ist abhängig je nach dem Ort der beabsichtigen Applikation. Für die Applikation auf der Haut wird eine Creme oder eine Salbenbasis normalerweise bevorzugt. Zweckmässige Basen umfassen Lanolin, Silvaden (Marion) (insbesondere für die Behandlung von Verbrennungen), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwald, Connecticut) und dergleichen. Gewünschtenfalls ist es möglich, AR enthaltende Zusammensetzung in Verbände oder andere Wundabdeckungen einzuverleiben, damit die Wunde kontinuierlich dem Peptid ausgesetzt ist. Aerosol-Anwendungen können ebenfalls Verwendung finden.

Die Konzentration des AR in der Behandlungszusammensetzung ist nicht kritisch, sollte jedoch genügend sein, um eine Epithel-Zellproliferation zu induzieren. Die Zusammensetzungen können topisch auf dem geschädigten Bereich appliziert werden, typischerweise als Augentropfen in die Augen oder als Cremen, Salben oder Lotionen auf die Haut. Bei den Augen ist eine häufige Behandlung wünschenswert, normalerweise in Intervallen von 4 Std. oder weniger. Auf der Haut ist es wünschenswert, dass die Behandlungszusammensetzung kontinuierlich auf den geschädigten Bereich während der Heilung aufrechterhalten wird, wobei Applikationen der Behandlungszusammensetzungen zwei- bis viermal täglich vorgenommen werden.

Der verwendete Anteil des Haupt-Polypeptides variiert je nach der Art der Verabreichung, der Verwendung von anderen Wirkstoffen und liegt im allgemeinen im Bereich von 1 ng bis 100 ng. Das Haupt-Polypeptid kann mit einem physiologisch anwendbaren Träger, wie Kochsalzlösung, phosphat-gepuffer-ter Kochsalzlösung oder dergleichen verwendet werden. Der Anteil der verwendeten Verbindung wird

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empirisch bestimmt, auf Basis der Reaktion von Zellen in vitro und auf die Reaktion von Versuchstieren auf die Haupt-Polypeptide oder Formulierungen, welche diese Haupt-Polypeptide enthalten.

Die AR-Verbindungen können allein oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren, Inhibitoren oder Immunomodulatoren verwendet werden.

Diagnose und Behandlungen von Neoplasien

Die Zusammensetzungen, welche erfindungsgemässe Peptide enthalten, können als nützliche Mittel für die Diagnose, Prognose und Behandlung einer grossen Vielzahl von Neoplasien verwendet werden.

Eine Anzahl von diagnostischen Verwendungen von AR und verwandten Molekülen werden ebenfalls ins Auge gefasst. In der Praxis können die Haupt-Polypeptide mit einer Markiersubstanz versehen werden, wie einem Radioisotop, einem Enzym, einer fluoreszierenden Substanz, einer chemilumneszieren-den Substanz, einem Enzym-Fragment, Partikeln usw. Solche Verbindungen können zur Titration der Anzahl Rezeptoren von AR auf einer Zelle verwendet werden. Die Identifikation der Rezeptoren für AR ist eine Indikation für eine mögliche Verantwortlichkeit der Zellen für die biologischen Effekte von AR und der verwandten Moleküle. AR, AR-verwandte Moleküle und/oder darauf gerichtete Antikörper können in kompetitiven Tests für den Nachweis von AR in Medien, insbesondere in physiologischen Medien verwendet werden. Es kann eine Vielzahl von bekannten diagnostischen Tests verwendet werden.

Die Gegenwart und die Menge des AR in Körperflüssigkeiten und Geweben kann direkt oder indirekt mit der Gegenwart und der Durchdringung von gewissen Krebsarten in Verbindung stehen. Tests, welche das AR nachweisen und/oder quantifizieren können, sind nützlich für die Krebsdiagnose und -prognose (vgl. den vorstehenden Abschnitt unter dem Titel «Amphiregulin-Antikörper-Produktion»).

Der Nachweis von AR-mRNA ist ebenfalls von praktischer Bedeutung. Tests, welche Nukleinsäure-Proben zum Nachweis von Sequenzen verwenden, die die gesamte oder Teile der Gensequenz enthalten, sind im Fachgebiet bekannt und werden venwendet. AR-mRNA-Niveaus können in Erscheinung tretende oder existierende Neoplasien angeben und demzufolge sind Tests, welche AR-mRNA-Konzentra-tionen quantifizieren können, wertvolle diagnostische Werkzeuge.

Überdies können bösartige Zellen, welche den AR-Rezeptor exprimieren unter Verwendung von markiertem AR oder AR-verwandten Molekülen in einem Rezeptorbindungs-Test oder unter Verwendung von Antikörpern des AR-Rezeptors selbst nachgewiesen werden. Die Zellen können in Übereinstimmung mit der Gegenwart und der Dichte von Rezeptoren für AR unterschieden werden, wobei ein Mittel für die Voraussage der Empfindlichkeit solcher Zellen auf die biologischen Aktivitäten von AR zur Verfügung gestellt wird.

AR kann als anti-neoplastische Verbindung verwendet werden. Für die Verwendung in vivo können die Hauptverbindungen auf verschiedene Weisen verwendet werden, wie beispielsweise durch Injektion, Infusion, topisch, parenteral usw. Die Verabreichung kann in jedem physiologisch annehmbaren Träger, einschliesslich phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, Kochsalzlösung, sterilisiertem Wasser usw. vorgenommen werden. AR und verwandte Moleküle können ebenfalls in Liposomen eingekapselt werden und können konjugiert mit Antikörpern werden, welche den Tumor oder zellspezifische Antigene erkennen und binden können, wobei ein Mittel erhalten wird, welches die pharmazeutischen Zusammensetzungen zielgerichtet appliziert.

AR kann in vivo für die Induktion der terminalen Differenzierung von Tumorzellen nützlich sein. Solche Zellen haben vom gewöhnlichen Verlauf der Zelldifferenziationscharakteristik von normalen Zellen abgelenkt und sind zur kontinuierlichen Proliferation fähig. Im Gegensatz dazu differenzieren normale Zellen in Zellen, welche unter den meisten Umständen zu einer weiteren Zellteilung unfähig sind. Demzufolge kann die Fähigkeit von AR, dass es normale Zelldifferentiation in Tumoren reaktivieren kann und schliesslich das fortgesetzte Tumorwachstum bremsen kann, in der Tumortherapie eine wertvolle Anwendung finden.

AR und verwandte Verbindunge, Analoge und Peptide davon, können allein oder mit mindestens einer anderen anti-proliferativen Verbindung, wie Interferon, TGF-ß1, TGF-ß2, Tumor-Nekrose-Faktor-ß, Tumor-Nekrose-Faktor-ß, usw. für die Behandlung von hormonal verursachten Karzinomen venwendet werden, welche eine grosse Anzahl von Organen schädigen können, wie beispielsweise die Lungen, Brüste, Prostata oder Dickdarm. Hormonempfindliche Karzinome können ebenfalls behandelt werden, indem die Herstellung von AR in den Karzinomzellen induziert wird. Induktoren sind beispielsweise Östrogene, wie 17-B-Estradiol, Verbindungen östrogener Aktivität und Verbindungen mit anti-östrogener Aktivität, wie Tamoxifen. Jede Kombination dieser Verbindungen kann ebenfalls als Induktor venwendet werden.

Die erfindungemässen Verbindungen können in vitro verwendet werden, um das Wachstum von Zellen oder Zellinien, welche auf AR empfindlich sind, zu hemmen, um diese von Zellen zu unterscheiden, welche nicht empfindlich sind. Auf diese Weise können heterogene Mischungen oder Zellinien von unerwünschten Zellen befreit werden, wenn die unerwünschten Zellen empfindlich auf die Wachstums-Hemmaktivität des AR sind. Beispielsweise können die erfindungsgemässen Verbindungen in vitro dazu verwendet werden, bösartige Zellen vom Mark für autologe Marktransplantationen zu eliminieren und um die Prolifération von bösartigen Zellen im Blut vor der Wiederinfusion zu eliminieren oder zu hemmen.

Die wirksamste Konzentration von AR für die Hemmung der Prolifération einer vorgegebenen Zelle

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kann durch Zugabe von verschiedenen AR-Konzentrationen zu den interessierenden Tumorzellen bestimmt werden und der Hemmungsgrad der Zellproliferation kann gezeigt werden. Die wirksamste Konzentration von individuellen Induktoren und/oder Kombinationen von Induktoren kann durch den Nachweis der AR-Produktion in Karzinomzellen bestimmt werden.

Beispiel: Herstellung, Reinigung und Charakterisierung des humanen Amphiregulins

Die nachstehenden Abschnitte beschreiben die Reinigung und Charakterisierung des Amphiregulins, welches durch MCF-7-Zellen, welche durch TPA behandelt waren, produziert wurde.

Material und Methoden

Die folgenden Verfahren wurden verwendet, um die AR-Synthese in MCF-7-Zelien einzuleiten und im wesentlichen reines AR herzustellen und zu charakterisieren.

SDS-Polvacrvlamid-Gelelektroporese

Die Proteine wurden auf SDS-PAGE-Plattengelen (normal oder Mini-Biorad-System) bestimmt, wie beschrieben (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685) und wurden durch Silberfärbung nachgewiesen (Merril et al., 1981, Science 211:1437-1439).

Das isoelektrische Focusina

Das isoelektrische Focusing wurde durchgeführt, wie es im wesentlichen auf dem technischen Datenblatt von Isolab für die «Resolve IEF-Gele» beschrieben ist. Kurz geschildert, wurden die Proben auf vorgegossene Agarose-Geie (85 x 100 mm, pH 3-10) geladen und auf einem Resolve Modell FR-2500 einer Isoelektro-Focusing-Apparatur focusiert, wobei ein Biorad-Modell 3000 Xi computer-gesteuerte Elektrophorese-Stromversorgung verwendet wurde. Die Biorad-IEF-Standards wurden entlang der Probe focusiert, gefärbt und das trockene Gel wurde einem Kodak X-Omat AR-Film ausgesetzt, wobei ein DuPont-Cronex Lightning Plus-Verstärkerschirm verwendet wurde.

lodieruna des Proteins

Die Proteine wurden mit 125l markiert, wobei die Chioramin T-Methode verwendet wurde (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50:54-65).

Proteinbestimmuna

Die Proteinkonzentrationen wurden durch Absorption bei verschiedenen Wellenlängen bestimmt (210 bis 280 nm). Die Methoden von Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275) und Bradford (1976, Anal. Biochem. 72:248-252) wurden verwendet, wobei bovines Serumalbumin als Standard diente.

i25|-EGF-Bindungstest

Die Bindungstests wurden in 48-Loch-Gewebekultur-Platten, bei frischer Kultur und/oder es wurden formalin-fixierte A431-Zeilen, wie beschrieben (Carpenter et al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4484—4891); Shoyab, et al., 1979, Nature 279:387-391; DeLarco, et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 3685-3690) verwendet oder durch Immobilisierung von Plasma-Membranen auf 96-Loch-Polyvinylchlorid-Piatten, wie beschrieben (Kimball und Warren, 1984, Biochem. Biophys. Acta 771:82-88).

Herstellung von Amphiregulin

Sammlung von konditionierten Medien aus TPA-behandelten MCF-7-Zellen

MCF-7-Zellen wurden in T 150-Corning-Gewebekultur-Flaschen kultiviert, wobei ein gesamtes Volumen von 25 ml 50% IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media) + 50% DMEM, das 0,6 tig/ml Insulin und 15% hitze-inaktiviertes, fötales, bovines Serum (MCF-7, vollständiges Medium) aufwies, verwendet wurde. Ungefähr 1 x 106 Zellen wurden pro Flasche vorgelegt und bei 37°C mit 5% CO2 inkubiert. Am Tag 6 wurde alles Medium entfernt und 20 ml frisches MCF-7 vollständiges Medium, das 100 ng/ml TPA enthielt, wurde zu jeder Flasche gegeben. 48 Std. später wurde das Medium entfernt und jede Flasche mit 15 ml 50% IDMM + 50% DMEM (serumfreies Medium) gespült und 25 ml frisches, serumfreies Medium wurde zu jeder Flasche gegeben und dann wurde mit 5% CO2 bei 37°C inkubiert. Vier Tage später wurde das konditionierte, serumfreie Medium gesammelt, zentrifugiert um Trümmerteilchen zu entfernen und bei -20°C aufbewahrt. Die Flaschen wurden wiederum mit 25 ml serumfreiem Medium versehen und das konditionierte, serumfreie Medium wurde jeden dritten oder vierten Tag gesammelt. Ein aliquoter An14

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teil des konditionierten Mediums jeder Sammlung wurde auf wachstumshemmende Aktivität (GIA) an humanen, epidermoiden Karzinomzellen A431 getestet. Üblicherweise wurden drei bis vier Runden des konditionierten Mediums von jedem Batch der TPA-behandelten MCF-7-Zellen gesammelt.

Isolierung des rohen AR

Es wurden ungefähr 4500 ml kondjtiertes Medium aufgetaut und bei 4°C während 15 Min. bei 3500 Umdrehungen/Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde in einem Amicon-2 Liter-Konzentrator konzentriert, wobei eine YM10-Membrane (Amicon) bei 4°C verwendet wurde. Sobald das Volumen des Reten-ats ungefähr 200 ml betrug, wurden 1000 ml kaltes Mili-E-Q-Wasser zugegeben und die Mischung wurde auf 200 ml rekonzentriert.

Das Konzentrat wurde entfernt und in eine vorgekühlte Corning-Zentrifugenflasche mit 200 ml Inhalt transferiert. Dann wurde konzentrierte Essigsäure unter Rühren zugegeben, bis zu einer Endkonzentration von 1 M Essigsäure. Die Mischung wurde dann während 1 Std. bei 4°C stehengelassen und während 20 Min. mit 40 000 X g bei 4°C in einer Sorval RC-5B-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und bei 4°C aufbewahrt. Der Bodensatz wurde in 30 ml 1 M Essigsäure suspendiert und wieder wie oben beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum sorgfältig entfernt und mit dem ersten Überstand gepoolt und dann gegen 17 I 0,1 M Essigsäure in Spectrapore-Dialyse-Schlauch Nr. 3 dialysiert (Molekulargewichtsausschluss von ungefähr 3000). Der Dialysepuffer wurde dreimal nach einer Zeitperiode von 2 Tagen gewechselt. Das Retenat wurde lyophilisiert. Das trockene Material wurde entfernt, gepoolt, gewogen und bei -20°C bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt. Der Einfachheit halber wird dieses Material «Rohpulver» genannt.

Reinigung von Amphiregulin

Umkehrphasen-Flüssiochromatooraphie

950 mg des Rohpulvers (von ungefähr 9 I serumfreiem, konditioniertem Medium) wurde in 300 ml 0,1% TFA (Trifluor-Essigsäure) suspendiert und während 20 Min. bei 7000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt und auf eine Säule mit präparativem C18 (2,54 cm x 27 cm; 55-105 jim; Waters), die mit 0,1 5 TFA in Wasser equilibriert war, aufgetragen. Der Chromatographieträger wurde in Acetonitril (MeCN) mit 0,1% TFA suspendiert, die Aufschlämmung in eine 2,54 cm Säuie gegossen und die Säule wurde mit 400 ml MeCN mit 0,1% TFA gewaschen und dann mit 600 ml 0,1% TFA in Wasser equilibriert. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 4 ml/Min. und die Chromatographie wurde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die Säule wurde mit 650 ml 0,1% TFA in Wasser gewaschen. Die durchfliessende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeit wurden gesammelt. Dann wurde die stufenweise Elution folgendermas-sen durchgeführt: (1) 650 ml 20% MeCN/HaO mit 0,1% TFA, (2) 650 ml 40% MeCN/H20 mit 0,1% TFA, (3) 650 ml 60% MeCN/H20 mit 0,1% TFA und (4) 650 ml 100% MeCN mit 0,1% TFA. Von jeder Fraktion wurde ein aliquoter Anteil genommen und auf GIA getestet. Ungefähr 77% der gesamten GIA-Aktivität trat in den Durchbruch- und Waschfraktionen auf.

Die Durchbruch- und Waschfraktionen wurden isokratisch auf eine präparative Partisi! 10 ODS-3-Säule aufgetragen (10 um, 2,2 x 50 cm, Whatman), welche an ein Hochleistungs-Flüssigchromatogra-phie-System angeschlossen war (HPLC, Waters). Die Fliessgeschwindigkeit wurde auf 4 ml/Min. eingestellt. Wenn einmal eine Probe durch die Säule durchgetreten war, wurde die Säule mit 250 ml 0,1% TFA in Wasser gewaschen. Der lineare Gradient wurde zwischen dem primären Lösungsmittel, 0,1% TFA in Wasser und dem sekundären Lösungsmittel, Acetonitril, welches 0,1% TFA enthielt gegeben. Die Gradienten-Bedingungen waren folgende: 0 bis 15% in 10 Min., 15 bis 15% in 30 Min., 15 bis 25% in 150 Min., 25 bis 65% in 100 Min. und 65 bis 100% 10 Min. Alle Lösungsmittel waren in der HPLC-Qualität. Es wurden Fraktionen von 14 ml gesammelt und aliquote Anteile jeder Fraktion wurden auf GIA getestet. Es wurden zwei breite Aktivitätspeaks festgestellt (Fig. 1). Die früheluierten Peaks (Elution zwischen 20 bis 23% Acetonitril) wurden zusätzlich gereinigt und charakterisiert.

Die Fraktionen 47 bis 62 wurden gepoolt. 224 ml 0,1% TFA in Wasser wurden zur gepoolten Fraktion zugegeben. Die Mischung wurde isokratisch in eine semi-präparative n-Bondapak-C18-Säule (7,8 x 300 mm, Waters) mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/Min. bei Zimmertemperatur injiziert. Die linearen Gradienten-Bedingungen waren 0 bis 17% in 10 Min., 17 bis 17% in 30 Min., 17 bis 25% in 320 Min. und 25 bis 100% in 40 Min. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 1 ml/Min. während dem Gradienten, wobei 4 ml Fraktionen gesammelt wurden. Es wurden aliquote Anteile genommen und auf GIA getestet. Es wurden zwei Hauptaktivitätspeaks beobachtet und mit Acetonitril-Konzentrationen von ungefähr 20% bzw. 21% eiuiert (Fig. 2).

Die Fraktionen 49 bis 53 wurden gepoolt. 20 ml 0,1 % TFA wurde zur gepoolten Fraktion gegeben. Die Mischung wurde isokratisch auf eine n-Bondapak-C18-Säule (3,9 x 300 mm, Waters) mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1 ml/Min. bei Zimmertemperatur appliziert. Die Gradienten-Bedingungen waren 0 bis 18% in 10 Min., 18 bis 18% in 30 Min., 18 bis 25% in 280 Min. und 25 bis 100% in 20 Min. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 0,4 ml/Min. und es wurden 2 mf Fraktionen gesammelt. Die hauptsächliche Aktivität ging aus der Säule bei einer Acetonitrii-Konzentration von ungefähr 21,5% hervor (Fig. 3A). Die Frak-

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tionen 54 bis 59 (Fig. 2) wurden gepoolt und exakt, wie in Fig. 3A beschrieben, chromatographiert. Die hauptsächlich aus der Säule eluierte Fraktion trat bei einer Acetonitril-Konzentration von ungefähr 22,2% auf (Fig. 3B).

Gelpermeations-Chromatoaraphie

Die Fraktionen 35 bis 38 (Fig. 3A) wurden individuell auf etwa 70 p.l konzentriert, wobei ein Speed-Vac-Konzentrator (Savant) verwendet wurde, wobei ein gleiches Volumen Acetonitril mit 0,1% TFA zugegeben wurde. Diese 140 pl-Probe wurde auf Bio-Sil TSK-250-Säulen injiziert (7,5 x 300 mm je, Bio-Rad), wobei die Säulen nacheinander angeordnet waren. Die Elution wurde isokratisch mit einer mobilen Phase von 50% AcetonM/HgO mit 0,1% TFA bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 0,4 ml/Min. und die Papiergeschwindigkeit betrug 0,25 cm/Min.; es wurden 0,4 ml Fraktionen gesammelt und die aliquoten Anteile wurden auf GIA getestet. Die chromatographischen Profile der Fraktionen 35, 36 und 37 (Fig. 3A) sind in den Fig. 4A, 4B bzw. 4C dargestellt.

Die Fraktionen 41 und 42 (Fig. 3B) wurden miteinander vereinigt und auf 70 nl konzentriert und dann einer Gelpermeationschromatographie wie oben beschrieben, unterworfen. Das chromatographische Profil ist in Fig. 4D angegeben.

Zellwachstumstests

Zellwachstums-Modulationsversuch. unter Verwendung von 125l-Desoxvuridin-Einverleibuna in DNA

Die Versuche wurden in 96 Flachloch-Platten (Falcon 3071) durchgeführt. Das humane, epidermoide Karzinom von Vulva-Zellen (A431) wurden als Testzellen für die Wachstumshemm-Aktivität (GIA) verwendet und die humanen Vorhaut-Fibroblasten (Sadamoto) als Indikatorzellen für die Wachstumshemmende Aktivität (GSA). 3,5 x 104 Zellen in 50 p.l DMEM, welches mit 5% hitze-inaktiviertem, fötalem, bovinen Serum (FBS) ergänzt wurde, Penicillin/Streptomycin (PS) und Glutamin (Testmedium) wurden in sämtliche Löcher mit Ausnahme der peripheren Löcher gegeben. Die peripheren Löcher enthielten 50 p.l PBS. 3 Std. später wurden 50 nl Testprobe in Testmedium in jedes Loch gegeben, während die Kontrollö-cher nur 50 nl Testmedium enthielten. Drei Löcher wurden für jede Konzentration der Testprobe verwendet. Die Platten wurden bei 37°C während 2 bis 3 Tagen inkubiert. Danach wurden 100 p.l Lösung mit 125l-lod-2'-125l-desoxyuridin (4 Ci/mg bis 0,5 mCi/ml (2 pJ/ml in Testmedium)) wurde in jedes Loch gegeben und die Platten wurden bei 37°C inkubiert. Nach 4 bis 6 Std. wurde das Medium von den Löchern abgesaugt, einmal mit 2 jxl PBS gewaschen. Dann wurde 200 fil Methanol zu jedem Loch gegeben, die Platten wurden während 10 Min. bei Zimmertemperatur inkubiert und das Methanol wurde durch Absaugen entfernt. 200 fili M Natriumhydroxid wurde zu jedem Loch gegeben, die Platten wurden 30 Min. bei 37°C inkubiert. Das Natriumhydroxid wurde mit Titertek-Steckern (Flow Labs) entfernt. Die Stecker wurden in 12 x 75 mm Plastikröhrchen transferiert und die i25|.|UdR-Einverleibung wurde in einem Gammazähler zur Qualifikation gezählt.

Weichaoar-Kolonien-Test

0,5 ml Basisschicht von 0,5% Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM, welches 10% hitzeinaktiviertes FBS enthielt, wurde in 24 Loch-Costar-Gewebe-Kulturplatten gegeben. 0,5 ml 0,3% Agar, welche die gleiche Medium-FBS-Mischung enthielt, 5 bis 10 x 103 Testzellen und die zu testenden Faktoren in verschiedenen Konzentrationen wurden als Schicht über die Basis-Agarschicht gegeben. Die Platten wurde bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 in der Luft inkubiert und nach 7 Tagen durch Zugabe von 0,5 ml 0,3% Agar, das das gleiche Medium und die gleichen Konzentrationen Testmaterial enthielten, wieder genährt. Die Kolonien wurden numeriert, abgelöst und entfernt und die Anzahl der Kolonien, welche mehr als 20 Zellen aufwiesen, wurden zwischen den Tagen 7 und 14 bewertet.

Zellwachstums-Hemmtest

A431-Zellen wurden mit einer Konzentration von 2,1 x 104 Zellen pro Loch in 0,3 ml Medium (DMEM mit 10% FBS, P/S, Glutamin) in 24 Loch-Costar-Platten (ungefähr 2 cm2/Loch) gebracht und während 2 Std. bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Testproben bei verschiedenen Konzentrationen im Doppel in 0,3 ml Medium in jedes Loch eingeführt. Die Kontroilöcher enthielten Medium ohne Probe. Die Platten wurden bei 37°C während 72 Std. inkubiert. Das Medium wurde dann abgesaugt, die Zellen mit 1 ml PBS/Loch gewaschen, mit 0,5 ml Trypsin (0,5 %)-EDTA (0,5 mM) gelöst und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt.

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Analyse der Primärstruktur von AR Reduktion und S-Pvridvlethvlieruna

AR (20-30 (ig) wurde in einem 1,5 ml Mikrofugen-Polypropylen-Röhrchen getrocknet, in 100 jui 3M Harnstoff in 0,05 M TRIS-HCI, pH 7,5, suspendiert. 4 pl 2-Mercaptoethanol wurde zur Mischung gegeben, der Inhalt gemischt und mit Stickstoff gespült und bei 25°C inkubiert. Nach 2,5 Std. wurde 4,5 jxl frisch destilliertes 4-Vinylpyridin zur Mischung gegeben, das Röhrchen wurde wiederum mit Stickstoff gespült und während 2 Std. bei 25°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde auf pH 2,0 mit 10% TFA angesäuert. Das S-pyridylethylierte AR wurde durch rp HPLC gereinigt, wobei eine ji-Bondapak-C18-Säu-le verwendet wurde (3,9 x 300 mm, Waters). Die Acetonitril-Konzentration wurde linear erhöht (1%/Min.) während 55 Min., mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1 ml/Min. Das primäre Lösungsmittel war 0,1% TFA. Das S-pyridylethylierte AR (SPE-AR) wurde mit ungefähr 26,5% Acetonitril eluiert, mit ungefähr einer 4% höheren Acetonitril-Konzentration als das unbehandelte AR.

N-Glvkanase-Behandluna

AR oder S-pyridylethyliertes AR (10 bis 20 pg) wurde in einem 1,5 ml-Polypropylen-Mikrofugen-Röhr-chen getrocknet, in 80 pl 0,1 M Phosphatpuffer pH 5,5 suspendiert, 10 bis 20 pl N-Glykanase (0,25 Ein-heiten/pl, Genzyme) wurden zugegeben, die Mischung wurde während 16 Std. bei 37°C inkubiert und 0,9 ml 0,2% TFA wurden zur Reaktionsmischung gegeben und Proben wurden auf eine Ultrapore-RPSC-C3-rp-HPLC-Säule injiziert (4,6 x 75 mm, Altex) bei einer Fiiessgeschwindigkeit von 1 ml/Min., vorher mit dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA inkubiert. Acetonitril mit 0,1% TFA wurde als sekundäres Lösungsmittel verwendet. Die Konzentration von Acetonitril wurde linear (0,4%/Min.) während 85 Min. bei Zimmertemperatur erhöht. N-deglykosyliertes AR und N-deglykosyliertes S-pyridylethyliertes AR wurde ungefähr bei Acetonitril-Konzentrationen von 16,5 bzw. 20,5% eluiert.

Enzvmatische Spaltung von N-alvkanase-behandeltem S-Pvridvlethvliertem AR

Die Spaltung mit Endopeptidase Lys-C wurde in 60 pl 0,1 M TRIS-Essigsäure-Puffer, pH 8,0, bei 25°C während 16 Std. durchgeführt. Das Enzym/Substratverhältnis betrug 1:5 (w/w). Endopeptidase-Arg und S. aureus V8-Protease-Verdauungen wurden in 80 pl 0,05 M TRIS-HCI, pH 8,0 und 0,1 M Am-monium-bicarbonat bei 37°C während 16 Std. durchgeführt. Das Enzym/Substratverhältnis war wiederum 1:5.

Chemische Spaltung

Für die CNBr-Spaltung am Methioninrest wurden 5 pg N-glykanase-behandeltes S-pyridylethyliertes AR in einem 1,5 ml Polypropylen-Mikrofugen-Röhrchen in 75 pl 70% Ameisensäure suspendiert, dann wurde 25 pl CNBr-Lösung (25 mg/ml in 70% HCOOH) zugegeben, gemischt und das Röhrchen wurde mit Stickstoff gespült. Die Reaktion wurde während 22 Std. bei 25°C im Dunkeln durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser auf ein Volumen von 1,1 ml verdünnt und in einem Speed-Vac-Konzen-trator getrocknet. Die getrocknete Probe wurde in 20 pl 2-Aminoethanol suspendiert, 10 Min. bei 22°C stehengelassen und dann vakuumgetrocknet. Die Mischung wurde in 0,9 ml 0,2% TFA suspendiert.

Peptid-Isolieruno

Die Peptide wurden auf einer Umkehrphasen-HPLC C8-Säule (4,6 x 100 mm, Whatman), welche mit einem HPLC-System verbunden war (Waters) aufgetrennt. Die angesäuerte Probe (pH 2,0) wurde auf eine Säule gegeben, welche mit 0,1% TFA (primäres Lösungsmittel) equilibriert war, mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1 Min./ml und dann wurde die Säule weiter mit ungefähr 15 ml 0,1% TFA gewaschen. Die linearen Gradienten wurden zwischen dem primären Lösungsmittel und dem sekundären Lösungsmittel Acetonitril mit 0,1% TFA verwendet. Die Gradienten-Bedingungen waren 0 bis 50% in 125 Min. mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min.

Aminosäure-Analvse

Die getrockneten Proben wurden mit konstant-siedender HCl (5,7 M, Pierce), die 1% (v/v) Phenol unter reduziertem Druck in einem teflonversiegelten Glas-Hydrolyse-Kolben (Pierce) bei 150°C während 16 Std. hydrolysiert. Die Hydrolysate wurden in einem Speed-Vac-Konzentrator getrocknet (Savant Instruments) und mit Phenylisothiocyanat während 20 Min. bei Zimmertemperatur deriviert. Die Phenylthio-carbamyl-aminosäure-Derivate wurden mittels rp HPLC auf einer Octadecyl-Säule (4,5 x 250 mm, IBM) analysiert. Der lineare Gradient wurde zwischen dem primären Lösungsmittel 0,15 M Natriumacetat pH 6,4, 0,05% Triethylamin, titriert auf pH 6,4 mit Essigsäure und dem sekundären Lösungsmittel, 60% Acetonitril mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1 ml/Min. bei 38°C.

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Aminosäure-Seauenz-Bestimmuna

Die Peptidsequenzen wurden mit einem Sequenator «Applied Biosystem Model 475 gas phase sequen-cer» wie beschrieben bestimmt (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 7990-7997). Drei Vorzyklen des Edman-Abbaues wurden durchgeführt, bevor die Probenapplikation für jeden Lauf durchgeführt wurde. Es wurde 25% TFA zur Umwandlung des Triazolin-Derivates in Phenylthiohydantoin-aminosäuren verwendet. Die Identifikation der Phenylthiohydantoin-aminosäuren wurden on-iine auf einem Modell 120A PTH Analyzer durchgeführt (Applied Biosystem), wie dies beschrieben wurde (Hunkapiller und Hood, 1983, Science 219:650-659).

Verschiedene Behandlungen

50 bis 100 Einheiten von semireinem (semi prep. rp C18 Stufe) oder praktisch reines AR wurde für diese Experimente verwendet (Tabelle 1). N-Glykanase und O-Glykanase waren von Genzyme Corp., Boston; alle anderen Enzyme waren von Boehringer Mannheim Biochemikalien oder Worthington Biochemi-cals. Die Behandlungen wurden in 50 bis 200 |il eines zweckmässigen Puffers durchgeführt. Es wurde ein Enzymüberschuss verwendet, normalerweise 5 bis 20% (w/w) Substratkonzentration. Nach der Behandlung wurden die Proben auf GIA analysiert, wobei das störende Material durch verschiedene analytische Mittel entfernt wurde. In den meisten Fällen wurde der Probe-pH mit 10% TFA auf etwa 2 eingestellt. Die Proben wurden auf eine Umkehrphasen-Ultraporen-RPSC C3-Säule (4,6 x 75 mm, Altex) appliziert, welche mit 0,1% TFA equilibriert war. Die Säule wurde weiter mit dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA gewaschen. Die Elution wurde begonnen unter Verwendung von Acetonitril mit 0,1% TFA als sekundäres Lösungsmittel. Die Gradienten-Bedingungen waren 0 bis 50% während 0,2 Min. und 50 bis 50% während 19,8 Min. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/Min. und die 2 ml Fraktionen wurden gesammelt. Es wurden aliquote Anteile genommen und auf GIA getestet. Die AR-Aktivität wurde normalerweise in Fraktion 4 eluiert.

DNA-Bindungsstudien

Die Bindung des AR an native Kälber-Thymus-DNA-Zellulose, denaturierte Kälber-Thymus-DNA und Zellulose wurde durchgeführt, wie beschrieben (Herick und Alberts, 1971, Methods in Enzymology 21: 198). Die Zellulosen (10 mg) wurden in 500 p.l Ladungspuffer rehydriert (20 mM Tris pH 7,4, 10% Glyce-rin, mM EDTA, 1 mM ß-Mercaptoethanol, 100 ng/ml BSA und 50 mM NaCI). Die Reaktionen wurden doppelt in 1,5 ml EppendorfRöhrchen mit 300 jxl hydrierten Zellulose-Proben (gepacktes Volumen), welche fünfmal mit Ladungspuffer gewaschen waren, durchgeführt. Dann wurde 0,2 ng 125I-AR (spezifische Aktivität 425 nCi/ng) oder eines anderen 125I-markierten Protein in 250 nl Beladungspuffer zu jedem Röhrchen gegeben. Die Proben wurden gemischt und bei 4°C während 20 Min. unter periodischer Rührung inkubiert und dann fünfmal mit 200 pJ Beladungspuffer pro Waschung gewaschen. Die Elution wurde stufenweise mit 0,1 M, 0,15 M, 0,25 M, 0,6 M, 1 M und 2 M NaCI in Beladungspuffer durchgeführt (fünfmal mit 200 p.I bei jeder Konzentration). Spezifisch gebundenes Material wurde so definiert, dass die Elution bei einer Konzentration von 0,25 M NaCI oder grösser war. Das Material, weiches bei einer Konzentration von 0,15 M NaCI oder weniger eluiert wurde, wurde als nicht spezifisch gebunden betrachtet.

Resultate

Herstellung von AR durch TPA-behandelte MCF-7-Zellen

Es wurden MCF-7-ZeIlen auf einem Kunstoff-Substrat gezüchtet, welches typische epitheloide Merkmale aufwies: die Zellen waren klein und von polygonaler Form. Das TPA induzierte dramatische, morphologische Änderungen in einer dosenabhängigen Weise. Im Anschluss an die TPA-Behandlung verloren die MCF-7-Zellen ihre wohldefinierte Morphologie, wurden rund und breiteten sich aus. Die TPA erzielte eine dosisabhängige Reduktion der Zellzahl und eine Zunahme des Zellvolumens im Vergleich zu den unbehandelten Zellen.

Das serumfreie, konditionierte Medium der MCF-7-Zellen enthielt keine nachweisbare Wachstums-hemm-Aktivität für die A431-Zellen. Die serumfreien Überstände, welche jedoch aus den MCF-7-Zel-len, die während 2 bis 3 Tagen mit TPA behandelt waren, wurden gesammelt und zeigten eine Hemmung der Proliferation der epidermoiden Karzinom-Zellen A431. Die optimale Induktion der Hemmaktivität wurde zwischen 25 und 100 ng/ml TPA beobachtet. Sogar nach der Entfernung von TPA schieden die TPA-behandelten MCF-7-Zellen diese Aktivität in serumfreiem Medium während mindestens 8 Tagen. Ob-schon eine Reduktion der wachstumshemmenden Aktivität eine Zeitlang nach der TPA-Entfernung festgestellt wurde, weisen diese Resultate auf Amphiregulin, welches die Depression in MCF-7-Zellen, welche mit TPA behandelt wurden, induziert oder verbessert.

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Ursprüngliche Charakterisierung

Die Tabelle Ii fasst die Wirksamkeit von verschiedenen physikalischen, chemischen und enzymati-schen Behandlungen auf die anti-proliferative Aktivität des Amphiregulins zusammen. Die GIA (Wachstumshemmende Aktivität) von Amphiregulin war gegen die Behandlung mit 1 M Essigsäure, 1 M Ammoniumhydroxid, 6 M Harnstoff, 0,01 M Natrium-metaperiodat, Erwärmung auf 56°C während 30 Min. und Behandlung mit Neuraminidase, N-Glykanase, O-Glykanase, Lipase, Phospholipase A2, C oder D resistent. Die Aktivität war jedoch empfindlich gegen Erwärmen auf 100°C während 10 Min., auf Reduktion, Reduktion und 4-Vinylpyridin-Behandlung und gegen Verdauung mit Proteinasen, wie Tryp-sin, Endopeptidase Lys-C, Endopeptidase-Arg und Endopeptidase-Glu (V-8). Diese Resultate führen zum Schluss, dass Amphiregulin ein Protein ist, welches Cysteine in Disulfidbrücken enthält, welche für seine biologische Aktivität essentiell sind. Dieses Protein kann Oligosaccharid und/oder Liporeste enthalten, welche für die biologische Aktivität nicht obligatorisch sind.

Tabelle II

Wirkungen von verschiedenen Behandlungen auf die GIA von Amphiregulin

Behandlung Prozent Kontrolle

1M Essigsäure während 2 Std. bei 4°C 102

1M NH40H während 2 Std. bei 4°C 97

56°C während 30 Min. 96

100°C während 10 Min. 5

6M Harnstoff (2 Std. bei 25°C) 82

0,2M 2-MercaptoethanoI (2,5 Std. bei 25°C) 6 2-Mercaptoethano! + 4 Vinyipyridin (2,5 Std. bei 25°C) + ( 2 Std. bei 25°C) 1

0,01 M Natrium-metaperiodat (6 Std. bei 4°C im Dunkeln) 86

TPCK-Trypsin (6 Std. bei 37°C) 3

TPCK-Trypsin + Sojabohnen-Trypsin-lnhibitor (6 Std. bei 37°C) 82

Sojabohnen-T rypsin-lnhibitor (6 Std. bei 37°C) 109

Endopeptidase Lys-C (20 Std. bei 25°C) 5

Endopeptidase Arg (16 Std. bei 37°C) 4

Endopeptidase Glu (16 Std. bei 37°C) 6

Neuraminidase (16 Std. bei 37°C) 103

N-Glykanase (16 Std. bei 37°C) 90

O-Glykanase (16 Std. bei 37°C) 102

Neuraminidase + N-Glykanase (16 Std. bei 37°C) 94

Neuraminidase + O-Glakanase (16 Std. bei 37°C) 105

Phospholipase A2 (6 Std. bei 37°C) 82

Phospholipase C (6 Std. bei 37°C) 95

Phospholipase D (6 Std. bei 37°C) 80

Lipase (6 Std. bei 37°C) III

Reinigung von Amphiregulin

Eine Zusammenfassung der Amphiregulin-Reinigung ist in Tabelle III dargestellt. Eine 1842-fache Reinigung mit 5,1% Ausbeute wurde für die TSK 250-l-Fraktion und eine 2270-fache Reinigung mit einer 1,7% Ausbeute ist für die TSK 250-ll-Fraktion erhalten worden. Das Verfahren ist reproduzierbar. Wir haben gereinigtes Amphiregulin bei vier verschiedenen Gelegenheiten mit ähnlichen Resultaten erhalten. Die spezifische Aktivität des gereinigten Amphiregulins fällt in den Bereich von 2,7 bis 3,5 x 106 Einheiten/mg Protein. Gereinigtes Amphiregulin von der TSK-250-l-Säuie, welches eine spezifische Aktivität von etwa 3,0 x 106 aufweist, wurde für strukturelle Bestimmungen und andere biochemische Studien verwendet.

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Tabelle III

Zusammenfassung der Reinigung von Amphiregulin (GIA)

Fraktion

Volumen (mL)

Protein (ng)

GIA*

(Einheit X10-3)

Spezifische Aktivität Einheiten^"3 pro mg

Ausbeute %

Reinigung (fach)

Roh

300

916,600

1363

1.49

100

1

Prep. C18 Flow-thru and wash

950

532,000

1052

1.98

77.2

1.3

Prep. rp. ODS

225

2,281

286

125.43

21.0

84.2

Semiprep. rp. C18-1

20

339

'97

286.14

7.1

192.0

Semi prep. rp. C18-II

20

235

92

391.49

6.7

262.7

Anal rp. C18-Ì

6

242

50

206.61

3.7

138.7

Anal rp. C18-ll

6

173

46

265.89

3.4

178.4

TSK 250-1

3.6

25.5

70

2,745.10

5.1

1,842.3

TSK 250-1—A

1.6

6.6

15

2,272.73

1.1

1,525.3

TSK 250-1-B

1.2

11.4

33

2,894.74

2.4

1,942.8

TSK 250-i-C

0.8

7.5

22

2,933.33

1.6

1,968.7

TSK 250-11

1.2

6.8

23

3,382.35

1.7

2,270.0

* Die Einzelheiten sind im Kapitel «Reinigung vom Amphiregulin» und den entsprechenden Unterabschnitten angegeben. Eine Einheit GIA wird als derjenige Anteil des Faktors definiert, welcher erforderlich ist, um die I-Desxyuridin-Einverleibung in A431-Zellen um 50% zu hemmen.

Analyse von Amphiregulin (ARÌ und S-pvridvlethvliertem Amphiregulin (SPE-AR) durch HPLC

Die Gelpermeations-Chromatographie von AR und SPE-AR auf einer TSK 250-Säule (7,5 x 600 mm, Bio-Rad) ist in Fig. 5A bzw. 5B dargestellt. Die Aktivität wurde mit dem Proteinpeak koeluiert (5A). Das Molekulargewicht von AR und SPE-AR wurde aus den Daten in Fig. 5 definiert und mit etwa 14 000 bzw. 17 000 bestimmt. Die berechneten Molekulargewichte für die Strukturen des verstümmelten AR und des AR gemäss Fig. 12 sind etwa 8500 bzw. 9100 u.

AR und SPE-AR wurden als symmetrische einzelne Peaks aus einer Ultrapore-RPSC C3 rp HPLC-Säule (4,6 x 75 mm, Altex) eluiert (Fig. 6A und B). Die GIA wurde mit dem Proteinpeak koeluiert (Fig. 6A). Das SPE-AR, das mit einer Acetonitril-Konzentration von ungefähr 21% eluiert wurde, erforderte eine etwas 4% höhere Acetonitril-Konzentration als das unbehandelte Protein. Diese Resultate führen zum Schluss, dass AR reich an Cysteinresten ist, welche durch 4-Vinylpyridin modifiziert sind, was demzufolge das AR hydrophober macht und es gleichzeitig mit höheren Acetonitril-Konzentrationen ausgewaschen wird.

SDS-PAGE-Analvse von AR

Die Fig. 7A zeigt eine Analyse von AR, N-glykanase-behandelten AR (NG-AR), SPE-AR und N-gly-kanase-behandeltem SPE-AR (NG-SPE-AR) in 15% Acrylamid unter reduzierenden Bedingungen (Fig. 7A). AR und SPE-AR wanderten im Gel als breite, diffuse, einzelne Bande mit einem mittleren, relativen Molekulargewicht von 22 500, innerhalb des Bereiches von 20 000 bis 25 000 (Strecken 1 und 3). Die Behandlung von AR und SPE-AR mit N-Glykanase führte zu einer schnelleren Wanderung dieser Proteine. NG-AR und NG-SPE-AR wanderten als einzelne Bande mit einem mittleren Molekulargewicht von 14 000 bzw. 14 500 u. Ähnliche Resultate wurden erhalten, wenn die Proteine in einem 15% Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen laufengelassen wurden (die Daten sind nicht gezeigt). Die Behandlung von AR mit Neuraminidase, O-Glykanase oder Neuraminidase und O-Glykanase zusammen, zeigte keine Änderung seiner elektrophoretischen Mobilität im Gel, weder unter reduzierenden noch unter nicht reduzierenden Bedingungen. Demzufolge ist AR ein einkettiges Glykoprotein, welches eine oder mehrere N-gebundene Oligosaccharidketten enthält, welche für die GIA des AR in vitro nicht erforderlich sind. Die Behandlung von NG-AR oder AR mit Phospholipase D (PLD) (Kohl) führte zu einer Reduktion von GIA auf 80% der Kontrolle. PLD-behandeltes NG-AR wurde einer rp-HPLC auf C3-Säulen unterworfen und die gereinigten, aktiven Peaks wurden mittels 20% SDS-PAGE (Fig. 7B) analysiert. Eine einzelne Bande von Mr 5600 wurde beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass PLD oder einige kontaminierende Proteasen in der PLD-Hersteliung das AR in eines oder mehrere aktive Fragmente umwandelt.

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Isoelektro-Focusing (lER-Analvse von AR

Die lEF-Analyse von 125|-markiertem AR wurde wie vorher beschrieben durchgeführt. Das AR wurde als einzige breite Bande focusiert, mit einem Pi zwischen 7,6 und 8 (Fig. 8). NG-AR focusierte ais einzelne Bande mit einem Pi von etwa 8,05. Demzufolge ist AR ein basisches, einkettiges, N-gebundenes Glykoprotein.

Biologische Eigenschaften

Die Hemmung der 125l-Desoxyuridin-Einverleibung in die DNA der A431-Zellen durch verschiedene Konzentrationen des gereinigten AR ist in Fig. 9A angegeben. Eine 50%-ige Hemmung der DNA-Synthe-se wurde bei ungefähr 0,2 ng/Loch beobachtet. Demzufolge wurde ein 50%-ige DNA-Synthesehemmung bei A431 humanen, epidermalen Karzinomzellen bei ungefähr 0,13 nM reinem Protein beobachtet. Es sollte jedoch bemerkt werden, dass die GIA des AR auf experimentelle Bedingungen, wie die Anzahl Zel-ien/Loch (Zelldichte), Zeit der Faktorapplikation, Dauer der Behandlung, Serumkonzentration und anderen Variablen abhängt.

Wenn die A431-Zellen in Abwesenheit und in Gegenwart von verschiedenen AR-Konzentrationen gezüchtet werden und das Zeliwachstum durch direkte Zellzählung verfolgt wird, wurde gefunden, dass das AR die Proliferation von A431 in dosisabhängiger Weise hemmt (die Daten sind nicht dargestellt). Demzufolge ist das Ausmass der 125l-Desoxyuridin-Einverleibung in die DNA ein gutes Mass für das Zellwachstum.

Die Stimulierung von 125l-Desoxyuridin-Einverleibung in DNA der humanen Vorhaut-Fibroblasten (Sadamoto) durch verschiedene Konzentrationen des gereinigten AR ist in Fig. 9B dargestellt. Eine zweifache Stimulation der i25|-Desoxyuridin-Einverleibung wurde bei ungefähr 0,7 ng/ml oder ungefähr 0,05 nM AR beobachtet. Die maximale Antwort war ungefähr eine sechsfache Stimulation der i25|-Desoxyuri-din-Einverleibung in diese Fibroblasten. Demzufolge wirkt AR als Wachstumsfaktor für humane Fibroblasten sogar in Gegenwart von 5% FBS.

Der Effekt von AR auf die Einverleibung von i25|-Desoxyuridin in DNA verschiedener Tumor- und Nichttumor-Zellinien von Menschen und einigen nicht-humanen Zellinien wurden erforscht. Die Daten sind in Tabelle IV dargestellt. Das AR hemmte das Wachstum von zahlreichen Klonen von A431-Zellen, humanen Brust-Karzinomzellen HTB 132, humanen Ovar-Teratokarzinomzellen HTB 1575, humanen, epidermalen Cervix-Karzinomzellen CRL 155, humanen, papillären Adenomen von Ovarzellen HTB 75 und humanen Adeno-Karzinomen von Brustzellen HTB 26. Es wies keinen signifikanten Effekt auf verschiedene Zellen auf (Tabelle III). Das AR stimulierte die Einverleibung von i25|-Desoxyuridin auf verschiedene humane Fibroblast-Zellinien, humanen, hypophysen Tumorzellen CRL 7386, humanen Ovar-Adeno-Karzinomzeilen HTB 77, Lebenzellen des afrikanischen grünen Affen BSC 1 und Leberzellen von Ratten SA6. Das AR wies keinen sichtbaren Effekt auf die Proliferation von T, B oder endothelialen Zellen auf. AR unterdrückte die humanen proliferativen oder cytotoxischen T-Zellantworten in gemischten Leukozyten-Kultur-Reaktionen (MLC) nicht.

AR ist ein monomeres Protein, welches für seine Aktivität Zwischenketten-Disulfid-Bindungen nötig hat, jedoch keine Glykosylierung für die Aktivität erfordert, ist unter massig sauren und basischen Behandlungen stabil und ist stabil, wenn es während 30 Min. bei 56°C wärmebehandelt wird. AR verliert die vollständige biologische Aktivität, wenn es reduziert, während 5 Min. auf 100°C erwärmt, mit Trypsin, Endopeptidase Lys-C, Endopeptidase ARG oder Endopeptidase GLU verdaut wird.

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Tabelle IV

Wirkungen von Amphiregulin auf die Proliferation von Zeilen3

c

Indikatorzelien

Wachstums-

Wachstums-

hemm. Aktivität stim. Aktivität

(Einheiten)0

(Einhéiten)

Humanes

Epidermoides Karzinom der Vulva A431

125

Humanes

Adenokarzinom der Brust HTB 132

240

Humanes

Epidermoides Karzinom der Cervix CRL 1550

28

Humanes

Papilläres Adenom des Ovars HTB 75

19

Humanes

Teratokarzinom des Ovars HTB 1572

55

Humanes

Adenokarzinom der Brust HTB 26

5

Humanes

Melanom A375

N.D.

N.D.

Humanes

Adenokarzinom der Brust ZR 75 30

N.D.

N.D.

Humanes

Adenokarzinom der Brust MCF-7

N.D.

N.D.

Humanes

Adenokarzinom der Lunge A549

N.D.

N.D.

Humanes

Adenokarzinom der Prostata PC3

N.D.

N.D.

Humanes

Karzinom des Colons H3347

N.D.

N.D.

Humane

Lymphoblastoid(T)-Ze!len CEM

N.D.

N.D.

Humane

EBV transf. B-Zeilen

N.D.

N.D.

Humanes

Epidermales Karzinom der Laryns Hep 2

N.D.

N.D.

Humanes

Cervikales Karzinom CRL 1594

N.D.

N.D.

Humanes

Adenokarzinom des Ovars HTB 77

25

Humane

Vorhaut-Fibroblasten (Sadamoto)

225

Humane

Vorhaut-Fibrobiasten (Goodwin)

70

Bovine

Fötale Herz-Endotheliale Zellen

N.D.

N.D.

Mäuse

Balb/3T3

N.D.

N.D.

Affen

Leber des grünen':afrikanischen Affen BSC-1

65

Ratten

Niere SA6

45

a 125 Einheiten (GIA an A431-Zellen) von AR wurden in 250 (il Testmedium suspendiert, fünffach seriell mitTestmedium verdünnt. Es wurden sechs Verdünnungen für jede Zelle verwendet. Die Fraktionen wurden auf die wachstumsregulierende Aktivita getestet und GIA- und die GSA-Einheiten wurden berechnet b eine GIA-Einheit wurde als diejenige Menge des Faktors definiert, welche 50% der 125l-Desoxyuridin-Einverleibung in Zellen hemmt c eine GSA-Einheit wurde als diejenige Menge definiert, welche für einen Faktor erforderlich ist, um die 125l-Desoxyuridin-Einverieibung in Zellen um 100% zu erhöhen.

N.D. = nicht nachweisbar

Der Effekt von AR und EGF auf die NRK-SA6-Zellkolonien-Bildung in Weichagar in Abwesenheit und Gegenwart von TGF-ß wurde durchgeführt und die Resultate sind in Tabelle V dargestellt. Der EGF induzierte das verankerungs-unabhängige Wachstum von SA6-Zellen in dosisabhängiger Weise in Gegenwart von TGF-ß, während das AR sich als sehr schwacher Induktor der SA-G-Kolonienbildung in Weichagar erwies (Tabelle V)

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Tabelle V

Effekt von AR und EGF auf NRK-SA6 Zellkolonienbildung in Weichagar

Zugabe

Anzahl Kolonien

(pro mi)

pro sechs Felder

Keine

0

TGF-ß (1 ng)

0

AR (2 ng)

0

AR (4 ng)

0

AR (2 ng) + TGF-ß (1 ng)

7

AR (4 ng) + TGF-ß (1 ng)

8

EGF (2 ng)

0

EGF (4 ng)

6

EGF (2 ng) + TGF-ß (1 ng)

30

EGF (4 ng) + TGF-ß (1 ng)

114

Die Versuche wurden wie im Abschnitt beschrieben durchgeführt. Die Kolonien wurden als Schwärm von mindestens 6 Zellen definiert.

Wirkung des AR auf die Bindung von EGF an seine spezifischen Rezeptoren

Es wurde gefunden, dass AR die Bindung von 1Z5I-EGF an A431-Zellen ebenso wie an die A431-Plas-mamembranen hemmen kann (Fig. 10). Eine 50%ige Hemmung der 12S-l-EGF-Bindung an fixierte Zellen und Membranen wurde bei ungefähr 1,1 nM bzw. 1,8 nM EGF beobachtet, während eine 50%ige Reduktion der EGF-Bindung an Zellen und Membranen bei ungefähr 1,8 nM bzw. 5,7 nM beobachtet wurde. Unmarkierter EGF hemmte die i25|-EGF-Rezeptor-Wechselwirkung bei höheren Konzentrationen in beiden Systemen. Der maximale Wettbewerb mit AR war 75% bzw. 50% für die Bindung an Zellen bzw. Membranen. Die Konkurrenzkurven für AR waren ebenfalls nicht parallel zu denjenigen, welche mit EGF festgestellt wurden. Diese Resultate führen zum Schluss, dass AR eine niedrigere Affinität für die EGF-Re-zeptoren als EGF aufweist. Ebenso ist der spezifische Rezeptor des AR nahe mit dem EGF-Rezeptor verwandt.

Verschiedene Klone der A431-Zellinie mit unterschiedlicher Empfindlichkeit auf AR-Hemmung wurden ausgewählt und ein Mangel an Korrelation zwischen der AR-Empfindlichkeit und der Anzahl der EGF-Rezeptoren pro Zelle oder Kd wurde beobachtet (Tabelle VI).

TabeliVI

Mangel an Korrelation zwischen der Amphiregulin-Empfindlichkeit auf verschiedene A431 -Klone und Anzahl Kp-des EGF-Rezeptors

EGF-Bindungsparameter

Relative Empfindlichkeit

A431-Klone

Bindungsstellen

Kd-(NM)

(GIA) geg. AR

pro Zelle

A-3

4,6 x105

1,80

34

F-8

9,0 x 105

3,13

20

A-2

5,1 x105

1,38

11

A-8

5,3 X105

3,18

1

Verschiedene A431-Klone wurden durch das Wachstum in Weichagar ausgewählt. Die EGF-Bindung wurde wie im entsprechenden Abschnitt beschrieben durchgeführt. Kd und die Anzahl der Bindungsstellen wurden aus Scatchard-Plots berechnet (Scatchard et al., 1949, Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660-672).

Chemische Struktur des Amphiregulins

Die Aminosäuresequenz von AR wurde aus einer Mikrosequenz-Analyse des S-pyridylethylierten Proteins (SPE-AR) und durch die Endoproteinase Lys-C, Staphylokokken aureus V8 und die Endopeptidase Arg gebildeten Fragmenten abgeleitet. Die Sequenzen des verstümmelten Proteins und des Proteins enthielten 6 zusätzliche Aminosäuren und sind foigendermassen:

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verstümmeltes AR

1 10 20

VVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK

30 40 50

NRRNRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI

60 70 , 78

EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

grösseres AR

1 10 20

SVRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPKRKKK

30 40 50

GGKNGKNRRNR KKKNPCNAEF QNFCI

60 70 SO 84

HGECKYIEHLEAVTC KCQQEYFGER CGEK

Die obige Sequenz verwendet den Einbuchstaben-Aminosäure-Abkürzungsstandard für jede Aminosäure. Die Menge des grösseren AR erwies sich als etwa 16% derjenigen des verstümmelten AR.

Die Proteinsequenz des AR wurde mit allen Proteinen der National Biomedicai Research Foundation Datenbank (PIR 13) verglichen. Die genetische Sequenz-Datenbank (Bolt Beranek and Newman, Inc., Los Alamos National Laboratory; Freisetzungsnummer 50) und das Europäische Molekularbiologie-Laboratorium DNA-Sequenz-Bibliothek (Freisetzungsnummer 12). Diese Recherchen zeigten, dass AR ein neues Protein darstellt und ein Mitglied der EGF-Superfamilie der Wachstumsfaktoren ist. Diese Familie umfasst die EGF (Mäuse, Mensch, Ratte, Rind usw.), TGF-a, virale Wachstumsfaktoren (Vaccinia, Myxo und Shope-Fibrom), humaner Plasminogen-Aktivator, boviner Faktor IX, humaner Faktor X, LDL-Rezeptor, bovines Protein C, humanes Proteoglykan-Kernprotein, Produkt des Drosophila Notch-Gens, Produkt des C. eleaans lin 12-Gen und das zellinien-spezifische Produkt des Gens des Seeigels S. purouratus. Das Aneinanderreihen der AR-Struktur mit den Strukturen der EGF-Superfamilien-Pro-teinen zeigt, dass das AR wie andere Mitglieder der EGF-Superfamilie die kennzeichnenden sechs essentiellen Systemreste enthält und die Konservierung der Zwischenräume der Cysteinreste aufrechterhält und einige der charakteristischen, streng bewahrten Aminosäuren enthält. Es ist offensichtlich, dass das AR unter die Mitglieder der Wachstumsfaktoren-Familie fällt und wie EGF, TGF aussieht und ebenso wie MGF, SFGF, insbesondere bezüglich der Verwendung von Asparagin aussieht. Beispielsweise in der Stellung 2 (erstes Cystein = 1 ) weisen alle TGF und EGF Prolin auf, VGF hat Glycin und MGF, SFGF und AR haben Asparagin. In der gleichen Schlaufe in der Position 7 haben EGF, VGF Glycin, die TGF haben Glutamin und die MGF, SFGF und AR haben Asparagin. In der dritten Schlaufe jedoch hat das AR die Beta-Kurve in der Position 34 nicht beibehalten (in MGF, SFGF ist es ein Asparagin und in allen anderen Mitgliedern ein Glycin), AR hat jedoch eine Glutaminsäure (niederes Beta-Kurvenpotential). Das AR hat eine andere Struktur für die hoch-konservative dritte Schlaufe, welche die Rezeptorbindung beeinträchtigen kann. AR hat keine Asparaginsäurereste in der Wachstumsfaktor-Struktur, wie sie möglicherweise in MGF und SFGF als Glykosyiierungsstellen verwendet werden.

Die N-terminaie Sequenz von AR besitzt insofern eine gewisse Analogie mit den N-terminalen Sequenzen des TGF, des VGF und des MGF, als dass es reich an Prolinen, Serinen und Threoninen ist und wie die TGF und VGF potentielle N-verbundene Glykosyiierungsstellen aufweist (tatsächlich hat es eine solche Stelle), ebenso wie als Möglichkeit für die O-verknüpfte Glykosylierung in dieser Region ist es reich an Serinen, Threoninen und Prolinen. Diese Region zwischen dem N-Terminus der TGF-Vorläufer und dem N-Terminus von VGF ist stark konserviert und scheint eine hoch-glykosylierte Region zu sein.

AR ist ein extrem hydrophiles Protein, insbesondere in der Region, welche die Aminosäuren 8 bis 45 enthält (Fig. 2). Das hydropathische Profil des AR zeigt eine Ähnlichkeit zu denjenigen anderer Mitglieder der EGF-Familie. Das hydropathische Profil des C-terminalen Teils des AR, das strukturell mit anderen Gliedern der EGF-Familie verwandt ist, ist verschieden der Profile anderer Mitglieder dieser Familie (Fig. 11B und C).

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AR bindet spezifisch DNA

Das 1251-ar wurde auf seine Fähigkeit, Zellulose, denaturierte DNA-Zellulose und native DNA-Zeliu-lose zu binden, getestet, wobei der Test verwendet wurde, welcher im obenbeschriebenen, entsprechenden Kapitel beschrieben ist. Die Resultate sind in Fig. 14A angegeben und zeigen, dass AR spezifisch die denaturierte als auch die native DNA-Zellulose bindet, jedoch nicht an Zellulose bindet. Die Bindung der nativen DNA war drei- bis viermal grösser als die Bindung an denaturierte DNA.

Die Fähigkeit des AR, spezifisch DNA zu binden, differenziert das AR von allen anderen Mitgliedern der EGF-Superfamilie. Beispielsweise ist EGF nicht fähig, DNA-Zellulose zu binden (Fig. 14B). Die Resultate führen demzufolge zum Schluss, dass der hydrophile Aminosäure 45 N-terminale Bereich des AR, welcher im EGF oder anderen Mitgliedern der EGF-Familie nicht vorhanden ist, eine nukleare Loka-lisationssequenz sein kann, welche beim Zielen des AR auf den Nukleus involviert ist, wobei der Faktor mit der DNA in Wechselwirkung tritt.

Beispiel: Antikörper gegen Amphiregulin

Die Herstellung von Antikörpern gegen das AR und synthetisches AR und AR-Vorläuferpeptide ist nachstehend beschrieben.

Material und Methoden

Festphasen-Peptidsvnthese

Amphiregulin wurde hergestellt und gereinigt gemäss dem entsprechenden früheren Abschnitt. Fünf Peptide, welche den Resten 31 bis 50 (Nr. 279), 71 bis 90 (Nr. 280), 108 bis 130 (Nr. 264), 166 bis 184 (Nr. 259) und 221 bis 240 (Nr. 281) der AR-Primärstruktur entsprechen (Fig. 15) wurden durch die Festphasentechnik auf einem automatischen Peptid-Synthesizer Applied Biosystems Inc. synthetisiert, im wesentlichen wie beschrieben (Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149). Die synthetisierten Peptide wurden vom Harzgerüst abgespalten, wobei ein hohes HF-Spaltverfahren verwendet wurde (Tarn et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 105: 6442). Die synthetischen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.

Antikörperproduktion

Polyklonale Antiseren zum reifen AR und synthetische AR-Peptide, chemisch mit Schlüsselloch-Schnecken-Hämocyanin (KLH) konjugiert wurde in jungen, erwachsenen weissen Neuseeland-Kanin-chen hergesteilt. Die synthetischen Peptide wurden zu KLH wie beschrieben konjugiert (Ishikawa et al., 1983, Immunoassay 4:235); das reife AR wurde nicht gekuppelt.

Das AR oder die Peptidkonjugate wurden mit dem Ribi-Adjuvanssystem emulgiert (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT). Eine Gesamtdose von 1 ml wurde jedem Kaninchen verabreicht: 0,8 ml intramuskulär an zwei Stellen jedes Hinterbeines und 0,2 ml subkutan an jeder Stelle. Zur Bildung der Antiseren gegen reife AR wurden 30 ng des reifen AR für die primäre Inokulation und 15 ng für die anschliessenden Verstärkungsinjektionen verwendet. Zur Bildung der Antiseren gegen synthetische AR-Peptide wurden 100 |ig des konjugierten Peptides für die primäre Inokulation und 50 jxg für die nachfolgenden Verstärkungen verwendet. Die Verstärkungs-Inokulationen wurden alle drei bis vier Wochen verabreicht und das Blut wurde den Kaninchen 10 bis 14 Tage nach den Verstärkungsinjektionen genommen.

Immunopräzipitation

Das AR wurde mit 1251 radiomarkiert, wobei die Chioramin T-Methode verwendet wurde (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50: 54-65). 10 jd polyklonales Serum (oder Verdünnung in PBS) wurde mit 10 jil 125|-AR (50 ng/ml), spezifische Aktivität 425 jiCi/jig) und 30 jxl PBS kombiniert und im wesentlichen getestet wie beschrieben (LeBier et al., 1982, J. Immunol. 129:2287-2292).

Radio-lmmunoassav

Die polyklonalen Seren wurden 1:50 in PBS verdünnt. 125|-AR (1jig/ml, spezifische Aktivität 425 nCi/ng) wurde 1:200 mitTNEN/0,1% BSA (20 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,05% NP-40, 0,1% BSA) verdünnt. 10 p.) unmarkiertes AR (1 mg/ml), 10 jil verdünntes polyklonales Serum und 30 nl verdünntes 125I-AR wurden kombiniert und bei Zimmertemperatur während 45 Min. inkubiert. Die Protein-A-Sepharoselösung wurde foigendermassen hergestellt: 200 mg getrocknete Pharmacia Protein-A-Sepha-rose wurde mit 1,4 ml PBS rehydriert und 80 ni des Rehydrates wurde gewaschen und auf 400 pl mit einer Lösung, welche 100 mM Tris pH 8,1,150 mM NaCI, 0,5% Triton X-100, 2 mM PMSF, 1% Aprotinin und 0,5 ng/ml Levpeptin verdünnt. 20 nl Protein A-Lösung wurde dann zur Mischung zugegeben und wäh-

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rend weiteren 30 Min. inkubiert. Die Sepharosekügelchen wurden dann zweimal mit 500 nl TN EN/0,1% BSA gewaschen, in 50 jil SB (80 mM Tris pH 6,8, 3% SDS, 15% Glykol, 0,01% Bromphenol-Blau, 5% ß-Mercaptoethanol) resuspendiert und bei 100°C während 5 Min. erwärmt. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände in einem Gamma-Zähler auf Radioaktivität getestet. Dieses Verfahren wies einzig 100 pg AR nach.

Der enzvmaebundene Immunoadsorbens-Test

Das Festphasen-Mikro-ELISA-Verfahren wurde abgeändert von U.S. Patent Serial Number 740 124, eingereicht am 30. Mai 1985. Es wurden Terasaki-Mikroschalen hergestellt, indem zu jedem Loch 5 [il synthetisches AR-Peptid zugegeben wurde, mit PBS auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und dann wurde die Lösung über Nacht bei Zimmertemperatur trocknengelassen. 5% Biotto in PBS wurde zu den Platten zugegeben und das Ganze wurde bei Zimmertemperatur während 1 Std. stehengelassen. Anschliessend wurden 10 nl Verdünnungen von polyklonalen Antikörper-Lösungen (verdünnt in PBS/1 % Blotto/0,05% Triton X-100) wurden zu jedem Loch zugegeben, während 1 Std. bei Zimmertemperatur inkubiert und dann viermal mit PBS gewaschen. 5 nl Peroxidase konjugiertes Geissen-Anti-Kanin-chen IgG (Cappel) in einer Verdünnung von 1:1000 in PBS/1 % Blotto/0,05% Triton X-100 wurde zu jedem Loch zugegeben, während 1 Std. bei Zimmertemperatur inkubiert und dann sechsmal mit PBS gewaschen. 10 n' MikroEIA Chromogan-Lösung (Genetic Systems Corp.) wurde zu einer 1:20 Verdünnung gegeben und die Extinktion wurde dann bei OÜ492 nach 20 Min. und 40 Min. abgelesen, gemäss der MikroEIA-Vorschrift von Genetic Systems.

Western-Blottina

Die Proben wurden auf einem 15% Polyacrylamidgel oder einer 16% Tricin-polyacrylamidgel und einer Bio-Rad Mini-Gel-Apparatur elektrophoretisiert. Das Gel wurde dann direkt auf ein Nitrozellulose-Blatt gegeben und in der Kassette auf solche Weise eingeklemmt, dass die Nitrozellulose auf der kathodischen Seite lag. Der Protein-Transfer wurde unter Verwendung eines Trames von 400 mA mit einer konstanten Spannung während 30 Min. durchgeführt. Die Nitrozellulose wurde dann entfernt und in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40 über Nacht bei 4°C gespült.

Der Nitrozellulose-Filter wurde dann in einem Antiserum, welches in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40 Reaktionspuffer verdünnt war, während 90 Min. bei Zimmertemperatur auf einer schaukelnden Plattform ausgesetzt, wonach viermal (je 5 Min.) in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40 gewaschen wurde.

Das alkalische phosphatase-konjugierte Protein A (Cappel), das in 1:500 in 2,5% Blotto/PBS/0,25% NP-40 verdünnt war, wurde dann zum Nitrozellulose-Blatt zugegeben und während 60 Min. bei Zimmertemperatur in einer schaukelnden Schale inkubiert. Der Filter wurde dann viermal gewaschen (je 3 Min.) mit PBS/0,2% NP-40, anschliessend durch 5 Min. in «APS»-Puffer (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCl2). Der Filter wurde in Farbreagens (40 ml APS-Puffer, 12 mg 5-Brom-4-chlor-3-in-doyl-phosphat (Sigma), 6,8 mg Nitroblautetrazolium (Sigma), unmittelbar vor Gebrauch zubereitet und durch ein 0,2 fim-Filter filtriert, entwickelt und mit Wasser abgeschreckt und dann an der Luft getrocknet.

Charakterisierung der AR-Antiköroer

Die polyklonalen Antikörper, welche durch reifes AR und synthetische AR-Peptide hervorgerufen wurden, wurden durch die Radioimmuno-Präzipitation, Radio-lmmunoassay, ELISA und Western Blotting charakterisiert. Die Resultate sind in Tabelle VII angegeben.

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Tabelle VII

Charakterisierung von Antikörpern gegen Amphiregulin und synthetische AR-Peptide

Polyklonal. Seren gegen

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N.D.

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a Verdünnung der erforderlichen Antiseren b die Werte in Klammern geben die Empfindlichkeit der Methode an

RIP «= Radio-immunopräzipitation

RIA = Radio-lmmunoassay

ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay

WB = Western Blot

N.D. = nicht bestimmt

Beispiel; cDNA-Klonierung des Amphiregulin-Vorläufers

Das folgende Beispiel beschreibt die Klonierung und die Analyse von cDNA, welche den Amphiregu-lin-Vorläufer aus TPA-behandelten MCF-7 humanen Brust-Karzinomzellen codiert.

Material und Methoden

RNA-Herstelluna

Die RNA wurde aus subkonfluenten Zellen isoliert, welche in T150-Gewebekultur-Flaschen gezüchtet oder aus frisch gefrorenen Gewebeproben unter Verwendung der Guanidinium-Methode isoliert wurden, wie sie durch Chirgwin (1979, Biochemistry, 18, 5294) beschrieben wurde. Die Zellen von vier T150 wurden in PBS gewaschen, trypsinisiert, wiederum in PBS gewaschen und die Kügelchen wurden in 8 ml 4M Guanidlnium-isothiocyanat-Lösung resuspendiert. Die DNA wurde Scherkräften unterworfen, indem sie durch eine 18 Guage-Nadel gepresst wurde. Die Probe wurde auf 2,4 ml 5,7 M CsCI in einem Beckman SW41Ti-Röhrchen überschichtet und bei 32 000 Umdrehungen/Min. während 20 Std. bei 20°C zentrifugiert. Die Pellets wurden in 30 n' 2,5 M CsCI resuspendiert und mit 2 Volumen EtOH bei Zimmertemperatur ausgefällt. Die Pellets wurden in 300 n' H2O resuspendiert und dann wurden 35 nl 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 800 nl EtOH zugegeben und die RNA wurde bei -70°C ausgefällt. Die Ausfällung wurde wiederholt und die RNA wurde dann kurz getrocknet und wieder in 100 ni H2O resuspendiert und bei OD26O quantitativ bestimmt und bei -70°C aufbewahrt.

Random-Markieruna nach der Random-Prime-Methode mit 32P-TTP

Die spezifischen Fragmente der AR-codierenden Region wurden aus der Niedertemperatur-Gelaga-rose (Bio-Rad) herausgeschnitten und 32P-TTP markiert (NEN, 3000 Ci/mmol), wobei die Random-Prime-Methode, welche durch Feinberg entwickelt wurde, eingesetzt wurde (1983, Anal. Biochem., 137, 266). Die nicht einverleibten Desoxyribonukleoside wurden durch Chromatographie auf einer 1,5 ml Sephadex 50-Säule entfernt. Die spezifischen Aktivitäten betrugen typischerweise 0,5 bis 2,5 x 109 cpm/ng.

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RNA-Gele und Northern Blot-Analvse

10 oder 20 ng der totalen RNA wurden einer Elektrophorese auf 1,2% Agarose/Formaldehyd-Gelen für die Northern-Analyse unterworfen. Die Agarose/Formaldehyd-Gele wurden in 40 mM N-Morpho-linopropansulfonsäure (MOPS), pH 7,0/1 mM EDTA/10 mM Natriumacetat/2/2M deionisiertes Formaldehyd (pH 5,6) in einer IBI VCV-Gel-Apparatur mit gefrorenen Platten einer Elektrophorese unterworfen. Die RNA wurde in etwas Puffer mit 50% bei 65°C denaturiert und in einmal MOPS bei 20 bis 30 mA während 3 bis 5 Std. laufengelassen. Das Gel wurde in 10x SSC während 30 Min. gespult und auf Hybond-N-Membranen (Amersham) transferiert, UV-vernetzt (1200 pJ), prähybridisiert und hybridisiert in 5x SSPE (1x SSPE ist 0,18 M NaCI/10 mM Natriumphosphat, pH 7,7, 0,1 mM EDTA), 5x Denhardt, 0,5% SDS und 20 ng/ml denaturierte Lachsspermien-DNA als Träger. Die Hybridisierungen wurden in 42% während 16 Std. mit 2x 106 cpm/ml der 32P-ARBPI durchgeführt. Die Blots wurden verschiedene Male in 2x SSC mit 0,1% SDS bei Zimmertemperatur und anschliessend durch 1x SSC/0,1% SDS, 65°C, gewaschen und einem Kodak X-OMAT mit zwei Dupont-Lightning Plus-Intensivierungsschirmen bei -70°C ausgesetzt. Die Banden wurden als (+) gezählt, wenn sie nach einer Übernacht-Aussetzung klar ersichtlich waren, (+/-) wenn nach drei Tagen Aussetzung sichtbar und (+/+) wenn nach 6 Std. sichtbar.

cDNA-Klonieruna

MCF-7-Zellen wurden für die RNA nach der Behandlung mit 100 ng/ml 12-0-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA) während 24, 40 und 72 Std. geerntet. Die Poly(A)+RNA wurde aus den gepoolten aliquoten Teilen dieser Proben isoliert und als Schablone für die doppelsträngige cDNA-Synthese verwendet, im wesentlichen wie beschrieben (Gubler und Hoffman, 1983, Gen 25: 263). Die cDNA mit endständigem G wurde an der EcoRI-Stelle des gt10 unter Verwendung des BR1-Oligonukleotid-Adapters verbunden (Rose et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83:1261-1265).

Spezifisch wurde 5 ng TPA-behandelte MCF-7 Poly(A)+RNA wärmebehandelt und mit 5 ng Oligo(dT) vorbehandelt, wobei 100 U Umkehr-Transkriptase in 45 nl Reaktionsvolumen verwendet wurden. Die Synthese des zweiten Stranges wurde mit 4 U RNase H und 115 U E. coli DNA pol I durchgeführt. 10 ng T4 DNA-Polymerase wurde zur Entfernung der 3'-Überhänge verwendet, was zu verstümmelten Enden führte. Die ganzen 6,8 ng der doppelsträngigen cDNA wurde über eine Sephadex G50-Säule laufengelassen, um die cDNA mit mehr als 500 bp zu wählen und dann wurden 150 ng cDNA mit terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase mit einem dG-Schwanz versehen. Die mit einem dG-Schwanz versehene cDNA wurde mit der EcoRI-Stelle von A.gt10 verbunden, wobei BR1-Adapter (AATTCCCCCCCCCCCC) verwendet wurden. Die verbundene DNA wurde in vitro gepackt (Grosveld et al., 1981, Gene 13:227-237) und auf E. coli C600 rK~m K hfl beschichtet, mit einer Wirksamkeit von 106 Rekombinanten/ng cDNA. Es wurden Duplikate der Nitrozellulose-Erhebungen auf 2,5x 105 Rekombinanten genommen und die Filter wurden mit [32P]-markierten besten Abschätzungen abgetastet und die degenerierten Oligonukleotid-Proben (Tabelle VIII, unten), welche abgeleitet waren von der primären AR-Sequenz, wie sie durch den automatischen Edman-Abbau von N-glykanase-behandeltem, reduziertem und S-pyridylethyliertem AR bestimmt war (siehe «Beispiel: Herstellung, Reinigung und Charakterisierung des humanen Amphiregulins»)

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Die Restriktionsanalyse zeigte eine geringe Anzahl von Stellen in der cDNA-lnsertion von pAR1 mit einzelnen Stellen für Bsml, EcoRV, Hgal, Nael, Pvull, Smal und Sstl und zwei Stellen für Sspl. In der Insertion kam keine Verdauung mit BamHI, dal, EcòRI, Hindlll, Kpnl, Pstl, Pvul, SphI, StuI und Xbal zustande. 170 bp Bsml bis PvuIl-Fragment wurde isoliert und als Probe einer zweiten cDNA-Bank von

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100 000 Rekombinanten verwendet, welche im wesentlichen wie oben beschrieben, hergestellt wurde. Es wurden dreizehn positive Klone mit Insertionen im Bereich von 300 bp bis 1,3 kb identifiziert, wobei sechs grösser als 1 kb waren und fünf eine einzige Sstl-Stelle enthielten, von welcher bekannt war, dass sie innerhalb der 100 bp des 5'-Endes von pAR1 enthalten war. Vier der späten fünf Insertionen wurden für eine weitere Restriktion und eine Sequenzanalyse subkloniert (pAR3, pAR5, pAR9, pAR13). Alle diese Klone besassen identische Restriktionskarten auf Basis von Bsml, EcoRV, Pvull, Sstl und Smal, mit der Ausnahme, dass pAR9, welches eine 3'-Verstümmelung von 100 bp aufwies und, wie später gefunden wurde, von einer As-Spur stammte, vermutlich genügend für die Vorbehandlung mit Oligo(dT) war.

Nukleotidsequenz-Analyse von AR-cDNA-Klonen

Die exakten Oligonukleotid-Primer wurden für die Sequenz beider Stränge des 1230 bp pAR1-Klons verwendet, wobei die Didesoxy-Ketten-Terminierungsmethode verwendet wurde (Sanger et al., 1977, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467). Das komplette Nukleotid und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Klones pAR1 ist in Fig. 16 dargestellt. Ein offener Leserahmen von 965 bp beginnt beim Nukleotid Nummer 1. Das erste AUG liegt in der Position 210, ist jedoch nicht mit der optimalen Übereinstimmung nach Kozak für die Translations-Startstellen konform (Kozak, 1984, Nucleic Acids Research 12: 857-872; Kozak, 1986, Cell 44: 283-292) wegen der Abwesenheit von Purin an der Stelle -3. Solche AUG-Triplette können jedoch als Initialcodon dienen, wie Kozak in 3% der geprüften Messages feststellte und von einer möglichen Wichtigkeit ist die Gegenwart eines Adenosins in Position -1 in allen diesen «weniger begünstigten» AUG und in der mRNA von AR. Obschon ein zweites Methionin beim Nukleotid 378 festgestellt wurde, welches nicht mit der Initial-Übereinstimmungssequenz konform war, wird angenommen, dass das erste AUG die wahre Translations-Startstelie ist, da es durch die vorausgesagte 19 Aminosäurenstrecke von prädominant hydrophoben Resten gefolgt war, welche durch 3 Proline, typischerweise einer Signal-Peptidsequenz unterbrochen waren (Heijne, 1983, J. Biochem. 133: 17-21).

Der längste offene Leserahmen, weicher mit einem Methionin startet, codiert ein 252 Aminosäuren-Polypeptid, welches das Signalpeptid mit 19 Resten umfasst. Vor der codierenden Sequenz befinden sich 209 Nukleotide der 5'-untransiatierten Sequenz und nach der codierenden Sequenz befindet sich ein terminales Transiationssignal, TAA, und 262 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz. Eine wirksame Poly(A)-Additionssignal-Sequenz, AATAA, befindet sich 64 Nukleotide stromaufwärts einer Strecke von 15 Adenylatresten, von welchen vermutet wird, dass sie den Poly(A)-Schwanz bilden. Die 3'-un-translatierte Region von AR enthält vier Kopien der Sequenz ATTTTA, welche ebenfalls in gewissen Lymphognen, Cytokinen und Proto-Oncogenen vorhanden ist. Im GM-CSF dieser Sequenz, vermittelt die RNA die Destabilisierung und Zersetzung (Shaw, 1986, Cell 46: 659-667). Die Konservierung des Motives in funktionell ähnlichen Molekülen führt zum Schluss, dass AR ebenfalls mit dieser Lymphokin-Klasse verwandt sein könnte.

Die cDNA-Sequenz bestätigt, dass die reife AR-Peptidsequenz (wie oben angegeben) mit Ausnahme der Aminosäure Position 113 (Fig. 15), welche als Asparaginsäure (D) durch Proteinanalyse sequeniert wurde und als Asparagin (AAT = N) von den cDNA-Klonen abgeleitet wurde. Bei fünf geprüften cDNA besassen alle ihre 5-Enden innerhalb der ersten 25 bp der pAR1-Sequenz.

Der Vergleich der cDNA-Sequenz mit den bestgeschätzten Proben zeigten 74% (ARK41) und 77% (ARK31) eine vollständige Homologie. Keine der Proben hatte mehr als 8 aufeinanderfolgende, passende bp, jedoch insgesamt 50 der 67 mit ARK41 aneinandergereihten Peptide produzierten unter Bedingungen von sehr niederer Stärke, ein nachweisbares Signal. Der Codongebrauch durch die AR mRNA-Sequenz unterscheidet sich beträchtlich von den Gebrauchsequenzen nach Lathe (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183: 1-12), wodurch erklärt wird, dass die degenerierten Oligonukleotide in diesem Fall zu stärkeren Signalen führten. Aus der cDNA- und Proteinsequenz werden zwei Proteine mit einem Molekulargewicht von 9772 und 9173 für die zwei Formen des reifen AR auf Basis der cDNA (Fig. 16) und der Proteinsequenz vorausgesagt. Das hydropathische Profil des AR-Vorläufers ist in Fig. 11D dargestellt.

Der AR-Vorläufer besitzt 3 potentielle N-Glykosylierungsstellen, eine im N-terminalen Bereich (Position 30 in Fig. 16) und 2 in der hydrophilen Region des reifen AR (Positionen 113 und 119). Von der Glykosylierung ist bekannt, dass sie 10 bis 12 kd zum Molekulargewicht des reifen AR beiträgt und sie kann leicht durch Kohlehydrat-Addition an einer oder beiden dieser Stellen des hydrophilen Bereiches durchgeführt werden.

Der N-terminale serin-reiche Bereich des AR-Vorläufers (Fig. 15) enthält drei potentielle Tyrosin-Sul-fierungsstellen bei y81 y83 und y87, basierend auf der Gegenwart von sauren Resten, kurveninduzierenden Aminosäuren und die Reste, welche eine sterische Hinderung verursachen könnten, sind abwesend (Huttner, 1987, TIBS 12: 301-303). Die meisten tyrosin-sulfatierten Proteine sind Sekretionsproteine. Es wird angenommen, dass die Tyrosin-Sulfatierungsänderungen an der Aktivierung, am Transport oder am proteolytischen Vorgang in Vorläuferproteinen beteiligt sind. Der serin-reiche Bereich von AR kann O-gebundene Kohlenhydrat-Reste enthalten, was durch die Reichlichkeit der Se-rin/Threonin-Reste (23 von 81) in dieser Molekülregion gegeben ist, welche Stellen für solche Bindungen darstellen. In dieser Hinsicht sind O-glykosylierte Formen anderer Mitglieder der EGF-Familie, TGF-a, festgestellt worden (Ignotz et al., 1986, PN AS 83:6307-6311).

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Keiner der Serinreste des AR-Vorläufers passt in die Übereinstimmungssequenz für cAMP-abhängi-ge Kinase-Phosphorylierungsstellen (Grima, et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82: 617-621) noch zeigt einer der Tyrosinreste flankierende Sequenzähnlichkeiten mit bekannten Phosphotyrosin-Re-sten.

Der hydrophile Bereich des reifen AR-Proteins ist aus zahlreichen positiv geladenen Aminosäuren zusammengesetzt (16 von 37 Resten sind Lysin oder Arginin), wobei zwei aufeinanderfolgende Strecken von vier bis fünf basischen, geladenen Aminosäuren umfasst werden. Die nuklearen Zielrichtungssignale des grossen SV40 T-Antigens sind ähnlich wie diese Region des AR und enthalten eine charakteristische KKKRK-Sequenz, vor welcher die kleinen Aminosäuren (Glycin, Alanin, Prolin) vorliegen, welche die Bildung einer a-helikalen Struktur erlauben können (Burglin et al., 1987, EMBO 6: 2617-2625; Dingwai! et al., 1987, EMBO 6: 69-74). Die Mutationsanalyse definierte vier aufeinanderliegende basische Reste als prädominante Merkmale der nuklearen SV40-Lokalisations-Frequenz (Lanford, 1984, Cell 37: 801-813). Andere nukleare Proteine mit ähnlichen basischen Aminosäure-Strecken sind vermutlich in die nukleare Zielrichtung involviert, z.B. Nukleoplasmin, Polyom-Virus T, Histon und c-myc. Die Fusion von zahlreichen nuklearen Signalsequenzen mit Genen für Hühner-Pyruvatkinase, Albumin, Immunoglobulin, Ferritin und ß-Galactosidase führt zur Lokalisation dieser sonst für den Nukleus cyto-plasmischen Proteine (Moreland, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 4048-4057). Ob die hydrophilen Sequenzen in AR in die Zielrichtung dieser Wachstumsmodulatoren zum Nukleus involviert sind, ist nicht erwiesen; die Fähigkeit des AR, die DNA spezifisch zu binden, impliziert, dass AR innerhalb des Nukleus eine funktionelle Rolle spielt. In dieser Hinsicht kann AR die DNA-Synthese, den Zellzyklus oder eine Vielzahl von anderen nuklearen Vorgängen regulieren.

Der TGF-a-Vorläufer enthält zahlreiche Cysteine im C-terminalen, cytoplasmischen Bereich, wobei einige davon eine kovalente Palmitat-Bindung eingehen (Bringman, 1987, Cell 48: 429-440). Im Gegensatz dazu fehlen dem AR-Vorläufer Cysteine in seinem cytoplasmischen Bereich und es ist demzufolge nicht zu erwarten, dass sie Palmitat-Reste enthalten. Obschon die biologische Funktion der Palmitat-Bin-dung unbekannt ist, stellt dies einen weiteren Unterschied zwischen dem AR und anderen Mitgliedern der EGF-Superfamilie dar.

Zelluläre Quellen der Amphiregulin-Synthese

Die Northern Blot-Analyse (Thomas, 1980, PNAS 77: 5201), wobei a32P-markierte AR-cDNA-Frag-mente verwendet werden, zeigte die Hybridisierung einer einzigen 1,4 Kb RNA-Art aus einer Vielzahl von normalen, humanen Gewebe- und Tumorzellinien. Es wurde eine einzelne Bande auf den Northern Blots festgestellt, wobei entweder AREB1 (ein 480 bp BstEII - PvuIl-Fragment von pAR1, welches die gesamte codierende Region des reifen AR und einen Teil des N-terminalen Vorläufers und des trans-membranen Bereichs enthält) oder AR170 (ein 170 bp Bsml - Pvull-Fragment von pAR1, welches nur die C-terminale Hälfte des reifen AR enthält) als markierte Proben verwendet wurden. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle IX dargestellt und zeigen, dass eine Niederstufen-Expression (+) von AR-RNA bei normalen erwachsenen Lungen- und Pancreasgeweben festgestellt wurde. Eine kleinere, jedoch nachweisbare Expression (+/-) wurde in normalem Nieren-, Leber- und Hirngewebe festgestellt.

Tabelle IX

Normales, humanes Gewebe AR-RNA

Lunge +

Leber +/-

Pancreas +

Niere +/-

Milz

Hirn +/-Placenta -Eingeweide, fötal =

Da das AR ursprünglich TPA-behandelten MCF-7-Zellen isoliert wurde, war es von Interesse, den Zeitablauf der TPA-lnduktion der AR-RNA in diesen Zellen zu bestimmen. Die MCF-7-Zellen wurden mit TPA während 0,1, 2, 6,18, 24 und 48 Std. mit TPA behandelt, die gesamte RNA wurde isoliert und für jede Strecke eines 1,2% Formaldehyd-Agarosegel wurden 10 ng verwendet, auf Nylonmembranen transferiert und mit einer ARBP1-Probe, die komplementär zur gesamten codierenden Region des reifen AR war, einem Screening unterworfen. Eine beeindruckende Verbesserung der 1,4 kb AR-RNA-Art wurde schon. 1 Std. nach der Behandlung mit TPA festgestellt, mit einem Maximum zwischen 18 und 24 Std. Die anschliessenden Northern Blots, welche mit 32P-ARBPI durchgeführt wurden, zeigten eine TPA-Stimu-

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lierung der AR-RNA-Synthese in anderen Brustkrebs-Zeilinien, obschon die maximalen Grade nie so hoch wie bei den TPA-induzierten MCF-7-ZeIlen waren.

Es wurde ein Satz von Tumorzellen vor und nach 24 Std. Induktion mit TPA auf das AR-RNA-Niveau getestet. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle X zusammengefasst. Mit einigen Ausnahmen befinden sich die einzigen Quellen von nachweisbarer AR-RNA in humanen Brustkrebs-Zellinien, welche mit TPA behandelt waren. Eine solche Ausnahme ist Caki-1, eine humane, helle Nierenzell-Karzinomlinie, welche im wesentlichen hohe Mengen von AR-RNA exprimiert, in einem Ausmass, wie es in den TPA-induzierten MCF-7-Zellen festgestellt wurde. Sämtliche überwachten TPA-behandelten Brustkrebs-Zellinien zeigten eine AR-spezifische Hybridisierung.

Offensichtlich spielt AR eine funktionelle Rolle in der erwachsenen Lunge, Pancreas, Niere, Leber und Hirn und ist möglicherweise in eine grosse Anzahl von Prozessen involviert, einschliesslich der Wundheilung, der Geweberegeneration und der Aufrechterhaltung von neuronalen Zellen.

Tabelle X

Humane Zellinie

Ursprung

AR-RNA-Niveau

uninduziert

TPA-induziert

MCF-7 (HTB 22)

Brust-Adenokarzinom

+

1111

HBL-100 (HTB 124)

Brust, normal

-

+

BT-474 (HTB 20)

Brust-Kanalkarzinom

-

+

MDA-MB-157 (HTB 24)

Brust-Medullakarzinom

+

+

MDA-MB-361 (HTB 27)

Brust-Adenokarzinom

+

+

Hirnmetastase

SK-BR-3 (HTB 30)

Brust-Adenokarzinom

-

+

BT-476

Brust-Karzinom

-

+

JEG-3 (HTB 36)

Choriokarzinom

-

+/-

Caki-1 (HTB 46)

Helles Nierenzell-Karzinom

+++

+++

Hautmetastase

SK-HEP-1 (HTB 52)

Leber-Adenokarzinom

-

-

G-401 (CRL 1441)

Wilm-Tumor

-

-

HEPM (CRL 1486)

Embryonales Gaumen-Mesenchym

-

+1-

A-431 (CRL 1555)

Epidermoides Karzinom

-

-

HBL-299 (CCL137)

Embryo-Lunge

-

-

HUF

Vorhaut-Fibroblasten

-

+/-

Beispiel: Genomische Klonierung und Analyse des Amphiregulin-Gens

Die folgenden Beispiele beschreiben die genomische Klonierung von humanem Amphiregulin-Gen, seine Struktur und die Intron/Exon-Organisation. Funktionelle und evolutionäre Begleiterscheinungen werden im Hinblick auf die EGF-Superfamilie von Wachstumsfaktoren ebenfalls diskutiert.

Material und Methoden

Southern Blot-Hvbridisierunaen

Die gesamte genomische DNA wurde isoliert (Maniatis, 1982, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual) aus subkonfluenten Zellen in T150-Gewebekultur-Fiaschen. 20 ng DNA wurde mit Restriktionsenzymen, wie angegeben, verdaut, auf 0,8% Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen und auf Hy-bond-N (Amersham) mit 20x SSC Grundpuffer (Southern, 1975, J. Mol. Biol., 98: 503-517) einen Abdruck gemacht und die DNA durch UV-Aussetzung mit 1200 nJ gebunden. Die Filter wurden bei 65°C über Nacht in einem Hybridisierungspuffer hybridisiert (6x SSC, 5x Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 20 ng/ml gescherte, natürliche Lachsspermien DNA), welche 2x10S cpm 32p-markiertes AR-spezifi-sches Fragment pro ml enthielt. Die Proben wurden «Random-Prime»-markiert, auf eine spezifische Aktivität von 5 bis 25x108 cpm/|ig. Die Filter wurden extensiv in 2x SSC, 65°C, gewaschen und über Nacht bei -70°C einer Autoradiographie unterworfen.

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Genbank-Konstruktion

Der Bakteriophage Lambda L47.1 wurde als Klonierungsvektor ausgewählt und phosphatase-behan-delte Arme wurden nach der Verdauung mit BamHI, EcoRI und Hindlll hergestellt. Die hochgewichtige DNA aus MCF-7-Zellen wurde mit Hindlll verdaut, auf 0,8% Niedertemperatur-Gelagarose (Bio-Rad) einer Elektrophorese unterworfen und nach der Grösse fraktioniert. Die Agarose-Fraktion, welche maximal mit dem gewünschten Restriktionsfragment angereichert war, wurde bei 65°C geschmolzen, die DNA wurde mit Phenol und NaOAc extrahiert, dann mit Ethanol ausgefällt und dann in einer Konzentration von 25 bis 100 ng/ml resuspendiert. Die Bankkonstruktionen bestanden aus einer Übernacht-Verbindung bei 14°C von 100 mg Lambda L47.1-Armen und 40 ng grössenfraktionierter DNA in 5 jxl Reaktionsvolumen, wobei T4 DNA-Ligase (Biolabs) verwendet wurde. Die rekombinanten Phagen wurden in vitro mit Extrakten gepackt (Grosveld, 1981, Gene 13:227-237), die mit E. coli-Stämmen BHB2688 N205 recA~ (Lambda imm^clts b2 red3 Eam4 Sam7) und BHB2690 N205 recA-(Lambda imm^clts b2 red3 Dam15 Sam7) hergestellt wurden, gepackt. Die Banken wurden auf E. coli LE392 titriert. Die genomischen Klone wurden mit AR-spezifischen DNA-Proben einem Screening unterworfen, indem eine in situ-Plaaue-Hybridisierung durchgeführt wurde (Benton, 1977, Science 196:180-182) und die DNA wurde aus den gereinigten positiven Klonen der Plaque isoliert (Huynh, 1985, In DNA Cloning Techniques: A Practical Ap-proach, D. Glover, ed. (Oxford: IRL Press), Seiten 49-78). Die Hindlll-Insertionen wurden herausgeschnitten und in pEMBLI 8 für die Restriktionsanalyse und für die Fortpflanzung einer Subklonierung unterworfen.

Primer-Extension-Test

Die RNA wurde aus MCF-7-Zellen, wie oben beschrieben, isoliert. Synthetische Oligonukleotide, welche zu den Nukleotiden 40 bis 60 (ARAP) und 76 bis 97 (ARCP) in der AR-cDNA-Sequenz komplementär war, wurde mit T4-Polynukleotid-Kinase 32P-endmarkiert auf eine spezifische Aktivität von 2 bis 5x 10® cpm/fig. Eine Million cpm markiertes Oligonukleotid wurde zur Vorbereitung (Prime) des ersten cDNA-Stranges auf 50 ng MCF-7-RNA verwendet, im wesentlichen wie oben beschrieben. Die Produkte wurden mit RNase A behandelt, mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, in 80% Formamid hitzedenaturiert, 100°C, 5 Min., und durch Elektrophorese auf Standard 8% Polyacrylamid-7M-Harnstoff-Sequenierungsgel analysiert.

CAT-Test

MCF-7-Zellen wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Für jeden Test wurde eine 100-mm-Schale mit 10 ml Medium mit 1 bis 2x106-Zellen beschichtet und 24 Std. später wurde 20 ng Kalziumphosphat-ausge-fällte überspiralisierte Piasmid-DNA zu den Zellen gegeben (Southern und Berg, 1982). Die Zellen wurden 4 Std. nach der Transfektion mit frischem Medium gespült und während 90 Sek. einem Schock mit 25% Glycerin unterworfen. Die Zellen wurden wiederum gespült und mit 20 ml frischem Medium, welches 0 oder 100 ng/ml TPA enthielt, überschichtet. Die Zellen wurden gewaschen und 40 Std. nach dem Glyce-rinschock geerntet und durch Beschallung in 100 n' 0,25 M Tris-HCI (pH 7,8) lysiert. Die CAT-Aktivität wurde im wesentlichen durchgeführt, wie dies durch Gorman et al. (1982) beschrieben wurde. Der Zellextrakt (3 bis 50 n') wurde zu 2,5 mCi 14C-Chloramphenicol (NEN) in 150 nl Reaktionsvolumen von 0,5 M Tris (pH 7,8), 0,5 mM AcetylCoA zugegeben. Die Reaktionsmischungen wurden bei 37°C während 2 Std. inkubiert, mit 1 ml Ethylacetat extrahiert und auf Kieselgel-TLC-Platten mit CHCÌ3:1-Butanol (95:5) entwickelt. Die TLC-Platten wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Das acetylierte und nicht acetylierte ^C-Chloramphenicol wurde nachgewiesen, indem die ausgeschnittenen Flecken gegen Optifluor gezählt wurden. Die Einheiten der enzymatischen Aktivität CAT wurden als ng Chloram-phenicol, welches pro Stunde pro ng Protein im Zellextrakt acetyliert wurde, berechnet.

In situ-chromosomale Hvbridisieruna

Das Plasmid pAR9 wurde einem «Random-Prime-Labeling» mit 3H-TTP unterworfen und für die Hybridisierung von humanen Metaphasen-Zellen verwendet, welche aus phytohämagglutinin-stimulierten peripheren Blutlymphocyten in der 500 bis 800 Bandstufe hergestellt wurden. Diese Probe entspricht einer AR-cDNA deren viel der 3'-untranslatierten Region fehlt und in die EcoRI-Stelle von pEMBL18 insertiert wurde.

Die Hybridisierung wurde wie vorher beschrieben durchgeführt (Le Beau, 1985, PNAS 82: 6692-6696), wobei 2, 4, 20 und 40 ng Probe pro ml Hybridisierungsmischung eingesetzt wurde. Die Autoradio-graphien wurden unter Verwendung einer Kodak NTB-2-Nuclear-Track-Emulsion und Diapositiven, weiche während 7 bis 60 Tagen ausgesetzt waren, hergestellt. Die Chromosomenbänder wurden durch Färben mit Chinikrin-Senf sichtbar gemacht.

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Chromosomale Lokalisierung des AR-Gens

Die Chromosomen-Zuordnung des humanen AR-Genes wurde in situ durch Hybridisierung von 3H-markierter AR-cDNA mit normalen Metaphasen-Chromosomen bestimmt. Die Silberkörner wurden auf 50 Metaphasen-Schichten gezählt, wobei 30% nicht zufällig verteilt auf den Banden 4q13 bis 4q21 vorlag. Die Resultate wurden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an Hamster/humaner somatischer Zellhybrid-DNA, weiche nur das humane Chromosom 4 enthielt, bestätigt. Die von AR-Exon 3 abgeleiteten Oligonukleotid-Primer und das flankierende Intron bildeten ein 220 bp PCR-Fragment nur bei der humanen DNA und der hybriden DNA, welche das Chromosom 4 enthält, während die Hamster DNA negativ war.

Die Chromosomen-Region 4q13 bis 4q21 enthält ebenfalls die Gene für gro oder meiamon-wachstums-stimulierende Aktivität (Anisowicz, A., et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7188-7192; Richmond, Al., et al., 1988, EMBO J. 7:2025-2033), c-kit-Rezeptor (Yarden et al, 198, EMBO J. 6:3341-3351), Plättchenfaktor 4 (PF4) (Griffin et al., 1987, Cytogenetic Cell Genet., 45: 43-73), der Interferon-Gamma-induzierbare Faktor IP-10 (Luster, A.D., et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84: 1868-1871), Vitamin D-Bindungsprotein (gruppenspezifische Komponente) (Cooke, N.E. et al., 1986, Human Genetics 73: 225-229; McCombs J.L. et ai., 1986, Cytogenet. Cell Genet. 42: 62-64), und Statherin, ein kalziumregulierendes, speichelartiges Protein (Sabatini L.M. et al., 1987, Am. J. Hum. Genet. 41: 1048-1060). Das Gen für den EGF wurde distal bei 4q25 lokalisiert.

Grò, IP-10 und PF4 gehören zur Klasse der strukturell verwandten Peptide und können eine Familie von Wachstumsfaktoren bilden, welche im Chromosom 4 gruppiert sind. c-Kit codiert einen Zelloberflächen-Rezeptor, welcher strukturell und funktionell mit verschiedenen Wachstumsfaktor-Rezeptoren verwandt ist, welche eine tyrosin-spezifische Kinase-Aktivität aufweisen, einschliesslich EGF-Rezep-tor, Neu-Oncogen, PDGF-Rezeptor und Insulin-Rezeptor. Im allgemeinen stellen die Gene für Liganden und ihre Rezeptoren bestimmte Chromosomen dar, jedoch werden einige durch gewöhnliche chromosomale Lokationen dargestellt (Groffin, 1983, Nucl. Acids Res. 11: 6331-6339; Pettenati, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84: 2970-2974). Der Ligand für c-kit wurde noch nicht identifiziert und das AR muss auf seine solche Aktivität getestet werden.

Spezifische Translokationen werden bei vielen Bösartigkeiten beobachtet. Die bei angeborener akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), t(4;11) (q21;q23) am meisten aufgezeichnete cytogene Abweichung umfasst den Bereich, durch welchen AR abgebildet wird (Heim, S., et ai., 1987, Leukämie 1:16-23). Die ALL werden nun durch Morphologie neu klassifiziert, wie sie durch die französisch-amerikanischbritische Zusammenarbeitsgruppe (FAB), B und T-Zellmarkierungen und Chromosomenanalyse definiert wurde. Diese Klassifikationen dienen als Basis für die Diagnose, Prognose und Behandlung von ALL. Ein Drittel all dieser Klassen von ALL umfasst spezifische Translokationen und t(4;11) entspricht einer schwachen Prognose-Gruppe, die am häufigsten Kinder von weniger als 16 Mte. mit einer mittleren Überlebenszeit von weniger als 1 Jahr betrifft (Kocova et ai., 1985, Cancer Genetics and Cytogenetics 16: 21-32). Die translokations-involvierte Region 4q21 wurde ebenfalls in T-Lymphomas festgestellt (Levine, E.G. et ai., 1986, Cancer Res. 46: 6481-6488) und ein Fall von akuter Myeblasten-Leukämie (AML) (Selypes, A. et al., 1987, Human Genet. 76:106-108). Diese Region enthält ebenfalls Gene für ein dentales Dysgenese-Syndrom und das «Piebaid-Merkmal», einer vererbten Störung, welche wegen einer defekten Melanoblasten-Migration und Differenzierung zu einer fleckigen Hauptpigmentierung führt (Hoo, J.J., et al., 1986, Human Genet. 73:230-231).

Vergleichende Studien zwischen dem AR und den auf den Chromosomen 4q13 bis 4q21 lokalisierten Störungen erlauben uns die Bedeutsamkeit dieser Colokalisierung zu bestimmen. Die gegenwärtige, cytogenetische Analyse führt zum Schluss, dass die Region 4q21 Gene enthält, welche in die lym-phocytogenetische Differenzierung involviert sind. Schliesslich können diese Assoziationen zu weiteren biologischen Aktivitäten oder Anwendungen für dieses wachstumsregulierende Molekül führen.

Genomisches Klonen

Die vorherbeschriebene Southern Blot-Anaiyse von MCF-7 DNA, die mit Hindlll, EcoRI oder BamHI verdaut wurde, zeigte einzelne Banden von 12 kb, 8 kb bzw. 20 kb, wenn mit einer 830 bp-Probe (32P-markiertes Pvull/Bsml verdautes pAR1), welches den 5'-Teil des AR-Gens enthielt, hybridisiert wurde, führt zum Schluss, dass AR ein einziges Kopiergen darstellt. Eine 170 bp-Probe (AR 170, Bsml-Pvull) des 3'-Endes von reifem AR, einschliesslich des transmembranen und cytoplasmischen Bereiches der Codierungsregionen, die mit den gleichen Hindlll, EcoRI und BamHI-Fragmenten hybridisiert wurde und ebenfalls mit einem zusätzlichen 7,5 kb Hindlll-Fragment, zeigten, dass die Mehrheit der AR-codieren-den Regionen zwischen zwei Hindi Il-Fragmenten von 12 und 6,5 kb aufgespalten ist. Identische Banden wurden durch Southern Analyse festgestellt an verdauter DNA von humaner Placenta, Hirn, Melanom (SK-Mel 29), Brustkrebs (HTB36), Epidermoid-Karzinom (A431) und Lungenkrebs und zeigt, dass das AR-Gen keinen massiven Umlagerungen oder Verstärkungen unterworfen wurde.

Zum Klonen wurden die beiden Hindlll-Fragmente aus der MCF-7-DNA ausgewählt, da sie wahrscheinlich die meisten, wenn nicht alle AR-Gene und ihre flankierenden Sequenzen enthalten. Hindill-verdaute MCF-7-DNA wurde grössenfraktioniert und die zweckmässigen Fraktionen wurden in A.L47.1

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eingebunden. Von zahlreichen positiven waren zwei Klone, AARH12 und XARH6 für eine genauere Charakterisierung ausgewählt. Die 12 und 6,4 kb-lnsertionen wurden in pEMBL18 subkloniert und auf verschiede Restriktionsstellen kartiert. Unter Verwendung von exaktem Oligonukleotid-Primern und der direkten Sequenierung von zahlreichen, kleineren Subklonen, wurde die Sequenz von allen Exons und ihren Intron-Verbindungen bestimmt, wobei keine Widersprüche mit der cDNA-Sequenz festgestellt wurden.

Charakterisierung der AR 5'-regulierenden Region

Die genomische Klonierung von AR führte zu einer Isolierung von 6,5 kb der 5'-flankierenden Sequenz, welche im 12 kb Hindlll-Fragment enthalten war. Das 688 bp-Fragment der ersten EcoRI-Stelle 5' des Exons 1 an der Smal-Stelle in Exon 1 (Position 40 in der cDNA) wurde subkloniert und an beiden Strängen sequeniert. Diese Daten sind in Fig. 17 dargestellt.

Die Primerausdehnung wurde an MCF-7-RNA mit zwei separaten Oligonukleotiden von Exon 1 durchgeführt. Eine Haupttranskriptions-Startstelle, die durch beide Oligonukleotide bestätigt wurde, wurde von 1 bp 5' bis zum längsten cDNA-Klon festgestellt. Es wurden zwei kleinere Stellen an den Positionen +1 und +2 in der cDNA-Sequenz festgestellt, was bestätigte, dass viele der cDNA-Klone nahezu in voller Länge vorlagen. Um funktionell die Regelregion des AR-Gens zu bestätigen, wurde ein chimerisches Gen (pXAREICAT) konstruiert, welches die 688 bp EcoRI bis Smal AR 5'-flankierende Region (Sequenzen 648 bis +40, mit +1, welches die Haupttranskriptions-Startstelie ist) konstruiert, welche die Expression eines promotorlosen Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gens steuert. Diese Konstruktion war fähig, die Transkription des CAT-Gens zu simulieren, wenn es vorübergehend in MCF-7-Zellen eingeführt wurde und die Aktivität wurde durch Zugabe von TPA sechs- bis siebenmal gesteigert. Dies bestätigt sowohl strukturell als auch funktionell, dass wir das 5'-Ende des AR-Gens kloniert haben. Wir konstruierten dann eine Serie von 5' CAT-Deletionsmutanten, welche die AR-Sequenzen -539 bis +40 (Eia), -387 bis +40 (Eie), -277 bis +40 (Elc), -148 bis +40 (Eid), -77 bis +40 (Eie), -79 bis +40 (Elg) oder +19 bis +40 bp (Elh) im gleichen Vektor enthielten. Die Grundaktivität wurde verloren, wenn die Deletion über den Teil -70 herausging, d.h. Elh zeigte keine messbare Aktivität und alle diese Konstruktionen zeigten eine 3,5- bis 7fach verbesserte Expression in Reaktion auf eine 40-Std.-Behand-lung mit 100 ng/ml TPA. Diese Konstruktionen können ebenfalls in vorübergehenden Tests zur Bestimmung von Morphogenen, Mitogenen, Wachstumsfaktoren, Drogen oder rohen Fermentationsextrakten auf die Regulierung der AR-Expression getestet werden, was die Identifikation von neuen therapeutischen Mitteln ermöglicht.

Auslaufende nukleare Experimente zeigen die 3- bis 5fach verbesserte Transkription von AR in Reaktion auf TPA, was zum Schluss führt, dass die verbesserte Promotoraktivität mindestens teilweise für die TPA-lnduktion von AR verantwortlich ist. Die Northern-Analyse von mit TPA-behandelten MCF-7-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Actinomycin D identifiziert AR als verhältnismässig stabile RNA mit einer Halbwertszeit von mehr als 4 Std. Die Induktion der AR-Expression in Reaktion auf TPA ist demzufolge mannigfaltig, wobei eine verbesserte Transkription einer eher stabilen mRNA involviert ist.

Intron/Exon-Organisation des AR-Gens, AR-Proteinbereichen, evolutionäre und funktionelle Begleiterscheinungen

Die vollständige genomische Sequenz des humanen Amphiregulins ist in Fig. 17 dargestellt und die Beziehung zwischen den Exons und den Proteinbereichen des AR-Moleküls ist schematisch in Fig. 18 dargestellt. Die Primer-Ausdehnungs-Analyse von AR in RNA und Studien unter Verwendung der chimeri-schen AR/GAT-Promotor (CAT = Chloramphenicol-acetyltransferase, ein Markierungsgen) Konstruktion lokalisiert in den 64 bp 5' bis zum Ende des längsten cDNA-Klones einen funktionellen Promotor. Überdies besteht ein übereinstimmender TATA-Kasten 29 bp stromaufwärts des 5'-Endes der cDNA-Sequenz. Vor dem 3'-Ende des Gens ist eine übereinstimmende Polyadenylierungs-Signalsequenz vorhanden, 64 Nukleotide vom Poly(A)-Schwanz der cDNA entfernt. Die primäre Transkription des AR-Gens ist ungefähr 10,2 kb.

Sechs Exone codieren den humanen AR-Vorläufer und umspannen 10,2 kb der genomischen DNA. Die AR-Exone reichen von 112 bis 270 kb in der Länge und sind durch Introne zwischen 1,25 kb und 2,1 kb unterbrochen. Die fünf Introne vo AR unterbrechen die Codierungssequenz in solcher Weise, dass viele der Proteinbereiche Produkte eines einzelnen Exons sind. Das Exon 1 codiert die 5'-untranslatierten und die Signalpeptidbereiche, Exon 2 codiert den N-terminalen Vorläufer, Exon 5 enthält die cytoplastische Region und Exon 6 repräsentiert die 3'-untranslatierte Region. Zusammen codieren die Exone 3 und 4 das reife AR-Protein, einschliesslich der hydrophilen und EGF-ähnlichen Sequenzen, ebenso wie den vermeintlichen transmembranen Bereich. Die Verbindung zwischen den Exonen 3 und 4 kommt zwischen der zweiten und dritten Schlaufe der EGF-ähnlichen Region vor.

Wenn die Exonverbindungen bei einer Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von AR, von EGF und TGF-a überlagert sind, ist es naheliegend, dass all diese Proteine, welche durch zwei Exone codiert werden und dass das unterbrechende Intron in der gleichen Position vorliegt. Überdies codiert jedes 3'-

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Exon ebenfalls den transmembranen Bereich des entsprechenden Vorläuferproteins. Im Gegensatz dazu ist die EGF-artige Region in einem einzelnen Exon in allen anderen EGF-Homologen von Säugetieren enthalten, wofür die Exonstruktur bestimmt worden ist: einschliesslich der neun EGF-artigen Wiederholungen im EGF-Vorläufer; (Gray, 1983, Nature, 303, 722-725); die drei im LDL-Rezeptor (Yamamoto, 1984, Cell 39: 27-38); und diejenige im Ratten-Fibronectin (Patel, 1987, Embo J., 6: 2565-2572) und der humane Koagulationsfaktor XII (Cool, 1987, J. Biol. Chem. 262:13662-13673). Wirbellose Homologe, wie das Drosophilia Notch-Gen und lin-12 von C. eleaans enthalten ebenfalls mehrfache EGF-ähnliche Wiederholungen (Kidd, 1986, Molec. Cell. Biol. 6: 3094-3108; Greenwald, 1985, Cell 43: 583-590). Im Unterschied zu den Säugetier-Genen sind die meisten der EGF-artigen Wiederholungen im Notch in einer einzigen codierenden Region gespalten, mit nur 4 der 36 Motive, welche durch dazwischenliegende Seguenzen gespalten werden. Bemerkenswerterweise weisen nur zwei dieser 4 eine stärkere Übereinstimmung mit AR, als mit den übereinstimmenden Notch-Wiederholungen auf und eine wird sogar an der gleichen CXC-Sequenz, wie EGF, TGF-a und AR durch ein Intron unterbrochen. Das Nematoden lin-12-Gen enthält mindestens elf EGF-ähnliche Einheiten, wovon neun im ersten Exon und die verbleibenden zwei auf getrennten Exonen enthalten sind, mit einer intakten EGF-artigen Einheit, flankiert durch die Introne.

Unterschiede in den Strukturen der Exone, welche die EGF-artigen Wiederholungen von verschiedenen Organismen codieren, führten zum Schluss, dass sie unterschiedlichen Ursprungs sein könnten. Eine Gruppe enthält das EGF-artige Motiv, welches durch Introne und die andere Gruppe gebunden ist, wovon AR ein Mitglied ist, das ein unterbrochenes Motiv ausweist. Die Sequenzähnlichkeit zwischen den zwei Gruppen könnte das Resultat von konvergenten Evolutionen oder von einer Introninsertion nach ihrer Divergenz von einem gemeinsamen Ahnengen sein.

Das Vorhandensein des Introns in der gleichen CXC-Sequenz von EGF, TGF-a, AR und einer der Notch-Wiederholungen führt zum Schluss eines gemeinsamen Ursprungs, eine nähere Prüfung enthüllte jedoch eine unterschiedliche Intronphase. Die Intronphase bezieht sich darauf, ob das Intron den Leserahmen nach dem ersten (I), zweiten (II) oder dritten (O) Nukleotid eines Codons unterbricht. Es wird angenommen, dass die Phase insofern von evolutionärer Wichtigkeit ist, als sie es erlaubt, dass funktionelle Bereiche enthaltende Exone unter verschiedenen Proteinen verschleppt werden könnten. EGF und TGF-a besitzen ein Phasen ll-lntron in einer EGF-ähnlichen Einheit, während AR und Notch Phasen l-lntrone aufweisen. Eine ähnliche Verschiebung eines Nukleotides ist im zweitletzten Intron ersichtlich, innerhalb des Proteasenbereiches des Komplementfaktors B und Elastase (Cambell, 1983, PNAS, 80: 4464; Swift, 1984, J. Biol. Chem. 259: 14271). Die nicht zufälligen Stellungen dieser Introne können inplizieren, dass eine spezifische Intron-Insertionssequenz in diesen Genen vorhanden ist. Alternativ muss ein selektiver Druck vorhanden gewesen sein, um die codierende Region an dieser Stelle zu teilen. Der Vergleich von Sequenzen an der Exon-Intron-Verbindungsstelle mit EGF-artigen Einheiten von humanem EGF, TGF-a, AR und der ersten Notch-Wiederholung, enthüllen keine direkten Wiederholungen, wie sie häufig bei versetzbaren Elementen vorkommen. Alle vier haben jedoch die Sequenz «gtaagt», welche die Verbindung umrandet. Diese Sequenz kann eine gewisse Rolle im Ursprung oder beim Spleissen dieses Introns spielen.

Die viralen EGF-Homologe enthalten keine Introne; eine Ausrichtung zwischen VGF, EGF, TGF-a und AR zeigen jedoch Homologie, welche sich über den transmembranen Bereich ausdehnt, während die Wachstumsfaktoren von Myxom und Shope-Viren vor dieser hydrophoben Region beendet sind. Kürzliche Studien bewiesen, dass der TGF-a-Vorläufer als Transmembranen-Protein synthetisiert wird und eine differenzierende, proteolytische Spaltung führte zur Sekretion von grösseren Formen, welche zellspezifisch sein könnten (Teixido, 1987, Nature 326:883-885).

Andere EGF-Homologe, welcne den Transmembranen-Bereich enthalten, umfassen Gerinnungsfaktoren, LDL und die homöotischen Gene Notch und lin-12, obschon keines davon an eine EGF-ähnliche Wiederholung angrenzt. Die Gegenwart des EGF-Motivs in verschiedenen membrangebundenen Vorläufern führt zum Schluss, dass sie in einigen Fällen als ausgeschiedener Wachstumsfaktor reagiert haben könnten oder dass sie mit der Membran vereinigt blieb und eine Rolle in der intrazellulären und/oder intrazellulären Kommunikation spielen könnte.

Einige der AR-Homologen umfassen wirbellose, homöotische Gene. Homöotische Genprodukte sind in die Regulierung der Zellentwicklung involviert. Beispielsweise vermittelt das Notch Genprodukt den korrekten Fortschritt einer ectodermalen Zelle in einem Neuroblasten oder Dermobiasten. Die Notch-Mu-tanten aller dieser Zellen werden neuronal und die Nachkommenschaft mit dem gesamten Hirn und ohne Haut stirbt. Ein homöotisches Gen kann in autokriner Weise funktionieren, um einen bestimmten Zellzustand einzurichten und aufrechtzuerhalten, um das Genprodukt zu exprimieren und kann in die Regulierung eines solchen Zustandes in angrenzenden Zellen über Zell-Zellwechselwirkungen eingreifen. Ob AR ebenfalls zur Regulierung des Entwicklungszustands von gewissen Zelltypen funktioniert, muss noch ermittelt werden.

Entwicklung des reifen Amphiregulins

Die Charakterisierung der AR-cDNA enthüllte, dass 78 und 84 Aminosäure-Formen der AR als mittlerer Teil eines 252 Aminosäure-Transmembranen-Vorläufers synthetisiert wurden. Die Stellen für die

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proteolytische Spaltung des AR-Vorläufers, welche zur Freisetzung des reifen AR führen, passen nicht an die Spaltstellen irgendeiner bekannten Protease. Am N-terminaien Ende der Stellen sind Asp-Asp/Ser-Val und Glu-Gln/Val-Val, während die C-terminale Stelle Glu-Lys/Ser-Met ist. Die zwei AR-Formen scheinen das Resultat einer alternativen proteolytischen Entwicklung eines gewöhnlichen Vorläufers zu sein, da alle cDNA und genomischen Klone die gleiche Sequenz in dieser Region aufweisen. Interessanterweise liegt ein Intron zwischen den beiden N-terminalen Spaltstellen und es ist möglich, dass eine «Intronverschiebung» ebenfalls für diese Unterschiede in Betracht gezogen werden muss.

Die MCF-7-Zellen produzieren 80% ihres AR in der grösseren 84 Aminosäure-Form, während die Choreokarzinom-Zellinie HTB36 80% ihres AR in der kleineren 78 Aminosäure-Form produziert. Zur Bestimmung, ob dieser Unterschied mit Änderungen auf der DNA-Stufe verbunden sind, wurde die Polyme-rasen-Kettenreaktionstechnik (Scharf, 1986, Science 233: 1076-1078) verwendet, um das AR-Exon 3 von den MCF-7-Zellen und den HTB-36-Zelien zu isolieren, eine Linie, welche im wesentlichen hohe Stufen der AR-mRNA produziert. Ein AR-intron-spezifisches «Sinn»-Oligonukleotid und ein «Antisinn»-Oligonukleotid aus der codierenden Region des Exon 3 wurden verwendet, um das dazwischenliegende 220 bp-Fragment des AR-Gens von beiden DNA-Quellen spezifisch zu verstärken. Die direkte Sequenzanalyse zeigte keine Widersprüche, weder bei der Intron-Exon-Verbindung, noch in der Exon 3-codierenden Sequenz zwischen diesen beiden humanen DNA-Quellen, demzufolge sind die beiden AR-Formen das Resultat von alternativen proteolytischen Spaltungen des Vorläufers.

Struktureller Vergleich des AR und EGF-ähnlichen Wachstumsfaktoren

AR zeigt klar Sequenzhomologie mit anderen EGF-ähnlichen Proteinen mit der Konservierung von 6 Cysteinen, die in 3 Disulfidbindungen involviert sind, weiche die Sekundärstruktur des reifen Wachstumsfaktors definieren. Vorherige (computerunterstützte) Vergleiche von Aminosäuresequenzen führten zu einer Ordnung von EGF-ähnlichen Motiven in zwei bestimmte Gruppen: Wachstumsfaktoren und Blutkoagulationsfaktoren (vgl. Fig. 13). Wir haben zum Vergleich mit der AR und anderen bekannten DNA- oder Proteinsequenzen zwei Sequenzmuster ausgewählt. Die Auswahl war Basis einer scheinbaren Fähigkeit dieser Sequenzen zwischen den beiden Proteingruppen zu unterscheiden und weil sehr viele Lücken für eine optimale Gegenüberstellung erforderlich sind. Die exakten Sequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die erste Region entspricht den ersten elf Aminosäuren der zweiten Schlaufe des EGF und die zweite entspricht der dritten Cysteinschlaufe des EGF. Vier Repräsentative jeder Gruppe von Wachstumsfaktoren und Blutkoagulationsfaktoren wurden zur Bildung von übereinstimmenden Sequenzen auf Basis ihrer gut etablierten funktionellen und strukturellen Homologie ausgewählt. Es wurden, wenn immer möglich, die humanen Sequenzen ausgewählt, da wir sie letztlich mit dem humanen AR vergleichen wollen. Die Wachstumsfaktoren umfassen: humaner EGF, TGF-a, VGF und Shope-Wachs-tumsfaktor und die Koagulationsfaktoren umfassen: humaner Faktor IX, X, XII und Protein C. AR wurde ebenfalls mittels Datenbanken auf ihre beiden homologen Blocks getestet. Die übereinstimmende Sequenz wurde auf Basis der Häufigkeit gerichtet, dass ein Rest an einer vorgegebenen Position erscheint.

Die Struktur-Funktionsanalyse von verschiedenen TGF-a, VGF und EGF-Derivaten hat kürzlich zur Identifikation von verschiedenen Resten geführt, welche für die biologische Aktivität dieser Wachstumsfaktoren nützlich sind. Rekombinante Proteine, synthetische Peptide, stellenspezifische chemische Derivate und der proteolytische Abbau waren nützlich für die Bildung von geänderten Molekülen. Eine Verallgemeinerung umfassen (die Positionen beziehen sich auf die Ausrichtung in Fig. 15): die sechs Cysteine (Stellung 1,19,15,26,28 und 37) und ihre Disulfid-Schlaufen (1-15, 9-26,28-37) sind für die biologische Aktivität erforderlich, N-terminale Ausdehnungen haben wenig Effekt auf die Aktivität, ein aromatischer Rest (F, Y) ist in Position 8 erforderlich, eine nichtkonservative Änderung von y32, D41 oder L42 führt zum Aktivitätsverlust oder einem dramatischen Verlust der Rezeptorbindung oder der Autophosphorylierung.

Das AR genügt allen ausser den beiden letzten Kriterien für die Definition von Resten, welche erforderlich sind für die EGF-Rezeptorbindung und/oder mitogene Aktivität. Das reife AR ist unmittelbar vor D*f verstümmelt und ihm fehlt dieses «schwierige» Leucin 42 vollständig, dennoch steht es im Wettbewerb für die EGF-Rezeptorbindung und ersetzt EGF in einigen mitogenen Tests. Diese Unterschiede können jedoch verantwortlich für die nicht sättigbare Rezeptor-Bindungskinetik und ihre ausgeprägten funktionellen Unterschiede von EGF in gewissen Tests sein, wie dem TGF-ß-Synergismus, dem Diffe-renzialeffekt auf ausgewählten A431-Subklonen, Vernetzung, Phosphorylierungstests und der Fähigkeit, DNA zu binden. Die extrem hydrophile Strecke am N-Terminus von reifem AR kann ebenfalls zu einigen dieser Unterschiede in der Rezeptorbindung oder der biologischen Aktivität beitragen.

Die AR-Unterkategorie der BGF-Superfamilie

Es wurde eine Matrix von evolutionären Distanzen auf Basis der Nebeneinanderreihung in Fig. 13 berechnet und eine Computer-Analyse auf Basis von Tabelle I durchgeführt. Diese Matrix wurde verwendet, um ein Dendrogramm der EGF-Superfamilie abzuleiten. Die Nachforschung erfordert die Gegenwart von Cysteinen und die Zugabe eines Punktes für jeden Rest, der zur bestimmten Übereinstim37

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mungssequenz passt. Dieser evolutionäre Baum sagt voraus, dass AR in eine neue Unterkategorie der EGF-ähnlichen Faktoren fällt, auf Basis der strukturellen und funktionellen Homologie. Ein solches Modell sagt voraus, dass andere Mitglieder dieser Wachstumsfaktor-Familie existieren können und dass sie durch Homologie mit den obengenannten Sequenzmustern auf Basis von drei Kriterien identifiziert werden können: eine kombinierte Bewertung mit den beiden Wachstumfaktor-Regionen mit mehr als 20, eine Bewertung des kombinierten Koagulationsfaktor-Bereiches von weniger als 20, und eine Bewertung der kombinierten AR-Region mit mehr als 20. Es wird erwartet, dass alie neuen Moleküle, welche diesen Kriterien genügen würden, ebenfalls eine gewisse Homologie mit EGF, TGF-a, VGF oder AR aufweisen würden. Moleküle mit einer kombinierten Bewertung der AR-Region von mehr als 40 würden als Mitglied der AR-Familie klassifiziert, innerhalb der EGF-Superfamilie.

Beispiel:

Bakterielle Expression von Amphiregulin Material und Methoden Plasmid-Konstruktionen

Plasmid pARD1. Das Plasmid pARD1 enthält das 1,4 kb EcoRI cDNA-Fragment (pAR1) in pEMBL18 mit einem T- bis C-Wechsel in der Nukleotid-Position 532 in der cDNA, welche der Valin-Valin-Sequenz am Amino-Terminus des reifen AR entspricht. Dieser Basiswechsel wurde durchgeführt, indem eine auf die Stelle gerichtete Mutagenese durchgeführt und durch Sequenzanalyse bestätigt wurde. Diese Konstruktion erlaubt Zugang zur Bindung zwischen dem AR-amino-terminalen Vorläuferbereich und der hydrophilen Region durch Schaffung einer Ddel-Stelle (CTAAG).

Plasmid pARSTOP. Das Plasmid pARSTOP ist eine Zwischenkonstruktion, welche bei der Hersteilung eines AR-Sekretionsvektors verwendet würde. pARD1 wurde mit Sspl und Xbal verdaut und das 515 bp Fragment, welches die 9 carboxy-terminalen Aminosäuren des reifen AR codiert, die transmembranen und cytoplasmischen Bereiche und die 3'-untransiatierte Region wurden isoliert. Das 4,7 kb (Sspl-Xbal)-Fragment, das den verbleibenden amino-terminalen Teil der AR-cDNA enthielt, wurde gelgereinigt und mit den kinasierten, gehärteten, komplementären Oiigonukleotiden ARSTOP1 und ARSTOP2 verbunden (nachstehend geschildert). Diese Oligonukleotide haben ein stumpfes 5'-Ende und sind verträglich mit der Sspl-Stelle, welcher eine Sequenz folgt, die die carboxy-terminalen 9 Aminosäuren der reifen AR-Sequenz codiert, einem TAA-Stopcodon und den EcoRV und Xbal-Stellen.

YFGERCGEK* EcoRV/Xbal ARSTOP1 5' ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT ARSTOP2 3' TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC

Plasmid pbAR. Das Plasmid pbAR enthält einen promotorlosen TGF-ß-Führer, welcher an die reife 78 Aminosäureform von AR gebunden ist. Es wurde durch Verbindung der Oligonukleotide bLARN3 und bLARN4 mit dem 240 bp Ddel an das Xbal-Fragment von pARSTOP in EcoRI/Xbal mit pEMBLI 8 verdaut, konstruiert. bLARN3 und bLARN4 sind komplementär, schaffen einen 5' EcoRI und einen 3'Ddel-Überhang und eine einzelne interne Nael-Stelle, welche mit derjenigen in der Nähe des carboxy-terminalen Endes der TGF-ß-Leadersequenz verträglich ist. Die Verbindung zerstört die Ddel-Stelle und regeneriert die korrekte Aminosäuresequenz Valin-Valin am Amino-Terminus des reifen AR.

Sstll

AGVVKPPQNKTESE PHIL1 5' GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA

PHIL2 3' CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT

NTSDKPKRKKKGG PHILl 5' AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG

PHIL2 3' TTTATGÄAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC

EcoRI

KNGKNRRNRKKKN PHILl 5' CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG

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Plasmid pDCHBARI. Das Plasmid pDCHBARI ist ein Säugetier-Expressionsvektor (Fig. 19), welcher für die Sekretion der entwickelten, reifen 78 Aminosäure-Form des AR gezeichnet ist. Er enthält die TGF-ß-Leader/reife AR-Sequenz, getrieben von pbAR durch den CM V/HIV-Promotor, flankiert durch ein SV40-Polyadenylierungssignal. Der Vektor enthält ebenfalls SV2dhfr, in gleicher transkriptionaler Orientierung. PSVDR/bOM wurde mit Nael und Xbal verdaut und der 6 kb-Vektor wurde in Entfernung der ausgeschnittenen OncoM-codierenden Sequenz gereinigt. pbAR wurde ebenfalls mit Nael und Xbal verdaut und das 260 bp-Fragment, welches die carboxy-terminalen 5 Aminosäuren der TGF-ß-Signalse-quenz codiert und auf die 78 Aminosäuren enthaltende reife AR-Sequenz folgte ein Beendigungscodon und die Stellen EcoRV und Xbal wurden isoliert. Die Verbindungen wurden durch Sequenzanalyse verifiziert.

Plasmid dDCHBHILE. Das Plasmid pDCHBPHILE ist ein Säugetier-Expressionsvektor, welcher für die Sekretion eines chimärischen AR/EGF-Proteins gezeichnet wurde. Das Plasmid ist ebenfalls konfiguriert, um eine zukünftige Fusionskonstruktion zwischen dem hydrophilen Bereich der AR und anderen Wachstumsfaktoren zu erleichtern. Diese Konstruktion wurde geschaffen durch Verbindung des 6,5 kb Sstll/Xbal-verdauten pDCHBARI-Vektorfragmentes, des 175 bp EcoRI/Xbal-Fragmentes, welches das synthetische humane EGF-Gen enthielt und die Oligonukleotide PH1L1 und PH1L2. Diese Oligonukleotide sind mit 5' Sstll und 3' EcoRI-Veriängerungen komplementär und codieren den letzten Rest der TGF-ß-Signalsequenz und den gesamten AR-hydrophilen Bereich. pDCHBARI stellt den CMV/HIV-Promotor zur Verfügung, alle mit Ausnahme der letzten Aminosäure der TGF-ß-Signalsequenz und die SV40 und die Polyadenylierungssequenz zur Verfügung. Das EGF-Fragment wurde von Dr. Timothy M. Rose (Oncogen) erhalten und umfasst die zweckmässigen Stellen für eine zukünftige Manipulation.

Herstellung des pTAC-Vektors

Das von Dr. Timothy M. Rose (Oncogen) erhaltene Plasmid TacPak/EGF ist aus folgenden Einheiten zusammengesetzt: trp-lac-Hybrid-Promotor und die Cro-Gen Shine-Delgarno-Sequenz, welche als Bglll/BamHl-Fragment aus dem Expressionsvektor p135-1 isoliert wurde, welches anschliessend von pDR540 (Pharmacia) deriviert wurde; alkaline Phosphatase-Signalsequenz, die von synthetischen Oli-gonukleotiden TacPakl und TacPak2 (Dr. Rose, Oncogen) abgeleitet wurde; die synthetische EGF-Se-quenz stammte vom Plasmid pBM22/PAK/EGF; die Transkriptions-Beendigungsregion; pBR322-Gerüst mit dem neomycin-beständigen Gen, alle abgeleitet aus dem Plasmid p135-1. TacPak/EGF wurde mit BamHI verdaut und mit dATP und dGTP 2-Basen gefüllt, um eine Stelle zu schaffen, welche mit dem 2-Basen gefüllten Sali verträglich war und dann wurde mit Pvul verdaut. Die Verdauung entfernte das synthetische EGF-Gen und die Mehrheit der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz, Hess jedoch den Tac-Promotor und die Shine-Delgarno-Sequenzen zurück und initiierte das intakte ATG. Das 2,8 kb-Frag-ment wurde gelgereinigt.

Herstellung von modifiziertem Amphiregulin cDNA-Fraoment

Das Plasmid pARSTOP wurde mit Sali, mit TTP und dCTP 2-Basen gefüllt, um eine Stelle zu schaffen, welche mit einer BamHI 2-Basen gefüllten (dATP, dGTP)-Extension verträglich war und dann wurde mit Ddel und Bgll verdaut. Die spätere Verdauung war erforderlich, um die gleichzeitig wandernde DNA aus dem gewünschten 242 bp-Fragment zu entfernen, welches die kurze Form des reifen AR codiert, beginnend mit VKPP und mit CGEK endet, gefolgt durch einen synthetisch eingeführten Stop-Codon. Das 243 bp-Fragment wurde gelgereinigt.

Herstellung der synthetischen Oligonukleotide ALKPAR1 und ALKPAR2

Die komplementären synthetischen Oligonukleotide ALKPAR1 und ALKPAR2 wurden mit einem 5' Pvul-Überhang gezeichnet, welcher mit dem TacPak/EGF Pvul/BamHI-partiell gefüllten Fragment verträglich war und eine 3'-Ddel-Verlängerung, welche mit dem pARSTOP Ddel/Sall-partiell gefüllten Fragment verträglich war. Sie wurden auf einem «Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer» synthetisiert und auf einem Acrylamidgel gereinigt. Die Phosphate wurden mit T4-Kinase zu den Oligonukleotiden zugegeben und mit äquimolaren Anteilen getempert mit einer langsamen Abkühlung nach der Hitze-Denaturierung.

ALKPARl 5' ALKPAR2 3'

Pvul Ddel

IALALLPLLFTPVTKAVV

CGCCCTCmOTCira^CIGCTCTTCA^^ 3'

T/ÎGCXXXSAGOGÏGAAGAQGGTCflGGACAflGTCAGGTX^VCriXnTrKXafiCATCAAT 5'

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Verbindung und Isolierung von pTacAPARI

Das 243 bp Ddel bis Sall-partiell gefüllten AR-Fragment, das 2,8 kb Pvul/BamHI-partiell gefüllte Tac-Pak/EGF-Vektor-Fragment; und mit kinase-behandelte, getemperte ALKPAR1+2 Oligonukleotide wurden unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden, in kompetenten E. coli JM109-Zellen transformiert und auf LB/Neomycin-Platten transformiert. Die korrekte Konstruktion wurde mit Restriktionsverdauungen und DNA-Sequenierung bestätigt. Die Sequenz von pTacAPAR ist in Fig. 20 beschrieben.

Herstelluno des chimerischen hydrophilen Bereichs von AR/EGF-Gen-Fragment

Das Plasmid pDCHBPHILE wurde mit Sstll und Xbal verdaut, um das 286 bp-Fragment zu bilden, welche die letzten beiden Reste der TGF-ß-Signalsequenz (AG) codiert, 37 Reste des hydrophilen Bereichs von AR (VVKP...RKKK) und die 53 Reste synthetische Sequenz von reifer, humaner EGF-Sequenz (NSDS...WELR). Das 286 bp-Fragment wurde gelgereinigt.

Herstellung der synthetischen Oligonukleotide APAREGF1 und APAREGF2

Die komplementären synthetischen Oligonukleotide APAREGF1 und APAREGF2 wurden mit einem 5' Pvul-Überhang gezeichnet, welcher mit dem pTacAPARI und Pvul/Xbal-Fragment kompatibel war, um mit einer 3' Sstll-Verlängerung, welche mit dem Fragment pDCHBPHILE Sstll/Xbal-Fragment verträglich war. Die Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer synthetisiert und aus einem Acrylamidgel gereinigt. Es wurden Phosphate zu den Oligonukleotiden mit T4-Kinase zugegeben und äquimolare Anteile wurden getempert mit anschliessender langsamer Abkühlung nach der Wärme-Denaturierung.

Pvul Sstll

IALALLPLLFTPVTK APAREGF1 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACACC 3' APAREGF2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5'

Verbindung und Isolierung von dTACAPHILE

Das 286 bp-Sstll/Xbal-Fragment, welches den hydrophilen Bereich von AR codiert, welcher an die reife EGF-Sequenz gebunden ist, das 2,8 kb Pvul/Xbal pTacAPARI-Vektor-Fragment und mit Kinase behandelte, getemperte APAREGF1+2 Oligonukleotide wurden unter Verwendung von DNA Ligase verbunden, in kompetenten E. coli JM109 transformiert und aus LB/Neomycin-Platten ausgewählt. Die korrekte Konstruktion wurde durch Restriktionsverdauungen und DNA-Sequenierung bestätigt. Die Nukleotid-Sequenz von pTacAPHILE ist in Fig. 21 gezeigt. Das erwartete Translationsprodukt sollte zwischen dem Dipeptid-Ala-Gly unmittelbar nach der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz gespalten werden, wobei ein zusätzlicher Rest (Glycin) zum AR hydrophilen Bereich zugefügt wird. Die Nukleoti-den-Reste, welche von der normalen humanen Sequenz verschieden sind, sind in fetten Buchstaben angegeben (Fig. 20).

Reinigung des rekombinanten Amphiregulins

Die Plasmide pTacAPARI und pTacAPHILE wurden in kompetentem E. coli JM109 transformiert und zur Konfluenz in 10 ml LB bei 37°C gezüchtet, bis zu einem AeOO von 0,7. Die Kulturen wurden dann mit 100 uM IPTG induziert und während 24 bis 72 Std. gezüchtet. Die Kulturen wurden zweimal bei 5000 Umdrehungen/Min. zentrifugiert, je 15 Min., der Rückstand wurde gewonnen und die Reinigung wurde mit dem Überstand fortgesetzt. Die Proben wurden zehnmal auf einer amicon-Ultrafiltrations-Apparatur mit YM5-Membranen gereinigt (Ausschluss des Molekulargewichtes 5000). Die Konzentration wurde mit 5 Volumen MiiliQ Wasser verdünnt und auf einen Zehntel des Original-Kulturvolumens rekonstituiert. Es wurde bis zu einer Konzentration von 1M Eisessig zugeführt und die Proben wurden bei 4°C während 2 bis 24 Std. aufbewahrt. Die Proben wurden bei 19000 Umdrehungen/Min. während 20 Min. bei 4°C in Oakridge-Röhrchen in SS34 Rotor zentrifugiert. Das Präzipitat wurde mit 20 ml 1M Essigsäure extrahiert und die Überstände wurden gepoolt. Die geklärten Überstände wurden dann gegen 0,1 M Essigsäure während 2 Tagen dialysiert, lyophilisiert und -20°C aufbewahrt.

Der Zell-Niederschlag und die rohen, getrockneten Überstände wurden durch Immunoblotting und Wachstumshemm-Tests (GIA) auf AR-Protein getestet. Der Zell-Niederschlag von 50 p.l konfluenter Kultur oder 100 bis 200 nl getrocknetem Überstand wurde auf einem 16%Tricin-polyacrylamidgel laufengelassen und mit «Fast Green» gefärbt und auf Nitrozellulose übertragen. Es wurden Western Blots, wie vorher beschrieben, durchgeführt.

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Resultate und Diskussion

Die Zeil-Niederschläge der Transformanten, welche pTacAPARI trugen, zeigten genügende Mengen immunoreaktives Protein, welches bei 10 ku wanderte, ebenso wie einige Zersetzungsprodukte und möglicherweise Dimäre. Die Überstände hatten ungefähr 100 bis 200 ng/ml von ausgeschiedenem immunore-aktiven AR. Die GIA in den Überständen betrug ungefähr 150 ng/ml AR bei der A431-A3-lndikator-Zelli-nie, verglichen mit dem gereinigten, nativen AR-Standard. Es wurden grosse Mengen immunoreaktives Protein in diesem System hergestellt, das meiste blieb in Form eines Aggregates in der Zelle. Tests der periplasmischen Zubereitungen und der Überstände zeigten das Ausscheiden des aktiven Proteins nach dem Wachstum von 2 bis 3 Tagen.

pTacAPHILE stellt ein zweckmässiges Mittel dar, durch welches der hydrophile Bereich von AR an den N-Terminus irgendeines geklonten Gels befestigt werden kann. Diese Region könnte dem normalen Rezeptor des Ligandens veränderte Bildungsmerkmale verleihen, Funktionen, wie eine nukleare Lokali-sationssequenz, DNA-Bindung oder einen Transport durch das Lipid oder andere Membranen, welche normalerweise für den gebundenen Faktor undurchlässig sind, erlauben.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden am 19. Januar 1989 bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA, (NRRL) hinterlegt und wurden mit den folgenden Hinterlegungsnummern versehen:

Mikroorganismus Plasmid Hinterlegungsnummer

Escherichia coli HB101 pAR1 B—18438 Escherichia coli HB101 pARH12 B-18439 Escherichia coli HB101 pARH6 B-18440 Escherichia coli JM109 pTacAPARI B-18441 Escherichia coli JM109 pTacAPHILE B-18442

Es wird ebenfalls darauf hingewiesen, dass alle Basenpaare und Aminosäure-Rest-Nummern und die angegeben Grössen für Nukleotide und Peptide approximativ sind und nur für die Zwecke der Beschreibung angegeben wurden.

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Protein mit einer Aminosäuresequenz, die folgende Sequenz umfasst:

   1 10 20

   VVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK

   30 40 50

   NR R NRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI

   60 70 78

   EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

   2. Protein gemäss Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht von 8500 bis 25000 u.

   3. Protein der Aminosäuresequenz

   1 10 20

   SVRVEQVVKF PQNKTESENT SDKPKRKKK

   30 40 50

   GGKN G KNR R NR KKKNPCNAEF QNFCI

   60 70 80 84

   HGECKYIEHLEAVTC .KCQQEYFGER CGEK

   nach Anspruch 1.

   41

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   CH 681 080 A5

   4. Protein gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Molekulargewicht im Bereich von 9100 bis 25000 u besitzt.

   5. Protein gemäss Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es einen pl im Bereich von 7,6 bis 8,0 besitzt.

   6. Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es glykosyliert ist.

   7. Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es unglykosyliert ist.

   8. Protein gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, welches das Wachstum von humanen Krebszellinien von epithelischem Ursprung hemmt.

   9. Protein gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, welches das Wachstum von in vitro-aezüchteten. humanen Vorhaut-Fibroblasten stimuliert.

   10. Protein gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, welches einen bifunktioneilen Zellwachstumsregulator umfasst, welcher das Wachstum von humanen Krebszellinien von epithelischem Ursprung hemmt und das Wachstum in in vitro-aezüchteten. humanen Vorhaut-Fibroblasten stimuliert.

   11. Protein gemäss Anspruch 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, das als humane Krebszeiiinie von epithelischem Ursprung ein epidermisches Karzinom der Vulva A431 oder ein Adeno-Karzinom der Brust HTB132 hemmt.

   12. Protein gemäss Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, das als humane Vorhaut-Fibroblasten die Sadamoto- oder Goodwin-Zellinien stimuliert.

   13. Protein gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, welches das Wachstum von humanen Krebszellinien von epithelischem Ursprung hemmt.

   14. Protein gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein oder ein Peptid ist, welches einen bifunktionellen Zellwachstumsregulator umfasst, welcher das Wachstum von humanen Krebszellinien epithelischen Ursprungs hemmt und das Wachstum von in vitro-kultivierten. humanen Vorhaut-Fibrobiasten stimuliert.

   15. Protein gemäss Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es als humane Krebszeiiinie epithelischen Ursprungs ein epidermisches Karzinom der Vulva A431 oder ein Adeno-Karzinom der Brust HTB132 hemmt.

   16. Protein gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es als humane Vorhaut-Fibroblasten die Sadamoto- oder Goodwin-Zellinien stimuliert.

   17. Protein nach Anspruch 1 in Form eines Amphiregulin-Vorläufers, welcher die Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in Fig. 16 von der Aminosäure 1 bis zur Aminosäure 252 dargestellt ist.

   18. Nukleotid-Sequenz als Mittel zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 in Form eines Amphi-regulin-Vorläufers, welche die Nukleotid-Codierungssequenz enthält, wie sie in Fig. 16 von der Nukleo-tid-Nummer 1 bis zur Nukleotid-Nummer 1243 dargestellt ist.

   19. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäss Anspruch 1 oder 3 in Form des bifunktionellen Wachstumsregulationsfaktors Amphiregulin, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst:

   a) Kultivierung von MCF-7-Zellen in Gegenwart von 12-0-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA);

   b) Sammeln des konditionierten Mediums von den MCF-7-Zellen; und c) Isolierung des Amphiregulins aus dem konditionierten Medium.

   20. Protein erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 19.

   21. Antikörper, welcher ein Epitop von Amphiregulin gemäss Anspruch 20 erkennt.

   22. Antikörper gemäss Anspruch 21, worin das Epitop die Aminosäuresequenz

   DTYSGKREPFSGDHSADGFE enthält.

   23. Antikörper gemäss Anspruch 21, worin das Epitop die Aminosäuresequenz

   SSSEPSSGADYDYSEEYDNE enthält.

   24. Antikörper gemäss Anspruch 21, worin das Epitop die Aminosäuresequenz

   VKPPQNKTESENTSDKPKRKKKG enthält.

   25. Antikörper gemäss Anspruch 21, worin das Epitop die Aminosäuresequenz

   EAVTCKCQQEYFGERCGEK enthält.

   26. Antikörper gemäss Anspruch 21, worin das Epitop die Aminosäuresequenz

   VQLRRQYVRKYEGEAEERKK enhält.

   27. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäss Anspruch 1 oder 3 in Form von Amphiregulin, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst:

   42

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   CH 681 080 A5

   a) Kultivierung einer Escherichia coli-Zelle. welche eine Nukleotid-Sequenz enthält, die das Amphiregulin unter Kontrolle einer zweiten Nukleotid-Sequenz codiert, welche die Genexpression reguliert, so dass ein Peptid oder ein Protein mit Amphiregulin-Aktivität durch die Escherichia coli-Zelle hergestellt wird;

   b) Gewinnung des Amphiregulins aus der Kultur.

   28. Verfahren gemäss Anspruch 27, worin die Nukleotid-Sequenz, welche das Amphiregulin codiert, die Nukleotid-Sequenz enthält, wie sie in Fig. 16 von den Nukleotid-Nummern 1 bis 1243 dargestellt ist.

   29. Verfahren gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleotid-Sequenz, welche die Genexpression steuert, den Tac-Promoter enthält.

   30. Verfahren nach Anspruch 27 zur Herstellung eines Proteins gemäss Anspruch 1 oder 3 in Form von Amphiregulin, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

   a) Kultivierung des Escherichia coli-Stammes JM 109, welcher durch das Plasmid pTacAPARI transformiert ist und die Hinterlegungsnummer NRRL B-18441 aufweist, und b) Gewinnung des Amphiregulins aus der Kultur.

   31. Verfahren nach Anspruch 27 zur Herstellung eines Proteins gemäss Anspruch 1 oder 3 in Form von Amphiregulin, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

   a) Kultivierung von Escherichia coli-Stamm JM 109, welcher durch das Plasmid pTacAPHILE transformiert ist und die Hinterlegungsnummer NRRL B-18442 aufweist; und b) Gewinnung des Amphiregulins aus der Kultur.

   32. Genomische Nukleotid-Sequenz als Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss einem der Ansprüche 19 oder 27 zur Herstellung eines Proteins in Form von Amphiregulin, welche Sequenz die Nukleotid-Sequenz enthält, wie sie in Fig. 17 dargestellt ist.

   33. Genetisch modifizierte Zelle, welche die Nukleotid-Sequenz enthält, die das Amphiregulin unter Kontrolle einer zweiten Nukleotid-Sequenz codiert, welche die Genexpression so steuert, dass Amphiregulin produziert wird, als Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss einem der Ansprüche 19 oder 27.

   34. Genetisch modifizierte Zelle gemäss Anspruch 33, worin die Nukleotid-Sequenz, weiche das Amphiregulin codiert, die Nukleotid-Sequenz enthält, wie sie in Fig. 16 von der Nukleotidnummer 528 bis 761 dargestellt ist.

   35. Genetisch modifizierte Zelle gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Escherichia coli-Zelle ist.

   36. Genetisch modifizierte Zelle gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleotid-Sequenz, welche die Genexpression kontrolliert, einen Tac-Promoter enthält.

   37. Das Plasmid pAR1 zur Herstellung eines Proteins nach Patentanspruch 1 oder 3, hinterlegt im Escherichia coli-Stamm. welcher die Hinterlegungsnummer NRRL B-18438 aufweist.

   38. Plasmid pARH12, zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 3, hinterlegt im plasmidtra-genden Escherichia coli-Stamm HB 101, welcher die Hinterlegungsnummer NRRL B-18439 aufweist.

   39. Plasmid pARH6, zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 3, hinterlegt im plasmidtra-genden Escherichia coli-HB 101-Stamm, welcher die Hinterlegungsnummer NRRL B-18440 aufweist.

   40. Plasmid pTacAPARI, zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 3, hinterlegt im plasmid-tragenden Escherichia coli-JM 109-Stamm, weicher die Hinterlegungsnummer NRRL B-18441 trägt.

   41. Plasmid pTacAPHILE, zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 3, hinterlegt im plas-midtragenden Escherichia coli-JM 109-Stamm, welcher die Hinterlegungsnummer NRRL B-18442 aufweist.

   43