CH687233A5 - Neue abgeschwaechte Pseudomonas aeruginosa Staemme. - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stammes, der einen LDso von mindestens 2.0 x 107 Zellen in Mäusen hat, einen Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt nach dem Verfahren, einen nicht pathogenen Impfstoff zum Erzeugen eines Immunansprechens gegen eine Krankheit, die durch Pseudomonas aeruginosa bewirkt wird, ein Verfahren zur Herstellung des nicht pathogenen Impfstoffes, ein Inkubationsmedium zum Inkubieren eines abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stammes, ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Stoffes zur Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion in einem Patienten, der die Infektion zeigt, sowie einen therapeutischen Stoff, hergestellt gemäss dem eben erwähnten Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stamme, welche gemäss dem Fisher-Devlin Immunotypus durch ein Isolieren von Pseudomonas aeruginosa in einem reinen Zustand erhalten werden und danach der isolierte Stamm durch ein wiederholtes Durchfuhren durch Mäuse geläutert wird, ein daraus hergestellter prophylaktischer Impfstoff, und durch Zellwandproteine injizierte therapeutische Immunoglobuline, die vom abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm abgetrennt wurden, und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Pseudomonas aeruginosa ist ein motiler, gram-negativer Stab, ungefähr 0,5 tim x 1,5-3,0 um, der ein einziges Flagellum aufweist und verbreitet im Boden, Wasser, Abwasser und menschlischen Eingeweiden vorkommt. (Mol. Microbiol. 4, 1069-1075, 1990). Pseudomonas aeruginosa ist ein pathogener Stamm, der hartnäckige Infektionen wie beispielsweise Septicemia, allgemeine Infektion, chronische Infektion der Atemwege, cystische Fibrosis der Pankreas, etc. bewirkt. Die Septicemia, die durch Pseudomonas aeruginosa bewirkt wird, ist eine Krankheit, die entweder durch die Invasion des Mikroorganismus selbst oder durch das Ausscheiden seines giftigen Inhaltes in das Blut von Patienten erfolgt, die eine geschwächte Widerstandskraft auf Grund einer Operation, Lacération, Trauma und ähnliches aufweisen. Das Vorhandensein des Giftes bewirkt einen Schock mit hohem Fieber, verminderten Blutdruk-kes und andere Symptome, die schlussendlich zum Tode führen. Weiter, weil Pseudomonas aeruginosa in Infektionen der Hamwege festgestellt worden ist, ist das Interesse an Pseudomonas aeruginosa stark angewachsen. Folglich ist die Entwicklung von medizinischen Wirkstoffen, die im Stande sind, hartnäk-kig eiternde Krankheiten wie Septicema und Infektionen des Harntraktes zu verhüten oder behandeln, dringend notwendig. Jedoch sind Pseudomonas aeruginosa Stämme resistent gegen die weiteren antibiotischen Substanzen und bis heute ist kein wirksamer präventiver oder therapeutischer Wirkstoff gegen Pseudomonas aeruginosa Infektionen entwickelt worden. Folglich hat die Bösartigkeit der Pseudomonas aeruginosa Infektionen während der Zeit zugenommen.

Pseudomonas aeruginosa Stämme können in verschiedener Weise klassifiziert werden. Ein solches Klassifikationssystem klassifiziert die Stämme in sieben (7) Typen gemäss dem Fisher Immunotypus. Ein weiteres System ist auf der O-antigen Gruppe wie von Terada vorgeschlagen, basiert. Noch ein anderes System ist das Internationale Antigen Klassifizierungssystem (IATS). Hinsichtlich der Klassifikationssysteme sind die Pseudomonas aeruginosa Stämme, die am meisten in mit Pseudomonas aerugino-sa-infizierten Patienten vorkommen, wie folgt: 5/2a, 2c, 3, 7/3a, 3c, 1/4a, 4b, 6/5a, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /11 und 3, 7/3d, 3e Arten gemäss dem Fisher Immunotypus/O-Serotypus, wobei die 3, 7, 2 und 1 Typen als Fisher Immunotypen (entsprechend 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a und 4b als O-Serotypus hauptsächlich vorhanden sind).

Ein Verfahren zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Infektionen neutralisiert die Pseudomonas aeruginosa Giftstoffe mit Gegengiftstoffen. Jedoch ist der Gegengiftstoff ein therapeutischer Wirkstoff, der nur in Patienten wirksam ist, die bereits unter Septicemia leiden, und weist keine prophylaktische Wirkung auf. Weiter ist das gegenwärtig erhältliche Gegenmittel sehr teuer und seine Verwendung ist beschränkt. Zusätzlich ist der wichtigste Nachteil, der die Verwendung des Gegengiftstoffes begleitet, die verhältnismässig tiefe Heilquote und die begleitenden ernsthaften Nebenwirkungen.

Ein zur Zeit studiertes Verfahren zum Vermeiden der Nachteile, die dieses Gegengift begleiten, verwendet ein gleiches Antigen zur Verhinderung und zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Infektionen. Zur Zeit studierte Verfahren zum Erhalten des gleichwirkenden Antigens können allgemein in zwei Gruppen klassifiziert werden. Das erste Verfahren betrifft die Verwendung eines gleichwirkenden Antigens, das von Pseudomonas aeruginosa Stämmen abgetrennt und gereinigt wurde, das verschiedene Immunotypen als prophylaktischer Impfstoff Antigen gegen Pseudomonas aeruginosa Infektionen hat (Japan, J. Exp. Med. 45, 355-359, 1975). Das zweite Verfahren betrifft die Verwendung einer allgemeinen Antigenmasse, die hergestellt wird, indem eine Gentechnik verwendet wird, gemäss welcher ein Gencode für das erwünschte Antigen isoliert wird und in einem zweckdienlichem Vektor eingegeben wird, um einen rekombinierten Vektor zu erhalten, und dann wird der zweckdienliche Wirt mit dem sich ergebenden rekombinierten Vektor transformiert und incubiert, um das erwünschte Antigen aufzubringen.

Obwohl die Entwicklung eines prophylaktischen Impfstoffes, indem ein allgemeines Antigen verwendet wird, in der Theorie ein sehr wirksames Verfahren ist, zeigt zur Zeit der Fortschritt des Studium betreffend diesem Verfahren, dass dieses Verfahren viele Probleme hat, die ungelöst bleiben. Der grösste Nachteil ist, dass das allgemeine Antigen nicht alle Arten der Pseudomonas aeruginosa, die unterschiedliche Immunotypen haben, nicht verhindern kann, und damit ist dessen Wirksamkeit sehr tief.

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Eine solche tiefe Wirksamkeit lässt vermuten, dass das Vorhandensein eines anderen, unbekannten grösseren Antigens, zusätzlich zum allgemeinen Antigen, eine wirksame prophylaktische Wirkung bewirken kann.

Ein weiteres Verfahren zur Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion ist die Verabreichung von Antibiotika oder chemotherapeutischen Wirkstoffen, die eine Breitbandselektivität für den Pseudomonas aeruginosa Stamm haben. Weil es jedoch zahlreiche Pseudomonas aeruginosa Stämme gibt und diese im allgemeinen eine hohe Widerstandskraft gegen Arzneistoffe haben, sind viele Patienten den Pseudomonas aeruginosa Stämmen unterlegen, die nicht durch Antibiotika wirksam behandelt werden konnten.

Weiter wurde 3in Verfahren entwickelt, das ein therapeutisches Immunoglobulin verwendet. Jedoch zeigt ein solches Immunoglobulin keine oder nur eine kleine therapeutische Wirkung bei allen Pseudomonas aeruginosa Infektionen und ist daher nur für sehr begrenzte Arten von Pseudomonas aeruginosa Infektionen verwendet worden. Dies ist hauptsächlich darum, weil das Immunoglobulin gemäss einem Verfahren zum Herstellen eines polyclonalen Antikörpers gegen einen gewissen Mikroorganismus hergestellt wird und damit nicht allgemein gegen die zahlreichen Pseudomonas aeruginosa Stämme wirksam sein kann.

Es wurden Versuche durchgeführt, einen billigen therapeutischen Wirkstoff mit monoclonalen Antikörpern von Mäusen zu entwickeln (J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985) oder mit monoclonalen Antikörpern von Menschen (FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990), gegen Pseudomonas aeruginosa. Hier können Zellenwände ausgewählt werden, um die meist wirksamen Neutralisier-Antikörper von einer Zellenbank mit einer Zellenfusionstechnik zu erzeugen, und dann kann eine Zellenlinie als Ausgangsmaterial verwendet werden, um den erwünschten Antikörper industriell herstellen zu können. Jedoch zielt dieses Verfahren auf eine Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion durch eine Erzeugung von Antikörpern, jedoch nicht durch prophylaktische Impfstoffe. Zusätzlich weist dieses Verfahren den Nachteil auf, dass, weil alle Infektionen, die durch verschiedene Pseudomonas aeruginosa Stämme mit unterschiedlichen serologischen und immunologischen Arten bewirkt werden, diese nicht alle mit nur einer Art eines monoclonalen Antikörpers behandelt werden können. Das heisst, die monoclonale Antikör-per-Therapie kann nicht zur Behandlung aller der mit Pseudomonas aeruginoas infizierten Patienten wirksam verwendet werden.

Um die wirksame Behandlung mit diesem Verfahren zu verbreiten, wurde ein gleichzeitiges Verabreichen von verschiedenen Arten von Antikörpern auf der Basis ihrer untersuchten Querreaktivität entwik-kelt. Dazu wurde Blut von mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten entnommen und untersucht, um die serologische und immunologische Art der infizierenden Pseudomonas aeruginosa Stämme zu identifizieren. Dann werden dem Patienten Antikörper verabreicht, die zur identifizierten Art passen. Jedoch benötigt dieses Verfahren viel Zeit und ist daher nicht möglich für Patienten, deren Zustand eine unverzügliche Behandlung benötigt.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Zellenwandproteinen, die von Pseudomonas aerugino-se Stämmen abgetrennt worden sind als ein Antigen für einen Impfstoff vorgeschlagen worden (siehe Vaccine, Vo. 7, «Expérimental Studies on the protective efficancy of a Pseudomonas aeruginosa Vaccine», 1989). Jedoch verwendet das in der obigen Vorveröffentlichung vorgeschlagene Verfahren vier Arten von allgemeinen Pseudomonas aeruginosa Stämmen, d.h. NN 170 041, NN 170 015, NN 868 und NN 170 046, die nicht abgeschwächt sind, und damit ist ein Problem in Verbindung mit den Giften der Pseudomonas aeruginosa Stämmen selbst vorhanden. Weiter können beim Herstellen eines Impfstoffes aus Protein-Komponenten aus solchen Pseudomonas aeruginosa Stämmen Zellen zerstört werden, welche in das Medium fremde nukleide Säuren und giftige hochmolekulare Stoffe, Lipopolysaccha-ride (LPS) abgeben können, die im Cytoplasma vorhanden sind. Diese Substanzen werden dann im sich ergebenden Impfstoff als Verunreinigungen aufgenommen, welche die notwendige Sorgfalt, mittels der der Impfstoff verabreicht wird, verstärken und möglicherweise dessen Anwendung beschränken.

Daher haben die gegenwärtigen Erfinder eine breite Forschung durchgeführt, um ein Mittel zu finden, die imstande sind, wirksam Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa zu erzeugen, und das eine gute immunogenische (d.h. antigenische) Aktivität zeigt und eine äusserst kleine Gefahr auf Grund der innewohnenden Toxizitäten der Pseudomonas aeruginosa Stämme selbst bilden. Als Folge haben die gegenwärtigen Erfinder bestätigt, dass, wenn Pseudomonas aeruginosa Stämme von mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten isoliert werden, basiert auf ihre Immunoarten in sieben (7) Spezies klassifiziert werden und dann jeder reine Stamm abgeschwächt wird, indem der Organismus mehrere Male durch einen neuen zweckdienlichen Tierwirt hindurchgelassen wird, sichere und abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme erhalten werden können. Diese Stämme haben Zellenwandproteine, die nicht nur zur Herstellung eines Impfstoffes für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa Infektionen nützlich ist, sondern die auch als Antikörpererzeuger verwendet werden können, um Immoglu-buline für eine Pseudomonas aeruginosa Infektion im tierreichen Körper zu erzeugen. Die sich ergebenden Immunoglobuline zeigen ausgezeichnete therapeutische Wirkungen gegen verschiedene Pseudomonas aeruginosa Infektionen, einschliesslich schwere Fälle, gemäss der vorliegenden Erfindung.

Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen neuen und sichereren abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm zu zeigen, der Zellenwandproteine enthält, die eine Antigenizität zeigen, ohne die Toxizität des Pseudomonas aeruginosa Stammes selbst.

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Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff zu zeigen, der ein Immunansprechen erzeugt, um eine nachfolgende Erkrankung zu verhindern, die in einem Patienten, der den Impfstoff erhält, durch Pseudomonas aeruginosa erzeugt wird.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes zu zeigen.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen therapeutischen Stoff für die Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion zu zeigen, der mindestens ein Immunoglobin für einen Pseudomonas aeruginosa Stamm enthält.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des Immoglobulins zu zeigen.

Das Obige hat einige der mehr pertinenten Ziele der Erfindung aufgezeigt. Diese Ziele sollten als rein beispielsweise von einigen der pertinenteren Eigenschaften und Anwendungen der Erfindung ausgelegt werden. Es können viele andere nützliche Ergebnisse beim Anwenden der offenbarten Erfindung in einer anderen Weise erhalten werden, oder durch ein Modifizieren der Erfindung innerhalb des Bereiches der Offenbarung. Entsprechend können weitere Ziele und ein gründlicheres Verstehen der Erfindung erhalten werden durch Bezugnahme auf die Zusammenfassung der Erfindung und die detaillierte Beschreibung, die die bevorzugte Ausführung zusätzlich zum Geltungsbereich der Erfindung beschreibt, der durch die Ansprüche bestimmt ist, wenn sie im Zusammenhang mit den beigelegten Zeichnungen genommen wird.

Eine Ausführung der vorliegenden Erfindung betrifft neue, sichere und wirksame abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme, die Zellwandproteine haben, welche eine Antigenizität ohne die Giftigkeit des Pseudomonas aeruginosa Stammes zeigen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung sichere, abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme, die erhalten werden, indem Pseudomonas aeruginosa Stämme von Patienten isoliert werden, die mit Pseudomonas aeruginosa Stämmen infiziert sind, die isolierten Mikroorganismus Stämme in sieben (7) Arten von Spezies gemäss dem Fisher-Der-lin Immunotypus klassifiziert werden, für jeden Immunotypus ein einziger entsprechender Stamm ausgewählt wird, der ausgewählte Stamm durch widerholte Einspritzen/Isolieren/Wiedereinspritzen-Schritte in Versuchstiere, gereinigt wird, und für jeden der sieben (7) Typen der Pseudomonas aeruginosa Stämme der am meisten abgeschwächte Stamm ausgewählt wird.

Eine weitere Ausführung der Erfindung ist auf einen neuen Impfstoff und das Verfahren für die Herstellung des Impfstoffes für die Prophylaxe gegen die Pseudomonas aeruginosa Infektion gerichtet. Der Impfstoff wird hergestellt, indem Zellenwandproteine in einem weitgehend reinen Zustand von jeder der sieben (7) Typen der sicheren, abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme wie unten beschrieben, abgetrennt werden und die abgetrennten Zellenwandproteine weiter gereinigt werden, und dann, vorzugsweise, die gereinigten Zellenwandproteine, die von mindestens 3 Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa miteinander kombiniert werden. Bevorzugterweise werden gleiche Mengen von Zellenwandproteinen von jedem der 3 Typen zur Herstellung des Impfstoffes gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet.

Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung ist ein therapeutischer Stoff gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion, der mindestens ein Immunoglobulin enthält, das erzeugt ist durch ein Kultivieren mindestens eines abgeschwächten Psudomonas aeruginosa Stammes, ein Abtrennen des Zel-lenwandproteins, ein Reinigen des abgetrennten Zellenwandproteins und dann ein Einspritzen des reinen Zellenwandproteines als Antikörpererzeuger in Versuchstiere, um das Immunoglobulin zu induzieren, und ein Verfahren zur Herstellung des therapeutischen Stoffes.

Die mehr pertinenten und wichtigen Eigenschaften sind oben abgegeben worden, so dass die Einzelbeschreibung der Erfindung, die nachfolgt, besser verstanden wird und der vorliegende Beitrag zur Technik voll verstanden werden kann. Zusätzliche Eigenschaften der nachfolgend beschriebenen Erfindung bilden den Gegenstand der Ansprüche der Erfindung. Der Fachmann wird erkennen, dass das Konzept der Erfindung und die hierin offenbarte spezifische Ausführung einfach als Basis zum Modifizieren oder Ausbilden anderer Strukturen zum Ausführen derselben Zwecke der vorliegenden Erfindung benützt werden kann. Weiter wird der Fachmann erkennen, dass solche äquivalente Ausbildungen nicht vom Geist und Geltungsbereich der in den Ansprüchen dargelegten Erfindung abweichen.

Für ein gründliches Verstehen der Natur und Ziele der Erfindung, soll Bezug auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung; zusammengenommen mit den beigelegten Zeichnungen, genommen werden:

Fig. 1 zeigt das Ergebnis von SDS-PAGE gereinigte Zellenwandproteine, die von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen gemäss der vorliegenden Erfindung abgetrennt worden sind; und

Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Gewichtsänderung einer männlichen Maus darstellt, in welche das Zellenwandprotein von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen gemäss der vorliegenden Erfindung intravenös injiziert worden ist.

Fisher-Devlin Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa werden in sieben (7) Typen klassifiziert, Typ 1 bis Typ 7. In der vorliegenden Erfindung werden Pseudomonas aeruginosa Stämme, die die Fisher Immunotypen 1 bis 7 aufweisen, als die Stämme für die Abschwächung gewählt, auf der Basis der Tatsache, dass sie im Blut des grössten Teiles, d.h. 90 bis 95% oder mehr der mit Pseudomonas aeru-

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ginosa infizierten Patienten detektiert werden. Insbesondere sind unter den sieben (7) Typen der Pseudomonas aeruginosa der Typ 1 und Typ 3 die am meisten detektierten Stämme in mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten. Jedoch kann die Lehre der vorliegenden Erfindung gegen irgendwelche der Stämme vor Pseudomonas aeruginosa zum Schaffen von Schutz oder Behandlung verwendet werden.

Sicher abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung können erhalten werden, indem jeder der sieben Typen der Pseudomonas aeruginosa Stämme in einem reinen Zustand aus dem Blut von Patienten isoliert wird, bei denen festgestellt worden ist, dass sie eine Pseudomonas aeruginosa Infektion haben, und dann die isolierten Stämme durch wiederholte Reinigungsvorgänge abgeschwächt werden. Die sicher abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme, die in dieser Weise erhalten werden, sind alle sieben (7) Typen und sind bezeichnet als CFCPA 10 142 (Fisher Type 1), CFCPA 20 215 (Fisher Type 2), CFCPA 30 720 (Fisher Typ 3), CFCPA 40 057 (Fisher Typ 4), CFCPA 50 243 (Fisher Typ 5), CFCPA 60 534 (Fisher Typ 6), bzw. CFCPA 70 018 (Fisher Typ 7). Hier ist CFCPA ein Acronym von «Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa», das von der Cheil Food and Chemicals Inc. gebildet wurde, in welcher die Erfinder der vorliegenden Anmeldung angestellt sind, und der Name des vorliegenden Stammes, Pseudomonas aeruginosa.

Die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme, die durch die wie oben beschriebenen wiederholten Reinigungsprozeduren erhalten werden, haben Erscheinungsbilder und mikrobiologische Eigenschaften, die weitgehend identisch zu denjenigen der entsprechenden Mutterstämmen sind, zeigen jedoch neue Eigenschaften, die zur Herstellung eines Impfstoffantigens für die Prophylaxe gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion anstatt irgendwelche Pathogenizität, die in den Mutterstämmen vor der Abschwächung vorhanden sind. Daher werden die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung als neue Mikroorganismus-Stämme betrachtet. Folglich wurden diese Stämme bei der Korean Culture Center of Microorganismus in der Korean Fédération of Culture Collection, nachfolgend als KCCM bezeichnet, hinterlegt, die eine internationale Hinterlegungsstelle nach dem Vertrag von Budapest vom 12. Mai 1993, mit der Zugriffsnummer der KCCM 10 029 für CFCPA 10 142, KCCM 10 030 für CFCPA 20 215, KCCM 10 031 für CFCPA 30 720, KCCM 10 032 für CFCPA 40 057, KCCM 10 033 für CFCPA 50 243, KCCM 10 034 für CFCPA 60 532 und KCCM 10 035 für CFCPA 70 018.

Die Reinigungsvorgänge zur Erzeugung der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme werden wiederholt durchgeführt, allgemein bis die Stämme die erwünschten LD50 Werte zeigen. Obwohl die Anzahl der Reinigungsvorgänge oder Schritte variiert, abhängig vom Grad des Könnens der Techniker, der Toxizität der Mutterstämme und ähnliches, wird der Reinigungsschritt bevorzugterweise 3 bis 7 Male ausgeführt, z.B. bis das LD50 der Pseudomonas aeruginosa mindestens 2 x 107 Zellen beträgt. Der LD50 Pegel der neuen abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme, der damit gemäss der vorliegenden Erfindung in der Maus erhalten wird, beträgt vorteilhaft 2,0 x 107 Zellen oder mehr.

Die vorliegende Erfindung zeigt auch einen Impfstoff für die Immunisierung gegen Pseudomonas aeruginosa Infektionen, und welcher hergestellt wird in Zellenwandproteine in einem reinen Zustand von jedem der neuen abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen gemäss der vorliegenden Erfindung wie oben angeführt, abgetrennt werden, und dann die abgetrennten Zellenwandproteine weiter gereinigt werden, und die gereinigten Zellenwandproteine, die damit erhalten wurden, in einem gewissen Mischverhältnis kombiniert werden, vorzugsweise in gleichen Mengen der Zellenwandproteine von jedem der erwünschten Pseudomonas aeruginosa Stämmen für welche eine Immunisierung gesucht wird. Das heisst, die für jeden Stamm verwendete Menge ist derart genügend, dass eine Immunisierung gegen den Stamm in einem jeweiligen Mutterwirttyp induziert wird.

Zusätzlich zeigt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen für eine Immunisierung gegen Pseudomonas aeruginosa, gekennzeichnet in dem abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme in Fermentoren inkubiert werden, währenddem optimale Wachstumszustände beibehalten werden, um eine Pseudomonas aeruginosa Stamm-Masse zu erhalten. Die erhaltene Mikroorganismus-Masse wird gemäss einer Folge von Prozeduren behandelt, einschliesslich einem Extrahieren von Zellenwandproteinen durch eine Behandlung mittels eines organischen Lösungsmittels, ein Fraktionieren basiert auf Molekulargewichte, Ultrazentrifugen, um die erwünschten Zellenwandproteine zu erhalten. Die erhaltenen Zellenwandproteine, die von den sieben (7) Typen der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen erhalten werden, werden in einer zweckdienlichen Konstitution miteinander kombiniert, bei einem erwünschten Verhältnis, vorzugsweise in gleichen Mengen.

Das Verfahren zur Herstellung der Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung gemäss der obigen Beschreibung kann wie folgt zusammengefasst werden.

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Tabelle 1:

Prozeduren zur Trennung und Reinigung von Zellenwandproteinen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen und zur Herstellung von Impfstoffen

Kultivierung von sieben (7) Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen

Abtrennung von Mikroorganismus Zellen

Abgetrennte Zellen + Organisches Lösungsmittel

Extraktion von Zellenwandproteinen

Erstes Fraktionieren nach Molekulargewicht (Ultrafiltration)

Zweites Fraktionieren nach Molekulargewicht (Ultrafiltration)

Ultrazentrifuge (180,000 g)

Abgetrennte Zellenwandproteine (Mr 10,000 « 100,000)

Mr = relative Molekülmasse

Pseudomonas aeruginosa Impfstoff

Nachfolgend werden die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mehr im einzelnen unter Bezugnahme auf das Verfahren zu deren Herstellung beschrieben.

Zum Herstellen von Impfstoffen für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa gemäss der vorliegenden Erfindung werden im ersten Schritt sieben Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen, i.e. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 bzw. CFCPA 70 018 in einem zweckdienlich bemessenen Fermenter inkubiert. Als Nährmedium für diesen Zweck ist ein tryptisches Soja-Nährmedium, bevorzugt ein spezielles Medium wie unten beschrieben, für die Inkubation von Pseudomonas aeruginosa wie oben beschrieben, geeignet.

Das spezielle Nährmedium umfasst Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgS04 (0,5 g/l), Ca CO3 (5 g/l), KH2 PO4 (1 g/l), FeSÛ4 (5 mg/l), Cu CO4 (5 mg/I) und Zu SO4 (5 mg/1). Dieses spezielle Nährmittelmedium ist einzig und durch die vorliegenden Erfinder aufgestellt zur Kultivierung von Pseudomonas aeruginosa Stämmen und ist neu. Entsprechend ist dieses spezielle Nährmittelmedium durch den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung umfasst. Wenn Pseudomonas aeruginosa Stämme im speziellen Medium zum Wachstum gebracht werden, ist der Ertrag der Bakterienmasse mindestens 30% höher als der Bakterienmasse, die in einem tryptischen Sojanährmedium zum Wachstum gebracht wird, auf der Basis des Gewichtes der trockenen Bakterienmasse. Folglich ist die Verwendung eines solchen speziellen Mediums eine bevorzugte Ausführung.

In einem solchen Inkubationsschritt der Bakterienmasse sind die optimalen Wachstumsbedingungen: Temperatur 37°C, Belüftungsmass 1 wm(volume/volume-Minute) und das Saatvolumen 5% v/v des Wachstums-Nährmediums, und die Inkubation wird unter einem Rührmass von 100 rpm vorerst während 2 Stunden und danach 600 rpm für 10-20 Stunden, vorteilhaft während 12 bis 16 Stunden durchgeführt.

Nach Beendigung der Inkubation werden in einem zweiten Schritt die ausgefällten Bakterienzellen von dem Nährmedium mittels Zentrifugen oder ähnlichem ausgetrennt. Die ausgetrennten Bakterienzellen werden im dritten Schritt mit einer organischen Lösung behandelt, um die Mikroorganismen inaktiv zu machen und gleichzeitig alle lipiden Zellenwandkomponenten zu entfernen. Im dritten Schritt wird das organische Lösungsmittel vorteilhaft aus der Gruppe bestehend aus Azeton, Chloroform, Ethanol, Butanol, etc. ausgewählt, wobei Azeton am meisten vorzuziehen ist.

Darauf enthält der vierte Schritt das wiederholte Extrahieren von Zellenwandproteinen, d.h. 5 bis 6 Extraktionen währenddem die Zellen selbst nicht zerstört werden, so dass ihr Zelleninhalt verloren geht. Aus diesem Grund werden Mikroorganismuszellen in einer Lösung, wie beispielsweise eine Phosphatbufferlösung, Trisbufferlösung und ähnlichem, gehalten, bevorzugt in der Phosphatbufferlösung, und es wird mit einem Mischer oder Homogenisator auf sie eingewirkt, um die Zellenwandproteine zu extrahieren. Das Extrahieren wird vorteilhaft mit einem Rühren bei 100 bis 2000 rpm bei 4°C durchgeführt. Zusätzlich sollten im vierten Schritt besondere Vorsichtsmassnahmen getroffen werden, um eine Zerstörung der Zellen zu verhindern, so dass die erwünschten Zellenwandproteine von den giftigen Proteinen, die im Cyptoplasma vorhanden sind, getrennt gehalten werden können. Folglich ist es während dem Extrahiervorgang notwendig, dauernd festzustellen, ob die Zellen zerstört werden oder nicht, indem das Vorhandensein von Lactat-Dehydroyenase oder Hexokinase als ein cytoplasmisches Anzeigeenzym festgestellt wird.

Danach werden die Zellenwandproteine der abgeschwächten Pseudomonas aeruginose Stämme, die in einem Supernatant gemäss den obigen Vorgängen erhalten wurden, aufgetrennt, indem sie einer ersten und einer zweiten Ultrafiltration unterworfen werden, um nur die Proteine zu erhalten, die Moleku6

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largewichte zwischen 10,000 und 100,000 aufweisen. In diesem Schritt ist es sehr wichtig, dass ein Molekulargewicht der resultierenden Zellenwandproteine im Bereich von 10,000 bis 100,000 liegt. Der Grund ist, dass das Molekulargewicht von Zellenwandproteinen unter 10,000 nicht die erwünschte prophylaktische Wirkung erbringt, wie durch Tierversuche festgestellt worden ist, währenddem ein Molekulargewicht höher als 100,000 giftige Wirkungen auf Grund des Vorhandenseins von hoch molekularer Lipopolysacchariden (LPS) bewirken könnte.

Die abgetrennten Zellenwandproteine von jedem der sieben Typen der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa, die ein Molekulargewicht zwischen 10,000 und 100,000 haben, werden weiter durch ein Ultrazentrifugen gereinigt, um jeglichtsmögliches kleinstes Lipopolysaccharid zu entfernen, das noch vorhanden sein könnte. Dann wird ein Schritt zur Entfernung jeglicher bakterieller Verunreinigungen durchgeführt, um schliesslich die Zellenwandproteine von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen zu erhalten, die unpathogenisch sind und eine genügende Reinheit zur Verwendung als Impfstoff zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas aeruginosa Infektion aufweisen.

Die Zellenwandproteine, die aus den sieben Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen erhalten wurden, werden dann in einem gewissen Verhältnis kombiniert, um den Impfstoff zu bilden. Betrachtet man die Häufigkeit des Auftretens der Krankheit der Mutter-Pseudomonas aeruginosa Stämme vor dem Abschwächen, sollte die Kombination der Zellenwandproteine durchgeführt werden, indem Zellwandproteine gemischt werden, die von mindestens drei (3) erhalten wurden, mehr bevorzugt vier (4) Typen oder mehr, und am meisten bevorzugt alle sieben (7) Typen der Pseudomonas aeruginosa Stämme. Obwohl das Mischverhältnis sich mit den Typen der Pseudomonas aeruginosa Stämmen, von denen die Zellenwandproteine, die zu kombinieren sind, erhalten werden, ändert, werden die Zellenwandproteine vorteilhaft in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen gemischt.

Beispielsweise sind die bevorzugten Impfstoffzusammensetzungen gemäss der vorliegenden Erfindung diejenigen, die Zellenwandproteine enthalten, die aus CDCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 532 in einem Mischverhältnis von 1:1:1,5:0,5; 1:1:1:1 oder 0,5:1,5:1,5:0,5 erhalten werden, oder ein Impfstoff, der alle Zellenwandproteine, die aus CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018 in einem Mischverhältnis von weitgehend äquivalenten Mengen erhalten werden. Die kleinste Menge des Zellenwand-proteingemisches von jedem Stamm der Pseudomonas aeruginosa, der im Impfstoff vorhanden ist, ist die kleinste Menge, welche genügt, im beabsichtigten Wirt/Patienten eine Immunisation zu bewirken.

Falls erwünscht, kann der Impfstoff für die Prophylaxe gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion gemäss der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den Zellenwandproteinen, die wie oben erhalten werden, pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, beispielsweise Calciumhydroxid, Calciumphosphat, ISCON (Immunität stimulierender Complex), SAF-1 (Syntex Adjuvant Formulation -1), SAF m (modifizierte Syntex Adjuvant Formulation) und ähnliche Exzipienten, die dem Fachmann bekannt sind, enthalten.

Zum Gebrauch als ein prophylaktischer Impfstoff gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion ändert die abzugebende Dosis mit dem Geschlecht, dem Alter, Gewicht, Gesundheitszustand, etc. der Personen, die der Pseudomonas aeruginosa ausgesetzt sein könnten, beträgt jedoch allgemein 0,5 bis 2,5 mg des Gemisches des Zellenwandproteins jedes der abgeschwächten Stämme. Diese Menge wird allgemein von einer Bakterienmasse mit einem Trokkengewicht von 0,1 g bis 0,5 g erhalten (entsprechend einem Nassgewicht von 0,5 bis 2,5 g). Die bevorzugte Weise der Verabreichung ist durch ein intramuskuläres Einspritzen.

Gemäss einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung kann das Zellenwandprotein, das in einem reinen Zustand vom abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm der vorliegenden Erfindung erhalten wird, auch als Antikörpererzeuger zum Erzeugen von Antikörpern in Versuchstieren verwendet werden. Somit schafft die vorliegende Erfindung einen therapeutischen Wirkstoff zur Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion, der ein Immunoglobulin enthält, das durch ein Einspritzen des Zel-lenwandglobulins in einem reinen Zustand, das durch eine Abtrennung und Reinigung, wie oben erwähnt, erhalten worden ist, in ein Versuchstier, um die Bildung eines Immunoglobulins gegen Pseudomonas aeruginosa zu induzieren.

Insbesondere ist das abgetrennte und gereinigte Zellenwandprotein, das durch die Vorgehen, wie sie insbesondere oben dargelegt sind, aus abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen der vorliegenden Erfindung erhalten werden, ein Antigen, das zum Impfen von Versuchstieren, beispielsweise Schafe, Hasen, etc. verwendet wird, um das Bilden des dazugehörigen Antikörpers zu bewirken. Das Blut wird von den Versuchstieren entnommen und dann wird das Serum abgetrennt. Das abgetrennte Serum wird in einer bekannten Weise behandelt, um das erwünschte Immunoglobulin in einem reinen Zustand zu erhalten. Zu diesem Zweck kann das Abtrennen und Reinigen des Immunoglobulins vom abgetrennten Serum gemäss irgendwelchem Verfahren, das in dem entsprechenden technischen Gebiet gut bekannt ist, durchgeführt werden (siehe Practical Immunology, 3 rd. Ed. (1989), 292-294), beispielsweise indem das abgetrennte Serum mit destilliertem Wasser gemischt wird, das Gemisch einer DEAE-Zellulose (Diethylaminolthyl-Zellulose) zugegeben wird, um ein Absorbieren des Immunoglobulins zu ermöglichen, das Supernatant entfernt wird und danach die Immunoglobulin-absorbierte DEAE-Zellu-lose mehrere Male mit einer gepufferten Phosphatlösung gewaschen wird, um das gereinigte Immunoglobulin zu erhalten.

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Das Immuglobulin, das im therapeutischen Stoff zur Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion verwendet wird, wird durch eine Immunisation eines Versuchstieres mit einem Gemisch erhalten, das Zellenwandproteine enthält, die in einem bestimmten Verhältnis von verschiedenen abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen abgetrennt wurden. Zu diesem Zweck kann ein kombiniertes Immunoglobulin verwendet werden, das erhalten wird durch ein Immunmachen eines Versuchstieres mit einem Gemisch, das aus jedem der Zellenwandproteine besteht, die von "jedem der sieben (7) Typen der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen in einem gewissen Verhältnis erhalten wird, vorzugsweise in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen. Jedoch, wenn die Kreuzreaktivität jedes der Immunoglobuline berücksichtigt wird, bilden die Immunoglobuline, die durch ein Immunisieren eines Versuchstieres mit einem Gemisch erhalten werden, das aus Zellenwandproteinen besteht, die aus jedem der 4 Typen der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme wie folgt besteht: CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534 und einem Verhältnis von 1:1:1:1, eine beträchtliche therapeutische Wirkung auf Infektionen, die durch alle der Pseudomonas aeruginosa Stämme, die die Fisher Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 haben, bewirkt werden. Dieses ist der bevorzugte kombinierte Immunoglobulin therapeutische Stoff zur Behandlung einer Krankheit, die durch Pseudomonas aeruginosa bewirkt ist.

Das Immoglobulin für Pseudomonas aeruginosa gemäss der vorliegenden Erfindung kann als pharmazeutische Zusammensetzung in einer lyophilisierten Form oder einer flüssigen Form ausgebildet werden, und falls notwendig, pharmazeutisch annehmbare Träger, beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel, isotonische Stoffe und ähnliches enthalten. Die pharmazeutisch annehmbaren Träger, die vorzugsweise verwendet werden können, umfassen beispielsweise Mannitol, Lactose, Saccharose, menschliches Allumin, etc. im Falle von lyophilisierten Präparaten und eine physiologische Salzlösung, Wasser zum Spritzen verabreichen, Phosphat Bufferlösung, Aluminiumhydroxid, etc. im Falle von flüssigen Präparaten.

Die Dosierung des Immunoglobulins variiert, abhängig vom Alter, Körpergewicht, Geschlecht und allgemeinen Gesundheitszustand der Person, der Stärke der Pseudomonas aeruginosa Infektion und von der Komponenten des verabreichten kombinierten Immunoglobulins. Das Immunoglobulin wird einer erwachsenen Person allgemein in einer Menge von 0,1 mg bis 1000 mg verabreicht, bevorzugt 1 mg bis 100 mg pro Tag pro kg Körpergewicht, über den intravenösen Weg.

Die vorliegende Erfindung wird mehr detailliert erläutert durch die folgenden Beispiele, ist jedoch in keiner Weise auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1:

Isolation des Pseudomonas aeruginosa Stammes von mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten und dessen Identifizierung.

Von jeder der 260 verschiedenen Blutproben, die von mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten entnommen wurde, wurde etwa 1 bis 5 ml Aliquot aseptisch gesammelt und während einer Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachdem das Blut über Nacht in einem Kühlschrank bei 4°C gelagert worden war, wurde es während 10 Minuten bei 4°C mit 1500 x g (G : Schwerkraft) zentrifu-giert, um die Feststoffe zu entfernen und ein supernatantes Serum zu erhalten. Das oben erhaltene Serum wurde mit einer Phosphat Bufferlösung (NaF^PCU 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCI 8,766 g per Liter) in einem Verhältnis von 1:10 (Serumzulösung) verdünnt und danach auf tryptische Sojanäh r-medium-Kultivierungsplatten aufgestrichen, wobei 1,0 bis 1,5 Agar zugegeben wurde, das vorgängig hergestellt worden war. Die Kultivierungsplatte wurde während 12 Stunden, oder mehr, in einem Inkubator inkubiert, der unter aerobischen Bedingungen auf einer dauernden Temperatur von 37° gehalten wurde. Die damit erhaltenen Kulturen wurden auf frische Kultivierungsplatten überführt und dann wurden die erwünschten Mikroorganismen mittels einem bekannten Verfahren zum Isolieren von reinen Mikroorganismen (siehe Thomas B. Brock Michael T. Madigan, Biology of Microorganismus (1988), tth Ed. pp 32-33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey) in einem reinen Zustand isoliert.

Für die isolierten Pseudomonas aeruginosa Stämme sind ihre serologischen und immunologischen Eigenschaften schon offenbart worden (siehe Bergey's Manual) und ihre Identifikation kann mit Verwendung einer handelsüblichen Ausrüstung gemäss dem analytischen Verfahren bestimmt werden, das in J. Gen. Microbiol, 130, 631-644, 1984 beschrieben ist. Jeder Pseudomonas aeruginosa Stamm wurde in ein Reagenzglas eingefüllt, das 5 ml eines tryptischen Soja-Nährmediums enthielt, und dann unter aerobischen Zuständen bei 37°C inkubiert, um die Konzentration der Bakterienmasse so einzustellen, so dass das Aufnahmevermögen von ungefähr 2.0 oder mehr unter sichtbarem Licht von 650 nm beibehalten wurde.

Aus dieser Kulturlösung wurde ein Aliquot von 1 ml aseptisch herausgenommen und mit 6000 x g bei 4°C während 10 Stunden zentrifugiert. Die supernatante Kulturlösung wurde entfernt und der niedergeschlagene Mikroorganismus suspendiert, indem dieselbe Menge eines sterilisierten salinischen Mittels zugegeben wurde. 15 n I jedes Prüfserums, das in der Ausrüstung enthalten war und im Prüfserum (normales Hasenserum) wurden jedem Behältnis einer Mikroplatte mit 96 Behältnissen zugegeben und mit 15 nl der Mikroorganismus-Suspension vermischt, die oben erhalten wurde, um festzustellen, ob die Agglutination innerhalb 10 bis 30 Minuten stattfindet. In diesem Versuch, weil der Microorganismus

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Stamm in einem Behältnis mit einer positiven Agglutination einen Serotyp hat, der identisch zum dazugegebenen Serum ist, konnte die Identifikation der isolierten Mikroorganismen einfach durchgeführt werden.

Beispiel 2:

Auswahl von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen von jedem der isolierten Pseudomonas aeruginosa Stämmen.

Um Pseudomonas aeruginosa Stämme abzuschwächen, um sichere Mikroorganismen zur Verwendung in der Herstellung eines Impfstoffes zu erhalten, wurde für jeden der Pseudomonas aeruginosa Stämme, die verschiedene Immunotypen aufweisen, ein Stamm ausgewählt und dann durch widerholte Reinigungen abgeschwächt.

In diesem Vorgang wurde eine Prüfung für einen giftigen Pseudomonas aeruginosa Stamm GN 11189 (Episom Institut, Japan) ausgewählt, welcher eine Todesrate von 100% innerhalb von 3 Tagen nach einer intravenösen (oder intraperitonealen) Einspritzung von 2,0 x 106 Zellen von GN 11189 in eine männliche ICR Maus, die 20 bis 25 g wiegt, zeigt.

Jeder Stamm der oben ausgewählten Pseudomonas aeruginosa Stämme der einen verschiedenen Immuntyp hatte, wurde in einem flüssigen tryptischen Soja-Nährmedium unter denselben Zuständen wie im Beispiel 1 kultiviert und dann während 10 Minuten mit 6000 x g bei 4° zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag von Zellen wurde in 10 ml einer physiologischen Salzlösung suspendiert, wieder unter denselben Zuständen wie oben zentrifugiert, und dann mit einer frischen physiologischen Salzlösung verdünnt, um den Anteil Zellen auf 5 x 105, 5 x 106, 5 x 107 und 5 x 108 Zellen pro ml einzustellen. Jede Zellenlösung wurde einer Gruppe, bestehend aus 10 ICR Mäusen über die intravenöse (oder intraperitoneale) Route injiziert. Der Prüfgruppe wurde der GN 11189 Stamm mit einer Menge von 2,0 x 10 Zellen pro Prüftier verabreicht. Im Zeitpunkt, in welchem die Sterberate innerhalb 3 Tagen in der Prüfgruppe 100% beträgt, wurden Pseudomonas aeruginosa Stämme aseptisch von den ICR Mäusen/Maus, die bei der höchsten Zellenkonzentration überlebte(n) isoliert. Die isolierten Pseudomonas aeruginosa Stämme wurden wieder auf einem tryptischen Soja Agar Plattenmedium auf gestrichen. Nach dem wie oben erwähnten Verfahren zur Isolation von reinen Mikroorganismen wurde jeder Mikroorganismus Stamm in einem reinen Zustand isoliert.

Alle sieben (7) Arten der ersten abgeschwächten Mikroorganismen wurden gemäss dem oben beschriebenen Verfahren etwa 3 bis 7 Mal durch ICR-Mäuse hindurchgeführt bis der erwünschte LDso von mindestens 2,0 x 107 Zellen für jeden Mikroorganismus Stamm erreicht wurde. Der Sicherheitswert jedes schliesslich abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stammes, der als LDso ausgedrückt ist, ist in der nachfolgenden Tabelle 2 aufgelistet.

Tabelle 2:

Sicherheitswerte von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen, die gemäss der vorliegenden Erfindung ausgewählt sind.

Ausgewählte P. aeruginosa Stämme

Fisher-Devlin Immunotyp

Ursp. LDso

Endgültige LDso

Prüf-Stamm

CFCPA 10142

1

1,5 x 106

7,6 x 107

CFCPA 20215

2

1,4 x 106

2,7 x 107

CFCPA 30720

3

2,0 x 106

2,5 x 108

CFCPA 40057

4

3,7 x 106

4,5 x 107

CFCPA 50243

5

5,0 x 106

3,0 x 107

CFCPA 60534

6

1,5 x 106

2,0 x 107

CFCPA 70018

7

3,8 x 106

2,7 x 107

Prüf-Stamm

GN 11189

—

—

2,0 x 106

Alle sieben (7) Arten der Mikroorganismen, die oben erwähnt sind, zeigten den LDso Wert von mindestens 2,0 x 107 Zellen. Entsprechend konnte identifiziert werden, dass die abgeschwächten Mikroorganismen ausgewählt wurden.

Beispiel 3:

Identifikation von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen.

Sterilisiertes Cetrimid (w/v) wurde einem flüssigen Nährmedium (pH 7,2-7,4) zugegeben, welches durch eine Sterilisation mittels Dampf in einem Autoklaven bei 121°C während 15 Minuten bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,3% (v/v) vorbereitet wurde. Ein 10 ml Aliquot des damit erhaltenen Me-

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diums wurde antiseptisch entnommen und dieses in ein Reaktionsgefäss gegeben, welchem ein Tropfen jedes Pseudomonas aeruginosa Stammes, der in einem reinen Zustand gemäss Beispiel 2 oben isoliert worden war, eingegeben und dann einer Saatkultur bei 30 bis 37°C während 12 bis 16 Stunden ausgesetzt. Aus dem Reaktionsgefäss, in welchem das Wachsen des Mikroorganismus stattfindet, wurde 0,5 ml der Kulturlösung entnommen, auf einer Platte eines Cetrimid Agar Mediums als Pseudomonas aeruginosa Isolationsmedium aufgestrichen und dann wurde die Platte inkubiert. Die Kolonie, die zuerst als Pseudomonas aeruginosa durch Bildung von Pigment identifiziert wurde, wurde auf ein Pseudomonas aeruginosa Agar Medium überführt und inkubiert zur Detektion von Fluorescin (Proteos Pepton No. 3 (oxoid) 2%, Glycerol (bidestilliert) 1%, K2HPO4 (Wasserfrei) 0,15%, MgSÜ4 7H2O 0,15%, Agar 1,5% (w/v), pH 7.2), und dann ein Pseudomonas aeruginosa Agar Medium zum Detektieren von Pyocyanin (Pepton (Difco) 2%, Glycerol (bidestilliert) 1%, K2SO4 (wasserfrei) 1%, MgCb (wasserfrei) 0,14%, Agar 1,5% (w/v), pH 7.2), und dann wieder für eine morphologische Prüfung, Nährstoffbedarf und Oxidaseprüfung untersucht, um das Vorhandensein des Pseudomonas aeruginosa Stammes festzustellen. Die Typen der ausgewählten Pseudomonas aeruginosa Stämme wurden gemäss dem IATS Klassifikationssystem festgestellt, indem eine Pseudomonas aeruginosa Antigenapparatur (hergestellt durch Difco Laboratories, Detroit, Michigan/USA) verwendet wurde, und dann gemäss den Fisher Immuno-Serotypen klassifiziert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeschrieben.

Tabelle 3:

Kriterien zur Auswahl von Pseudomonas aeruginosa Stämmen und deren serotypischer und Schutzbereich

Geprüfte Sache

Wachstum auf isolierten Medium

Wachstum auf Pseudomonas aeruginosa Medium für Detektion

Morphologische Eigenschaften (Mikroskop)

Gram Verfärbung Oxidase Reaktion

Antigen-Antikörper Reaktion

(Erste ausgewählte Stämme CFCPA 20 215

CFCPA 60 534

CFCPA 10 142

CFCPA 30 720 CFCPA 30 721

Prüfergebnisse

Wachstum

Wachstum

Beide Enden sind rund und ein einziges polares Flagellum ist vorhanden

Gram Negativ

Positives Ansprechen (+) oder positiv-negatives Ansprechen (+)

Schutz für Fisher Typen 3 und 7 als Fisher Immunotyp 2 (O-Serotyp 7)

Schutz für Fisher Typen 3 und 7 als Fisher Immunotyp 6 (O-Serotyp 5)

Schutz für Fisher Typen 2 und 1 als Fisher Immunotyp 1 (O-Serotyp 4)

Schutz für Fisher Typ 6

als Fisher Immunotyp 3 (O-Serotyp 3)

Beispiel 4:

Physiologische Eigenschaften von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen.

(1) Für jede der sieben Arten der Pseudomonas aeruginosa Stämmen, die gemäss Beispiel 2 abgeschwächt worden sind, wurden Wachstumsraten abhängig von verschiedenen pH Werten bestimmt. Jeder Mikroorganismus Stamm wurde in 50 ml eines tryptischen Soja-Mediums mit einem pH-Wert von 7,2 eingegeben und danach bei 37°C während 12 bis 16 Stunden unter aerobischen Zuständen mit einer Rührzahl von 200 rpm vor-inkubiert. Jeder vor-inkubierte Bakterienmassen-Stamm wurde in 500 ml jeweils eines frischen tryptischen Soja-Mediums von pH 3,0; pH 5,0; pH 7,0 und pH 9,0 mit der endgültigen Konzentration von 1% (v/v) eingegeben und dann in Fermentoren bei 37° und den selben Zuständen wie oben inkubiert. Während dieser Zeitspanne wurde von jedem Kulturmedium in Inten/allen von 2 Stunden eine Probe entnommen, und dann wurde die Konzentration der Bakterienmasse ermittelt, indem die Absorbanz der Probe bei 600 nm mittels eines Spectrophotometers gemessen wurde. Die Ergebnisse davon sind in der folgenden Tabelle 4 beschrieben.

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Tabelle 4:

Mikroorganismus Wachstumsraten abhängig vom pH Wert

Stämme pH 3,0 pH 5,0

pH 7,0

pH 9,0

CFCPA 10 142

- +++

+++

+++

CFCPA 20 215

- +++

+++

+++

CFCPA 30 720

- +++

+++

++

CFCPA 40 047

- +++

+++

++

CFCPA 50 243

- +++

+++

++

CFCPA 60 534

- +++

+++

++

CFCPA 70 018

- +++

+++

+++

Anmerkung: + Wachstum,

- Kein Wachstum

Wie aus der Tabelle 4 ersichtlich ist, sind die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung und stark sauren Bedingungen nicht gewachsen, zum Beispiel bei pH 3,0, zeigten jedoch weitgehend identische oder ähnliche Wachstumsraten unter Mediumzuständen bei pH 5,0 bis pH 9,0. Somit können in der vorliegenden Erfindung alle 7 Arten des Mikroorganismus innerhalb eines breiten pH Bereiches sehr gut wachsen.

(2) Die Wachstumsraten der Pseudomonas aeruginosa Stämme wurden gemäss desselben Vorgehens wie in (1) oben gemäss Temperaturvariationen bestimmt. Jeder der 7 Arten der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme wurde in 50 ml eines tryptischen Soja-Mediums mit einem pH Wert von 7,0 eingegeben und dann während 12 bis 16 Stunden bei 37°C unter aerobischen Zuständen mit einem Rührmass von 200 rpm vor-inkubiert. Jeder der vor-inkubierten Stämme wurde in 500 ml eines tryptischen Soja-Mediums mit einem pH Wert von 7,0 eingegeben und dann in Fermentoren inkubiert, die unter denselben Zuständen wie oben bei unterschiedlichen Temperaturen von 25°C, 30°C, 37°C und 42°C gehalten wurden. Während dieser Zeitspanne wurde die Wachstumsrate in jedem Fermentor bestimmt, indem die Absorbanz der Kulturlösung bei 600 nm mittels eines Spectrophotometers gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 beschrieben.

Tabelle 5:

Wachstumsraten von Mikroorganismen abhängig von T emperaturvarianten

Stämme

25°C

30°C

37°C

42°C

CFCPA 10 142

+

+++

+++

+

CFCPA 20 215

+

+++

+++

+

CFCPA 30 720

++

+++

+++

+

CFCPA 40 057

+

++

+++

+

CFCPA 50 243

+

++

+++

+

CFCPA 60 534

++

+++

+++

+

CFCPA 70 018

+

++

+++

+

Anmerkung: + Wachstum, - Kein Wachstum

Wie aus der Tabelle 5 ersichtlich ist, zeigten alle 7 Arten der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme das beste Wachstum bei 37°C und zeigten auch das gute Wachstum bei 30°C, 25°C. Jedoch zeigte jeder der 7 Arten der Pseudomonas aeruginosa Stämme eine verhältnismässig langsame Wachstumsrate relativ zur Wachstumsrate bei den anderen Temperaturen.

(3) Das folgende Experiment war zum Feststellen der Auswirkung einer Kohlenstoffquelle auf die Wachstumsrate von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen. Jede der 7 Arten der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme wurde in 50 ml tryptisches Soja-Medium mit einem pH Wert von 7,0 eingegeben und danach bei 37° während 12 bis 16 Stunden unter aerobischen Zuständen mit einem Rührmass von 200 rpm inkubiert. Danach wurde das Kulturmedium mit 6000 x g bei 4°C während 10 Minuten unter aseptischen Bedingungen zentrifugiert, um die Bakterienmasse zu ernten, die danach in 10 ml einer physiologischen Saline resuspendiert wurde. Jeweils 50 nl der erhaltenen Mikroorganismus-Suspensionen, die oben erhalten wurde, wurde jeweils in 5 ml eines M 9 Mediums (Na2 HPO4 7H2O 12,8 g; KH2 PO4 3 g; NaCI 0,5 g; NH4CI 1h) eingegeben, das verschiedene Kohlenstoff11

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quellen (wie unten ersichtlich) enthielt und dann während 12 Stunden inkubiert. Dann wurde für jede Kulturlösung das Ausmass des Wachstums des Mikroorganismuss durch ein Messen der Absorbanz bei 600 nm festgestellt.

Tabelle 6:

Wachstumseigenschaften von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen, abhängig von der Kohlenstoffquelle

Kohlenstoff Quellen

P. aeruginosa Stämme

CFCPA CFCPA 10142 20215

CFCPA 30720

CFCPA 40057

CFCPA 50243

CFCPA 60534

CFCPA 70018

Glukose

+++

+++

++

+++

+++

+++

+++

Xylose

-

-

-

-

-

-

-

Mannitol

++

++

++

++

++

++

++

Galaktose

-

-

±

-

±

-

-

Sorbitol

-

-

-

-

-

-

-

Inosital

-

-

-

-

-

-

-

Maltose

-

-

-

-

-

-

-

Sucrose

-

-

-

-

-

-

-

Arabinose

-

-

-

-

-

-

-

Mannose

-

±

±

-

±

±

-

-Alanin

-

-

-

-

-

-

-

Salze

-

-

-

-

-

-

-

Anmerkung : + Wachstum, - Kein Wachstum

Wachstumseigenschaften von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen abhängig von Kohlenstoffquellen zeigten ein Muster, das weitgehend ähnlich den Wachstumseigenschaften allgemeiner Pseudomonas aeruginosa Stämmen in Abhängigkeit von Kohlenstoffquellen ist. Es sollte jedoch vermerkt werden, dass Pseudomonas aeruginosa als allgemein nicht Mannose gebraucht, angegeben wurde, abgeschwächtes Pseudomonas aeruginosa gemäss der vorliegenden Erfindung ein kleines Wachstum im Mannose enthaltenden Medium zeigte.

Wie aus dem obigen ersichtlich ist, können abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung in einem herkömmlichen Medium inkubiert werden, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Zusammensetzungen, Aminosäuren, Vitamine und andere Nährstoffe enthält, unter aerobischen Bedingungen bei ausgewählter Temperatur, pH-Wert, etc. inkubiert werden kann, um eine bakteriologische Masse zu erhalten. Zellenwandproteine, die aus der sich ergebenden Bakterienmasse ergeben, werden zur Herstellung von Pseudomonas aeruginosa Impfstoffen verwendet.

Als Kohlenstoffquelle zur Inkubation abgeschwächter Pseudomonas aeruginosa Stämmen können verschiedene Kohlenstoff hydrate, beispielsweise Glukose, Mannitol, Fructose, etc., verschiedene organische Säuren, beispielsweise Essigsäure, Pyruvicsäure, Milchsäure und ähnliches verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene organische und anorganische Ammoniumsalze, Peptone, Hefeextrakte, Kasein-Hydrolysate und die weiteren Stickstoff enthaltenden Substanzen verwendet werden. Als anorganische Zusammensetzungen können Magnesiumsulfate, Kalziumkarbonate, Ferrosulfate, Kupfersulfate, Zinksulfate und Kaliumdihydrosenphosphate und ähnliches verwendet werden. Die Inkubation wird vorteilhaft bei 25 bis 30° C unter aerobischen Zuständen durchgeführt, beispielsweise mittels einer Plattenkultur oder einer Flüssigkeitskultur, beispielsweise einer Schüttelkultur oder Belüftungsschleuderkultur. Der pH-Wert des Mediums wird während der Inkubation vorteilhaft auf pH 5 bis 9 gehalten. Vorteilhaft wird die Bakterienmasse, die beim Zentrifugieren der Kulturlösung erhalten wurde, die während 12 bis 16 Stunden inkubiert wurde, als Ausgangsmaterial zur Herstellung der nachstehend beschriebenen Impfstoffe verwendet.

geigpiel

Inkubation von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen.

(1) In einem 5L Fermentor wurde die Bakterienmasse von Pseudomonas aeruginosa, die gemäss Beispiel 2 erhalten wurde, wie folgt zur Massenproduktion inkubiert. 2,5L der Mediumlösung, die durch ein Auflösen von 30 g des tryptischen Soja-Mediums pro 1 I destilliertes Wasser erhalten wurde, wurde

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auf pH 7,2 eingestellt, sterilisiert und in den 5 L Fermentor eingegeben. Die Inkubationszustände waren: Inkubationstemperatur war 37°; Belüftungsrate war 1 wm; eingegebene Menge der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Bakterienmasse, die nach Beispiel 2 für Kulturlösung erhalten wurde, war 5% (v/v); und das Rührmass wurde bei 100 rpm während den ersten 2 Stunden gehalten, und danach wurde die Inkubation bei einem festen Rührmass von 600 rpm während 16 Stunden fortgesetzt. Obwohl die Mengen der erhaltenen Bakterienmasse etwas unterschiedlich waren, abhängig von der Art des Pseudomonas aeruginosa Stammes, war die durchschnittliche Ausbeute ungefähr 8 g (Trockengewicht) Bakterienmasse pro Liter Kulturlösung.

(2) Jeder der sieben Typen der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme wurde unter denselben Inkubationszuständen wie oben in (1) inkubiert, mit der Ausnahme, dass das spezielle Medium zum Kultivieren des Pseudomonas aeruginosa, welches aus Glukose (5g/l), Pepton (15b/l), MgSÛ4 (0,5g/l), CaC03 (5g/l), KH2PO4 (1g/l), FeS04 (5mg/l), CUSO4 (5mg/l) und ZUSO4 (5mg/l) besteht, als ein Medium verwendet wurde. Mit diesem speziellen Medium wurden ungefähr 10,4 g bis 10,5 g (Trok-kengewicht) Bakterienmasse für jeden Mikroorganismus-Stamm erhatten. Somit kann die Verwendung dieses speziellen Mediums die Ausbeute von Bakterienmasse erreichen, die mindestens 30% (basiert auf Trockengewicht) höher als diejenige in einem tryptischen Soja-Medium ist.

Beispiel 6:

Teilweise Reinigung von Zellenwandproteinen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen.

Zur Herstellung von Impfstoffen gegen Pseudomonas aeruginosa wurden Zellenwandproteine von jeder der sieben Arten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen teilweise gereinigt. Nachfolgend wird nun der Typ 3 Stamm, d.h. CFCPA 30 720 (KCCM 10 031) als typisches Beispiel verwendet. Jedoch können die anderen abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme ebenfalls demselben Verfahren, wie dem nachfolgenden Reinigungsverfahren, unterworfen werden, um die teilweise gereinigten Zellenwandproteine zu erhalten.

2,5 L des speziellen Mediums, das im Beispiel 4 (23) oben verwendet wurde, wurde in einen 5 L Fermenter eingebracht und dann während 12 bis 16 Stunden inkubiert, währenddem dieselben Inkubationszustände wie oben beibehalten wurden. Nach der Beendigung der Inkubation wurden 2,5 L der Kulturlösung mit 6000 xg bei 40°C während 20 Minuten zentrifugiert, um das Supematant zu entfernen. Die niedergeschlagenen Zellen wurden in einer Phospatbufferlösung (Na2HP04 1,15 g; KCl 0,2 g; KH2PO4 0,2 g; NaCI 8,766 g pro Liter; pH 7,2) bei 4°C resuspendiert, wieder zentrifugiert und dann mit derselben Phosphatbufferlösung gewaschen. 130 g der damit erhaltenen Zellen wurden 3 Volumen (etwa 390 ml) Azeton in Bezug auf das ursprüngliche Nasszellenvolumen zugegeben und dann wurde das Gemisch bei 4° während 12 Stunden oder mehr stehen gelassen. Das Azeton wurde von der niedergeschlagenen Zelle entfernt und 2 Volumen (etwa 260 ml) frisches Azeton in Bezug auf das ursprüngliche Nasszellenvolumen wieder dem Rückstand zugegeben. Das sich ergebende Gemisch wurde während 5 bis 10 Minuten umgerührt und dann während 20 Minuten bei 8000 x g zentrifugiert. Das supernatante Azeton wurde entfernt und dasselbe Volumen Azeton dem Rückstand zugegeben. Das Gemisch wurde in einer wie oben beschriebenen Weise umgerührt und zentrifugiert, um das Supematant zu entfernen. Die niedergeschlagenen Zellen wurden bei Raumtemperatur auf einer Platte getrocknet, um das Azeton zu entfernen. Die getrockneten Mikroorganismen wurden resuspendiert, indem 250 ml derselben Phosphatbufferlösung wie oben zugegeben wurde, so dass die endgültige Konzentration auf 10% (v/v) eingestellt werden kann. Das sich ergebende Gemisch wurde mit einem Homogenisator bei einem Mass von 500 bis 1500 rpm während 10 Minuten behandelt, währenddem die Temperatur auf 4°C gehalten wurde, um die Zellenwandproteine zu extrahieren. Die gewonnene Suspension wurde während 30 Minuten mit 8000 bis 10,000 x g zentrifugiert, um das Supematant zu erhalten. Die niedergeschlagenen Zellen wurden abgetrennt, wieder suspendiert, indem dasselbe Volumen Phosphatbufferlösung hinzugegeben wurde und dann einer zweiten Extraktion unter denselben Bedingungen wie bei der obigen, ersten Extraktion ausgesetzt, um das Supematant zu erhalten.

Indem dieselben Bedingungen wie beim ersten Extrahierverfahren beibehalten wurden, wurden die Zellenwandproteine wiederholt 5 bis 6 mal extrahiert, wobei Sorge getragen wurde, die Zellen nicht zu zerstören (Lysierung). Die Zerstörung der Zellen kann durch ein Messen eines spezifischen Proteins als cytoplasmische Anzeigesubstanz festgestellt werden, d.h. Lactat Dehydrogenase oder Hexokinase. Die extrahierten Supernatante, von denen jedes geprüft wurde, um sicherzustellen, dass die Zellenwandproteine ohne einen Einschluss von cytoplasmischen Proteinen, Lactat-Dehydrogenase und Hexokinase hatten, wurden gesammelt, gerührt und dann endlich rezentrifugiert mit 10,000 x g bei 4°C während 30 Minuten, um ein reines Supematant zu erhalten. Die damit erhaltene Proteinlösung bestand ausschliesslich aus reinen Zellenwandproteinen und wurde mittels quantitativen Proteinprüfungen so eingestellt, dass die Proteinkonzentration bei einem Stand von 1 mg/ml bis 2 mg/ml gehalten wurde. Weiter wurde die Reinheit der Proteinlösung mittels einer 10 bis 15% konzentrierten Gradientelektrophorese festgestellt. Als Ergebnis konnte identifiziert werden, dass das Vorhandensein der erwünschten Zellenwandproteine, die ein Molekulargewicht im Bereich von 10,000 bis 10,000 hatten, da war (siehe Fig. 1).

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Beispiel 7:

Reine Reinigung der Rohproteine.

Das nachfolgende Verfahren wurde durchgeführt, so dass die rohe Zellenwandproteinlösung in der Konzentration von 1 bis 2 mg/ml gereinigt würde, um nur die wirksamen Komponenten zu enthalten.

2 bis 2,5 I der rohen Zellenwandproteinlösung wurde zuerst einem Molekulargewicht von 100,000 abscheidenden Membranfilter im Pellicon Cassetten System ausgesetzt, um Proteinmoleküle zu entfernen, die ein Molekulargewicht von mehr als 100,000 aufweisen. Gemäss diesem Verfahren wurden Proteine mit einem Molekulargewicht unter 100,000 als Filtrat gewonnen und Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als 100,000 wurden dauernd im Kreislauf gehalten, um von den kleinen Molekülen abgeschieden zu werden, die ein Molekulargewicht unter 100,000 hatten.

Als ein Ergebnis wurde die Proteinlösung bei 10 bis 20% des ursprüunglichen Volumens konzentriert und aufeinanderfolgend gewaschen mit 20 bis 25 I (die zehnfache Menge des ursprünglichen Volumens der Proteinlösung) einer sterilisierten Phosphatbufferlösung (Ma2HP04 1,15g; KCl 0,2 g; KH2PO4 0,2 g; NaCI 8,766 g pro Liter) um 90% oder mehr der Proteine zu gewinnen, die ein Molekulargewicht unter 100,000 hatten. Die Proteine, die ein Molekulargewicht unter 100,000 hatten und als das Filtrat abgetrennt waren, wurden einem Membranfilter, der ein Molekulargewicht von 10,000 ausscheidet, im selben System zugeführt, um Proteine, die ein Molekulargewicht von weniger als 10,000 haben und andere Verunreinigungen auszuscheiden, und gleichzeitig die Proteine, die ein Molekulargewicht von 10,000 bis 100,000 haben, zu einer Konzentration von 1 mg/ml zu konzentrieren.

Schliesslich wurde das Supematant ultrazentrifugiert, um Lipopolysaccharid (LPS) zu entfernen und mit den Zellenwänden in Zusammenhang stehende Fragmente, die möglicherweise im Supematant, das oben erhalten wurde, in Spurenmengen vorhanden sind, zu entfernen. Ultrazentrifugieren wird mit 180,000 x g bis 200,000 x g während 3 Stunden bei 4°C durchgeführt. Nach dem Entfernen der Niederschläge wurde das erhaltene Supematant durch Filtration durch einen 0,2 um Filter sterilisiert, um 250 bis 260 mg Proteinkomposition zur Verwendung in Impfstoffen für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion zu erhalten.

Beispiel 8:

Reinigung von Zellenwandproteinen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen die andere Immunotypen haben.

Die verbleibenden sechs Arten der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung, d.h. CFCPA 10141, CFCPA 20215, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 und CFCPA 70018 wurden gemäss demselben Verfahren wie das, das für die Inkubation und das Reinigen der Mikroorganismen zur Herstellung der Impfstoffzusammensetzung für den CFCPA 30720 Pseudomonas aeruginosa Stamm durchgeführt wurde, das in Beispiel 5, Beispiel 6 und Beispiel 7 beschrieben ist. Die damit letztendlich erhaltenen Pseudomonas aeruginosa Impfstoffzusammensetzungen zeigten dasselbe Bandmuster wie die CFCPA 30720 Impfstoffzusammensetzung, im 10 bis 15% Konzentrationsgradienten SDS-PAGE. Zusätzlich, als eine Folge des Vergleiches mit einem standard Molekulargewichtsanzeiger konnte festgestellt werden, dass alle Proteine, die in Impfstoffzusammensetzungen enthalten waren, ein Molekulargewicht im Bereich von 10,000 bis 100,000 hatten.

Beispiel 9:

Prüfung des Kreuz-Schutzvermögens mit kombinierten Antigenen.

Die Zellenwandproteine, die von jedem abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm nach den Abtrennungs- und Reinigungsschritten gemäss den in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Beispielen erhalten wurden, wurden einer sechs Wochen alten männlichen ICR Maus mit einem Gewicht von 23 bis 25 g in einer Menge von 0,2 mg/kg intraperitoneal verabreicht, um das Tier immun zu machen. Jede Gruppe bestand aus 10 bis 15 Versuchstieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde von 2 bis 3 Mäusen pro Gruppe Blut zur ELISA (Enzyme-Iinked immunosorbent assay) entnommen. Für die verbleibenden ICR Mäuse wurde der wild-artige Pseudomonas aeruginosa Stamm entsprechend des jeweiligen Immunotyps in einer Menge von 10- bis 50mal des erstweiligen LD50 Wertes für jeden Mikroorganismus Stamm, der in Tabelle 2 in Beispiel 2 aufgelistet ist, eingespritzt. Die Schutzwirkung gegen jeden Pseudomonas aeruginosa Stamm wurde während einer Woche kontinuierlich überwacht. Als Folge zeigten alle Versuchsgruppen eine Schutzwirkung gegen die entsprechenden Pseudomonas aeruginosa Stämme, und die ELISA's von allem dem gesammelten Blut zeigten ebenfalls gute positive Werte, welches eine Verbesserung des immunologischen Ansprechens bedeutet.

In der vorliegenden Erfindung, zum Herstellen von Impfstoffen, die die allgemeine Schutzwirkung gegen Infektionen aufweisen, die durch jeden Typ von Pseudomonas aeruginosa Stämmen bewirkt sind, wurden vier Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen (drei Typen von Pseudomonas aeruginosa Stämmen, die meistenteils in Infektionen des menschlichen Körpers ermittelt werden und ein Typ des Pseudomonas aeruginoa, der schwierig zu überwinden ist, wenn man mit ihm angesteckt war, z.B. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534) wurden behandelt,

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um Zellenwandproteine zu erhalten, die in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen kombiniert waren und dann geprüft wurden bezüglich des Kreuzschutzvermögens gegen jeden Immunotyp der Pseudomonas aeruginosa Stämme.

Zellenwandproteine, die von den vier Typen der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen, wie oben ausgeführt, abgetrennt worden waren, wurden in einem Verhältnis äquivalenter Mengen (1:1:1:1), basiert auf dem Gewicht, kombiniert. Die kombinierten Zellenwandproteine wurden männlichen ICR Mäusen intraperitonal verabreicht, um die Versuchstiere zu immunisieren. Der Kontrollgruppe wurde 0,3 ml einer Phosphatbufferlösung (Na2 HPCU 1,15 g; KCl 0,2 g; KH2PO4 0,2 g; NaCI 8,766 g pro Liter) gegeben. Eine Woche nach der Immunisierung wurden jeder der Versuchsgruppe, die mit Pseudomonas aeruginosa Impfstoff immunisiert worden war, und der Kontrollgruppe, die mit der Phosphatbufferlösung immunisiert worden war, intraperitoneal Pseudomonas aeruginosa in fünf (5) verschiedenen Konzentrationen, verdünnt in einer Serie von 10 Malen von 1 x 108 Zellen bis 1 x 104 Zellen, verabreicht, und nach einer Woche wurde die Zahl Überlebender der Versuchstiere gezählt, um den Wirksamkeitsindex (El) zu berechnen. Die hervorgegangenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 aufgelistet, in welcher der Wirksamkeitsindex definiert ist als der Wert von LD50 in der Versuchsgruppe dividiert durch den LD50 in der Kontrollgruppe. Wie aus der Tabelle 7 ersichtlich ist, hat ein Impfstoff, der aus Zellenwandproteinen besteht, die von 4 Arten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen erhalten wurden, d.h. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534 einen El-Wert von 3,0 bis 18 oder mehr gegenüber jedem Innunotypus der Pseudomonas aeruginosa Stämmen. Daher, wenn in Betracht gezogen wird, dass Impfstoffe, die den El-Wert von mindestens 2 aufweisen als eine gute immunologische Wirkung habend betrachtet werden, ist es ersichtlich, dass der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung eine gute Schutzwirkung gegen Infektionen zeigt, die durch irgend einen der Typen der sieben (7) Arten von Pseudomonas aeruginosa Stämmen bewirkt werden.

Tabelle 7:

Kreuz-Schutzwirkungsprüfung für Pseudomonas aeruginosa Impfstoff, der durch Venwendung von vier (4) unterschiedlichen Spezies von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen hergestellt wurde gegen jeden Typ von Mikroorganismen

Probenstamm

Immunotyp

Serotyp

El-Wert

Mutterstamm von CFCPA 10142

1

06

9,5

Mutterstamn von CFCPA 20215

2

011

13

Mutterstamm von CFCPA 30720

3

02

18

Mutterstamm von CFCPA 40057

4

01

3

Mutterstamm von CFCPA 50242

5

010

4,5

Mutterstamm von CFCPA 60534

6

07

8,4

Mutterstamm von CFCPA 70018

7

05

7

Gemäss dem Vorgehen wie oben erwähnt, mit der Ausnahme, dass das Gemisch der hergestellten Zellenwandproteine von 3 Typen abgeschwächter Pseudomonas aeruginosa Stämmen CFCPA 10142, CFCPA 30720 und CFCPA 20215 (Gruppe I) stammte, und das Gemisch von Zellenwandproteinen von allen 7 Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen (Gruppe II), wobei alle die Zellenwandproteine in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen vorhanden sind, an Stelle des Gemisches aus 4 Arten Proteine verwendet wurde, wurde die Kreuz-Schutzwirkung dieser zwei Arten von Impfstoffen gegen Infektion durch jeden Pseudomonas aeruginosa überprüft. Die Ergebnisse dessen sind in der Tabelle 8 beschrieben.

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Tabelle 8 : Kreuz-Schutzwirkungsprüfung für Impfstoffe, die von 3 Typen (Gruppe I) oder 7 Typen (Gruppe II) von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen stammen gegen jeden Typ von Mikroorganismen

ID50 in Versuchsgruppe

EI Wert ( )

Probenstaxrm LD5q in Kantrollgruppe

Gruppe I Gruppe II

Mutterstanm von

CFCPA

10142

14,3

9,2

Mutterstanm von

CFCPA

20215

12,0

10,7

Mutterstanm

VC«

CFCPA

30720

18,0

15,0

Mutterstanm von

CFCPA

40057

2,5

8,3

Mutterstanm von

CFCPA

50243

4,0

10,6

Mutterstanm von

CFCPA

60534

3,7

9,7

Mutterstanm von

CFCPA

70018

2,8

12,9

Wie aus den obigen Versuchsergebnissen ersichtlich ist, zeigt dieser Impfstoff, weil der aus gemischten Proteinkomponenten bestehende Impfstoff gemäss der Erfindung aus Zellenwandproteinen zusammengesetzt ist, die aus mindestens drei (3) verschiedenen Arten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen gebildet ist, die voneinander verschiedene Immunotypen zeigen, eine ausgezeichnete Schutzwirkung gegen jeglichen Immunotyp von Pscheudomonas aeruginosa im Vergleich mit nur einer Art eines allgemeinen Antigens. Das heisst, obwohl der Wirksamkeitsindex des Impfstoffes gemäss der vorliegenden Erfindung sich mit der Art und Anzahl der ausgewählten Mikroorganismen aus abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen, Mischverhältnis der daraus gewonnenen Zellenwandproteine, immunologisches Vorgehen und Verfahren, etc. ändert, kann bestätigt werden, dass der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung gegen alle Pseudomonas aeruginosa Stämme wirksam ist, die gegenwärtig in Spitälern und Patienten vorkommen.

Beispiel 10:

Toxiologische Prüfung für Zellenwandproteine

Um einen zusammengesetzten Impfstoff für die Prophylaxe gegen eine Infektion herzustellen, die durch Pseudomonas aeruginosa bewirkt wird, muss die Sicherheit der Zellenwandproteine selbst, die als zusammengesetzter Impfstoff verwendet wird, und auch die Sicherheit der Mikroorganismen, die im Beispiel 2 beschrieben sind, selbst sichergestellt werden. In diesem Beispiel wurden Zellenwandproteine teilweise gereinigt und dann bezüglich ihrer Sicherheit in einem Versuchstier, d.h. Maus, geprüft. Insbesondere wurde jede der abgeschwächten Mikroorganismen mit einem tryptischen Soja-Medium als Kulturmedium inkubiert, in einem 5L Fermenter und danach gemäss den Vorgehen behandelt, die in den

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Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben sind. Die Supernatanten der Zellenwandproteine, die aus den abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen extrahiert worden waren, wurden zusammengenommen, wieder mit 10,000 x g bei 4°C während 30 Minuten zentrifugiert, um feine Partikel, die möglicherweise in der Lösung vorhanden waren, zu entfernen. Die sich ergebenden Zellenwandproteine wurden durch einen Amicon Membranfilter gefiltert, um ein Gemisch von Zellenwandproteinen zu erhalten, die ein Molekulargewicht im Bereich von 10,000 bis 100,000 haben, welches zu einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml konzentriert war, und dann mit einem 0,2 mm Filter sterilisiert, um eine Proteinquelle für ein toxikologisches Prüfen zu erhalten.

In der toxikologischen Prüfung waren die Versuchstiere männliche ICR Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g. Der Prüfgruppe wurde die Proteinquelle intravenös in einer Menge von 20 mg/kg und 100 mg/kg eingespritzt. Der Kontrollgruppe wurde eine physiologische Salzlösung in einer Menge von 25 ml/kg verabreicht. Wie aus der Tabelle 9 und der beigelegten Fig. 2 ersichtlich ist, zeigte die Prüfgruppe eine kleine Beschränkung der Gewichtszunahme am ersten Tag nach der Verabreichung, zeigte jedoch am und nach dem zweiten Tag ein normales Wachstum und keine besonderen Symptome. Zusätzlich, sogar am und nach dem 7. Tag konnten in jedem Organ keine besonderen Änderungen oder Symptome gefunden werden.

Tabelle 9:

Akute toxikologische Prüfung für eine Zellenwandproteinquelle aus abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen

Gruppe

Dosis

Prüflinge

Überleben/ Prüflinge

Bemerkungen

Prüfgruppe A

20 mg/kg

20

20/20

Keine Änderung des Körpergewichtes

Prüfgruppe B

100 mg/kg

15

15/15

Änderung des Körpergewichtes nur am ersten Tag

Kontroll-Gruppe

Physiologische Salzlösung

15

15/15

Keine Änderung des Körpergewichtes

Beispiel 11:

Feststellung der Antigenizität von Zellenwandproteinen.

Zellenwandproteine, die durch eine teilweise Reinigung von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen in derselben Weise wie in Beispiel 10 erhalten wurden, wurden als Antigen verwendet und wurden ICR Mäusen in einer Menge von 0,1 mg/kg oder 0,2 mg/kg intravenös eingespritzt, um die Versuchstiere zu immunisieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde jeder Maus der Gruppe von Mäusen eine gewisse Menge Blut entnommen, das Serum wurde vom aufgesammelten Blut getrennt und die Bildung der Antikörper wurde gemäss dem ELISA-Verfahren (J. Clin. Microbiol. 15, 1054-1058, 1982) bestimmt.

Zuerst wurden 100 des Antigens, das im Beispiel 10 hergestellt wurde, auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml in einem Überzugsbuffer (0,05M Karbonatbufferlösung, bestehend aus NaHC03 2,85 g; NaaCOa 1,7 g; H2OI, pH 9,6) jedem Behältnis einer 96-Behältnis Mikroplatte zugegeben und dann entweder bei Raumtemperatur während 2 Stunden oder bei 4°C während 12 bis 14 Stunden reagieren lassen, so dass das Protein an der Platte anhaftet.

Nach dem Entfernen der wässrigen Lösung wurde jedem Behältnis der Platte 200 nl von Bovine Serumalbumin (BSA) zugegeben und dann während einer Stunde reagieren gelassen, um den verbleibenden Teil in den Behältnissen, der nicht mit dem Protein verbunden war, zu blockieren.

In dieser Prüfung wurde das Serum einer nicht immunisierten Maus als Antikörper für die Kontrollgruppe verwendet. Nach der Beendigung der Reaktion wurde die Platte wieder 5- bis 6mal mit einer Phosphat Bufferlösung (pH 7,0-7,2) gewaschen und 100 jil eines zweiten Antikörpers, d.h. Hasen-anti Maus Ig-Peroxidase Conjugat, jedem Behältnis zugegeben und während einer Stunde bei normalen Temperaturen reagieren gelassen.

Danach wurde die Platte stark 7 Male oder mehr mit derselben Phosphatbuffer Waschlösung (pH 7,0-7,2) gewaschen. Als ein Substrat wurden 50 nl von Ortho-Phenylene diamine Dihydrochloride, in einer Citrat-Phosphat-Bufferlösung (0,1 M Citrat-Phosphatbuffer, pH 5,0) auf eine Konzentration von 0,3 bis 0,4 mg/ml eingestellt, jedem Behältnis der Platte zugegeben und während 20 Minuten ohne Licht reagieren gelassen. Dann wurden jeweils 50 nl 1N-schweflige Säure zugegeben, um die Reaktion in jedem Behältnis zu stoppen. Dann wurde für jede Reaktionslösung die Absorbanz bei 490 nm mittels einem Spectrophotometer gemessen.

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Tabelle 10:

Bildung von Antikörpern gegen Zellenwandproteine jedes Mikroorganismus (490 nm)

Antigen Gehalt (mg/kg)

Antikörper Verdünnung

1/5

1/25

1/125

1/625

1/3125

1/15625

Kontrollgruppe

0,16

0,15

0,29

0,47

0,41

0,43

Prüfgruppe

0,1

0,29

0,25

0,32

0,52

1,1

1,2

0,2

0,76

0,67

0,50

0,49

1,3

1,4

Aus der Tabelle 10 ist ersichtlich, dass bei der Prüfgruppe die Verabreichung von 0,1 oder 0,2 mg/kg Antigen eine Immunität ergibt, die 2- bis 5mal höher als die in der Kontrollgruppe ist.

Beispiel 12:

Herstellung von Immunoglobulin für Pseudomonas aeruginosa.

Die gemäss dem Beispiel 7 erhaltene Proteinlösung wurde Hasen verabreicht, um das entsprechende Immunoglobulin zu erzeugen. Obwohl das Zellenwandprotein, das vom abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm CFCPA 30720 erhalten wurde, als typisches Beispiel verwendet wurde, kann dasselbe Verfahren bei den anderen abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen angewendet werden.

0,5 bis 1 ml enthaltend 100 bis 200 ug von Zellenwandprotein) der Zellenwandproteinlösung, die vom CFCPA 30720 Stamm im Beispiel 7 erhalten wurde, wurde zum dreimaligen Impfen von Albinohasen mit Intervallen von 7 Tagen verwendet. Das Blut wurde in regelmässigen Intervallen von jedem der Hasen entnommen und das Serum abgetrennt. 100 ml des abgetrennten Hasenserum wurde mit 300 ml destilliertem Wasser gemischt und dem Gemisch wurden 500 g (Nassgewicht) DEAE-Zellulose bei 4°C zugegeben. Das sich ergebende Gemisch wurde während einer Stunde bei 4°C gründlich geschüttelt, stehen gelassen und dann wurde das Supematant abgetrennt und entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde dreimal mit jeweils 200 ml einer 0,01 M Phosphat gebufferten Lösung (Na2HPÛ4 1,15 g; KH2PO4 0,2 g; KCl 0,2 g; NaCI 8,766 g pro Liter, pH 8,0) gewaschen um 600 mg Immunoglobulin IgG zu erhalten, das eine Reinheit von 96% oder mehr hat.

Beispiel 13:

Therapeutische Auswirkung des Immunoglobulins auf eine Pseudomonas aeruginosa Infektion.

Für die Immunoglobuline gegen Pseudomonas aeruginosa Stämme, die im obigen Beispiel 12 erhalten wurden, wurden ihre therapeutischen Auswirkungen auf eine Pseudomonas aeruginosa Infektion gemäss der folgenden Weise geprüft. Nachfolgend wurden 10 Mäuse pro jede Gruppe verwendet.

1,0-3,0 x 106 Zellen jedes der pathogenischen Pseudomonas aeruginosa Stämme der Fisher immunotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden intraperitonisch in jede Maus injiziert, um eine Pseudomonas aeruginosa Infektion zu bewirken. Nach 2 bis 6 Stunden nach der Injektion wurde das gereinigte Immunoglobulin für jeden Stamm in jede Maus intravenös injiziert in einer Menge von 0,1 bis 2 mg pro Maus, um deren therapeutische Wirkung zu prüfen.

In der Kontrollgruppe wurden 0,5 ml einer physiologischen Salzlösung zur Injektion anstelle des Immunoglobulins injiziert. In dieser Prüfung waren die verwendeten Immunoglobuline CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, oder ein Gemisch dieser vier Arten Globuline im Verhältnis von äquivalenten Mengen.

Als Ergebnis zeigte die Kontrollgruppe, die nur die physiologische Salzlösung erhalten hat, eine Sterblichkeitsrate von 50% oder mehr innerhalb 48 Stunden und 100% nach 72 Stunden. Hingegen zeigte die Versuchsgruppe, die das entsprechende Immunoglobulin erhielt, eine Überlebensrate von 80% oder mehr nach 72 Stunden. Somit konnte demonstriert werden, dass das Immunoglobulin für die Behandlung einer Infektion wirksam ist, die durch pathogenische Pseudomonas aeruginosa Stämme bewirkt wird, die den entsprechenden Fisher Immunotyp haben. Jedoch hatte kein einziges Immunoglobulin viel Wirkung gegen eine Infektion, die durch pathogenische Pseudomonas aeruginosa Stämme bewirkt ist, die Fisher Immunotypen 4 und 5 haben.

Andererseits zeigte die Gruppe Mäuse, die die Kombination von 4 Arten des Immunoglobulins erhielten, im Gewichtsverhältnis 1:1:1:1 eine überlegene therapeutische Wirkung, sogar auf Fisher 4 und 5 Typen der Pseudomonas aeruginosa Stämme auf Grund ihrer Kreuz-Reaktivität. Entsprechend kann die kombinierte Immunoglobulin-Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung als ein therapeutischer Stoff, der für Infektionen wirksam ist, gebraucht werden, die durch Pseudomonas aeruginosa Stämme bewirkt werden, die alle Fisher Immunotypen haben. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in den Tabellen 11 und 12 zusammengefasst.

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Tabelle 11:

Immunologische Schutzwirkung gemäss der Verwendung von Immunoglobulin alleine oder in einer Kombination derselben.

Stämme, die zur Herstellung von Immunoglobulin verwendet wurden

Fisher Immunotyp

Immunologischer Schutzbereich

CFCPA 20215 Stamm allein

2

Fisher Typen 3, 7

CFCPA 60534 Stamm allein

6

Fisher Typen 3, 7

CFCPA 10142 Stamm allein

1

Fisher Typen 2, 1

CFCPA 30720 Stamm allein

3

Fisher Typ 6

CFCPA 20215

CFCPA 60534 gemischter

2, 6, 1, 3

Fisher Typen

CFCPA 10142 Stamm

3, 7, 2, 1, 6,

CFCPA 30720

4 und 5

Tabelle 12:

Gegenseitiges Verhältnis des immunologischen Schutzes von Immunoglobulin gegen Pseudomonas aeruginosa Stämme.

CFCPA 20215 Stamm induziertes

Immunologischer Schutz gegen Fisher Typ 3 und

Immunoglobulin

Fisher Typ 7

CFCPA 60534 Stamm induziertes

Immunoglobulin

CFCPA 10142 Stamn induziertes

Immunologischer Schutz gegen Fisher Type 2

Immunoglobulin und Fisher Type 1

CFCPA 30720 Stamm induziertes

Immunologischher Schutz gegen Fisher Typ 6

Immunoglobulin

Kombination der oberen 4 Arten des

Immunologischer Schutz gegen alle Fisher Typen

Immunoglobulins

1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7

Beispiel 14:

Therapeutische Wirkung der kombinierten Immunoglobuline auf Pseudomonas aeruginosa Infektion.

4 Arten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen, die im Beispiel 13 ausgewählt wurden, d.h. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534 wurden gemäss denselben Vorgängen wie in Beispielen 5, 6 und 7 inkubiert und extrahiert, um die kombinierte Zusammensetzung von Zellenwandproteine zu erhalten, die dann drei Male mit Intervallen von einer Woche in einer Menge von 1,5 bis 2 mg einer Ziege inokuliert wurde, gemäss derselben Weise wie Beispiel 13, um das kombinierte Pseudomonas aeruginosa Immunoglobulin in einer grossen Menge zu erhalten, das gemäss des bekannten Verfahrens gereinigt wurde (siehe Practical Immunology, 3rd Ed., (1989), Seiten 292-294).

Um die immunologische Schutzwirkung und die therapeutische Wirkung des oben erhaltenen Immunoglobulins auf pathogenische Pseudomonas aruginosa verschiedener Fisher Immunotypen festzustellen, wurden pathogenische Pseudomonas aeruginosa Stämme, die jeden Immunotyp hatten, in eine Gruppe von Mäusen inokuliert (Sechs Gruppen: 20 Mäuse pro Gruppe), in welche vorgängig die kombinierte Immunoglobulin-Zusammensetzung drei Mal injiziert worden ist, und einer weiteren Gruppe Mäuse (Sechs Gruppen: 10 Mäuse pro Gruppe, die keine Immunoglobulin-Zusammensetzung erhielten), in einer Menge von 1,0 bis 3,0 x 10° Zellen pro Maus, um die immunologische Wirkung des kombinierten Immunoglobulins zu beobachten. Zusätzlich wurde in eine weitere Mausgruppe (Sechs Gruppen: 10 Mäuse pro Gruppe) zuerst pathogenischer Pseudomonas aeruginosa Stamm inokuliert und nach 2 bis 6 Stunden wurde die oben erhaltene kombinierte Immunoglobulin-Zusammensetzung intravenös in einer Menge von 0,1 bis 5 ms pro Maus, die ungefähr 20 bis 25 g wog, injiziert, um die therapeutische Wirkung der Immunoglobulin-Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung zu beobachten.

Als Folge davon konnte demonstriert werden, dass die kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung eine immunologische Schutzwirkung von 80% oder mehr zeigte, und eine therapeutische Wirkung von 75% oder mehr, (bestimmt als die Überlebensrate (%) nach 7 Tagen) währenddem alle der Kontrollgruppe innerhalb 3 Tagen starb.

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Somit kann festgehalten werden, dass die kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als nützlicher medizinischer Stoff verwendet werden kann, der sowohl eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung als auch eine immunologische Schutzwirkung zeigt.

Beispiel 15:

Rezeptur von Immunoglobulinen

Die Kombination von Zellenwandproteinen, die durch Inkubation und Extraktion von 4 Arten abgeschwächter Pseudomonas aeruginosa Stämme, die im Beispiel 13 gewählt wurden, d.h. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, gemäss demselben Vorgehen wie der Beispiele 5, 6 und 7 wurde einer männlichen Ziege in derselben Weise wie Beispiel 14 verabreicht, um das kombinierte Pseudomonas aeruginosa Immunoglobulin zu erhalten, das abgetrennt und gereinigt wurde, und dann zu einer Rezeptur gebracht wurde, indem verschiedene pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet wurden, so dass 1 bis 100 mg von Antikörper-Immunoglobulin pro kg Körpergewicht verabreicht werden kann. Die Immunoglobulin-Rezeptur wurde einer Maus verabreicht, die mit Pseudomonas aeruginosa infiziert war, um die Wirksamkeit des Immunoglobulins abhängig von den Arten der für das Immunoglobulin verwendeten Träger zu bestimmen. Als Folge davon zeigt im Falle einer flüssigen Rezeptur das Immunoglobulin-Präparat mit physiologischer Salzlösung zum Einspritzen oder eine Phosphatbufferlösung als Träger eine hohe Wirksamkeit, und im Falle einer lyophilisierten Rezeptur gibt die Verwendung von Mannitol, Saccharose oder Lactose als Träger die hohe Wirksamkeit des Immunoglobulin Präparates. Andererseits vermindert in einer lyophilisierten Rezeptur die Verwendung von menschlichem Albumin zusammen mit Pseudomonas aeruginosa gemäss der vorliegenden Erfindung die Wirksamkeit des Immunoglobulins und im Falle einer flüssigen Rezeptur zeigt die Venwendung von Aluminiumhydroxid als pharmazeutischer Träger eine kleine Wirksamkeit. Die Prüfergebnisse sind in der Tabelle 13 summiert.

Tabelle 13:

Wirksamkeit des Pseudomonas aeruginosa Immunoglobulins abhängig von pharmazeutischen Trägern.

Art Rezeptur

Bestandteile

Wirksamkeit

Lyophilisierte Rezeptur

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + Mannitol (5-20%)

++++

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + Lactose (5-20%)

+++

gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + Saccharose (5-20%)

+++

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + menschliches Albumin (1-5%)

++

Flüssige Rezeptur

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + physiologische Salzlösung

++++

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + Destilliertes Wasser zur Injektion

++++

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + Phospat Bufferlösung

++++

Gereinigte kombinierte Immunoglobulin Zusammensetzung + Aluminiumhydroxid + Lösungsmittel

++

Beispiel 16:

Wirksamkeit der Immunoglobulin Zusammensetzung Rezeptur

Das in Rezeptur vorhandene Immunoglobulin mit einer Phosphatbufferlösung, wie identifiziert, um eine hohe Wirksamkeit von dem Prüfungsergebnis nach Beispiel 15 zu zeigen, wurde geprüft, um die Wirksamkeit als ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für eine sekundäre Hautinfektion in Verletzung, Verbrennung, Wunde und ähnlichem zu bestimmen. Eine Maus erhielt eine Verbrennung gemäss dem Verbrennungsversuchsvorgehen (Siehe J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975). Die flüssige Rezeptur, die 0,5 bis 1 mg des kombinierten Pseudomonas aeruginosa Immunoglobulins pro 1 ml vor Phosphatbufferlösung enthielt, wurde zu einem Sprühstrahl gebildet, welcher dann auf den gebrannten Teil der Maus in der Prüfgruppe aufgebracht wurde, um die Wirkung derselben im Vergleich mit derjenigen in der Kontrollgruppe festzustellen, die keine Behandlung durch den Immunoglobulin Sprühstrahl hatte. Als Folge dieses Versuches zeigte die Mausgruppe mit dem Immunoglobulin-Phosphatbufferlö-

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sungs-Sprühstrahl eine bemerkenswert höhere Überlebensrate als die nicht behandelte Gruppe. Somit kann demonstriert werden, dass das Pseudomonas aeruginosa Immunoglobulin enthaltende Präparat eine überlegene Schutzwirkung und eine überlegene therapeutische Wirkung gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion zeigt. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in der nachfolgenden Tabelle 14 aufgezeigt.

Tabelle 14:

Ergebnis der Verbrennungsprüfung

Behandlung

Anzahl Mäuse

Pseudomonas aeruginosa

Inokulation

Überlebensrate

24 h

48 h

72 h

96 h oder mehr

Verbrennung (mit Immunoglobulin behandelt)

20

örtliche Inokulation

20/20

19/29

16/20

16/20

Verbrennung (nicht mit Immunoglobulin behandelt)

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örtliche Inokulation

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Kontrollgruppe

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keine Inokulation

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Wie oben beschrieben, ist jeder abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stamm gemäss der vorliegenden Erfindung beträchtlich sicher im Verhältnis zur wilden oder pathogenischen Spezies. Zusätzlich, weil deren Zellenwandproteine eine ausgezeichnete Sicherheit und Kreuzschutzwirkungs-Eigenschaft aufweisen, und auch ein überlegenes Vermögen zum Bilden neutralisierender Antikörper, können die Zellenwandproteine nicht nur als Impfstoff für die Prophylaxe gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion, sondern auch als Antikörpererzeuger im Versuchstier verwendet werden, um Immunoglobulin zu erzeugen, das als therapeutischer Stoff für eine Pseudomonas aeruginosa Infektion verwendet werden kann. Somit kann gesehen werden, dass abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung äusserst wertvolle Mikroorganismen zur Herstellung eines prophylaktischen Impfstoffes und ein therapeutischer Stoff für eine Pseudomonas aeruginosa Infektion sind.

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stammes, der ein LDso von mindestens 2.0 x 107 Zellen in Mäusen hat, wobei das Verfahren darin besteht, dass Pseudomonas aeruginosa in einem reinen Zustand gemäss dem Immunotyp von Patienten, die mit Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, isoliert werden und dass die Stämme einer wiederholten Reinigung ausgesetzt werden, um den Stamm abzuschwächen.

   2. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) der Korean Fédération of Culture Collection.

   3. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) der Korean Fédération of Culture Collection.

   4. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) der Korean Fédération of Culture Collection.

   5. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10032 (CFCPA 40057) der Korean Fédération of Culture Collection.

   6. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) der Korean Fédération of Culture Collection.

   7. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10034 (CFCPA 60534) der Korean Fédération of Culture Collection.

   8. Ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, hergestellt gemäss Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugriffsnummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) der Korean Fédération of Culture Collection.

   9. Venwendung mindestens eines Pseudomonas aeruginosa Stammes nach einem der Ansprüche 2-8, zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion.

   10. Ein nicht-pathogener Impfstoff zum Erzeugen eines Immun-Ansprechens gegen Pseudomonas aeruginosa enthaltend ein Gemisch aus Zellenwandproteinen, die von mindestens einem abgeschwäch-

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   ten Pseudomonas aeruginosa Stamm nach einem der vorangehenden Ansprüche 2-8 genommen ist, um ein Immun-Ansprechen zu induzieren, um ein späteres, durch Pseudomonas aeruginosa bewirktes Erkranken zu verhindern.

   11. Impfstoff nach Anspruch 10, wobei der abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa Stamm mindestens drei (3) Stämme enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 und CFCPA 70018.

   12. Impfstoff nach Anspruch 11, wobei die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme aus: CFCPA 10142, CFCPA 20215 und CFCPA 30720 bestehen.

   13. Impfstoff nach Anspruch 11, wobei die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme gewählt sind aus der Gruppe: CFCPA 10142, CFCPA 20215 und CFCPA 30720 und CFCPA 60534.

   14. Impfstoff nach Anspruch 11, wobei die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämme sieben (7) Typen der Stämme CFCPA 10142, CFCPA 20215 und CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 und CFCPA 70018 sind.

   15. Impfstoff nach einem der Ansprüche 10-14, wobei die Zellenwandproteine von jedem der vorhandenen abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stämmen in äquivalenten Mengen vorhanden sind.

   16. Impfstoff nach Anspruch 10, enthaltend weiter pharmazeutisch annehmbare Excipienten.

   17. Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-pathogenen Impfstoffes nach einem der Ansprüche 10-16, zur Immunisation gegen eine Pseudomonas aeruginosa Infektion, enthaltend:

   a) von Patienten, die mit Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, Pseudomonas aeruginosa sammeln;

   b) Auswählen und Isolieren mindestens einer Spezies von Pseudomonas in einem reinen Zustand;

   c) jedes reine isolierte Pseudomonas aeruginosa in einem ersten Kultiviermedium inkubieren;

   d) Abschwächen jedes reinen inkubierten Stammes durch wiederholte Injektionen in Versuchstieren und für jeden abgeschwächten Pseudomonas Stamm den am meisten abgeschwächten Stamm auswählen;

   e) jeden abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm in einem zweiten Kultiviermedium inkubieren;

   f) das abgeschwächte Pseudomonas aeruginosa vom Kultiviermedium abtrennen;

   g) das abgetrennte Pseudomonas aeruginosa mit einer organischen Lösung behandeln, um lipide Komponenten von Zellenwänden zu inaktivieren und zu entfernen;

   h) aus dem behandelten Pseudomonas aeruginosa das Zellenwandprotein entnehmen, mit gleichzeitiger Feststellung, ob die Zellen der Pseudomonas aeruginosa zerstört werden durch Ermitteln des Vorhandenseins von abgesonderter Dehydrogenase oder Hexokinase als cytoplasmisches Anzeigeenzym:

   i) Aussetzen des extrahierten Zellenwandproteins einer Ultrafiltration, um nur diejenigen Zellenwandproteine auszuwählen, die eine relative Molekülmasse im Bereich von 10,000 bis 100,000 aufweisen; j) das Zellenwandprotein ultrazentrifugieren, um jegliches Lipopolysaccharide und jegliche bakteriellen Substanzen zu entfernen;

   k) die ausgewählten Zellenwandproteine in einem reinen Zustand zurückgewinnen;

   I) Herstellen eines Impfstoffes indem die ausgewählten Zellenwandproteine als antigene Substanz verwendet werden, um eine Immunisierung zu induzieren.

   18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Extrahieren durchgeführt wird, indem die behandelten Pseudomonas aeruginosa Zellen in eine Bufferlösung gegeben werden.

   19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Bufferlösung aus der Gruppe, bestehend aus einer Phosphat-Bufferlösung und einer Trisbufferlösung, ausgewählt wird.

   20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Extrahieren der Zellenwandproteine durchgeführt wird, indem die Bakterienmasse stehen gelassen wird oder auf die behandelten Pseudomonas aeruginosa Zellen mit einem Mischer oder Homogenisator eingewirkt wird.

   21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Mischer mit 100 bis 2000 rpm bei 4°C betrieben wird.

   22. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Extrahieren 5 bis 6 Male durchgeführt wird.

   23. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die organische Lösung aus der Gruppe bestehend aus Azeton, Chloroform, Ethanol, Butanol ausgewählt wird und am meisten bevorzugt ist die organische Lösung Azeton.

   24. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die isolierten Pseudomonas aeruginosa Stämme CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 und CFCPA 70018 umfassen.

   25. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das zweite Kultiviermedium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus tryptischem Soja-Nährmedium und im Kultivierungsmedium, das Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgS04 (0,5 g/l), CaC03 (5 g/l), KH2PO4 (1 g/l), FeS04 (5 mg/l), CuSC>4 (5 mg/l) und ZuS04 (5 mg/l) umfasst.

   26. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Inkubation der abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Zustände umfassen: eine Temperatur von 37°C, ein Belüftungsmass von 1 wm (Volumen/Volumen Minute) und ein Saatvolumen von 5% v/v der Kultiviermediumlösung, mit einer Inkubation, die unter einem Rührmass von 100 upm wahren den ersten 2 Stunden und dann bei 600 upm für die folgenden 10 bis 20 Stunden, bevorzugt 12 bis 16 Stunden.

   27. Ein Inkubationsmedium für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 17-26 zum Inkubieren eines

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   abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stammes, enthaltend Glukose 30 g; Pepton 15; MgSCU 0,5 g; CaCOa 5 g; KH2PO4 1 g; FeSC>4 5 mg; CUSO4 5 mg und ZnS04 5 mg pro Liter.

   28. Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Stoffes zur Behandlung einer Pseudomonas aeruginosa Infektion in einem Patienten, der die Infektion zeigt, wobei der Stoff mindestens ein gegen mindestens einen Pseudomonas aeruginosa Stamm spezifisches Immunoglobulin aufweist, das durch Injektion eines Zellwandproteins in einem zweckdienlichen Wirt erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von mindestens einem abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa Stamm nach einem der Ansprüche 2-8 genommen wird, und dass ein Pseudomonas aeruginosa Stamm, der die Zugriffsnummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) der Korean Fédération of Culture Collection hat, in einer genügenden Menge im Wirt induziert wird, dass ein Immunansprechen erzeugt und die Produktion des Immunoglobulins eingeleitet wird, um die widrigen Auswirkungen der Krankheit, die durch Pseudomonas aeruginosa bewirkt werden, mindestens zu vermindern.

   29. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Immunoglobulin gegen jeden der Pseudomonas aeruginosa Stämme, die den Fisher Immunotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 entsprechen, enthält.

   30. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er Immunoglobuline gegen irgendwelche vier der Pseudomonas aeruginosa Stämme, die den Fisher Immunotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 entsprechen, enthält.

   31. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er Immunoglobuline gegen irgendwelche drei der Pseudomonas aeruginosa Stämme, die den Fisher Immunotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 entsprechen, enthält.

   32. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er in einer lyophilisierten Form vorliegt.

   33. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 32, der weiter einen zweckdienlichen, pharamzeutisch annehmbaren Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mannitol, Lactose, Saccharose und menschlichem Albumin enthält.

   34. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 28, in einer flüssigen Form und der zusätzlich zweckdienliche pharmazeutisch annehmbare Träger enthält.

   35. Ein therapeutischer Stoff, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 28, in einer pharmazeutischen Verabreichungsform als Injektion, Tablette, Kapsel, Augentropfen, Spray oder Salbe.

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