CH688195A5 - Peptide mit PTH-aehnlicher Aktivitaet. - Google Patents

Description

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CH 688 195 A5

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten des Parathormons (PTH), ein Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung als Pharmazeutikum.

Der Ausdruck «PTH», wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede genetisch kodierte Form eines Parathormons, einschliesslich der reifen 84 Aminosäuren enthaltenden Form einer gegebenen PTH Art eines Vertebraten, beispielsweise Mensch, Schwein, Ratte, Rind, Huhn und Fragmente hiervon, wie auch Analoga und Derivate hiervon mit PTH-ähnlicher Aktivität. Die Position jeder in der PTH Sequenz beteiligten Aminosäure wird gemäss der international anerkannten Weise nummeriert. In Übereinstimmung und wie es üblich ist, wird in der folgenden Beschreibung das gleiche Nummerierungssystem auf die Aminosäuren der PTH Sequenz unabhängig vom Substitutionsmuster im Molekül angewendet.

Genauer gesagt liefert die vorliegende Erfindung eine PTH Verbindung, die eine PTH-ähnliche Aktivität aufweist und zumindest eine Modifikation umfasst.

Wenn die PTH Sequenz von einem PTH Fragment stammt, ist es ein PTH Fragment, das PTH-ähnliche Aktivität aufweist und zumindest die ersten 27 N-terminalen Aminosäureeinheiten von PTH enthält, vorzugsweise bis zu den ersten 38 N-terminalen Aminosäureeinheiten von PTH, beispielsweise 1-34 bis 1-38, beispielsweise 1-34, 1-36, 1-37 oder 1-38 PTH, und zumindest eine der a-Aminosäuren gemäss der Erfindung ersetzt ist. Eine oder mehrere a-Aminosäureeinheiten, die normalerweise in der natürlich vorkommenden PTH Sequenz vorkommen, können auch weggelassen werden. hPTH Fragmente, insbesondere hPTH (1-34) und hPTH (1-36) sind bevorzugt.

Der C-Terminus der PTH Verbindungen kann sein -COOH, verestertes -COOH, beispielsweise -COORa, worin Ra für ein niederes Alkyl steht, beispielsweise Ci_4Alkyl, -CONH2 oder ein einfach oder zweifach substituiertes Amid, beispielsweise -CONRbRc, worin eines von Rb und Rc für Wasserstoff steht und das andere für einen aliphatischen Rest steht, beispielsweise Ci_6Alkyl, oder beide für einen aliphatischen Rest stehen, oder Rb und Rc zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Rest bilden, beispielsweise Pyrrolidinyl oder Piperidinyl.

Später werden diese Verbindungen als erfindungsgemässe Verbindungen bezeichnet.

«Natürliche Aminosäuren» beziehen sich auf jene, die im Fachgebiet gut bekannt sind. In der U-S-P-T-0 Veröffentlichung, Trademark Officiai Gazette, herausgegeben am 15. Mai 1990, Seiten 33 bis 46 werden sie und die Standardabkürzungen aufgelistet. Diese Aminosäuren und Abkürzungen werden hiermit eingeführt.

Die natürlichen Aminosäuren sind im folgenden angegeben:

A

Ala

Alanin

D

Asp

Asparaginsäure

E

Glu

Glutaminsäure

F

Phe

Phenylalanin

G

Gly

Glycin

H

His

Histidin

I

Ile

Isoleucin

K

Lys

Lysin

L

Leu

Leucin

M

Met

Methionin

N

Asn

Asparagin

Q

Gin

Glutamin

R

Arg

Arginin

S

Ser

Serin

T

Thr

Threonin

V

Val

Valin

W

Trp

T ryptophan

Y

Tyr

Ty rosin

Der Ausdruck «unnatürliche Aminosäure» Einheit meint eine Aminosäureeinheit, die nicht genetisch kodiert ist. Beispiele von unnatürlichen Aminosäureeinheiten umfassen beispielsweise die D-Isomere der natürlichen a-Aminosäuren, wie sie oben angegeben sind, Aib (Aminoisobuttersäure), bAib (3-Aminoiso-buttersäure), Nva (Norvalin), ß-Ala, Aad (2-Aminoadipinsäure), bAad (3-Aminoadipinsäure), Abu (2-Ami-

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nobuttersäure), Gaba (gamma-Aminobuttersäure), Acp (6-Aminocapronsäure), Dbu (2,4-Diaminobutter-säure), TMSA (Trimethylsilyl-Ala), alle (allo-lsoleucin), Nie (Norleucin), tert. Leu, Cit (Citrullin), Orn, Dpm (2,2'-Diaminopimelinsäure), Dpr (2,3-Diaminopropionsäure), a- oder ß-Nal, Cha (Cyclohexyl-Ala), Hy-droxyprolin, Sar (Sarcosin) usw., cyclische Aminosäureeinheiten und Na-alkylierte Aminosäureeinheiten, beispielsweise MeGly (Na-Methylglycin), EtGly (Na-Ethylglycin), EtAsn (N«-Ethylasparagin).

Mit Aminosäuren in geschützter Form sind natürliche oder unnatürliche Aminosäuren gemeint, die beispielsweise eine Seitenkette enthalten, die ein Heteroatom, wie O, S oder N enthält, das mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein kann. Der N-Terminus der erfindungsgemässen PTH Verbindungen kann ebenfalls in geschützter Form vorliegen.

N-Schutzgruppen, wie sie am N-Termlnus oder an Seitenkettenaminogruppen von Aminosäureeinheiten vorkommen können, umfassen solche Gruppen, wie sie beispielsweise in «Protective Groups in Or-ganic Synthesis», T. W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219-287 beschrieben sind, beispielsweise Acyl, wie Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl oder Benzoyl wahlweise am Phenylring mit beispielsweise p-Methoxycarbonyl, p-Methoxy, p-Nitro oder p-Phenylsulfonamidcarbonyl substituiert, Alkoxycarbonyl, wie t-Butyloxycarbonyl, Isobutyloxycarbonyl oder Methoxycarbonyl, Allyloxy-carbonyl, Trityl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl, Arylmethoxycarbonyl, wie 9-Fluorenylmethoxy-carbonyl oder Benzyloxycarbonyl wahlweise am Phenylring mit p-Methoxy, p-Nitro, o- oder p-Chlor, m-Phenyl oder 3,4-Dimethyl substituiert, Arylmethyl, wie Benzyl wahlweise ringsubstituiert mit p-Methoxy, p-Nitro oder p-Chlor, oder Arylsulfonyl, wie Phenylsulfonyl wahlweise ringsubstituiert mit p-Methyl oder p-Methoxy, oder Naphthylsulfonyl wahlweise ringsubstituiert mit beispielsweise Amino oder Di (C1-4AI-kyl) amino.

O-Schutzgruppen von O-enthaltenden Seitenketten sind beispielsweise die, wie sie in der obigen Literaturstelle «The Peptides», 3, (1981), E. Gross und J. Meienhofer (Herausgeber) beschrieben sind. Für funktionelle aliphatische Hydroxygruppen sind geeignete O-Schutzgruppen die, wie sie beispielsweise in «Protection of the Hydroxy Group», J. M. Stewart, 169-201 beschrieben sind, und beinhalten die Benzyl-, t-Butyl- und Methylgruppen. Für funktionelle aromatische Hydroxygruppen beinhalten geeignete O-Schutzgruppen die Benzyl-, t-Butyl-, Methyl-, Tosyl- und Benzyloxycarbonylgruppen. O-Schutzgruppen für funktionelle Carboxygruppen an Aminosäureseitenketten sind gut bekannte Estergruppen und sind beispielsweise in «The Peptides», 3, 101-135 («Carboxyl Protecting Groups» von R. W. Roeske) beschrieben und beinhalten die Methyl-, Ethyl-, t-Butyl- und Benzylgruppen. S-Schutz-gruppen für funktionelle Thiolgruppen an Aminosäureseitenketten sind gut bekannt und beispielsweise in «The Peptides», 3, 137-167 («Sulfhydryl Group Protection» von R. G. Hiskey) beschrieben. Beispiele beinhalten die Methyl-, t-Butyl-, Benzyl-, p-Methoxyphenylmethyl-, Ethylaminocarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen.

Gemäss der Erfindung können die PTH Verbindungen an ihren endständigen Aminogruppen zumindest einen Rest tragen, der aus einer L- oder D-a-Aminosäure, C2-eAlkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem Ci_sAlkyl, C2-eAlkenyl, C2-sAlkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl ausgewählt ist und/oder an einer oder mehreren Seitenkettenaminogruppe(n) zumindest einen Rest tragen, der aus C2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem Ci-sAlkyl, C2-8Alkenyl, C2-sAlkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3_6Cycloalkyl-Ci-4alkyl ausgewählt ist. Falls eine solche Gruppe an eine Seitenketten-aminogruppe gebunden ist, ist es vorzugsweise die a-Aminogruppe einer Lys Einheit. Bevorzugte Sub-stituenten für die Alkyl, Alkenyl, Aralkyl, Aralkenyl oder Cycloalkylgruppe sind Hydroxy, Amino und für den Arylteil auch Halogen und/oder Ci-4Alkoxy. Die Alkylgruppe oder der Alkylteil kann linear oder verzweigt und wahlweise durch O, S oder N unterbrochen sein. Vorzugsweise ist jedes Ci-sAlkyl, C2-8AI-kenyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl an der Aminogruppe einer PTH Verbindung nicht substituiert. Beispiele für Ci-sAlkyl sind Ci-eAlkyl, vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, für C2-sAlkenyl sind es C2-4Alkenyl, vorzugsweise Allyl, für C2-eAlkinyl sind es C2-4ÂI-kinyl, vorzugsweise Prop-2-inyl, für Aralkyl sind es Phenyl oder Benzyl, für Aralkenyl ist es Styryl, für C3-eCycloalkyl-Ci-4alkyl ist es Cyclohexylmethyl. C2-6Alkoxycarbonyl ist vorzugsweise Formyl oder Acetyl. Geeignete Beispiele für D- oder L-a-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, beinhalten beispielsweise D- oder L- Pro und Ala. Bevorzugte Substituenten, wenn sie vorkommen, sind Alkyl, Alkinyl, Alcoxycarbonyl oder eine an den N-Terminus der PTH Verbindung gebundene D- oder L-a-Aminosäure und/oder zumindest ein Alkyl oder Alkoxycarbonyl, das an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen gebunden ist.

Bevorzugte erfindungsgemässe PTH Verbindungen sind jene, die zumindest eine Aminosäureeinheit in einer der folgenden Positionen der PTH Sequenz ausgetauscht enthalten: 1, 2, 3, 8-11, 13 bis 19, 21, 22, 29 bis 34, insbesondere 8-11, 16-19, 33 und/oder 34. Ferner sind erfindungsgemäss bevorzugte PTH Verbindungen jene, die mehr als eine Aminosäureeinheit ersetzt enthalten, insbesondere mehr als zwei Aminosäureeinheiten, noch bevorzugter mehr als drei Aminosäureeinheiten, vor allem 5 bis 7 ersetzte Aminosäureeinheiten, vorzugsweise in jeder Kombination der oben angegebenen Positionen der PTH Sequenz.

In einer Reihe an bestimmten oder alternativen Ausführungsformen liefert die vorliegende Erfindung eine wie oben beschriebene PTH Verbindung, worin insbesondere die a-Aminosäuren in den Positionen 1 und 2 am Aminoterminus der PTH Sequenz durch ein Pseudodipeptid ersetzt sind.

Der Ausdruck «Pseudodipeptid», wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Dipetidisoster,

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worin die Peptidbindung zwischen den entweder natürlichen oder unnatürlichen 2 Aminosäureresten durch jede isostere Gruppe ersetzt ist, beispielsweise -CH2-NH-, -C(Halogen)=CH- oder -C(AI-kyl)=CH-

Beispiele für erfindungsgemässe Verbindungen, worin die a-Aminosäuren in den Positionen 1 und 2 durch ein Pseudodipeptid ersetzt sind, beinhalten beispielsweise die Verbindungen der Formel I

X - P, I

worin X ein Rest der Formel (a)

y i

Z-N - CH - C - CH - CH - CO- (a)

I I I

V V Y'

oder (b) ist

Y. V

| I

I-N - C - CH2 - N - CH - CO- <t»

I l 1

V Yb *'

worin jeweils Z und Z' unabhängig für H, wahlweise substituiertes Ci-sAlkyl, C2-8Alkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl oder eine Schutzgruppe steht, höchstens eines von Z und Z' für eine Schutzgruppe steht,

Z" für H, Ci-sAlkyl oder eine Schutzgruppe steht jeweils Y und Y' unabhängig für eine wahlweise geschützte Seitenkette einer natürlichen oder unnatürlichen a-Aminosäure stehen, eines von Ya und Yb für Wasserstoff steht und das andere für eine wahlweise geschützte Seitenkette einer natürlichen oder unnatürlichen a-Aminosäure steht oder Ya und Yb zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine C3-6Cycloalkylgruppe bilden, und W für ein Halogen oder C1-4Alkyl steht, oder

W und Y' zusammen mit der Gruppe -C"CH-CH- an die sie gebunden sind, einen wahlweise substituierten aromatisch-cyclischen oder heterocyclischen Rest bilden, und P1 eine wie oben definierte PTH Sequenz ist, worin die Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und 2 des N-Termunus weggelassen sind, in freier Form oder Salzform oder Komplexform.

In Verbindungen der Formel I kann Pi ein Fragment (3-z) von PTH sein, worin z für eine Zahl von 27 bis 38, vorzugsweise von 34 bis 38, insbesondere 34, 36, 37 oder 38, vor allem 34 oder 36 steht. Die durch Pi dargestellte PTH Sequenz kann entweder einer natürlich auftretenden PTH Sequenz oder einer natürlichen PTH Sequenz entsprechen, in der zumindest eine a-Aminosäureeinheit durch eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure wahlweise in geschützter Form ersetzt ist und/oder ein oder mehrere a-Aminosäureeinheiten auch weggelassen sind. Pi kann auch zumindest eine wie oben beschrieben substituierte Seitenkettenaminogruppe enthalten.

Halogen ist vorzugsweise Fluor oder Chlor.

Im Rest der Formel (a) weist die Doppelbindung vorzugsweise die Konfiguration trans (E) auf.

Als an das a-Kohlenstoffatom einer natürlichen a-Aminosäure gebundener Rest kann Y, Y', Ya oder Yb die Seitenkette in einer wie oben angegebenen natürlichen a-Aminosäure sein, wie sie beispielsweise in Gly (das heisst H), Ala, Val, Ser, Leu, Ile, Phe, Trp vorkommt. Y, Y', Ya oder Yb kann auch der an das a-Kohlenstoffatom einer wie oben erwähnten unnatürlichen a-Aminosäure gebundene Rest sein, wie er beispielsweise in Nva, Orn, Abu, Aib, Nie vorkommt. Falls die Seitenkette der natürlichen oder unnatürlichen Aminosäuren, wie Y, Y', Ya oder Yb, Heteroatome enthält, wie O, S oder N, können die Heteroatome in der Seitenkette wahlweise mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein, wie dies beispielsweise oben erwähnt ist.

Schutzgruppen, wie Z oder Z' oder Z" können die oben beschriebenen sein.

Ci-sAlkyl, wie Z oder Z' oder Z", kann das wie oben beschriebene sein.

Vorzugsweise steht Z oder Z' für Wasserstoff oder Ci-4Alkyl, insbesondere Wasserstoff oder Methyl.

Vorzugsweise steht Y für H oder CH3.

Wenn W für Ci-4Alkyl steht, steht es vorzugsweise für CH3.

Wenn W und Y' zusammen mit der Gruppe, an die sie gebunden sind, einen wahlweise substituierten aromatisch-cyclischen oder heterocyclischen Rest bilden, kann dies ein aromatischer 5- oder 6-

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gliedriger cyclischer Rest sein, der wahlweise 1 oder 2 aus N, S und O ausgewählte Herteroatome enthält, beispielsweise Phenyl, Imidazolyl, Pyridyl, Oxazolyl oder Thiazolyl. Ein bevorzugter Substituent ist Hydroxy oder Methoxy, insbesondere für den Phenylring.

Y' steht bevorzugt für H, CH3, Isopropyl oder Benzyl.

Wenn Z" für Ci-sAlkyl steht, steht es bevorzugt für CH3, C2H5 oder Isopropyl.

C3-6Cycloalkyl, wie Ya und Yb zusammen, steht vorzugsweise für Cyclopropyl oder Cyclopentyl.

Wenn Z" eine Schutzgruppe ist, ist dies vorzugsweise Acyl, insbesondere Acetyl. In einer Reihe an bestimmten oder alternativen Ausführungsformen liefert die vorliegende Erfindung eine PTH Verbindung, wie sie oben beschrieben ist, in der die a-Aminosäureeinheit in der Position 1 und/oder die a-Amino-säureeinheit in der Position 2 des N-Terminus der PTH Sequenz durch einen wahlweise geschützten natürlichen oder unnatürlichen Aminosäurerest ersetzt ist, vorausgesetzt, dass wenn die PTH Verbindung frei ist von D- oder L-a-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, oder von C2-6AI-koxycarbonyl oder wahlweise substituiertem Ci_sAlkyl, C2-sAlkenyl, C2-sAlkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl, sie anders als eine PTH Verbindung ist, die eine natürlich auftretende a-Aminosäuresequenz aufweist, oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-34) ist, worin i. die a-Aminosäure in der Position 1 Aib, Gly, D-Ser, D-Ala oder Tyr ist, oder ii. die a-Aminosäure in der Position 2 Ala, D-Val, Lys, Cit oder Arg ist und die a-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist, oder die a-Aminosäure in der Position 2 D-Val ist und die a-Aminosäure in der Position 34 D-Tyr ist und wahlweise die a-Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nie sind, oder iii. die a-Aminosäure in der Position 1 Aib ist und zumindest eine weitere a-Aminosäureeinheit folgen-dermassen ersetzt ist: die a-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu, Ile, Val, Phe oder Trp ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 11 Ser, Lys, Phe, ß-Nal, Trp oder Tyr ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-ß-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(Fmoc), D-Phe oder D-Asn ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 13 Leu ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 19 und/oder in der Position 21 Arg, Lys, Asn oder His ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 23 2-(1,3-Dithiolan-2-yl)Trp ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 25 und/oder in der Position 26 His ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 27 Gin oder Leu ist, oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-84) ist, worin i. die a-Aminosäure in der Position 1 Tyr, Val, Pro, Asp oder Cys ist, oder ii. die a-Aminosäure in der Position 2 Ala, Glu, Leu, Ser oder Arg ist.

Beispiele der erfindungsgemässen Verbindungen, in denen die a-Aminosäuren in der Position 1 und/ oder in der Position 2 wie oben erwähnt ersetzt sind, beinhalten beispielsweise Verbindungen der Formel II

Xia - Y2a - P2 II

worin Xia ein Rest einer wahlweise geschützten natürlichen a-Aminosäure oder ein Rest der Formel (IIa) ist

Î1

Za- N - [C]n - CO - (IIa)

I I

Z'a *2

worin jeweils Za und Z'a unabhängig für H, Ci-öAlkyl oder eine Schutzgruppe stehen, höchstens eines von Za und Z'a für eine Schutzgruppe steht, und entweder n für 1 steht und i. jeweils Ri und R2 unabhängig für Ci-6Alkyl stehen, oder ii. eines von Ri und R2 für Methyl oder Ethyl steht und das andere ein an das a-Kohlenstoffatom einer anderen natürlichen a-Aminosäure, als Ala, Leu, Ile oder Val gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder iii. eines von Ri und R2 für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl steht und das andere für einen an das a-Kohlenstoffatom einer unnatürlichen a-Aminosäure gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder iv. Ri und R2 zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine C3-6 Cycloalkyl-gruppe bilden, oder

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• N • C ■

v. der Rest Za ~ , 7 eine heterocyclischen Rest darstellt, der wahlweise zu einem Benzol-

I

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ring kondensiert ist,

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oder n für 2, 3, 4 oder 5 steht und jeweils Ri und R2 für H oder CH3 stehen, Y2a ein Rest einer wahlweise geschützten natürlichen a-Aminosäure oder ein Rest der Formel (IIb) ist

*3

N -lC)m

-CO -

(IIb)

2b ^4

worin

Zb für H oder Ci-6Alkyl steht und entweder m für 1 steht und i. jeweils R3 und R4 unabhängig für Ci—öAlkyl stehen, oder ii. eines von R3 und R4 für Methyl oder Ethyl steht und das andere eine an das a-Kohlenstoffatom einer anderen natürlichen a-Aminosäure, als Ala, Leu, Ile oder Val gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder iii. eines von R3 und R4 für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl steht und das andere für einen an das a-Kohlenstoffatom einer unnatürlichen a-Aminosäure gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder m für 2, 3, 4 oder 5 steht und jeweils R3 und R4 für H oder CH3 stehen und P2 eine wie oben definierte PTH Sequenz ist, in der die Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und/oder 2 des N-Terminus weggelassen sind.

Wenn der Rest Za - N - C - einen heterocyclischen Rest darstellt, der wahlweise zu ei-

I I

Z'a *2

nem Benzolring kondensiert ist, kann dies ein Rest sein, der von einem gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6-gliedrigen Heterocyclus abstammt, welcher ein oder mehrere aus N, O und S ausgewählte Heteroatome enthält. Beispiele für solche heterocyclischen Reste sind unter anderem 2-Pyridyl, 3-Mor-pholinyl, Hexahydropyridazinyl, 2- oder 3-lndolyl.

Wenn n oder m > 1 ist, kann die Gruppe CR1R2 oder CR3R4 für -CH(CH3)-CH2-, Propyl, Butyl oder Pentyl stehen.

C3-6Cycloalkyl für Ri und R2 zusammen ist vorzugsweise Cyclopropyl oder Cyclopentyl.

Als Rest, der an das a-Kohlenstoffatom einer natürlichen a-Aminosäure gebunden ist, kann Ri, R2, R3 oder R4 die Seitenkette sein, die in einer wie oben angegebenen natürlichen a-Aminosäure vorkommt, wie sie beispielsweise in Gly, Ser oder Thr vorkommt. Eines von Ri und R2 und eines von R3 und R4 kann für Methyl oder Ethyl stehen und das andere kann für CH3, Isopropyl, Isobutyl oder CH3-CH2-CH(CH3)- stehen. Ri, R2, R3 oder R4 kann auch der Rest sein, der an das a-Kohlenstoffatom einer wie oben erwähnten unnatürlichen a-Aminosäure gebunden ist, wie er beispielsweise in Abu, Gaba, Nva, Aib, TMSA oder Nie vorkommt. Wenn die Seitenkette der natürlichen oder unnatürlichen Aminosäuren, wie Ri, R2, R3 oder R4, Heteroatome enthält, wie O, S oder N, können die Heteroatome der Seitenkette wahlweise mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein, wie sie beispielsweise oben erwähnt sind. Schutzgruppen, wie Za oder Z'a können die sein, die oben beschrieben sind. Ci-6Alkyl als Zb ist vorzugsweise Methyl oder Ethyl. Vorzugsweise steht Zb für H. Ci-6Alkyl als Za oder Z'a ist vorzugsweise geradkettiges oder verzweigtes Ci_4Alkyl. Vorzugsweise steht eines von Za und Z'a für H und das andere für H, Ci-4Alkyl oder eine Schutzgruppe, insbesondere für H.

In einer weiteren oder alternativen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung auch eine wie oben beschriebene PTH Verbindung, in der die a-Aminosäureeinheit in der Position 8 und/oder die a-Aminosäureeinheit in der Position 18 durch einen wahlweise geschützten natürlichen oder unnatürlichen Aminosäurerest ersetzt ist, vorausgesetzt, dass wenn die PTH Verbindung frei ist von D- oder L-a-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, oder von C2-eAlkoxycarbonyl oder wahlweise substituiertem Ci-sAlkyl, C2-eAlkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl ist, sie anders als eine PTH Verbindung ist, die eine natürlich auftretende a-Aminosäuresequenz aufweist, oder die PTH Verbindung anders als PTH (1-34) ist, worin i. die a-Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nie oder jeweils Met(O) sind und wahlweise die a-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist, oder die a-Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nie sind und die a-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist und entweder die a-Aminosäure in der Position 12 L- oder D-Pro, L- oder D-Ala, Aib oder NMeGly ist, oder die a-Aminosäure in der Position 23 Phe, Leu, Nie, Val, Tyr, a-Nal oder ß-Nal ist, oder die Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nie sind und die a-Aminosäure in der Position 2 D-Val ist und die a-Aminosäure in der Position 34 D-Tyr ist, oder

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ii. die a-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu, Ile, Val, Phe oder Trp ist und wahlweise zumindest eine weitere a-Aminosäureeinheit folgendermassen ersetzt ist: Die a-Aminosäure in der Position 1 Aib ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 11 Ser, Lys, Phe, ß-Nal, Trp oder Tyr ist, und/ oder die a-Aminosäure in der Position 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-ß-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(Pmoe), D-Phe oder D-Asn ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 13 Leu ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 19 und/oder in der Position 21 Arg, Lys, Asn oder His ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 23 2-(1,3-Dithiolan-2-yl)Trp ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 25 und/oder in der Position 26 His ist und/oder die a-Aminosäure in der Position 27 Gin oder Leu ist, oder iii. die a-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Ala oder Ser ist, oder die a-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu ist und die a-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist.

Wenn die a-Aminosäureeinheit in der Position 8 durch eine unnatürliche Aminosäure ersetzt wird, kann dies eine unnatürliche Aminosäure sein, wie sie oben beschrieben ist, beispielsweise Nva, Nie oder Cha. Vorzugsweise ist es eine unnatürliche lipophile Aminosäure, vorzugsweise eine solche, die einen geradkettigen Alkylrest enthält.

Nva (Norvalin) und dessen Homologe sind besonders bevorzugt. Die unnatürliche Aminosäure in der Position 8 der PTH Sequenz kann auch eine Ca-methylierte oder Ca-ethylierte natürliche a-Aminosäure sein.

Beispiele für erfindungsgemässe PTH Verbindungen, in denen die a-Aminosäureeinheit in der Position 18 ersetzt ist, sind beispielsweise PTH Verbindungen, in denen der a-Aminosäurerest in der Position 18 durch einen natürlichen Aminosäurerest ersetzt ist, wie Gin, Tyr oder Lys, beispielsweise [Gln18]-PTH, [Lys18]PTH und [Tyr18]-PTH, insbesondere [Gin18 oder Lys18 oder Tyr18]-hPTH-(1-x), worin x eine Zahl von 27 bis 38, insbesondere von 34 bis 38 ist. Ala in der Position 18 ist ebenfalls bevorzugt, insbesondere wenn die PTH Sequenz ein (1-36) PTH Fragment ist. In diesen Verbindungen kann die Aminosäure in der Position 8 Met sein, oder sie kann durch eine aus Leu, Ile, Val, Phe, Gin, Trp, Ser und Ala ausgewählte Aminosäure ersetzt sein, oder sie kann ein unnatürlicher lipophiler Aminosäurerest sein, beispielsweise Nva oder Nie.

Eine andere Gruppe solcher erfindungsgemässer PTH Verbindungen umfasst beispielsweise PTH Verbindungen, in denen der Aminosäurerest in der Position 8 durch einen unnatürlichen lipophilen Aminosäurerest ersetzt ist, beispielsweise Nie oder noch bevorzugter Nva. In diesen Verbindungen kann die Aminosäure in der Position 18 Met sein oder sie kann durch eine Aminosäure ersetzt sein, die aus Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Ser, Ala, Gin, Lys oder Tyr, vorzugsweise Leu, Gin, Ala oder Tyr ausgewählt ist.

Eine weitere Gruppe solcher erfindungsgemässer PTH Verbindungen sind jene, in denen eine oder mehrere Aminosäureeinheiten in den verbleibenden Positionen, beispielsweise 1 bis 7, 9 bis 17 und/ oder 19 bis 38 entweder weggelassen oder zusätzlich zu dem Austausch der a-Aminosäureeinheit in der Position 8 und/oder 18 ersetzt sind. In einem solchen Fall wird die a-Aminosäure in der Position 8 vorzugsweise durch Leu ersetzt und die a-Aminosäure in der Position 18 durch Gin, Leu, Ala oder Tyr.

In einer weiteren oder alternativen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine wie oben beschriebene PTH Verbindung, in der zumindest eine a-Aminosäureeinheit in der PTH Sequenz durch eine a-Aminosäureeinheit ersetzt ist, die in der entsprechenden Position in PTHrP vorkommt, vorausgesetzt, dass wenn die PTH Verbindung frei ist von D- oder L-a-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, oder von C2_6Alkoxycarbonyl oder wahlweise substituiertem Ci_sAlkyl, C2-sAlkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder Cs-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl, sie anders als eine PTH Verbindung ist, die eine natürlich auftretende a-Aminosäuresequenz aufweist, oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-34) ist, worin i. die a-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu ist, und/oder die a-Aminosäure in der Position 11 Lys ist, und/oder die a-Aminosäure in der Position 19 und/oder 21 Arg ist, und/oder die a-Aminosäure in der Position 25 und/oder 26 His ist, und/oder die a-Aminosäure in der Position 27 Leu ist, oder ii. die a-Aminosäure in der Position 25 Gin ist, und/oder die a-Aminosäure in der Position 26 Asn ist, die a-Aminosäure in der Position 27 wahlweise Leu ist, oder die PTH Verbindung anders als [Leu8, Leu18] PTH (1-84) ist.

Der Ausdruck «PTHrP» (Parathormon related Peptide) bezieht sich auf jede genetisch kodierte Form von PTHrP, beispielsweise Mensch, Huhn-, Ratte- oder Maus-PTHrP. In Übereinstimmung und wie es üblich ist, wird in der folgenden Beschreibung das gleiche Nummerierungssystem auf die Aminosäuren der PTHrP Sequenz angewendet, die mit Ala in der Position 1 beginnt und beispielsweise Ala in der Position 38 enthält.

Diese Gruppe an erfindungsgemässen Verbindungen sind Hybride zwischen PTH und den homologen PTHrP Sequenzen (hierin als PTH-rP Hybride bezeichnet). Die Aminosäuresequenz, in der die erfindungsgemässe Substitution stattfindet, reicht von der Position 1 bis zur Position 38, insbesondere von 1 bis 36, vor allem von 1 bis 34.

Bevorzugte erfindungsgemässe PTH Verbindungen sind PTH-rP Hybride, in denen mehr als eine a-Aminosäureeinheit der PTH Sequenz, beispielsweise zumindest 2, vorzugsweise 3 bis 5 a-Aminosäure-einheiten erfindungsgemäss ersetzt sind. Eine bevorzugte Gruppe der erfindungsgemässen PTH-rP Hybride umfasst PTH Verbindungen, in denen zumindest eine a-Aminosäureeinheit der PTH a-Amino-

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säuresequenz in den Positionen 8 bis 11, das heisst Met8, His9, Asn10 oder Leu11 durch die entsprechende a-Aminosäureeinheit der entsprechenden Sequenz von PTHrP, das heisst Leu8, His9, Asp10 oder Lys11 ersetzt ist. Der Austausch an den Positionen 8 und/oder 10 ist bevorzugt, insbesondere an den Positionen 8 und 10. Noch bevorzugter werden die a-Aminosäuren an den Positionen 8, 10 und 11 dieser PTH Sequenz jeweils durch Leu8, Asp10 und Lys11 ersetzt.

Eine weitere bevorzugte Gruppe der erfindungsgemässen PTH-rP Hybride umfasst PTH Verbindungen, in denen zumindest eine a-Aminosäureeinheit der PTH a-Aminosäuresequenz in den Positionen 16 bis 19 durch die entsprechende a-Aminosäureeinheit der entsprechenden PTHrP Sequenz ersetzt ist, das heisst Gin16, Asp17, Leu18, Arg19. Vorzugsweise werden 3 oder alle 4 a-Aminosäuren dieser Sequenz ersetzt. Insbesondere bevorzugt sind erfindungsgemässe PTH Verbindungen, in denen die a-Aminosäure in der Position 16 Gin ist, die a-Aminosäure in der Position 18 Leu ist und die a-Aminosäu-re in der Position 19 Arg ist.

Eine weitere bevorzugte Gruppe der erfindungsgemässen PTH-rP Hybride umfasst PTH Verbindungen, in denen zumindest eine a-Aminosäureeinheit der PTH a-Aminosäuresequenz in den Positionen 33 und 34 durch die entsprechende a-Aminosäureeinheit der entsprechenden PTHrP Sequenz ersetzt ist, das heisst Thr33, Ala34. Vorzugsweise werden beide Aminosäuren ersetzt.

Ferner sind bevorzugte Gruppen der erfindungsgemässen PTH-rP Hybride PTH Verbindungen, die jede Kombination der oben erwähnten a-Aminosäuresubstitutionen (8-11, 16-19, 33-34) umfassen, noch bevorzugter eine Kombination der Substitutionen, die aus den oben erwähnten 8-11 und 33-34 Sequenzen ausgewählt werden.

Wie man erkennt, können in den erfindungsgemässen PTH-rP Hybriden eine oder mehrere a-Amino-säuren in den Positionen 1 bis 38 ferner durch eine oben erwähnte natürliche oder unnatürliche Aminosäureeinheit ersetzt werden oder weggelassen werden. In der Position 10 kann eine a-Aminosäure sein, die aus Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr ausgewählt ist. In der Position 13 kann eine andere D- oder L-a-Aminosäure sein als Arg, beispielsweise Ala, Cys, Gin, Ile, Asn, Trp, Asp, Val, Ser, Thr, Tyr, Met, Leu oder Gly, in der Position 16 kann eine D- oder L-a-Aminosäure sein, beispielsweise Lys, Ser, Leu, Ala, Gin oder Gly, in der Position 17 Ala oder Ser oder vorzugsweise eine Aminosäure mit einer grösseren Seitenkette als Ala oder Ser, beispielsweise Glu, Gin, Phe, His, Ile oder Lys, in der Position 18 Gin oder Tyr, in der Position 19 Ala, Arg, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn oder Ile, in der Position 26 Gin oder Arg, und/oder in der Position 33 eine D- oder L-a-Aminosäure, beispielsweise Ser, Thr, Leu, Gly, Gin, Arg, Pro, Asp, Ile, Lys oder Thr. Sie können auch am N-Terminus oder an einer Seitenkettenaminogruppe substituiert sein, wie dies oben erwähnt ist. Falls gewünscht, können die S- oder O-enthaltenden Seitenketten der erfindungsgemässen PTH-rP Hybride auch wie oben beschrieben geschützt sein.

Beispiele von erfindungsgemässen PTH-rP Hybriden sind [Leu8, Gin18, Thr33, Ala3<]PTH,

[Leu8, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]PTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala18, Gin18, Thr33, Ala3"]PTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala1«, Gln18]PTH,

[Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]PTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Gln18]PTH,

[Leu«, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Ala19]PTH,

[Leu8, Ala16, Gin18, Ala19, Thr33, Ala34]PTH und [Leu8, Asp10, Lys11, Gin18, Thr33, Ala34]PTH,

wobei die PTH Aminosäuresequenz von der Position 1 bis zur Position 38, insbesondere von 1 bis 36, vor allem von 1 bis 34 reicht.

Bevorzugte erfindungsgemässe PTH-rP Hybride sind PTH(l-x') Verbindungen, worin x' eine Zahl von 34 bis 38 ist, insbesondere 34, 36, 37 oder 38, vor allem hPTH(l-x'), worin eine oder mehrere a-Aminosäuren durch die a-Aminosäure(n) ersetzt sind, die an der entsprechenden Position in PTHrP vorkommen, vorzugsweise wie dies oben erwähnt ist. Wenn die Positionen 33 und 34 durch die entsprechende a-Aminosäuresequenz von PTHrP ersetzt sind, ist die PTH Verbindung vorzugsweise ein hPTH Fragment, das 34 a-Aminosäureeinheiten enthält. Die PTH-rP Hybride mit Carboxyterminus sind bevorzugt.

Vorzugsweise ist PTHrp hPTHrP.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können beispielsweise in freier Form, Salzform oder in Form von Komplexen hiervon vorkommen. Säureadditionssalze können beispielsweise mit organischen Säuren, Polymersäuren und anorganischen Säuren gebildet werden. Solche Säureadditionssalzformen beinhalten beispielsweise die Hydrochloride und die Acetate. Komplexe werden beispielsweise aus der erfindungsgemässen Verbindung durch die Zugabe von anorganischen Substanzen, beispielsweise anorganischen Salzen oder Hydroxiden, wie Ca- und Zn-Salzen, und/oder durch die Zugabe von polymeren organischen Substanzen gebildet.

Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen. Sie können schrittweise entweder in Lösung oder mittels Festphasensyntheseverfahren oder Gentechnologie hergestellt werden.

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Die erfindungsgemässen Verbindungen können beispielsweise folgendermassen hergestellt werden:

a) Entfernung von zumindest einer Schutzgruppe, die in einer geschützten erfindungsgemässen Verbindung vorkommt, oder b) Zusammenfügung von zwei Peptidfragmenten durch eine Amidbindung, wobei die Peptidfragmente so beschaffen sind, dass die gewünschte Aminosäuresequenz der gewünschten Verbindung erhalten wird, und dann die Ausführung des wahlweisen Schritts a) des Verfahrens,

c) zur Herstellung einer PTH Verbindung, in der die a-Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und 2 am Aminoterminus durch ein Pseudodipeptid ersetzt werden, Umsetzung eines Pseudodipeptids in geschützter oder ungeschützter Form mit einem PTH Peptid in geschützter oder ungeschützter Form, worin die Aminosäurereste in den Positionen 1 und 2 weggelassen werden und falls erforderlich, Ausführung von Schritt a), oder d) zur Herstellung einer PTH Verbindung, die zumindest einen Rest enthält, die aus einer an den N-Terminus gebundenen L- oder D-a-Aminosäure und C2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem Ci-aAlkyl, C2-sAlkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl ausgewählt ist und der an die endständige Aminogruppe und/oder eine Seitenkettenaminogruppe gebunden ist, Einführung eines solchen Rests in eine PTH Verbindung, die in geschützter oder ungeschützter Form vorliegt und keinen solchen Rest enthält, und falls erforderlich Ausführung von Schritt a), und Gewinnung der so erhaltenen Verbindungen in freier Form, Salzform oder in Komplexform.

Die Verfahrensschritte a), b) und c) können in Analogie zu bekannten Verfahren bewirkt werden, wie es beispielsweise im Fachgebiet der Peptidchemie bekannt ist oder in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Falls gewünscht können in diesen Reaktionen zur Verwendung bei Peptiden geeignete Schutzgruppen für funktionelle Gruppen verwendet werden, die nicht an der Reaktion beteiligt sind. Der Ausdruck Schutzgruppe kann auch ein Polymerharz beinhalten, das funktionelle Gruppen aufweist.

In Verfahrenschritt b) zur Herstellung einer PTH Verbindung, in der die a-Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und 2 am Aminoterminus durch ein Pseudodipeptid ersetzt sind, kann ein als Ausgangsmaterial verwendetes Peptidfragment das Pseudodipeptid an seinem N-Terminus enthalten. Dieses Ausgangsmaterial kann gemäss dem Verfahrensschritt c) hergestellt werden.

In Verfahrensschritt c) kann das als Ausgangsmaterial verwendete Pseudodipeptid eine Verbindung der Formel llaa oder llbb sein

ZZ'N - CHY - CW = CH - CHY' - COOH (llaa)

ZZ'N - CyaYb - CH2 - NZ" - CHY' - COOH (llbb)

worin Y, Y', Ya, Yb, 2, Z', Z" und W wie oben definiert sind oder ein funktionelles Derivat hiervon, beispielsweise ein Ester, ein saures Halogenid oder ein symmetrisches oder asymmetrisches Anhydrid.

Verbindungen der Formel llaa, in der W und Y' zusammen mit der Gruppe -C=CH-CH- , an die sie gebunden sind, einen wahlweise substituierten aromatisch-cyclischen oder heterocyclischen Rest bilden, und Verbindungen der Formel llbb, worin Z" für Alkyl oder eine Schutzgruppe steht, beispielsweise Acetyl, oder worin -CYaYb für C3-6Cycloalkyl steht und Z" für H steht, sind neu und Teil der Erfindung.

Der Verfahrensschritt d) kann in Analogie zu bekannten Verfahren, beispielsweise Alkylierungsverfah-ren, ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Alkylierung unter reduktiven Bedingungen ausgeführt, beispielsweise mittels eines entsprechenden Aldehyds oder Ketons. Sie kann beispielsweise in Gegenwart von NaBHaCN ausgeführt werden, vorzugsweise bei einem sauren pH, beispielsweise von 5 bis 7. Die Temperatur der Reaktion kann von beispielsweise -20°C bis 100°C betragen. Es kann vorteilhaft sein, die Reaktion in einem inerten Lösemittel auszuführen, beispielsweise Wasser, einem Alkohol, Dioxan oder DMF oder einem Gemisch hiervon. Eine D- oder L-a-Aminosäure kann gemäss dem bekannten Verfahren auch an den N-Terminus gebunden werden.

Das in Verfahrensschritt b) als Ausgangsmaterial verwendete Peptidfragment kann eine oder mehrere unnatürliche Aminosäureeinheiten umfassen, es kann auch am N-Tenminus und/oder an den Seitenket-tenaminogruppen durch einen Rest substituiert sein, die aus C2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem Ci-sAlkyl, C2-8Alkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl ausgewählt ist, oder es kann eine D- oder L-a-Aminosäure am N-Terminus tragen.

Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Fragmente hiervon, die natürliche a-Aminosäureeinheiten enthalten, können auch mittels rekombinanter Technologie hergestellt werden. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids geliefert, in dem ein Fusionsprotein in Bakterienzellen exprimiert wird, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid enthält, das das gewünschte Polypeptid an den C-Terminus hiervon gebunden aufweist.

Das Gen 55 Polypeptid kann das gesamte gp55 Protein des Bakteriophagen T4 (188 Aminosäurereste) umfassen, das in H. Gram und R. Rüger, 1985, The EMBO Journal, 4, (1), Seiten 257-264 be9

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schrieben ist. Alternativ dazu kann ein Fragment verwendet werden, vorzugsweise ein N-terminales Fragment des gp 55 Proteins. Beispielsweise kann ein gp55 Proteinfragment verwendet werden, das die ersten 112 N-terminalen Aminosäurereste des Proteins umfasst. Typischerweise umfasst das Gen 55 Polypeptid jedoch mindestens die ersten 25 N-terminalen Reste des gp55 Proteins.

Das mittelgrosse Polypeptid kann etwa 20 bis 100, beispielsweise 150, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 50 Aminosäuren lang sein. Beispiele für mittelgrosse Polypeptide beinhalten Calcitonine, Endorphi-ne, gastroinhibitorische Peptid(e), Glucagon, Neuropeptid Y, Wachtumshormon-Freisetzungsfaktor (GHRF), amyloide ß-Proteinfragmente, Hirudin, Insulin, Somatostatin, epidermalen Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor und PTH oder Fragmente hiervon. Besonders bevorzugte mittelgrosse Polypeptide, die gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, sind die erfindungsgemässen Verbindungen oder Fragmente hiervon, die natürliche Aminosäuresubstitutionen aufweisen.

Bequemerweise enthält das Gen 55-PTH Fusionsprotein auch einen spaltbaren Linker zwischen dem Gen 55 Polypeptid und dem gewünschten Polypeptid. Vorzugsweise ist der spaltbare Linker chemisch spaltbar und noch bevorzugter enthält er die Aminosäuresequenzen Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro.

In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid und ein gewünschtes mittelgrosses Polypeptid an den C-Terminus hiervon gebunden enthält.

Die Nukleotidsequenz ist vorzugsweise eine DNA Sequenz, die zur Expression in Bakterien geeignet ist. Diese Sequenz enthält typischerweise Nukleotide zwischen den für das Gen 55 und den das gewünschte Polypeptid kodierenden Sequenzen, die für einen spaltbaren Linker kodieren.

Die Erfindung liefert auch einen bakteriellen Expressionsvektor, der eine für das Fusionsprotein kodierende DNA Sequenz enthält.

Der Expressionsvektor enthält typischerweise zusätzlich zur kodierenden Sequenz des Fusionsproteins geeignete Expressionskontrollsequenzen, einschliesslich eines geeigneten Promotors, eines Operators und einer Ribosomenbindungsstelle und anderen geeigneten regulatorischen Sequenzen. Gewöhnlich enthält der Expressionvektor auch einen oder mehrere Selektionsmarker.

Jeder geeignete Promotor kann verwendet werden, wie der TrpE, Lambda PI, Lambda Pr, lac oder Tac Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor der Bakteriophagen T7 Promotor und der Expressionsvektor ein Plasmid. Zur E. coli Expression kann ein Vektor verwendet werden, der vom R1 oder Col-E1 Plasmid abstammt. Beispielsweise können der von Novagen erhältliche Expressionsvektor pET 17B oder ähnliche Vektoren verwendet werden.

In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung bakterielle Wirtszellen, die mit einer ein Fusionprotein kodierenden Sequenz oder einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind. Jede geeignete bakterielle Wirtszelle kann verwendet werden, obwohl der Wirt vorzugsweise E. coli ist. Beispielsweise können der E. coli Stamm BL21 (DE3) Lys E und ähnliche Stämme verwendet werden.

Vorteilhafterweise reichert sich das Protein innerhalb der Wirtszellen in Form von unlöslichen Einschlusskörpern an und erleichtert daher die Gewinnung des Fusionsproteinprodukts aus den Zellen. Um das gewünschte Polypeptidprodukt aus dem Fusionsprotein zu gewinnen, wird das Protein der Einschlusskörper gelöst, und das gewünschte Polypeptidprodukt vom Fusionsprotein abgespalten. Jede geeignete Lösungsbehandlung kann verwendet werden, einschliesslich Säurebehandlung beispielsweise bei etwa pH 2 bis 4, vorzugsweise mit Säure bei etwa pH 2,5, oder die Behandlung mit einem denaturierenden Mittel, beispielsweise einem milden Denaturierungsmittel, wie Guanidinhydrochlorid. Zusätzlich kann es notwendig sein, eine oder mehrere ungewünschte N-terminale Aminosäurereste vom Produkt zu entfernen, die nach der Spaltung verblieben sind.

Daher liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung des gewünschten Polypeptids in einem bakteriellen Wirt, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:

Veranlassung der wie oben definierten transformierten bakteriellen Wirtszellen, das Fusionsprotein in Form von Einschlusskörpem zu exprimieren,

Isolierung der Einschlusskörper,

Auflösen der Einschlusskörper, und

Abspaltung des gewünschten Polypeptids vom Fusionsprotein.

Im Fall von einigen mittelgrossen Polypeptiden, wie den PTH Verbindungen, ist es normalerweise nicht notwendig, sorgfältig kontrollierte Denaturierungs- und Renaturierungsverfahren zur Bildung von PTH Produkten in aktiver Form, beispielsweise mit PTH-ähnlicher Aktivität, auszuführen. Die mittelgrossen Polypeptidprodukte können in aktiver Form meistens durch Neutralisierung der zur Auflösung verwendeten sauren Bedingungen erhalten werden. Die Lösung und Spaltung des Fusionsproteins kann in einem einzigen Schritt ausgeführt werden.

Die Erfindung beinhaltet auch ein Fusionsprotein, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid und an den C-Terminus hiervon gebunden ein gewünschtes mittelgrosses Polypeptid umfasst.

Durch die Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren und Vektoren wurde festgestellt, dass es möglich ist, grosse Mengen an mittelgrossen Polypeptiden zu produzieren, insbesondere an PTH Produkten. In E. coli wurde festgestellt, dass bis zu etwa 50% des exprimierten Gesamtproteins das gewünschte Fusionsprotein ist. Ebenfalls, dass das Fusionsprotein Einschlusskörper bildet, die leicht vom

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anderen Zellmaterial zu trennen sind. Darüberhinaus bestehen die Einschlusskörper oft aus zumindest etwa 90% des gewünschten Fusionsproteins, was den erforderlichen Reinigungsaufwand deutlich reduzieren kann. Ferner kann die Expression des PTH Produkts in der Form des Fusionsproteins das endogene Prozessieren des Polypeptids in der Bakterienzelle wesentlich reduzieren, was die Erhaltung von homogenen Produkten erlaubt.

Vorzugsweise enthält der spaltbare Linker chemisch spaltbare Aminosäuren benachbart zum N-Terminus des gewünschten Polypeptids, um die Abspaltung des gewünschten Polypeptids vom Fusionsprotein durch einfache chemische Mittel zu erlauben. Vorzugsweise enthält das gewünschte Polypeptid die chemisch spaltbaren Gruppen nicht.

Bevorzugte chemisch spaltbare Linker enthalten die Aminosäuren Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro. Die Asp-Pro oder Asn-Gly Bindungen können chemisch mittels saurer Bedingungen gespalten werden, beispielsweise jeweils Ameisensäure (normalerweise etwa pH 2,5) oder Hydroxylamin. Die Dipeptide Pro-Pro oder Gly-Pro, die am N-Terminus des gewünschten Polypeptids verbleiben, können dann durch eine geeignete Dipeptidylpeptidase entfernt werden. Beispielsweise kann die L. lactis X-Pro-Dipeptidyl-peptidase EC 3.4.14.5 verwendet werden. Diese Peptidase ist in Nardi et al, 1991, Applied and Environmental Microbiology, 57, Seiten 45 bis 50 beschrieben.

Das gewünschte Polypeptid kann nach der Abspaltung vom Fusionsprotein gereinigt werden. Hier können HPLC Reinigungstechniken verwendet werden. Die Reinigung kann vor der Entfernung von allen unerwünschten N-terminalen Aminosäureresten ausgeführt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird ferner in den Beispielen 306 bis 312 geschildert, die sich auf Sequenzen beziehen, welche in den begleitenden Sequenzlisten angegeben sind, worin die SEQ ID Nr. 1 die Aminosäuresequenz und die entsprechende DNA Sequenz eines verkürzten gp55-Asp-Pro-Pro-hPTH(1-38) OH Fusionsproteins zeigt, wie sie in das Plasmid pET17B kloniert ist, und die SEQ ID Nr. 3 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende DNA Sequenz eines Vollängen gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(1-38) OH Fusionsproteins, wie es in das Plasmid pET17B kloniert ist.

In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in °C angegeben. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

BOC

= tert. Butyloxycarbonyl

DMF

= Dimethylformamid

DCM

= Dichlormethan

Fmoc

= 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

HOBt

= 1-Hydroxybenztriazol

TFA

= T rifluoressigsäure

Tri

= Trityl = Triphenylmethyl

RP-HPLC

= Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie

RT

= Raumtemperatur

DNP

= Dinitrophenyl

Tos

= Tosyl

DIPC

= Diisopropylcarbodiimid

Pmc

= 2, 2, 5, 7, 8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl

Ip

= Isopropyl

For

= Formyl

Cpe

= 1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure

Cpp

= 1 -Aminocyclopropan-1 -carbonsäure

Cha

= Cyclohexylalanin tBu

= tert. Butyl

Die SEQ ID Nr. 11 zeigt die Aminosäuresequenz von hPTH(1-34), die SEQ ID Nr. 12 zeigt die Aminosäuresequenz von hPTH(1-36), die SEQ ID Nr. 13 zeigt die Aminosäuresequenz von hPTH(1-38). Die Beispiele 1, 2, 5, 6, 11, 20-24, 27-30, 36, 37, 40, 41, 47, 49, 51, 53, 54, 57, 58, 61, 76-80, 82, 179, 185, 187, 191-193, 226, 230, 237, 239, 256 und 289 basieren auf der SEQ ID Nr. 11, die ausgetauschten Aminosäureeinheiten und ihre Position wird in den eckigen Klammern angegeben. Die Beispiele 12, 13, 18, 19, 31-35, 38, 39, 42-46, 48, 50, 52, 55, 59, 60, 62-71, 81, 83-85, 165-178, 180-184, 186, 188-190, 194-225, 227-229, 231-236, 238, 240-255, 257-266, 268-279, 282-288,

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290-300 und 302-304 basieren auf der SEQ ID Nr. 12, die ausgetauschten Aminosäureeinheiten und ihre Position wird in den eckigen Klammern angegeben. Die Beispiele 3, 4, 7-10, 14-17, 25, 26, 56, 72-75, 81, 86-164, 267, 280 und 281 basieren auf der SEQ ID Nr. 13, die ausgetauschten Aminosäureeinheiten und ihre Position wird in den eckigen Klammern angegeben.

Beispiel 1: Na-Isopropvl hPTH (1-34) NH?

Dieses Peptid wird schrittweise auf einem auf Polystyrol basierenden Harzträger zusammengefügt. Die Boc-Gruppe wird zum Schutz der alpha-Aminogruppe verwendet und die funktionellen Gruppen der Seitenketten werden folgendermassen geschützt: Lys (2-chlorbenzyloxycarbonyl), Ser(benzyl), Thr(ben-zyl), Glu(benzyl) Asp(benzyl), Met(O), His(DNP), Arg(Tos) und Trp(HCO). Die andereren Reste bleiben ungeschützt.

Amino-4-methylphenyl-methyl-co(polystyrol-divinylbenzol = MBHA-Harz) (0,7 mmol/g) wird dem folgenden Behandlungszyklus der Schritte (1) bis (7) unterzogen:

(1) DCM

(2) Trifluoressigsäure (50%) in DCM

(3) DCM

(4) Diisopropylethylamin (10%) in DMF

(5) DMF

(6) vorgebildetes symmetrisches Anhydrid (1,4 mmol pro g Ausgangsharz) der Boc-Aminosäure in DMF

(7) DMF

Die Volumina der Waschschritte und Reagenzien reichen von 5 bis 20 ml pro Gramm Ausgangsharz. Jeder Schritt wird so oft wie nötig wiederholt, um entweder die Reaktion des Harzes zu vervollständigen (Schritte 2, 4, 6) oder die Entfernung des vorherigen Reagenzes vom Harz (Schritte 1, 3, 5, 7) zu vervollständigen. Harzproben werden nach jedem Zyklus entnommen und auf Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch einen colorimetrischen Test auf verbleibende Aminogruppen mittels Ninhydrin getestet.

Kurz vor der Verwendung werden symmetrische Anhydride der Boc-Aminosäuren durch Umsetzung der Boc-Aminosäure (2,8 mmol pro g Harz) und DCCI (1,4 mmol pro g Harz) in DCM, das zur vollständigen Auflösung der Boc-Aminosäure in ausreichenden Mengen DMF enthält, hergestellt. Das Gemisch wird filtriert, mehr DMF wird zum Filtrat gegeben, das durch Verdampfen der flüchtigen Bestandteile bei einer Temperatur nicht über 15°C konzentriert wird, und die entstehende Lösung wird in Schritt (6) verwendet.

Der Reaktionszyklus (1) bis (7) wird für jede Aminosäure ausser Boc-Gln-OH und Boc-Arg(Tos)-OH wiederholt, die in Schritt (6) als vorgefertigte 1-Hydroxybenztriazolester in DMF angekuppelt werden, um so die Sequenz der Titelverbindung herzustellen.

Das komplett zusammengesetzte Peptidharz wird zweimal mit 20 ml 5% Thiophenol in DMF bei Raumtemperatur für eine Stunde behandelt und mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen. Das Peptidharz wird erneut den Schritten (1) bis (5) unterzogen, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml Aceton, 84 mg Natriumcyanborhydrid und 0,2 ml Essigsäure in 20 ml DMF pro Gramm Harz. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das Harz mit DMF und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.

Das Peptidharz wird mit flüssigem HF, Dimethylsulfid, p-Kresol und Ethan-1,2-dithiol gemäss dem «niedrig-hoch» Verfahren behandelt, das beispielsweise in International Journal of Peptide and Protein Research, Band 26, Seiten 262-273 (1985) beschrieben ist. Nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile und Waschen mit Ethyacetat wird der Rückstand mit einigen Portionen 1 %iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird durch wiederholte Umkehrphasenchromatographie auf einer Octadecyl-Kieselgelsäule mittels eines Gradienten aus Acetonitril in 2% Phosphorsäure oder in 20 mM Tetramethylammoniumphosphat gereinigt. Die die reine Verbindung enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, durch ein schwaches lonenaustauscherharz in Acetatform filtiert und das Filtrat wird unter Erhaltung der Titelverbindung lyophilisiert. MS (lonenspray): 4160.

Beispiel 2: fLvs (Ns-lsoDroDvlì2£^ZlhPTH(1-34l NH?

Das Peptid wird wie für Beispiel 1 beschrieben zusammengefügt, aber man verwendet Lys(Fmoc) zum Einbau in die Position 13 und Fmoc-Ser(tBu) in die endständigen Position 1.

Das vollständig zusammengefügte Peptidharz wird zweimal mit 20 ml 5% Thiophenol in DMF bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt und mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen. Das trockene Harz wird mit flüssigem HF behandelt, wie dies für Beispiel 1 beschrieben ist. Das Spaltprodukt (350 mg) wird in einem Gemisch aus Methanol (5 ml), Phosphatpuffer pH = 5,0 (5 ml), Natriumcyanborhydrid (48 mg) und Aceton (0,28 ml) suspendiert. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in 20%igem Piperidin in DMF für 15 Minuten suspendiert, mit 20 Volumina Ether verdünnt und filteriert. Der Rückstand wird in 100 ml

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Wasser und bis auf pH = 3 zugegebener Essigsäure gelöst, filtriert und das Filtrat wird lyophilisiert. Das Lyophilisat wird durch Umkehrphasenchromatographie auf einer Octadecyl-Kieselgelsäule gereinigt, indem man einen Gradienten von Acetonitril in 2% Phosphorsäure verwendet. Fraktionen, die die reine Verbindung enthalten, werden vereinigt, durch ein schwach basisches lonenaustauscherharz in Acetat-form filtriert und das Filtrat unter Erhaltung der Titelverbindung lyophilisiert.

MS (lonenspray): 4205,6

Beispiel 3: N«-lsopropvl fLvs (N£-lsopropvlllä-2£.2ZlhPTHM-38i-OH

a) Festphasenpeptidsynthese

Das Peptid wird schrittweise auf einem Harzträger auf Polystyrolbasis synthetisiert. Die alpha-Amino-gruppe wird durch Fmoc geschützt und die funktionellen Gruppen der Seitenkette sind folgende: Asp(OtBu), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg(Pmc) und Ser(tBu). Die anderen Aminosäuren bleiben ungeschützt. Zu 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-co(polystyrol 1% - divinylbenzol) verestertes Fmoc-Gly, 0,5 mmol/g, wird als Ausgangsmaterial für die schrittweise Festphasensynthese verwendet, die aus repetitiven Zyklen mit Abspaltung der Schutzgruppen der alpha-Aminosäure, Waschen, Kuppeln (Anhängen der neuen Aminosäure) und Waschen bestehen. Ein drei- bis fünffacher Überschuss an Fmoc-Aminosäuren in Form von vorgefertigten HOBt-Estern wird mittels DIPC gekuppelt. Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt) werden als symmetrische Anhydride mittels DIPC gekuppelt. Nach dem vollständigen Zusammensetzen der Peptidkette wird die Fmoc-Schutzgrup-pe von Ser1 durch 20% Piperidin/DMF entfernt. Die Abspaltung des Peptids vom Polystyrolharz und die Entfernung aller Schutzgruppen der Seitenketten wird durch die Behandlung des Peptidharzes mit einem Gemisch aus 10% Ethandithiol, Thioanisol, Thiokresol und Wasser in 90% TFA für drei Stunden bei Raumtemperatur erreicht. Die Harzpartikel werden wegfiltriert und mit etwas TFA gewaschen. Das Produkt wird aus den vereinigten Filtraten durch die Zugabe von Ether ausgefällt, filtriert und getrocknet. Das Produkt wird dann durch Chromatographie auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten von Acetonitril in 2% H3PO4 / Wasser gereinigt. Die die reine Verbindung enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz (Biorad, AG 4-X4, 100-200 Mesh in Acetat-form) filtriert und unter Erhaltung von hPTH-(1-3B)-OH lyophilisiert.

b) Alkylierung

40 mg (9 umol) hPTH-(1-38)-OH (4458,2 g/mol) werden in 1,2 ml Methanol, 1,2 ml Phosphatpuffer (Merck Nr. 9887, der auf pH 5,0 einyestellt ist), 45 mg (716 mmol) NaLHsCN (62,84 g/mol) und 0,8 ml (11 mmol) Aceton (73,52 ml/mol) gelöst. Die Reaktion wird mittels RP-HPLC auf einer C-18 Kieselgelsäule verfolgt und ist nach 15 Stunden bei Raumtemperatur beendet. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten von Acetonitril in 2% H3PC>4/Wasser chromatographiert. Die die reine Verbindungen enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz (Acetatform) filtriert und unter Erhaltung der Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat lyophilisiert.

[a] 2d° = -5,7° (c = 0,317 in 95 % AcOH)

MS (lonenspray): 4626

Beispiel 4: Na-Methyl [Ala1)PTH-f1-38i-OH

Die Peptidkette wird auf dieselbe Weise zusammengesetzt, wie in Beispiel 3a. An der Position 1 wird anstatt Fmoc-Ser(tBu)-OH die unnatürliche Aminosäure Fmoc-N«-Methyl-Ala-OH an das Peptidharz gekuppelt. Abspaltung, Abspalten von Schutzgruppen und Reinigung werden wie in Beispiel 3a durchgeführt.

MS (lonenspray) = 4455,91

Beispiel 5: fAla1. Ala3, Leu8. Gln13. Ala16. Gin™. Ala19. Phe". His™. His^, Leu27. Thr33, Ala34lhPTH(1-34) OH

Dieses Peptid wird in Analogie mit dem Verfahren von Beispiel 3a hergestellt. Anstatt zu 4-Hydroxy-methylphenoxymethylco(polystyroldivinylbenzol) verestertes Fmoc-Gly wird die geeignete Fmoc Aminosäure, beispielsweise Fmoc-Ala, Fmoc-Phe, Fmoc-D-Ala, Fmoc-D-Phe usw. verwendet. Zusätzlich werden die funktionellen Gruppen der Seitenketten folgendermassen geschützt: Thr(t-Butyl), Trp(Boc) und Tyr(t.-Butyl).

Durch Wiederholen des in den Beispielen 3 und 5 beschriebenen Verfahrens aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien können die folgenden Verbindungen erhalten werden.

Beispiel 6: [Leus, Asp1", Ala16, Gin™, Thr33]hPTH(1-34) OH Beispiel 7: [lle1]hPTH(1-38) OH (IS-MS: 4484)

13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Beispiel 8: [Alai, Abu2]hPTH(1-38) OH (IS-MS: 4428)

Beispiel 9: [Alai, Nva2]hPTH(1-38) OH (IS-MS: 4442)

Beispiel 10: [Alai, He2]hPTH(1-38) OH (IS-MS: 4456)

Beispiel 11: [Alai, Ala3, Leu8, Gin", Ala«, Gin«, Ala«, His26, Leu2?, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 12: [N-MeAlai]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4286)

Beispiel 13: [Alai, Ala3, Leu8, Gln18]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4235)

Beispiel 14: [Thr1]-hPTH-(1-38) OH (IS-MS: 4472)

Beispiel 15: [Leui]-hPTH-(1-38) OH (IS-MS: 4484)

Beispiel 16: [Abui]-hPTH-(1-38) OH (IS-MS: 4456)

Beispiel 17: [Gabai]-hPTH-(1-38) UH (IS-MS: 4456)

Beispiel 18: [Leu», Lys", Gln«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 19: [Leu8, Gin«, Asp", Leu«, Arg«, Arg22]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4347)

Beispiel 20: [Leu8, Gin«, Thr33, Ala34]-hPTH(1-34) OH (IS-MS: 4007)

Beispiel 21: [Leu8, Ala«, Gin«, Ala«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 3906)

Beispiel 22: [Leu», Ala", Gin«, Gln26, Phe27, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 23: lp-[Leu8, Lys(IP)", Gin«, Lys(IP)26.27, Ihr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 4175)

Beispiel 24: lp-[Leu8, Ala", Gin«, Gln26, Phe??, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 25: [Gln"]hPTH(1-38) OH

Beispiel 26: [Seri4]hPTH(1-38) OH

Beispiel 27: [Alai, A|a3, Leu«, Gin", Ala«, Gin«, Ala«, His25, His26, Leu27, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH Beispiel 28: [Alai, A|a3, Leu8, Gin", Ala«, Gin«, Ala«, Gin*«*, Phe27, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH Beispiel 29: [Leu6, Ala«, Gin«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 3965)

Beispiel 30: [Leu8, Gin«, Ala29, Glu3°, lle3i]hPTH(1-34) OH Beispiel 31: [Leu8, Asp", Lys", Gln«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 32: [Leu8, Aspi°, Lys11, Ser14, Ile15, Gin«, Asp17, Leu«, Arg«]hPTH(1-36) OH

Beispeil 33: [Leu8, Aspi°, Lys", Leu«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 34: [Leu8, Gin«, Asp17, Leu«, Arg«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 35: [Leu6, Aspi°, Lys", Ala", Leu«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4252)

Beispiel 36: [Leu8, Gin«, Asp", Leu«, Arg«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 37: [Leu8, Aspi°, Lys", Gin«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 4022)

Beispiel 38: [Leu8, Ala«, Asp", Leu«, Ala«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 39: [Leu8, Asp", Ala«, Asp", Leu«, Ala«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 40: [Leu8, Gin«, Arg22, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 41: [Leu8, Asp", Lys", Gin«, Asp", Leu«, Arg«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 4077)

Beispiel 42: [Leu8, Asp", Lys", Ala«, Gin«, Ala«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4181)

Beispiel 43: [Leu8, Ala«, Asp", Gin«, Ala«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4193)

Beispiel 44: [Leu8, Ala«, Ala", Gin«, Ala«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4149)

Beispiel 45: [Leu8, Ala", Gin«, Ala«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 46: [Leu8, Ala", Gin«, Ala«, Arg22]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4219)

Beispiel 47: [Leu®, Ala", Gin«, Ala«, Arg22, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 3960)

Beispiel 48: [Leu8, Gln«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 49: [Leu8, Asp", Lys", Ala«, Gin«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 3980)

Beispiel 50: [Leu8, Asp", Lys", Ala«, Gln«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4240)

Beispiel 51: [Leu8, Asp", Lys", Ala", Gin«, Ala«, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 3923)

Beispiel 52: [Leu8, Asp", Ala", Gln«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4225)

Beispiel 53: [Leu8, Asp", Lys", Ala", Gin18, Ala«, Thr33]hPTH(1-34) OH (IS-MS: 3999)

Beispiel 54: [Leu8, Gin", Ala", Gin«, Ala«, His26, Leu27, Thr33]hPTH(1-34) OH

Beispiel 55: [Leu8, Ala", Gin18, Ala«, Arg22]hPTH(1-36) OH

Beispiel 56: [lle«]hPTH(1-38) OH

Beispiel 57: [Leu8, Gin", Ala«, Gin18, Ala«, Arg22, His26, Leu27, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 58: [Leu«, Gin", Ala«, Gin«, Arg«, His^r Leu?7, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 59: [Leu8, Ser", Ala«, Gin«, Ala«, Arg22]hPTH(1-36) OH

Beispiel 60: [Leu8, Ala", Ala", Gin«, Ala«, Arg28, Arg27]hPTH(1-36) OH

Beispiel 61 : [Leu8, Gin", Ala", Gin«, Ala«, His26, Leu27, Arg33, Ala34]hPTH(1-34) OH

Beispiel 62: [Leu8, Alaie.1718.19]hPTH(1-36) OH

Beispiel 63: [Leu8, Ala", Ala", Gin«, Ala«, Gln26, Phe27]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4127)

Beispiel 64: [lp-[Leu8, Ala", Ala«, Gin«, Ala«, Gln26, Phe27]hPTH(1-36) OH

Beispiel 65: lp-[Leu8, Lys(lp)", Ala«, Gin«, Ala«, Lys(lp)26.27]hPTH(1-36) OH

Beispiel 66: [Leu8, Ala«, Gin«, Ala«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4166)

Beispiel 67: lp-[Leu8, Lys(lp)", Ala", Ala", Ala«, Ala«, Lys(lp)26.27]hPTH(1-36) OH

Beispiel 68: [Aib3, Gln«]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4283)

Beispiel 69: Ip-fLeu«, Asp", Lys(lp)i1 13.26,27, Gln«]hPTH(1-36) OH

Beispiel 70: lp-[Leu8, Ser", Ala", Gin«, Ala«, Arg22, Lys(lp)2627]hPTH(1-36) OH

Beispiel 71: [Leu8, Tyr18]hPTH(1-36) OH

Beispiel 72: [Ser33]-hPTH-(1-38)-OH

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Beispiel 73: [Thr33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 74: [Thr33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 75: [Gly33]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 76: [Leu8, His10, Gin«, Arg22, Thr33, Ala3<t]hPTH(1-34) OH Beispiel 77: [Leu8, Gly10, Gin18, Arg22, Thr33, Ala3«]hPTH(1-34) OH Beispiel 78: [Leu8, Glu10, Gin18, Arg22, Thrss, Ala3"]hPTH(1-34) OH Beispiel 79: [Leu8, Thr10, Gin18, Arg22, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH Beispiel 80: [Leu8, Gin10, Gin18, Arg22, Thr33, Ala3i]hPTH(1-34) OH Beispiel 81: [Gln33]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 82: [Leu«, Tyr10, Gin18, Arg22, Thr33, Ala3i]hPTH(1-34) OH

Beispiel 83: [1-Aminocyclopentan-1-cabonsäure1, Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(1-36) OH

Beispiel 84: [1-Aminocyclopentan-1-carbonsäre1, Leu8, Ala13.16. Gin18, Ala19, Arg2627]nPTH(1-36) OH

Beispiel 85: [1-Aminocyclopentan-1-carbonsäre3, Gln,8]hPTH(1-36) OH (IS-MS: 4309)

Beispiel 86: [Arg12]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 87: [Ser12]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 88: [Cys13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 89: [lle13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 90: [Asn13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 91: [Trp13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 92: [Asp13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 93: [VaP3]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 94: (Thr13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 95: [Ser13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 96: [Tyr13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 97: [Met13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 98: [Gln13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 99: [Leu13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 100: [Ala13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 101: [Gly13]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 102: [Val1<»]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 103: [Ala1"]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 104: [Lys1"]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 105: [Arg1"]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 106: [Thr14]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 107: [lle14]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 108: P"yr1"]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 109: [Tyr15]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 110: [Arg15]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 111: [Val15]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 112: [Lys16]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 113: [Ser18]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 114: [Leu16]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 115: [Ala16)-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 116: [Gly16]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 117: [Ala17]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 118: [Met17]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 119: [lle17]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 120: [Ser19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 121: [Lys19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 122: [Leu19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 123: [Ala19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 124: [Tyr19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 125: [Met19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 126: [His19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 127: [Val19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 128: [Gly19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 129: [Pro19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 130: [Asp19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 131: [lle19]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 132: [Val«, Gln2*]-HPTH-(1-38)-OH

Beispiel 133: [Arg«]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 134: [Phe2°]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 135: [Ala21]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 136: [Gly21]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 137: [Phe2']-hPTH-(1-38)-OH

15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Beispiel 138: [Leu2i]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 139: [Asn2i]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 140: [Gln2i]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 141: [Ser2i]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 142: [Gly22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 143: [Leu22-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 144: [His22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 145: [Ala22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 146: [He22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 147: [Va|22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 148: [Ser22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 149: [Arg22]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 150: [Arg26]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 151: [Va|27]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 152: [He27]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 153: [Leu27]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 154: [Arg27]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 155: [Ala2?]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 156: [Va|28]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 157: [Ne2e]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 158: [Pro3, Thr33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 159: [Arg33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 160: [Pr033]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 161: [Asp33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 162: [He33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 163: [LyS33]-hPTH-(1-38)-OH Beispiel 164: [Ile3\ Arg33]-hPTH-(1-38)-OH

Beispiel 165: f1-Aminocyclopentan-1-cabonsäure1lhPTH-(1-36l NH?

Das Peptid wird schrittweise an einem auf Polystyrol basierenden Harzträger zusammengefügt. Die Fmoc-Gruppe wird zum Schutz der alpha-Aminogruppen verwendet.

Die funktionellen Gruppen der Seitenketten werden als Arg(Pmc), Asn(Trt), Asp(OtBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), His-(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) und Syr(tBu) geschützt. Andere Aminosäuren bleiben ungeschützt.

4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyco(polystyrol-divinylbenzol), 0,4 mmol/g, das beispielsweise wie in Tetrah. Letters, 28, 3787-3790 (1987) beschrieben hergestellt werden kann, wird dem folgenden Behandlungszyklus der Schritte (1) bis (5) unterzogen:

(1) DMF

(2) Piperidin (20%) in DMF

(3) DMF

(4) Mischung von HOBt, Diisopropylcarbodiimid und Fmoc-Alanin (jeweils 0,8 mmol pro Gramm Ausgangsharz)

(5) DMF

Die Volumina der Waschschritte und Reagenzien reichen von 5 bis 20 ml pro Gramm Ausgangsharz.

Im nächsten Behandlungszyklus (1) bis (5) wird Fmoc-Alanin durch Fmoc-Valin und so weiter bei jedem Zyklus ersetzt, um am Harz die korrekte Aminosäuresequenz der Titelverbindung zusammenzufügen.

Jeder Schritt wird so oft wie nötig wiederholt, um entweder die Reaktion des Harzes zu vervollständigen (Schritte 2, 4) oder die Entfernung des vorherigen Reagenzes vom Harz (Schritte 3, 5) zu vervollständigen. Harzproben werden nach jedem Zyklus entnommen und auf Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch einen colorimetrischen Test auf verbleibende Aminogruppen mittels Ninhydrin getestet.

Am Ende der Synthese wird ein letzter Zyklus durchgeführt, der nur die Schritte (1) bis (3) enthält, und das Peptidharz wird mit 2-Propanol gewaschen, dann mit einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid (1:1 VA/) gewaschen und sorgfältig in einem Vakuumexsikkator getrocknet.

Das Peptidharz (1 g) wird in einem Gemisch (20 ml) aus Trifluoressigsäure, Wasser und 1,2-Ethan-dithiol (90:5:5 V/V) für 2 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert, die Harzpartikel werden abfiltriert und mit einem kleinen Volumen TFA gewaschen. Das Produkt wird aus den vereinigten Filtraten durch die Zugabe von Ether (20 Volumina) ausgefällt, filtriert, mit mehr Ether gewaschen und getrocknet. Der Rest wird in 2% Essigsäure gelöst, und die Lösung wird bei RT für 8 Stunden vor der Lyophilisierung stehengelassen. Das Lyophilisat wird auf einer C-18 Rieselgelsäule mittels eines Gradienten aus Acetonitril in 2% H3PO4 Chromatographien. Die Fraktionen werden durch analytische HPLC überprüft, und die, die die reine Verbindung enthalten, werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz in der Acetatform filtriert und unter Erhaltung der Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat lyophilisiert.

16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Fmoc-1-amiriocyclopentan-1-carbonsäure, die zur Herstellung des Peptidharzzwischenprodukts verwendet wird, kann hergestellt werden, wie dies beispielsweise durch G. Valle et al., 1988, in Can. J. Chem. 66:2575-2582 beschrieben worden ist.

MS (lonenspray): 4312

Beispiel 166: l1-M-AminocvcEllopropan-1-carbonsäurenhPTH-n-26l NH?

Dieses Peptid wird in Analogie zu dem Verfahren von Beispiel 165 hergestellt. Zur Herstellung des Ppetidharzzwischenprodukts verwendete Fmoc-1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure kann beispielsweise wie von M. Crisma et al. (1989) in Int. J. Biol. Macromol. 11:345-352 beschrieben hergestellt werden.

MS (lonenspray): 4283

Durch Wiederholung des in Beispiel 168 beschriebenen Verfahrens aber unter Venwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien können folgende Verbindungen erhalten werden:

Beispiel 167: [D-Pro1]hPTH(1-36 NH2

Beispiel 168: [Nva1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 169: [N-Me-Ser1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 170: [lndol-2-carbonsäre1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 171: [lndol-3-carbonsäure1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 172: [Pyridin-3-cabonsäure1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 173: [Pyridin-2-cabonsäure1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 174: [Hexahydropyridazin-3-cabonsäure1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 175: [Morpholin-2-cabonsäure1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 176: [Pr0i]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 177: [Leu1]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 178: [l|ei]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 179: [Thr33, Ala3<]hPTH(1-34) NH2

Beispiel 180: [Nva8]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 181: [Gln18]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 182: [Tyr18]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 183: [Lys18]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 184: [Ala1B]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 185: [Phe23, His25, His2«, Leu2?]-hPTH(1-34) NH2

Beispiel 186: [Phe23]-hPTH(1-36) NH2 (IS-MS: 4247)

Beispiel 187: [Phe23, His2s, His*6, Leu2?, lle^s, Ala29, Glu3o, ||e3i, Thr33, Ala34]-hPTH(1-34) NH2 (IS-MS: 3934)

Beispiel 188: [Ala29]-hPTH(1-36) NH2 (IS-MS: 4248)

Beispiel 189: [Ala3"]-hPTH(1-36) NH2 (IS-MS: 4210)

Beispiel 190: [Gln25]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 191: [Leu«, Asp10, Lys", Thr33, Ala3"]hPTH(1-34) NH2

Beispiel 192: [Ala1, His5, Leu«, Asp™, Lys", Thr33, Ala3t]hPTH(1-34) NH2

Beispiel 193: [Ser1", Ile15, Gin16, Asp", Leu18, Arg19, Thr33, Ala3*]hPTH(1-34) NH2

Beispiel 194: [D-Phe34, D-Ala38]hPTH(1-36)-NH2 [MS(IS):4290]

Beispiel 195: [Ala3]hPTH)1-36) NH2 [MS(IS): 4271]

Beispiel 196: [D-Ser3]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 290]

Beispiel 197: [D-Glu4]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4290]

Beispiel 198: [D-His9]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4286]

Beispiel 199: [Ala1<>]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 42431]

Beispiel 200: [D-Asn«>]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 201 : [Ala12]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4299]

Beispiel 202: [Gln13]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4287]

Beispiel 203: [His13[hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4296]

Beispiel 204: [Leu13]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4371]

Beispiel 205: [Alai3]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4228]

Beispiel 206: [Ala", Gln2e, Phe3", D-Ala36]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4249]

Beispiel 207: [Ala™]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4219]

Beispiel 208: [D-His'"]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 209: [D-Asn16]hPTH(+-36) NH2 [MS(IS): 4284]

Beispiel 210: [Ala"hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4270]

Beispiel 211: [D-Ser"]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 212: [Ala19]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4228]

Beispiel 213: [D-Glu19]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 214: [Ala21]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4257]

Beispiel 215: [Ala22]hPTH(+-36) NH2 [MS(IS): 4227]

Beispiel 216: [Gln26]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4287]

17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Beispiel 217: [Nle26]hPTH(1-36( NH2 [MS(IS): 4271]

Beispiel 218: [D-Lys26]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 219: [Nie*, 1B, 27]hPTH{1-36) NH2

Beispiel 220: [His27]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4294]

Beispiel 221: [Phe27]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4304]

Beispiel 222: [Nle27]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS):4271]

Beispiel 223: [Asn27]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4271]

Beispiel 224: [Ala27]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4228]

Beispiel 225: [D-Gln29]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4289]

Beispiel 226: [D-Asp30]hPTH(1-34) NH2 [MS(IS): 4118]

Beispiel 227: [Ala30]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4241]

Beispiel 228: [D-Val31]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4290]

Beispiel 229: [Ala31]hPTH(1-36) NH2 (MS(IS): 44258]

Beispiel 230: [Lys32]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 3832]

Beispiel 231 : [D-His32]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 232: [Ala32]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4219]

Beispiel 233: [D-Asn33]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 234: [Ala33]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4210]

Beispiel 235: [NMePhe34]hPTH(1-36) HN2 [MS(IS): 4301]

Beispiel 236: [D-Asp30]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4290]

Beispiel 237: lp-[Nle8, LysflpF, 26, 27, D-Asn33, D-Phe34]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 238: lp-[Nle8, « 27, LysfIP)«, 26]hPTH(1-36) NH2

Beispiel 239: [Nie«, «, D-Asn33, D-Phe34]hPTH(1-34) NH2 [MS(IS): 4080]

Beispiel 240: [Lys(IP)«]hPTH(1-36) NH2 [MS(IS): 4331]

Beispiel 241 : Propargyl-[A1]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 242: [Ala°]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 243: [Pro0]-HPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 244: Acetyl-HPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 245: [HyPro1]-HPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 246: N-Dimethyl-[Ala1]-HPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 247: [D-Seri]-HPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 248: [Lys(For)i]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4356]

Beispiel 249: [D-Glycerinsäure1]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 250: [Asn1]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 251 : [4-Aminobenzoesäure1]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 252: [4-Aminosalicylsäure1]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 253: rMSAi]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4343]

Beispiel 254: [Phel]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 255: [Propargylglycin1]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 256: [Ala1, His5, Leu8, Asp10, Lys11, Gln1s, Phe22, Phe23, His25, His26, Leu27, Thr33, Ala3«]-hPTH-(1-34)-NH2

Beispiel 257: [Abu2]-hPTH-(1-36)-NH2 Beispiel 258: [D-Val2]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 259: [tert.Leu2]-hPTH-(1-36)-NH2 Beispiel 260: [Ala1]-hPTH-(1-36)-NH2 Beispiel 261: [D-lle5]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 262: [D-Gln6]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 263: [D-Leu7]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 264: (Nle8]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4268]

Beispiel 265: [Phe8]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4303]

Beispiel 266: [Cha8]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4309 Beispiel 267: [Leu8]-hPTH-(1-36)-NH2 Beispiel 268: [D-Leu11]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4287]

Beispiel 269: [Ala"]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4244]

Beispiel 270: [D-Lys13]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 271: [D-Leu15]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 272: [Ala15]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4243]

Beispiel 273: [Ala16]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4243]

Beispiel 274: [Met(02)18]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4320]

Beispiel 275: [Nle18]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4268]

Beispiel 276: [D-Met18]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 277: [Lys20]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4259]

Beispiel 278: [D-Arg2°]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 279: [D-Va|21]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 280: [Trp(S02Pmc)23]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4723]

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Beispiel 281 : Trp(Pmc)23]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4660]

Beispiel 282: [D-Trp23]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 283: [Ala23]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4171]

Beispiel 284: [D-Leu2"]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 285: [Phe25]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4277]

Beispiel 286: [Lys25]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4258]

Beispiel 287: [Ala25]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4201]

Beispiel 288: [Ala26]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4229]

Beispiel 289: [Lys26/27(For)]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 290: [D-Lys27]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 291: [D-Leu28]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 292: [D-Phe34]-hPTH-(1-36)-NH2 [MS(IS): 4288]

Beispiel 293: [D-Va|35]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 294: [Ala35]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 295: [Pro35]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 296: [NMeVa|35]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 297: [Thrss, Ala36]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 298: [D-Ala36]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 299: [NMeAla36]-hPTH-(1-36)-NH2

Beispiel 300: (5-Amino-4-fluor-2-isopropvn-hex-3-enovl-hPTH-(3-36ì NH?

a) Herstellung von hPTH-(3-36)-NH-Harz

Dieses Zwischenprodukt wird in Analogie zum Verfahren von Beispiel 165 hergestellt.

b) [(5-Amino-4-fluor-2-isopropyl)-hex-3-enoyl]hPTH(3-36)-amid

204,6 mg Fmoc-hPTH(3-36)-NH-Harz, die wie in a) oben beschrieben erhalten wurden, werden für 5 Minuten mit DMF behandelt und dann einige Male mit Isopropanol und DMF gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppe wird durch die Behandlung mit DMF/Piperidin 8:2 für 10 Minuten entfernt. Das ungeschützte PTH-Fragment, 38,1 mg 4-Fluor-2-isopropyl-5-t.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure, 68,7 mg Benztriazol-1-yloxytris(pyrrolidin)phosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) und 26,6 mg 4-Methylmorpho-lin werden für 80 Minuten in 0,7 ml DMF geschüttelt. Nach einigen Waschschritten mit Isopropanol und DMF wird der feste Rückstand mit 4,5 ml TFA/0,25 ml Wasser / 0,25 ml Ethandithiol für 55 Minuten behandelt. Dieses Gemisch wird dann filtriert, und durch die Zugabe von Diethylether wird die Titelverbindung aus der verbleibenden Lösung ausgefällt. Die Titelverbindung wird durch präparative HPLC (Vydac Säule, Gradient A = Wasser, B = 7 Acetonitril / 3 Wasser / 0,2 Phosphorsäure) gereinigt. MS (lonenspray): Masse 4272 [a] j$5 nm = -66,8° (c = 0,25 in 95% AcOH)

Beispiel 301: 4-Fluor-2-isoproyl-5-tert.-butoxvcarbonvlamino-hex-3-enoat a) (S)-3-( 1 -Oxo(4-fluor-3-hvdroxv-2-isopropvhhex-4-envh-4-phenvlmethvl-2-oxazolidinon

Die Titelverbindung wird analog zu dem von D. A. Evans et al. in Org. Synth. 68, 1990 beschriebenen Verfahren hergestellt, indem man von (S)-3-(1-Oxoisobutyl)-4-phenylmethyl-2-oxazolidinon und 2-Fluor-but-2-enal ausgeht.

MS (FAB): MH+350

b) (S)-3-(1-Oxo(4-fluor-3-Q-(2.2.2-trichlorethanimo)-2-isoproPvli-hex-4-enyn-4-phenvlmethvl-2-oxazolidinon

1,5 g der Verbindung von Beispiel 301a) werden in 6 ml DCM gelöst. Bei 0°C werden 0,0958 ml 1,8-Diazabicyclo(5,4,0)undec-7-en (DBU) zugegeben. Zu dieser Lösung werden 0,475 ml Trichloracetonitril in 2 ml DCM tropfenweise bei 0°C gegeben. Nach 1 Stunde wird das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Hexan/Diethylether 2:1) gereinigt. MS (FAB): MH+ 493

c) (S)-3-n-Oxo(4-fluor-5-N-(2.2.2-trichloracetvlamino)-2-isopropvl)-hex-3-envh-4-phenvlmethvl-2-oxazolidinon

2 g der Verbindung von 301b) werden in 150 ml o-Xylol gelöst und unter Rückfluss bei 160°C für

3 Stunden gerührt. Dann wird o-Xylol entfernt und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Toluol/Ethylacetat 98:2) gereinigt.

MS (FAB): MH+ 493

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

d) 4-Fluor-5-N-2.2.2-trichloracetvlamino-2-isoDroDvl-hex-3-ensäure

Die Titelverbindung wird analog dem Verfahren hergestellt, das von D. A. Evans et al., Org. Synth. 68 1990 bschrieben wurde, aber unter Venwendung der Verbindung von 301 c) als Ausgangsmaterial. MS (FAB): MH+ 335

e) 5-Amino-4-fluor-2-isoproovl-hex-3-ensäure

899 mg der Verbindung 301 d) werden in 20 ml Ethanol gelöst und 13,5 ml 6 N Natriumhydroxidlösung werden zugegeben. Dieses Gemisch wird für 20 Stunden bei RT gerührt. Dann wird das Ethanol entfernt und die verbleibende wässrige Fraktion wird mit 2 N HCl auf pH = 2 angesäuert und mit n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wird eingedampft und der Rückstand wird durch Kieselgel (DCM/ Methanol 1:1) unter Erhaltung der reinen Titelverbindung filtriert.

MS (FAB): MH+ 190

0 4-Fluor-2-isoDropvl-5-tert.-butoxvcarbonvlamino-hex-3-ensäure

0,56 g der Verbindung von 301 e) werden in 12 ml Wasser gelöst, und 1,5 g Natriumcarbonat werden zugegeben. Zu dieser Lösung werden 0,4 g Di-tert. Butylcarbonat gegeben, die in 12 ml Tetrahy-drofuran gelöst sind. Dieses Gemisch wird bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Dann werden 50 ml n-Butanol und 50 ml Wasser zugegeben und unter starkem Rühren wird 1 N HCl bis pH = 2 zugegeben. Die organische Fraktion wird eingedampft und der Rückstand durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Hexan/Aceton 1:2) gereinigt.

MS (FAB): MH+ 290 [<x]d = -61,3° (1% in Methanol)

Durch Wiederholung der obigen Verfahren aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien werden die folgenden Verbindungen hergestellt:

4-Fluor-2-methyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure

4-Chlor-2-methyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure

4-Fluor-2-benzyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure

4-Chlor-2-isopropyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure

4-Methyl-2-isopropyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure

Beispiel 302:

Gemäss dem Verfahren des obigen Beispiels 300, aber unter Venwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können die folgenden Verbindungen hergestellt werden: -(5-Amino-4-fluor-2-methyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (lonenspray): Masse 4245 -(5-Amino-4-chlor-2-methyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (lonenspray): Masse 4260 -(5-Amino-4-fluor-2-benzyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (lonenspray): Masse 4320 -(5-Amino-4-chlor-2-isopropyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (lonenspray): Masse 4289 -(5-Amino-4-methyl-2-isopropyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (lonenspray): Masse 4269

Beispiel 303:

Gemäss dem Verfahren des obigen Beispiels 300, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können die folgenden Verbindungen hergestellt werden:

a) (5-Amino-3-aza-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (lonenspray): 4257] unter Verwendung von (4-Aza-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure als Ausgangsmaterial.

b) (5-Amino-3-aza-3-N-acetyl-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (lonenspray): 4299] unter Venwendung von (4-Aza-4-N-acetyl-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure als Ausgangsmaterial.

c) (5-Amino-3-aza-3-N-acetyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (lonenspray): 4257] unter Verwendung von (4-Aza-4-N-acetyl-2-t.-butoxycarbonylamino)-hexansäure als Ausgangsmaterial.

d) (5-Methylamino-3-aza-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (lonenspray); 4271] unter Verwendung von [4-Aza-2-(N-t.-butoxycarbonyl, N-methylamino)-5-isopropyl]-hexansäure als Ausgangsmaterial.

e) (5-Methylamino-3-aza-3-N-methyl-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH-(3-36)-amid [MS (lonenspray): 4235] unter Verwendung von [4-Aza-4-N-methyl-2-(N-t.-butoxycarbonylamino, N-methylamino)-5-isopropyl]-hexansäure als Ausgangsmaterial.

f) (5-Amino-3-aza-3-N-methyl-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (MS (lonenspray): 4271] unter Verwendung von (4-Aza-4-N-methyl-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure als Ausgangsmaterial.

20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

g) (5-Amino-3-aza-3-N-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (lonenspray): 4257] unter Venwendung von (4-Aza-4-N-isopropyl-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure als Ausgangsmaterial.

h) [1-cyclopentan-1-amino-1 -carbonsäure (psi CH2-NH)-Val2]-pTH(1-36)-amid unter Verwendung von 1-cyclopentan-1-t.butoxycarbonylamino-1-carbonsäure (psi CH2-NH)-Val-OH als Ausgangsmaterial.

Beispiel 304:

Gemäss dem Verfahren des obigen Beispiels 3 a) aber unter Verwendung des geeigneten Ausgangsmaterials kann die folgende Verbindung hergestellt werden:

(5-Amino-3-aza-2-isopropyl)-hexanoyl-[Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]-hPTH(3-36) OH [MS (lonenspray): 4135] unter Verwendung von (4-Aza-2-t.-butoxycarbonylamino)-hexansäure als Ausgangsmaterial.

Beispiel 305: (4-Aza-4-N-acetvl-2-tert.-butoxvcarbonylaminoV5-isopropvh-hexansäure a) Methvl(4-aza-2-tert.-butoxvcarbonvlamino-5-isopropvh-hexansäure

Boc-Ala-Val-OMe wird mit dem Lawesson-Reagenz (S. O. Lawesson, et al. Tetrahedron 1981, 37, 3635) behandelt. Das entstehende Endothiopeptid wird dann gemäss dem von F. S. Guziec et al. THL,

1990, 23-26 beschriebenen Verfahren reduziert.

MS(EI): MH+ 289

b) Methyl (4-aza-4-N-acetvl-2-tert.-butoxvcarbonvlamino-5-isopropvn-hexanoat

264 mg der Verbindung von 305 a) werden in 5 ml DCM gelbst und dann werden 0,14 ml Triethyl-amin und 0,072 ml Acetylchlorid zugegeben. Dieses Gemisch wird für 24 Stunden bei 40°C gerührt. Nach der Zugabe von 50 ml DCM wird die Lösung zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Fraktion wird getrocknet und eingedampft. Die so erhaltene Titelverbindung wird durch Säulenchromatographie (Hexan/Ethylacetat 4:1) gereinigt.

MS (El): M+ 330

c) (4-Aza-4-N-acetvl-2-tert.-butoxvcvcarbonvlamino-5-isopropvn-hexansäure

356 mg der Verbindung von 305 b) werden in 4 ml Methanol/Wasser 3:1 gelöst, und 53 mg Lithiumhydroxid werden zugegeben. Dieses Gemisch wird bei 60°C für zwei Stunden gerührt. Dann werden 25 ml DCM zugegeben und 1 N HCl wird tropfenweise unter starkem Rühren bis pH = 2 zugegeben. Die organische Fraktion wird abgetrennt, getrocknet und eingedampft und ergibt so die Titelverbindung in reiner Form.

MS (FAB): MH+ 317

Durch Wiederholung des Verfahrens, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können folgende Verbindungen erhalten werden: (4-Aza-4-N-acetyl-2-tert.-butoxycarbonylamino)-hexansäure (4-Aza-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure [4-Aza-2-(N-tert.-butoxycarbonyl, N-methylamino)-5-isopropyl]-hexansäure (4-Aza-4-N-methyl-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure (4-Aza-4-N-isopropyl-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure (4-Aza-2-tert.-butoxycarbonylamino)-hexansäure

Die Verbindungen der Beispiele 1 bis 300 und 302 bis 304 zeigen die korrekten Aminosäureverhältnisse bei der quantitativen Aminosäureanalyse. In den folgenden Beispielen, die das rekombinante Verfahren der Erfindung beschreiben, werden, falls nichts anderes angegeben ist, die in Ausubel et al.,

1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York beschriebenen Standardverfahren verwendet.

Beispiel 306: Klonierung des Bakteriophagen T4 Gen 55

Zwei DNA Fragmente, eines, das die gesamte kodierende Sequenz des Bakteriophagen T4 Gen 55 enthält, und das andere Fragement, das nur einen Teil davon kodiert, werden durch Polymerase-Ket-tenreaktion (PCR) mittels gereinigter T4 DNA als Template amplifiziert. Oligonukleotide, die Ndel oder BamHI Restriktionsschnittstellen enthalten, werden als Primer verwendet. Die PCR Reaktionen (25 Zyklen, jeweils 30s 94°C, 30s 50°C, 30s 72°C) werden mit 1 ng Template und 100 pM des stromaufwärts liegenden Primers (SEQ ID Nr. 5, wobei die Ndel Restriktionsschnittstelle von 7-12 Nukleotiden hiervon geliefert wird) und 100 pM des stromabwärts liegenden Primers (SEQ ID Nr. 6, wobei die BamHI Restriktionsschnittstelle von 5-10 Nukleotiden hiervon geliefert wird) in 100 pl Reaktionspuffer durchgeführt, der 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCb, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, und 0,1% Triton X 100 pH 9,0 enthält. Man erhält ein 0,6 kb Fragment.

Die verkürzte Form des Gen 55 wird durch PCR hergestellt, wie dies für das gesamte Gen beschrie-

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ben ist, mit dem Unterschied, dass man ein anderes Oligonukleotid als stromabwärts liegenden Primer verwendet (SEQ ID Nr. 7, wobei die BamHI Schnittstelle durch die Nukleotide 5-10 hiervon geliefert wird). Man erhält ein 0,35 kb Fragment.

Die 0,6 kb und 0,35 kb DNA Fragmente werden mit den Ftestriktionsendonukleasen Ndel/BamHI verdaut und in den Ndel/BamHI verdauten Expressionsvektor pET17B (erhalten von Novagen) kloniert. Das 0,6 kb DNA Fragment kodiert das gesamte gp55 Protein (188 Aminosäurereste - siehe SEQ ID Nr. 1), während das 0,35 kb Fragment ein aminoterminales 12 kD Fragment von gp55 kodiert (112 Aminosäurereste - siehe SEQ ID Nr. 3)

Beispiel 307: Herstellung und Klonierung der DNA, die hPTH(1-38) OH kodiert

Durch PCR werden DNA Fragmente erzeugt, die a) das den Aminosäureresten 110-115 der SEQ ID Nr. 1 und hPTH (1-38) entsprechende Linkerpeptid oder b) das den Aminosäureresten 186-191 der SEQ ID Nr. 3 und hPTH (1-38) entsprechende Linkerpeptid kodieren, indem man eine klonierte synthetische für PTH (1-38) kodierende Sequenz als Template verwendet. Die den Linker a) (SEQ ID Nr. 8) oder den Linker b) (SEQ ID Nr. 9) kodierenden Oligonukleotide werden als stromaufwärts liegende Primer verwendet. Der stromabwärts liegende Primer ist als SEQ ID Nr. 10 gezeigt. Die stromaufwärts liegenden Primer enthalten jeweils eine BamHI Klonierungsstelle und die stromabwärts liegenden Primer enthalten eine Xhol Schnittstelle (Nukleotide 5-10 jeder Sequenz). Die PCR Reaktion wird unter denselben Bedingungen durchgeführt, wie sie in Beispiel 306 beschrieben sind.

Nach der Spaltung mit BamHI und Xhol werden die 0,23 kb PCR Produkte in die BamHI-Xhol Ver-daus der gp55-pET17B Plasmide inseriert, welche in Beispiel 306 erhalten wurden.

Zur Expression der Fusionsproteine werden die entstehenden Plasmidkonstrukte in E. coli BL21 (DE3) Lys E transformiert, und ferner werden bakterielle Einzelkolonien erzeuge. Die Expression der Fusionsproteine wird durch Inkubation einer Vorkultur bei 37°C auf einem Rundschüttler über Nacht in «Circle» Wachstumsmedium (Bio 101) erhalten. Eine Hauptkultur wird mit 1 bis 5% des Hauptkulturvolumens mit der Vorkultur angeimpft. Die Hauptkultur wird dann bei einer Temperatur von 37°C und einem pH von 6,9 bis 7,1 fermentiert, während sie mit 10 l/min belüftet wird und bei 200-400 U/min geschüttelt wird. Die Expression wird durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert, sobald die Kultur eine OD550 von etwa 1,0 bis 5,0 erreicht hat. Nach der Induktion wird die Fermentation für fünf Stunden fortgesetzt, und dann wird die Fermentationsbrühe ohne Abtötung der E. coli Zellen geerntet. Die geernteten Zellen werden mit einer Rohrzentrifuge zentrifugiert, in Probenpuffer resuspendiert und auf Expression durch SDS PAGE getestet. Das Zellpellet wird dann bis zur Reinigung eingefroren. Die verwendeten Verfahren und die Wirtszellen sind vollständig in Studier et al, 1990, «Use of T7 RNA Polymerase to direct Expression of Cloned Genes», Methods in Enzymology, Academic Press, Seiten 60 bis 89 beschrieben.

Beispiel 308: Herstellung von Einschlusskörpern

Eingefrorene E. coli Pellets, die von Beispiel 307 erhalten wurden, werden 25%ig G/V in Puffer A (50 mM Tris pH 8,0, das 2 mM DTT, 5 mM Benzamidin-HCI, 1,5 mM MgCl2, 1,0 mM MnCb, 10 ng/ml DNAse 1 und 2 mg/ml Lysozym enthält) resuspendiert und durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Die resuspendierten Zellen werden lysiert, indem man sie durch einen Manton-Gaulin Homogenisator (2 Durchläufe bei 1 200 bar) durchlaufen lässt und das entstehende Lysat auf Eis hält. Das Lysat wird zweifach mit eiskaltem Puffer B (50 mM Tris pH B,0, das 2 mM DTT, 5 mM Benzamidin-HCI und 4 mM EDTA enthält) verdünnt und für 30 min bei 27 500 g zentrifugiert.

Der Überstand aus der Zentrifuge wird sorgfältig abgehoben und verworfen. Das Pellet wird in Puffer B 25%ig G/V resuspendiert, einmal mehr durch den Manton-Gaulin durchgelassen und wie vorher zentrifugiert. Dieses Verfahren wird einmal unter Verwendung von Puffer B und einmal mit Wasser wiederholt. Die entstehenden Einschlusskörperpellets werden gewogen und bei -20°C eingefroren, bis sie benötigt werden.

Beispiel 309: Auflösung und Spaltung der gpD55-Asp-Pro-Pro-(1-38ïhPTH-OH Einschlusskörper

Eingefrorene gp55-Asp-Pro-Pro-(1-3B)hPTH enthaltende Einschlusskörper, wie sie in Beispiel 308 erhalten wurden, werden in 10 mM HCl Säurelösung (analytischer Reinheitsgrad) in einer Endkonzentration von 6% G/V suspendiert. Die Lösung wird für 24 Stunden bei 50°C inkubiert und die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 Volumen wässriger 100 mM NaOAc Lösung beendet. Der verdünnte Überstand wird durch Zentrifugation bei 27 500 g für 30 Minuten geklärt und durch einen Glasfiberfilter filtriert.

Beispiel 310: Auflösung und Spaltung von op55-Asn-Glv-Pro-(1-38)hPTH Einschlusskörper

Eingefrorene gp55-Asn-Gly-Pro-(1-38)PTH enthaltende Einschlusskörper, die aus Beispiel 308 erhalten wurden, werden in 6 M Guanidin-HCI (das 2 M Hydroxylamin-HCI enthält und auf pH 9,0 durch Zugabe von 4,5 M LiOH gebracht wurde) unter Bildung von abgeschätzten 5 mg/ml Protein gelöst. Der pH

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wird erneut auf pH 9 durch weitere Zugabe von LiOH eingestellt und die Lösung wird für 4 Stunden bei 45°C inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Ameisensäure auf pH 4 beendet und die Lösung wird wie in Beispiel 309 beschrieben zentrifugiert und filtriert.

Beispiel 311: Präparative HPLC von Glv-Pro und Pro-Pro (1-38ihPTH

Filtrierte Überstände aus der Spaltung werden auf einer analytischen Umkehrphasen HPLC (Orpogen HD-Gel-RP-7s-300, 4 x 150 mm Säule) analysiert und mit einem bekannten (1-38)PTH Standard (Bachem) verglichen, um die PTH Konzentration zu bestimmen. Die Säule wird mit 85% HPLC Puffer A (90% Wasser, 10% Acetonitril, worin 0,1% V/V TFA enthalten sind) und 15% HPLC Puffer B (10% Wasser, 90% Acetonitril, worin 0,1 % TFA enthalten sind) äquilibriert und mit einem Gradienten von 15% HPLC Puffer B bis 100% HPLC Puffer B über 15 Minuten bei einer Flussrate von 0,75 ml/min eluiert.

In Abhängigkeit von der Grösse der Präparation werden die Überstände entweder auf eine 1,0 x 25 cm C4 Vydac oder eine 2,2 x 25 cm C4 Vydac aufgetragen. Die Säulen werden mit 85% HPLC Puffer A und 15% HPLC Puffer B bei Flussraten von jeweils 4 ml/min und 10 ml/min äquilibriert. Die Säulen werden mit Gradienten von jeweils 15% B bis 85% B über 80 ml und 15% E bis 55% B über 300 ml eluiert.

Die Gly-Pro-hPTH(1-38) oder Pro-Pro-hPTH(1-38) Peaks werden per Hand gesammelt und das Acetonitril wird später unter Vakuum entfernt. Die analytische HPLC wird verwendet, um sowohl die Peptid-konzentration nach der Spaltung als auch in den gesammelten Fraktionen zu bestimmen.

Die Lösemittel-freien Peptidlösungen werden mit einem gleichen Volumen 100 mM Natriumacetat verdünnt und der pH wird, falls erforderlich, auf pH 5,4 eingestellt. Nach der Filtration (0,2 um) wird die Lösung auf eine Kationenaustauschersäule (entweder Mono S oder SP-Sepharose High Performance, die jeweils in HR10/10 oder XK16/10 Säulen gepackt sind) aufgetragen, die mit 50 mM Natriumacetat pH 5,4 (Puffer C) äquilibriert ist. Die Säule wird mit einem NaCI Gradienten von 0 bis 500 mM in Puffer C über 7,5 Säulenvolumina eluiert. 10 ml Fraktionen werden gesammelt und der X-X-(1-38)hPTH Peak wird vereinigt. Die Peptidkonzentration wird vor der Verwendung der HPLC bestimmt.

Diese Säule dient sowohl dem Wechsel der Peptide in einen physiologischeren Puffer als auch der Entfernung der zusätzlichen Peptide, die durch die chemische Spaltung des Fusionsproteins an sich gebildet wurden.

Beispiel 312: Enzvmatische Entfernung von X-X aus X-X-H-38Ì- hPTH-OH

Vereinigte Peptidfraktionen, wie sie in Beispiel 311 erhalten wurden (Konzentrationsbereich 1,5-2,0 mg/ml), werden auf pH 8,0 durch die Zugabe von festem Tris gebracht. Gereinigte X-Prolyl Dipeptidase (0,5 mg/ml in PBS pH 7,2) (Nardi et al. (1991) App. Env. Microbiol. 57, Nr. 1, 45-50) wird 1:1000 zugegeben und die Lösung wird für 24 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von TFA bis 0,2% (pH = 5,0) gestoppt und das entstehende (1-38)PTH wird mittels HPLC (unter Venwendung derselben Bedingungen wie in Beispiel 6 beschrieben) isoliert. Das Lösemittel wird entfernt und das Produkt wird nach der Entfernung von Aliquots für die N-terminale Sequenz- und Massenspektroskopie-analyse lyophilisiert.

Beispiele für Ausbeuten, wie sie mittels der zwei oben beschriebenen Fusionsproteinansätze erhalten werden, sind folgende:

Gen55-Asp-Pro-Pro-hPTH(1-38) OH (mittels der «verkürzten» Form des Gen55)

Unter teilweise optimierten Fermentationsbedingungen wird ein Zellpellet mit 215 g Nassgewicht aus einer 10 Liter Fermentation erhalten. Der prozentuale Anteil der Expression des Fusionsprodukts liegt bei etwa 37%. Aus diesem Pellet werden 31 g Einschlusskörper isoliert. Die Proteinreinheit (in Bezug auf das Fusionsprotein) dieser Körper beträgt 61%. Nach der Auflösung, Spaltung und Zentrifugation/ Filtration werden etwa 620 mg Pro-Pro-PTH detektiert. Dieses Material ergibt 580 mg Pro-Pro-PTH nach der anschliessenden C4-Vydac HPLC. Nach Verdünnung, Kationenaustausch auf Mono S, Verdau mit X-Prolyldipeptidylpeptidase (bei einer Pro-Pro-PTH Konzentration von 2 mg/ml), HPLC und Lyophili-sierung, werden 440 mg des lyophilisierten reinen Produkts mit voller biologischer Aktivität erhalten. Dies stellt eine Ausbeute von 71% zwischen dem abgestoppten Spaltungsschritt und dem Endprodukt dar.

Gen55-Asn-Gly-Pro-hPTH(1-38) OH (mittels der «langen» Form des Gen55)

Aus einer nicht-optimierten 20 Liter Fermentation wird ein Zellpellet mit 78 g Nassgewicht mit 50%iger Expression des Fusionsproteins geemtet. Nach der Lyse und Zentrifugation werden 18 g an «90% reinen» Einschlusskörpem erhalten. Anschliessend an den sauren Stoppschritt und die Zentrifu-gation/Filtration werden etwa 470 mg Gly-Pro PTH detektiert. Nach einer HPLC auf C4 Vydac werden etwa 355 mg des Peptids detektiert, die sich auf 321 mg nach dem SP-Sepharose Kationenaustausch

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reduzieren. Die enzymatische Entfernung der Gly und Pro Reste wird bei 2 mg/ml ausgeführt. Nach dem letzten HPLC Schritt und der Lyophilisierung werden 244 mg reines voll biologisch aktives hPTH(1-38) OH gewonnen, was eine Ausbeute von 52% vom Reaktionsschritt der abgestoppten Spaltung aus darstellt.

Die Verbindungen der Beispiele 25, 26, 56 und 86 bis 164 werden ebenfalls durch das Verfahren der Beispiele 306 bis 312 hergestellt.

Die erfindungsgemässen Verbindungen in freier Form oder in Form von pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Komplexen zeigen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, wie sie in Tierversuchen deutlich wurden und sind daher in der Therapie indiziert.

Die biologische Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen wird in vitro durch die Messung ihrer Fähigkeit zur Stimulierung der cyclischen AMP Synthese in Ratten UMR 106-06 und humanen SaOS-2 Osteosarcomzellen gemäss dem Verfahren von Marcus und Aurbach in Endocrinology, 85, 801-810 (1969) ermittelt. Ratten VMR 106 Osteosarcomzellen werden in Eagle's Minimum Essential Medium 10% FCS in 12 Loch Platten bis zum Zellrasen gezogen, und humane SaOS-2 Osteosarcomzellen werden in McCoy's 5A Medium - 10% FCS gezogen. Das Medium wird dann durch ein Medium mit 2% FCS ersetzt und 1-5 tiCi/Probenloch [3H]-Adenin wird zugegeben. Zwei Stunden später werden die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in DMEM - 1% RSA inkubiert, das 1 mM 3-lsobutyl-1-methylxanthin enthielt, um Wirkungen aufgrund von Phosphodiesterasen auszu-schliessen. 20 Minuten später werden die Testsubstanzen zugegeben. Die Reaktion wird gestoppt und das cAMP 15 Minuten durch Zugabe von eiskalter 5%iger Trichloressigsäure extrahiert. Eine Trägerlösung (0,5 ml/Probenloch) wird zugegeben, die 5 mM unmarkiertes Adenin, Adenosin, AMP, ADP, ATP und cAMP wie auch 0,4 nCi [14C]-Adenosin zur Bestimmung der Ausbeute enthält. [3H]-cAMP wird mittels in Serie geschalteter Dowex 50W-X4 (200-400 Mesh) und Aluminiumoxid Chromatographie abgetrennt und ausgezahlt. Die Ergebnisse werden in % der Lösemittelkontrolle und der aus DRC Kurven bestimmten ECso Werte errechnet. Die erfindungsgemässen Verbindungen stimulieren die cAMP Bildung in Ratten UMR 106-06 und humanen SaOS-2 Osteosarcomzellen bei einer Konzentration von 10-" bis 10-e M.

Die erfindungsgemässen Verbindungen weisen auch Bindungsaffinität an PTH Rezeptoren auf, wie es sich aus folgendem Versuch ergibt:

[Tyr36]pTHrP(1-36) amid aus dem Huhn wird mit einer spezifischen Aktivität von 2200 Ci/mmol durch das Lactoperoxidaseverfahren (Anawa Lab. AG, Wangen) jodiert. Einschichtige Zellagen von Opossumnierenzellen werden mit 200 |il DMEM und HAM's F12 (1:1) gewaschen, worin 1% RSA enthalten sind, und bei 16°C mit 50 000 cpm an [1Z5l-Tyr36]chPTHrP(1-36)amid pro Probenloch in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 nM [Tyr36]chPTHrP(1-36)amid inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 0,5 ml Medium (4°C) gewaschen, mit 0,5 ml 1 N NaOH lysiert und die Radioaktivität wird bestimmt. Die spezifische Bindung wird als Gesamtbindung abzüglich der unspezifischen Bindung definiert. Die Kom-petitionskurven werden durch SCTFIT, einem Computerprogramm mit nicht-linearer Regression analysiert (Feyen et al, 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:8-13) und die Daten werden als mittlere pKd Werte (n=2 bis 3) dargestellt. Die erfindungsgemässen Verbindungen zeigen in diesem Test eine als mittlerer pKd Wert ausgedrückte Bindungsaffinität von 7 bis 10.

Ferner erhöhen die erfindungsgemässen Verbindungen Plasmacalciumspiegel nach kontinuierlicher s.c. Infusion, wie dies beispielsweise in männlichen tyreoparathyreoidektomiesierten Wistar Ratten bestimmt wurde, die 140 bis 170 g wogen. 5 Tage nach der Tyreoparathyreoidectomie implantiert man den Ratten im Genick Alzet-Minipumpen und infundiert die Testverbindungen in Mengen von 0,3 bis 30 ng/Tag/Ratte. Durch retroorbitale Punktion am Morgen der Tage 1, 2, 3 und 6 wird hiernach Blut entnommen und die Plasmacalciumkonzentrationen werden photometrisch bestimmt. In diesem Test erhöhen die erfindungsgemässen Verbindungen das Plasmacalcium.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind demnach zur Verhinderung oder zur Behandlung von allen Knochenzuständen indiziert, die mit erhöhtem Calciumverlust oder erhöhte Calciumresorption zusammenhängen, oder bei denen eine Calciumfixierung in den Knochen wünschenswert ist, beispielsweise unterschiedlich entstandene Osteoporose (beispielsweise juvenil, menopausal, postmenopausal, post-traumatisch, durch hohes Alter oder Corticosteroidtherapie oder Inaktivität verursacht), Frakturen, Osteopathie, einschliesslich akuten und chronischen Zuständen, die mit Skelettdemineralisierung zusammenhängen, Osteomalacie, periodontaler Knochenverlust oder Knochenverlust durch Arthritis oder Osteoarthritis oder zur Behandlung von Hypoparathyreoidismus.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind insbesondere für die Prävention oder Behandlung von unterschiedlich entstandener Osteoporose indiziert.

Für alle obigen Verwendungen liegt eine indizierte tägliche Dosierung im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 10 mg, vorzugsweise 0,003 bis 3, noch bevorzugter 0,01 bis 1 mg einer erfindungsgemässen Verbindung. Die erfindungsgemässen Verbindungen können einmal am Tag oder bis zu zweimal pro Woche verabreicht werden.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können in freier Form oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform oder als Komplexe verabreicht werden. Solche Salze und Komplexe können auf herkömmliche Weise hergestellt werden und entsprechen grössenordnungsmässig der Wirkung der freien Verbindungen. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zuammensetzung, die eine erfin-

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dungsgemässe Verbindung in freier Basenform oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform oder Komplexform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungmittel oder Träger enthält. Solche Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise formuliert werden. Die erfindungsgemässen Verbindungen können durch jeden herkömmlichen Weg verabreicht werden, parenteral, beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen, enterai, beispielsweise oral, wie in Form von Tabletten oder Kapseln, oder transdermal, nasal oder in Zäpfchenform.

Gemäss dem Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung ferner:

a) eine erfindungsgemässe Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen Komplex hiervon zur Verwendung als Pharmazeutikum,

b) eine erfindungsgemässe Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einem Komplex hiervon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei dem unter b) genannten Verfahren verwendet werden kann.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemässen Verbindungen als Zusatz oder Adjuvans bei einer anderen Therapie verwendet werden, beispielsweise einer Therapie, die einen Knochenresorptionshemmstoff verwendet, wie beispielsweise in der Osteoporosetherapie, insbesondere einer Therapie, die Calcium, Caicitonin oder ein Analogon oder Derivat hiervon verwendet, beispielsweise Lachs-, Aal- oder humanes Caicitonin, ein Steroidhormon, beispielsweise ein Östrogen, ein partieller Östrogenagonist oder eine Östrogen-Gestagen Kombination, ein Riphosphonat, Vitamin D oder ein Analogon hiervon, oder jede Kombination hiervon.

Wenn die erfindungsgemässen Verbindungen in Kombination verabreicht werden, beispielsweise als Adjuvans bei der Therapie der Knochenresorptionshemmung, werden die Dosierungen für den mitverabreichten Hemmstoff natürlich variieren in Abhängigkeit vom verwendeten Hemmstoffmittel, beispielsweise ob es ein Steroid oder Caicitonin ist, vom zu behandelnden Zustand, ob es eine heilende oder präventive Therapie ist, vom Verabreichungsplan und so weiter.

Gemäss dem Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt:

c) die Verwendung einer erfindungsgemässen Verbindung als Zusatz oder Adjuvans zu einer zweiten Arzneimittelsubstanz, wobei diese zweite Arzneimittelsubstanz ein Knochenresorptionshemmstoff ist, wie er beispielsweise oben erwähnt wurde, zur Verbesserung der Knochenbildung, beispielsweise Prävention oder Behandlung des Calciumverlustes, wie aller zur Prävention oder Behandlung der vorher angeführten spezifischen Zustände oder Krankheiten.

Die Verbindungen der Beispiele 20, 29, 37, 49 und 50 sind bevorzugt.

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SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION :

(i) APPLICANT:

(A) NAME: SANDOZ LTD

(B) STREET: PO BOX

(C) CITY: BASEL

/T*1Ì ÇTATF • 3Ç

(E) COUNTRY : SWITZERLAND

(F) POSTAL CODE (ZIP) : CH 4002

(G) TELEPHONE: 061 324 1111

(H) TELEFAX: 061 322 7572

(I) TELEX: 965 050 55

(ii) TITLE OF INVENTION: Organic Compounds (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 12

(iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk.

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO : 1 :

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 717 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Bateriophage T4/Homo sapiens

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 101..559

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO : 1 :

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATG TCA GAA ACT AAG

Met Ser Glu Thr Lys 1 5

CCT AAA TAT AAT TAC GTA AAC AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ATT Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu Leu Gin Ala Ile Ile 10 15 20

GAT TGG AAA ACA GAA TTA GCA AAT AAT AAA GAC CCA AAT AAA GTA GTT Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Pro Asn Lys Val Val 25 30 35

CGT CAG AAT GAT ACT ATC GGA TTA GCC ATT ATG CTT ATT GCA GAA GGC

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Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met Leu Ile Ala Glu Gly 40 45 50

TTA TCT AAA CGT TTC AAC TTT TCA GGA TAC ACC CAG TCT TGG AAA CAA 307

Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Trp Lys Gin 55 60 65

GAA ATG ATT GCA GAT GGT ATA GAA GCT TCT ATT AAG GGG CTT CAC AAT 355

Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile Lys Gly Leu His Asn 70 75 80 85

TTT GAT GAA ACG AAA TAT AAA AAC CCA CAT GCG TAT ATA ACT CAA GCT 4 03

Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala Tyr Ile Thr Gin Ala 15 90 95 100

TGT TTT AAT GCA TTC GTC CAA CGT GGA TCC ATC GAT CCA CCA TCC GTA 451

Cys ?he Asn Ala Phe Val Gin Arg Gly Ser Ile Asp Pro Pro Ser Val 105 110 115

TCA GAA ATA CAA CTA ATG CAT AAT CTG GGT AAA CAT CTG AAT TCA ATG 499

Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met 120 125 130

GAA CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAA AAA CTG CAG GAT GTA CAT AAT TTT 5 47

25 Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe

135 140 145

GTA GCT CTG GGT TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA 599

Val Ala Leu Gly 150

AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG 65 9

GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA 717

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENCE CKARACTERISTICS: (A) LENGTH: 153 amino acids 40 (B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu 15 10 15

Leu Gin Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp

50 20 25 30

Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met 35 40 45

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr

50 55 60

Gin Ser Trp Lys Gin Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile 65 70 75 80

60 Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala

85 90 95

Tyr Ile Thr Gin Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Gly Ser Ile

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Gin

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Met

His

Asn 125

Leu

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Lys

His

Leu Asn 130

Ser

Met

Glu

Arg Val 135

Glu

Trp

Leu

Arg

140

Lys

Lys

Leu

Gin

Asp 145

Val His

Asn

Phe

Val 150

Ala Leu

Gly

(2)

informa:

'ion for

SEQ

id no : 3 ;

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 945 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTKETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Bacteriophage T4/Homo sapiens

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 101..787

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC 60

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATG TCA GAA ACT AAG 115

Met Ser Glu Thr Lys 1 5

CCT AAA TAT AAT TAC GTA AAC AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ATT 163

Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu Leu Gin Ala Ile Ile 10 15 20

GAT TGG AAA ACA GAA TTA GCA AAT AAT AAA GAC CCA AAT AAA GTA GTT 211

Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Pro Asn Lys Val Val 25 30 35

CGT CAG AAT GAT ACT ATC GGA TTA GCC ATT ATG CTT ATT GCA GAA GGC 259

Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met Leu Ile Ala Glu Gly 40 45 50

TTA TCT AAA CGT TTC AAC TTT TCA GGA TAC ACC CAG TCT TGG AAA CAA 307

Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Trp Lys Gin 55 60 65

GAA ATG ATT GCA GAT GGT ATA GAA GCT TCT ATT AAG GGG CTT CAC AAT 355

Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile Lys Gly Leu His Asn 70 75 80 85

TTT GAT GAA ACG AAA TAT AAA AAC CCA CAT GCG TAT ATA ACT CAA GCT 403

Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala Tyr Ile Thr Gin Ala 90 95 100

TGT TTT AAT GCA TTC GTC CAA CGT ATT AAA AAA GAA CGT AAG GAA GTT 451

Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Ile Lys Lys Glu Arg Lys Glu Val 105 110 115

28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

499

547

5S5

643

691

739

787

847

907

945

CH 688 195 A5

C-CA AAG AAA TAT AGT TAC TTC GTT CAC AAT GTC TAT GAC AGC CGT GAC Ala Lys Lys Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val Tyr Asp Ser Arg Asp 120 125 130

GAC C-AT ATG GTT GCG TTA GTA GAT GAA ACT TTT ATT CAA GAC ATC TAT Asp Aso Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe Ile Gin Asp Ile Tyr 135 140 145

GAT AAA ATG ACG CAT TAC GAA GAA TCA ACC TAT AGA ACA CCG GGG GCT Asp Lys Met Thr His Tyr Glu Glu Ser Thr Tyr Arg Thr Pro Gly Ala 150 155 160 165

GAA AAG AAA AGT GTT GTA GAT GAT TCT CCT AGT TTG GAT TTT TTA TAT Glu Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser Pro Ser Leu Asp Phe Leu Tyr 170 175 180

GAG GCT AAC GAT GGA TCC GTT AAC GGT CCA TCC GTA TCA GAA ATA CAA Glu Ala Asn Asp Gly Ser Val Asn Gly Pro Ser Val Ser Glu Ile Gin 185 190 195

CTA ATG CAT AAT CTG GGT AAA CAT CTG AAT TCA ATG GAA CGT GTA GAA Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 200 205 210

TGG CTG CGT AAA AAA CTG CAG GAT GTA CAT AAT TTT GTA GCT CTG GGT Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly 215 220 225

TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA

CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA

GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO : 4 :

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 229 amino acids

(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu 1 5 10 15

Leu Gin Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp 20 25 30

Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met 35 40 45

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr

50 55 60

Gin Ser Trp Lys Gin Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile 65 70 75 80

Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala e5 90 95

Tyr Ile Thr Gin Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Ile Lys Lys

100 105 110

29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

Glu Arg Lvs Glu Val Ala Lys Lys Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val 115 120 125

Tyr Asp Ser Arg Asp Asd Asp Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe 130 * 135 140

Ile Gin Asd Ile Tyr Asp Lys Met Thr His Tyr Glu Glu Ser Thr Tyr 145 * 150 155 160

Arg Thr Pro Gly Ala Glu Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser Pro Ser 165 170 175

Leu Asp Phe Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Gly Ser Val Asn Gly Pro Ser 180 185 190

Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser 195 200 205

Mer Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn 210 215 220

Phe Val Ala Leu Gly 225

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 27 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

GAGGTGCATA TGTCAGAAAC TAAGCCT 27

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 40 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

GGTCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC 40

30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 28 base pairs (3) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT 28

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 42 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:

GAGTGGATCC ATCGATCCAC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO : 9 :

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS i

(A) LENGTH: 42 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internai

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:

GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:

31

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 688 195 A5

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 34 base pairs (3) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: incernai

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:

TCTACTCGAG TTAACCCAGA GCTACAAAAT TATG 34

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 34 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: unknown

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:ll:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 36 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: unXnown

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:

32

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

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CH 688 195 A5

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn ! 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe Val Ala 35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 38 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: unknown

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ II

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met 1 . 5

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu 20

Asn Phe Val Ala Leu Gly 35

> NO:13:

His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 10 15

Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 25 30

Claims (17)

Patentansprüche

1. Eine Verbindung der Formel

Ser-Val-Ser-Glu-lle-Gln-Leu-R,-His-R2-R3-Gly-FU-His-Leu-FÌ5-R6-R7-R8-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Fl9-Lys-Leu-Gln-Asp-Vai-His-Rio-Rii(Ri2)n-X

worin Ri Met oder Leu ist;

R2 Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr ist;

R3 Leu oder Lys ist;

R4 für Lys oder D- oder L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Ser, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu oder -Gly steht;

Rs für Asn, Gin, D-Gln oder D- oder L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala oder -Gly steht;

R6 Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile oder Lys ist;

R7 Met, Leu, Gin oder Tyr ist;

Rs für Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn oder Ile steht;

R9 Lys, Gin oder Arg steht;

R10 für Asn, Thr, D-Thr oder D- oder L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile oder-Lys steht; R11 Phe oder Ala ist;

R12 Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu oder Val-Ala-Leu-Gly ist;

n 0 oder 1 ist; und

X OH, ORa, NH2 oder NRbRc bedeutet, worin Ra Ci_4alkyl, ein Symbol von Rb und Rc H und das andere Ci-ealkyl ist,

vorausgesetzt, dass R7 Gin oder Tyr, und/oder R10 Thr und/oder Rn Ala ist.

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5

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50

55

60

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2. Verbindung, die zumindest einen Rest umfasst, der aus einer L- oder D-a-Aminosäure, C2-6AI-koxycarbonyl und wahlweise substituiertem Ci-sAlkyl, C2-sAlkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci_4alkyl ausgewählt ist und der an die endständige Aminogruppe einer Verbindung gemäss Anspruch 1 gebunden ist, und/oder zumindest ein Rest, der aus C2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem Ci-sAlkyl, C2-sAlkenyl, C2-sAlkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci_4alkyl ausgewählt ist und der an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen einer Verbindung gemäss Anspruch 1 gebunden ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, die 1-34 bis 1-38 Aminosäureeinheiten umfasst und die ausgewählt ist aus

[Leu8, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH

[Leu8, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln18]hPTH,

[Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Gln18]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH,

[Leu®, Ala16, Gin18, Ala19, Thr33, Ala3"]hPTH und

[Leu8, Asp10, Lys11, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH,

in freier Form oder in Salzform oder in Komplexform.

4. Verbindung nach Anspruch 2, die 1-34 bis 1-38 Aminosäureeinheiten umfasst und die ausgewählt ist aus

[Leu8, Gin18, Thr33, Ala3"]hPTH,

[Leu8, Ala16, Gin18, Thr33, Ala3"]hPTH,

[Leu8, ASp10, Lysll Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln18]hPTH,

[Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Gln18]hPTH,

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH,

[Leu8, Ala18, Gin18, Ala19, Thr33, Ala3"]hPTH und

[Leu8, Asp10, Lys11, Gin18, Thr33, Ala3"]hPTH,

und die Verbindung zumindest einen Rest umfasst, der aus einer L- oder D-a-Aminosäure, C2-6Alkoxy-carbonyl und wahlweise substituiertem Ci-sAlkyl, C2-eAlkenyl, C2-sAlkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci_4alkyl ausgewählt ist und der an die endständige Aminogruppe der Verbindung gebunden ist, und/oder zumindest ein Rest, der aus C2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C-i-eAlkyl, C2-8Alkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci_4alkyl ausgewählt ist und der an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen der Verbindung gebunden ist, in freier Form oder in Salzform oder in Komplexform.

5. Verbindung nach Anspruch I oder 3, ausgewählt aus [Leu8, Gin18, Thr33, Ala3"]-hPTH(1-34) OH

[Leu8, Ala16, Gin«, Ala19, Thr33, Ala34]hPTH(1-34) OH

[Leu8, Ala16, Gin18, Thr33, Ala3"]hPTH(1-34) OH

[Leu8, Asp10, Lys11, Gln18]hPTH(1-36) OH

[Leu8, Asp10, Lys11, Gin18, Thr33, Ala3i]hPTH(1-34) OH

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(1-36) OH

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Thr33, Ala3"]hPTH(1-34) OH

[Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln18]hPTH(1-36) OH und

[Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(1-36) OH

in freier Form oder in Salzform oder in Komplexform.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, in dem ein Fusionsprotein in Bakterienzellen exprimiert wird, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid enthält, das das gewünschte Polypeptid an den C-Terminus hiervon gebunden aufweist, das gewünschte Polypeptid abgespalten wird, und falls erforderlich, die Schutzgruppe entfernt wird.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 2, in dem ein Fusionsprotein in Bakterienzellen exprimiert wird, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid enthält, das das gewünschte Polypeptid an den C-Terminus hiervon gebunden aufweist, das gewünschte Polypeptid abgespalten wird und wahlweise substituierten Ci-sAlkyl, C2-8Alkenyl, C2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C3-6Cycloalkyl-Ci-4alkyl an die endständige Aminogruppe und/oder eine Seitenkettenaminogruppe des Polypeptids in geschützter oder ungeschützter Form eingeführt wird, und falls erforderlich, die Schutzgruppe entfernt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin das Fusionsprotein einen chemisch spaltbaren Linker zwischen dem Gen 55 und den gewünschten Polypeptiden aufweist, der die Aminosäuresequenzen Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro enthält.

9. Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, die als Ausgangsmaterial im Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8 verwendet wird.

10. Bakterieller Expressionsvektor, der eine DNA Sequenz nach Anspruch 9 enthält.

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45

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11. Bakterielle Wirtszellen, die mit einer DNA Sequenz nach Anspruch 9 oder einem bakteriellen Vektor nach Anspruch 10 transformiert sind.

12. Fusionsprotein, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid und eine gewünschte Verbindung nach Anspruch 1, an den C-Terminus hiervon gebunden enthält als Zwischenprodukt im Verfahren nach Anspruch 6 oder 7.

13. Fusionsprotein nach Anspruch 12, das einen chemisch spaltbaren Linker zwischen dem Gen 55 und den gewünschten Polypeptiden aufweist, der die Aminosäuresequenzen Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro enthält.

14. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier Form oder in einer pharmazeutisch annehmbaren Salzform oder Komplexform, als Pharmazeutikum.

15. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier Form oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform oder Komplexform zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verbesserung der Knochenbildung.

16. Venwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier Form oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform oder Komplexform zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung als Zusatz oder Adjuvans zu einem Knochenresorptionsinhibitor zur Verbesserung der Knochenbildung.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier Form oder in einer pharmazeutisch annehmbaren Salzform oder Komplexform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger hierfür enthält.

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