CN1056036C - 用重组天冬氨酸蛋白酶制造干酪 - Google Patents

用重组天冬氨酸蛋白酶制造干酪 Download PDF

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Abstract

一种以改进的产率生产干酪的方法，其中，向乳中加入足够量的得自Rhizomucor miehei或Rhizomucor pusillus的重组天冬氨酸蛋白酶以影响乳的凝结，其后以原本已知的制造干酪的方式处理得到的凝乳。

Description

用重组天冬氨酸蛋白酶制造干酪
本发明涉及一种以改进的产率生产干酪的方法。
在干酪生产中，为从乳清中分离出酪蛋白，有必要使乳凝结。为此目的，许多年来使用含有凝乳酶(一种从小牛胃里分离出的凝乳酶)的产品。过去几十年中，小牛胃的缺乏导致急于寻找其它凝乳酶。今天，商业上使用牛胃蛋白酶，猪胃蛋白酶，也使用微生物酶。微生物凝乳酶中最有用的是Rhizomucor miehei凝乳酶和Rhizomucor pusillus凝乳酶。
本发明中令人惊奇地发现，与天然酶相比天冬氨酸蛋白酶的糖基化作用使干酪产率提高0.2％。干酪产率提高0.2％意味着每吨干酪多产2公斤干酪，价值约8-10美元(乳品厂的价格)。
相应地，本发明涉及一种以改进的产率生产干酪的方法，其中，向乳中加入足够量的重组天冬氨酸蛋白酶以影响乳的凝结，其后以原本已知的制造干酪的方式处理得到的凝乳。
术语“重组天冬氨酸蛋白酶”用来表示用编码蛋白酶的DNA转化的宿主生物中产生物凝乳酶或微生物天冬氨酸蛋白酶。该宿主生物可以是一种真菌，例如酵母或丝状真菌。
术语“丝状真菌”用来包括属于藻菌纲，接合菌纲，子囊菌纲，担子菌纲或半知真菌类的真菌，包括丝孢菌纲如曲霉属，木霉属，青霉属，镰刀菌属或腐植菌属。蛋白酶
根据本发明，在以改进的产率生产干酪的过程中选用得自在曲霉或木霉属中表达的毛霉(例如Rhizomucor特别是Rhizomucor miehei或Rhizomucor pusillus)的重组天冬氨酸蛋白酶。
编码牛凝乳酶或前凝乳酶(preprochymosin)的DNA顺序可用如EP215 594中所述方法得到。编码Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶的DNA顺序可用如EP238 023中所述方法分离。
编码有利于基因表达的功能的DNA顺序一般包括一个启动子，转录作用起始位点以及转录终止和聚腺苷酸化(polyadenylation)功能。
启动子(本技术中已知，它前面是上游激活顺序和增强子顺序)可以是任何在丝状真菌中具有强转录活性的DNA顺序，可以得自编码胞外或胞内蛋白如淀粉酶，糖化酶，蛋白酶，脂肪酶或纤维素酶的基因。
合适的启动子的实例是得自编码米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉糖化酶，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶或米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的那些启动子。
丝状真菌宿主生物可以是以前已用作生产重组蛋白质的宿主的生物，例如曲霉的一个菌株象黑曲霉，构巢曲霉或米曲霉。例如，在EP238023中着重描述了在重组蛋白质生产中使用米曲霉。
可从与启动子相同的来源得到合适的终止和聚腺苷酸化的顺序。
用于转化真菌宿主细胞的技术可以选用如Yelton等人在Pro.Natl.Acad.Sci.USA 81，1984，PP.1470-1474或EP215 594中所述的转化构巢曲霉的方法，或者如Buxton等人在Gene 37，1985，PP.207-215或US 4,885,249中所述的转化黑曲霉的方法，或者EP238 023中所述的转化米曲霉的方法。在本发明的方法中，用含有编码选择性标记的DNA顺序的载体系统转化宿主细胞。在转化时该选择性标记能被插入宿主生物的基因组，但它既不能在转化之前被宿主表达，也不能在选择性条件下以足够生长的量被表达。于是，根据插入的选择性标记可从非转化子中选择并分离出转化子。
合适的选择性标记得自构巢曲霉或黑米霉argB基因，构巢曲霉trpC基因，构巢曲霉amds基因，粗糙链孢霉pyr4或DHFR基因，或者黑曲霉或米曲霉niaD基因。
编码天冬氨酸蛋白酶，启动子和终止子的DNA顺序可被插入到含有选择性标记的载体中，或被插入到引入宿主细胞的独立载体中。本上下文中，术语“载体系统”用来包括一个单独载体或者两个或多个共同含有将被引入宿主细胞的全部DNA信息的载体。载体或多个载体可以是线性分子或闭环分子。在本发明方法的一个优选的实施方案中，载体系统包括两个载体，一个载有编码选择性标记的DNA顺序，另一个载有编码血红素蛋白，前区(preregion)和有利于基因表达的功能的DNA顺序。
已令人惊奇地发现，重组天冬氨酸蛋白酶的糖基化作用的程度比得自自然产生的Rhizomucor菌株的天冬氨酸蛋白酶的糖基化作用的程度高。尤为特别的是，新的重组天冬氨酸蛋白酶的特征在于，其糖含量至少高于天然天冬氨酸蛋白酶50％，优选糖含量高于天然天冬氨酸蛋白酶100％。术语“天然天冬氨酸蛋白酶”用来指由自然界中的有机体(例如在小牛胃中或由微生物如Rhizomucor)产生的蛋白酶。
通过测定糖基化作用可能鉴别和鉴定天然天冬氨酸蛋白酶和重组天冬氨酸蛋白酶。
前面已述，曲霉用对天然腐植菌脂肪酶不同的方式使腐植菌脂肪酶糖基化(参见EP305 216)，但新的发现是曲霉也可用对天然Rhizomucor天冬氨酸蛋白酶不同的方式使Rhizomucor天冬氨酸蛋白酶糖基化，尤其是通过此方法可使天冬氨酸蛋白酶的糖含量提高50-100％。N-结合糖基化的量的分析
N-结合糖基化的量确定为天冬氨酸蛋白酶和去糖基化(deglycosylated)天冬氨酸蛋白酶之间分子量的差别。37℃下使用1mg/ml蛋白酶，反应时间为18小时，由糖苷内切酶H(得自Genzyme)(除去N-结合糖基化)进行去糖基化作用，内切酶的用量是这样决定的，当增大用量时不能再达到额外的糖基化。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电游测定分子量。
N-结合糖基化的量是以kD糖基化每摩尔蛋白质表示的。干酪制造
任何类型的乳，特别是得自反刍动物如乳牛，绵羊，山羊或骆驼的乳，都可用作本发明的方法中的原料，例如作为复原乳，全脂乳，浓缩全脂乳或脱脂乳。
可用各种不同方法如通过蒸发或喷雾干燥使乳浓缩，但优选用膜过滤法浓缩，即超滤(其中，允许分子量直到20,000的分子通过膜，超滤之前或之后可选用稀释超滤)，或超滤(其中，允许分子量直到500的分子通过膜)。有关超滤方法的更为详尽的描述参见例如Quist等人Beretning fra Statens MejeriforsΦg，1986。
本发明中，在向乳中加入重组天冬氨酸之前或同时加入发酵剂培养物。发酵剂培养物是传统干酪制造中采用的一种乳酸菌培养物，使乳中存在的乳糖发酵，作为蛋白酶和肽酶生产的结果进一步导致将凝结的酪蛋白降解为更小的肽和游离氨基酸。可以以用于此目的常规用量(即一般用量为1×104-1×105细菌/g干酪用乳)加入发酵剂培养物，并可以以冷冻干燥的，冷冻的或液态的培养物的形式加入。当本发明方法中使用的乳是浓缩乳时，优选使乳浓缩后再加入发酵剂培养物(尽管这并不是绝对需要的)，因为过滤过程中发酵剂细菌将被保留。
加入凝乳酶后，可用生产干酪的传统方式例如象R.Scott在Cheesemaking in Practise，2nd Ed.，Elsevier，London，1986中所述的那样，进行干酪制造过程的后继步骤即进一步盐浸，压滤以及使凝乳成熟。
目前已考虑用本发明方法方便地制备绝大多数类型的干酪。
本发明涉及一种液态，稳定的，喷雾干燥，真空干燥，冷冻干燥或粒状形式的，或者固定于合适载体上的天冬氨酸蛋白酶制品。
配制酶制品的各种方法在酶技术中已广为人知，例如参见K.Aunstrup等人，在Microbial Technology(H.J.Peppler and D.Perlman，Eds.)，2nd Ed.，Vol I，Academic Press 1979，PP295-297中的“Production of Microbial Enzymes”。
本发明方法中重组天冬氨酸蛋白酶的量随乳浓缩程度而不同，但通常加入的酶量为1-10KRU每升全脂乳。凝乳酶浓度(strength)
1RU是凝乳酶浓度的Novo单位。1KRU＝1000RU。用改进的Berridge法(N.J.Berridge，Analyst，77，1952，P.57)测定凝乳酶浓度。这里用Rennilase(得自Novo Nordisk A/S的Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶)粉末标准物作为参考测定凝乳酶浓度。
此方法的原理是，标准状态下酶与含有氯化钙的脱脂乳粉末的溶液反应。测定从加入酶直到反应混合物开始出现絮凝所需的时间。这个时间大致与酶浓度成反比，并把它与已知酶浓度的样品的絮凝时间相比较。这些时间相互不应有显著差别，应为5.0分钟±0.5分钟。
浓度的测定在30℃，肉眼可见下进行。使用含有溶解于100ml0.01M氯化钙溶液中的12g喷雾干燥的脱脂乳粉末的“Berridge底物”。底物在使用前至少静置1小时。
在玻璃水浴中进行分析。在水浴中，试管借助马达以相对于水平面约30倾角绕纵轴缓慢转动。因此，乳表面上面试管上连续形成一层乳膜，在它刚开始形成时很容易就能看到膜中的絮凝。
有时乳中会发生局部凝结。不能把这样的凝结误认为是真正的絮凝，真正的絮凝的特征是酪蛋白小薄片粘附到乳表面附近的试管上。
进行分析前约半小时，将含有10ml乳底物的塞好的试管置于30℃±0.1℃的恒温水浴中。絮凝时间随底物保温时间稍有变化。现在用注射器向3个试管中的每一试管加入1ml稀释的酶溶液，并同时起动用于每一个试管的秒表。将酶溶液注入到试管中后马上起动秒表。为防止乳起泡，顶着试管壁注入酶溶液。加入酶后，立刻用清洁干燥的塞子封闭试管，并且倒置3次将所有的酶从试管壁上洗到乳中。此后立即将试管放到旋转轴上。当凝结物小薄片开始沉积于试管上时停止用于第一个试管的秒表，用第2号试管替换该试管等等。力图在4.5和5.5分钟之间完成絮凝。3个试管的絮凝时间的变化不得超过0.1分钟(6秒钟)，其平均值用于计算凝乳酶浓度。凝乳酶浓度的计算
Figure C9419191500101
改进的Berridge法仅适用于测定未加钙盐的凝乳酶的凝乳酶浓度。
在下面实施例中进一步阐述本发明，但实施例绝不是用于对所要求的本发明范围的限制。
                     实施例1
使用米曲霉生产的天冬氨酸蛋白酶以及使用RennilaseXL的干酪产率酶
米曲霉生产的蛋白酶：在2.5m3的传统搅拌通气式发酵罐中，在含有大豆粗粉的培养基上发酵转化子(EP489718中所述)约5小时，生长过程中提供麦芽糖糊精，通过加入磷酸保持pH低于6.0。用传统的过滤、超滤和蒸发技术从发酵液中回收天冬氨酸蛋白酶。象美国专利4,357,357中所述那样破坏天冬氨酸蛋白酶的稳定性。天冬氨酸蛋白酶浓缩物被稀释至54.63KRU/g。
Rhizomucor miehei生产的天冬氨酸蛋白酶：使用RennilaseXL 51.42 KRU/g(得自Novo Nordisk A/S)。
使用两种酶，结果约15分钟后首次出现絮凝迹象。实验过程中保持用量恒定。乳的凝结能力的变化用切割时间的变化来补偿。烧杯中的干酪制造
向5升烧杯中加入4000g全脂巴氏杀菌乳(由MD Foods，Karolinevej 1，DK-4200 Slagelse，Denmark提供)。
室温下在足量乳中培养发酵剂培养物CHL 113 batch 010691(由Chr.Hansen，BΦge Alle 10，DK-2970 HΦrsholm，Denmark提供)16小时，以40g每份冷冻，份数足够整个实验使用。
加入CaCl2(每份0.8g)和一份解冻的发酵剂培养物。30分钟成熟时间之后，引入10.9KRU每4000g乳的凝乳酶。每个实验中都使用两种酶，其顺序不是随机的。絮凝时间约为15分钟。切割时间约为絮凝时间的2倍加1分钟。4分钟静置时间和15分钟搅拌时间后，将凝乳和乳清转入带有干酪滤布(cheesecloth)的模具中，让其隔夜排水。分析
充分混合的全部乳清通过一层纱布过滤以除去凝乳颗粒。在Tecator消化器和Kjeltec 1003蒸馏系统上用改进的凯氏定氮法测定总氮。蛋白质表示为N×6.38。所有的分析重复做三次。
对乳清总蛋白含量的差异作配对的t检验(n＝61)，将t＝X平均/(s2/n)1/2作为一个估计量，其中X是使用两种酶的相应实验间的总乳清蛋白的差值，s2是X的估计偏差，t0.95(60％)＝1.67，t0.995(60％)＝3.23。结果
在表1中可找到伊色列混合羊奶干酪生产的一些参数。对天冬氨酸蛋白酶絮凝时间平均为15.41分钟，对Rennilase XL絮凝时间平均为15.35分钟。△蛋白质计算为：Rennilase XL乳清量乘以蛋白质％减去天冬氨酸蛋白酶乳清量乘以蛋白质％的差值。平均蛋白质损失为30.30g(用天冬氨酸蛋白酶)和30.50g(用Rennilase XL乳清)。这些数据意味着，当从Rennilase XL改用天冬氨酸蛋白酶时干酪产率提高0.2％。
关于△蛋白质的X平均是-0.1953，s是0.4642，n＝61，因此，t的估计量可以计算为t0＝-0.1953/(0.46422/61)1/2＝-3.2860，这意味着能以非常高的概率(P＜.001)拒绝“产率间无差异”的假设。表1  生产伊色列混合羊奶干酪的一些参数参数                        平均值      n            s
乳，量                    4000g                    恒定发酵剂                     1％                      恒定凝乳酶KRU/4000g天冬氨酸蛋白酶             10.9        61           恒定RennilaseXL             10.9        61           恒定CaCl2                       0.02％                   恒定时间  分钟
     成熟                 30          122          恒定絮凝
     天冬氨酸蛋白酶       15.41       61           ±0.63
     Rennilase            15.35       60           ±0.64切割时间
     天冬氨酸蛋白酶       31.79       61           ±1.25
     Rennilase XL         31.82       60           ±1.21静置时间                   4                        恒定搅拌                       15                       恒定汲取                       10                       恒定汲取至压滤                 120                      恒定pH乳                         6.69        122          -凝结                       6.57        122          ±0.05乳清
    天冬氨酸蛋白酶        6.53        56           ±0.14
    Rennilase XL          6.53        51           ±0.14温度℃凝结                       33重量g
 乳                       4000        122          恒定
 乳清                     3299.3      122          ±27.5
 凝乳                     685.7       117          ±20.6回收率％产量/进料                     99.9乳清/产量                     82.8凝乳/产量                     17.2
                  实施例2
用糖苷内切酶H从Rhizomucor miehei和米曲霉表达的天冬氨酸蛋白酶去糖基
从R.miehei和米曲霉表达的天冬氨酸蛋白酶都是糖基化的蛋白质。糖苷内切酶H通过在两个结合到N-糖基化蛋白质中天冬酰胺酰基上的N-乙酰氨基葡萄糖分子间的特异性水解从N-糖基化蛋白质释放出糖基部分。样品
通过Journal of Chromatography 476(1989)227-233中所述方法从培养液中纯化米曲霉生产的天冬氨酸蛋白酶(如实施例1中所述方法生产)。
通过Journal of Chromatography 476：(1989)227-233中所述方法从Rennilase 150L(得自Novo Nordisk A/S)中纯化Rhizomucor miehei生产的天冬氨酸蛋白酶。实验
37℃下在pH6.0的100mM磷酸盐缓冲液中，浓度为1mg/ml的米曲霉生产的天冬氨酸蛋白酶和Rhizomucor miehei生产的天冬氨酸蛋白酶与糖苷内切酶(genzyme)共同保温18小时。在5-20％梯度凝胶中用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从分子量的变化测定水解度。结果
实验表明，0.02U/ml糖苷内切酶H几乎足以完全去糖基，但当不与糖苷内切酶H共同保温时天冬氨酸蛋白酶的分子量不变。
得自R.miehei和米曲霉的去糖基化天冬氨酸蛋白酶的分子量都为38.3kD，而得自R.miehei的糖基化酶的分子量为41.5kD，得自米曲霉的糖基化酶的分子量为44.7kD。
米曲霉表达的天冬氨酸蛋白酶的N-结合糖基化含量是6.4kD(44.7kD减去8.3kD)每摩尔蛋白质，比3.2kD(41.5kD-38.3kD)N-结合糖基化每摩尔Rennilase(R.miehei表达的天冬氨酸蛋白酶)高100％。
                         实施例3天冬氨酸蛋白酶的糖基化样品
用Journal of Chromatography 476(1989)227-233中所述方法从培养液中纯化米曲霉生产的天冬氨酸蛋白酶(如实施例1中所述方法生产的)。
用Journal of Chromatography 476：(1989)227-233中所述方法从Rennilase 150L(得自Novo Nordisk A/S)中纯化Rhizomucor miehei生产的天冬氨酸蛋白酶。
冷冻干燥两种纯化的酶。糖基化的测定
在微炉(micro-oven)中将25μg样品在2M TFA(三氟乙酸)中水解。
用Dionex高效阴离子交换色谱法(HP AEC)分离和检测单糖，通过16mM NaOH中的恒溶剂成分洗脱进行分离。用脉冲电流检测法(参见：Rocklin and Pohl；J.Liq，Chromatography 6：1577-1590)检测单糖。
经分析的样品相当于20μg干物质(样品)。
样品重复分析三次。
结果
                  Rhizomucor miehei        米曲霉
                  生产的                   生产的
                  天冬氨酸蛋白酶           天冬氨酸蛋白酶
半乳糖胺              0                        0
葡萄糖胺            265                      630
半乳糖              170                      500
葡萄糖              200                      100
甘露糖             1300                     2860
结果以相对量给出。
可以看出，米曲霉表达的天冬氨酸蛋白酶和R.miehei表达的天冬氨酸蛋白酶在糖含量上有显著差别，重组天冬氨酸蛋白酶的N-结合氨基葡萄糖(glucoseamin)，半乳糖和甘露糖含量比天然蛋白酶高100％。

Claims (13)

1.一种以改进的产率生产干酪的方法，其中，向乳中加入足够量的具有高于天然天冬氨酸蛋白酶的N-结合糖的重组天冬氨酸蛋白酶以影响乳的凝结，其后以原本已知的制造干酪的方式处理得到的凝乳。
2.根据权利要求1的方法，其中，编码天冬氨酸蛋白酶的基因得自丝状真菌。
3.根据权利要求2的方法，其中，丝状真菌是毛霉目。
4.根据权利要求2的方法，其中，丝状真菌是Rhizomucor属。
5.根据权利要求2的方法，其中，丝状真菌是Rhizomucormiehei或Rhizomucor pusillus。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中，天冬氨酸蛋白酶是用重组DNA技术在丝状真菌中生产的。
7.根据权利要求6的方法，其中，丝状真菌属于曲霉属或木霉属。
8.根据权利要求7的方法，其中，丝状真菌是米曲霉，黑曲霉，构巢曲霉或泡盛曲霉的一个菌株。
9.根据权利要求6的方法，其中，重组蛋白酶具有至少高于天然蛋白酶50％的N-结合糖含量。
10.根据权利要求9的方法，其中，重组蛋白酶具有高于天然蛋白酶100％的N-结合糖含量。
11.根据权利要求1的方法，其中，以1-10KRU每升乳的量加入该重组天冬氨酸蛋白酶。
12.根据权利要求1的方法，其中，乳是全脂乳或浓缩全脂乳。
13.根据权利要求1的方法，其中，在加入重组天冬氨酸蛋白酶之前或同时加入发酵剂培养物。
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