ES2143545T5 - Produccion de queso con proteasa aspartica recombinante. - Google Patents
Produccion de queso con proteasa aspartica recombinante.Info
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Abstract
UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE QUESO EN MAYORES CANTIDADES, EN DONDE SE AÑADE UNA PROTEASA ASPARTICA RECOMBINANTE, DERIVADA DE RHIZOMUCOR MIEHEI O RHIZOMUCOR PUSILLUS, A LA LECHE EN CANTIDADES SUFICIENTES COMO PARA QUE LA LECHE SE CUAJE, TRAS LO CUAL LA CUAJADA RESULTANTE SE TRATA SEGUN EL METODO CONOCIDO PER SE PARA LA PRODUCCION DE QUESO.
Description
Producción de queso con proteasa aspártica
recombinante.
Esta invención se refiere a un proceso para
producir queso con mejores rendimientos.
Para la producción de queso es necesario coagular
la leche con el fin de poder separar la caseína del suero. Los
productos que contienen renina, una enzima de coagulación de la
leche aislada del estómago de ternera, se han utilizado para este
propósito durante muchos años. El déficit de estómagos de ternera
en las últimas décadas resultó en una intensa búsqueda de otras
enzimas de coagulación de la leche. Actualmente, se están
utilizando comercialmente pepsina bovina, pepsina porcina así como
enzimas microbianas. Los más útiles de los cuajos microbianos son
el cuajo Rhizomucor miehei y el cuajo Rhizomucor
pusillus.
En esta invención se ha descubierto,
sorprendentemente, que la glicosilación de la proteasa aspártica
puede proporcionar un aumento del rendimiento del queso del 0,2% si
se compara con la enzima nativa. Un aumento del rendimiento del
queso de un 0,2% significa 2 kg. adicionales de queso por tonelada
de queso con un valor de aproximadamente
\hbox{8-10} US\textdollar(precio de la lechería).
Según esto, la presente invención se refiere a un
proceso para producir queso con mejores rendimientos, caracterizado
porque se añade una proteasa aspártica recombinante a la leche en
cantidad suficiente para obtener la coagulación de la leche,
después de lo cual se procesa el requesón de la manera conocida
per se para producir el queso.
El término "proteasa aspártica recombinante"
se aplica a la proteasa aspártica microbiana producida en un
organismo huésped transformado con codificación de ADN para la
proteasa. El organismo huésped es un hongo filamentoso.
Se pretende que el término "hongo
filamentoso" incluya los hongos que pertenecen a los grupos de
ficomicetos, zigomicetos, ascomicetos, basidiomicetos u hongos
imperfectos, incluyendo hipomicetos como los del género
Aspergillus, Trichoderma, Penicillium,
Fusarium o Humicola.
De acuerdo con esta invención se prefiere
utilizar proteasa aspártica recombinante de mucorales (por ejemplo
Rhizomucor, en particular Rhizomucor miehei o
Rhizomucor pusillus) expresados en Aspergillus o
Trichoderma en un proceso de producción de queso con mejores
rendimientos.
Por ejemplo, se puede obtener una secuencia de
ADN que codifica preproquimisona o proquimosina bovina según se
describe en la EP 215 594. Una secuencia de ADN que codifica
proteasa aspártica de Rhizomucor miehei puede aislarse según
se describe en la EP 238 023.
Las secuencias de ADN que codifican funciones que
facilitan la expresión del gen comprenden típicamente un promotor,
sitios de iniciación de transcripción y funciones de terminación de
transcripción y de poliadenilación.
El promotor, que puede venir precedido por
secuencias de activación de línea de entrada y secuencias de
intensificación según se conocen en la técnica, puede ser cualquier
secuencia de ADN que tenga una fuerte actividad transcripcional en
hongos filamentosos y se puede derivar de un gen que codifica una
proteína extracelular o intracelular como una amilasa, una
gluco-amilasa, una proteasa, una lipasa o una
celulasa.
Ejemplos de promotores adecuados son aquellos
derivados del gen que codifica la amilasa A. oryzae TAKA, la
proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la
\alpha-amilasa neutra A. niger, la
\alpha-amilasa estable al ácido A. niger,
la glicoamilasa A. niger, la lipasa Rhizomucor
miehei, la proteasa alcalina A. oryzae o la isomerasa de
fosfato de triosa A. oryzae.
El organismo huésped de hongo filamentoso puede
ser convenientemente uno que se ha utilizado previamente como
huésped para producir proteínas recombinantes, por ejemplo una cepa
de Aspergillus sp., como la A. niger, A.
nidulans o A. oryzae. El uso de A. oryzae para la
producción de proteínas recombinantes se describe extensamente en,
por ejemplo, la EP 238 023.
Las secuencias de terminación y poliadenilación
pueden derivarse convenientemente de las mismas fuentes que el
promotor.
Las técnicas aplicadas para transformar una
célula huésped de hongos se pueden adaptar convenientemente desde
los métodos para la transformación de A. nidulans descritos
en, por ejemplo, Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81, 1984, páginas 1470-1474, o EP 215 594, o
desde los métodos de transformación de A. niger descritos,
por ejemplo, en Buxton et al., Gene 37, 1985, páginas
207-215 o US 4.885.259 ó desde el método de
transformación de A. oryzae descrito en la EP 238 023. En el
proceso de la presente invención se transforma la célula huésped
con un sistema vector que comprende una secuencia de ADN que
codifica un marcador de selección capaz de ser incorporado en el
genoma del organismo huésped durante la transformación, que, sin
embargo, no es expresado por el huésped antes de la transformación
o es expresado en cantidades insuficientes para permitir el
crecimiento bajo condiciones selectivas. Los transformantes se
pueden seleccionar y aislar de los
no-transformantes sobre la base del marcador de
selección incorporado.
Los marcadores de selección adecuados se derivan
del gen A. nidulans ó A. niger argB, el gen A.
nidulans trpC, el gen A. nidulans amdS, el gen
Neurospora crassa pvr4 o DHFR, o el gen A.
niger o A. oryzae niaD.
Las secuencias de ADN que codifican la proteasa
aspártica, el promotor y terminador pueden insertarse en un vector
separado para la introducción en la célula huésped. En el presente
contexto, se supone que el término "sistema vector" incluye un
solo vector o dos o más vectores que contienen juntos la
información total de ADN a introducir en la célula huésped. El
vector o los vectores pueden ser lineales o moléculas circulares
cerradas. En un tipo de ejecución preferido del proceso de la
invención, el sistema vector comprende dos vectores, uno que lleva
la secuencia de ADN que codifica el marcador de selección, y el
otro que lleva las secuencias de ADN que codifican la proteína de
hemo, la prerregión y la expresión del gen que facilita las
funciones.
Se ha descubierto sorprendentemente que el
alcance de glicosilación de la proteasa aspártica recombinante es
superior al de la glicosilación de las proteasas aspárticas
obtenidas de las cepas Rhizomucor de procedencia natural. Más
específicamente, la nueva proteasa aspártica recombinante se
caracteriza porque el contenido de carbohidrato es, como mínimo, en
un 50% superior al de la proteasa aspártica nativa, de preferencia
el contenido de carbohidrato tiene un nivel del 100% superior a la
proteasa aspártica nativa. Se supone que el término "proteasa
aspártica nativa" significa la proteasa producida por un
organismo de la naturaleza (por ejemplo el Rhizomucor).
La diferenciación e identificación de la proteasa
aspártica nativa y de la proteasa aspártica recombinante es posible
a través de la medición de su glicosilación.
Anteriormente se ha descrito que el
Aspergillus glicosila la lipasa Humicola de forma
diferente a la lipasa nativa de Humicola (véase EP 305 216),
pero lo nuevo es que el Aspergillus también glicosila la
proteasa aspártica de Rhizomucor de forma diferente a la
proteasa aspártica nativa de Rhizomucor, y específicamente
que por este proceso aumenta el contenido de carbohidrato de la
proteasa aspártica en un 50-100%.
El alcance de glicosilación de unión N se
determina como la diferencia en pesos moleculares entre la proteasa
aspártica y una proteasa aspártica deglicosilada. La
deglicosilación se realiza por la endoglicosidasa H (genzima)
(elimina la glicosilación de unión N) utilizando 1 mg/ml de
proteasa y aplicando un tiempo de reacción de 18 horas a 37ºC, el
endo-H se dosifica de manera que no se obtiene
ninguna deglicosilación con dosificaciones mayores de
Endo-H. El peso MW se mide por
SDS-PAGE.
El alcance de la glicosilación de unión N se
expresa en glicosilación kD por mol de proteína.
Como material de partida se puede utilizar para
el proceso de la invención, cualquier tipo de leche, en particular
leche de rumiantes como son las vacas, ovejas, cabras o camellos,
por ejemplo leche reconstituida, leche entera, leche entera
concentrada o leche desnatada.
La leche puede concentrarse de diferentes formas
como por ejemplo por la evaporación o deshidratación por aspersión,
sin embargo, se concentra de preferencia por filtración de
membrana, por ejemplo ultrafiltración en la que se permite a las
moléculas con un peso molecular hasta 20.000 pasar a través de la
membrana, opcionalmente con diafiltración antes o después de la
ultrafiltración, o, posiblemente, hiperfiltración en la que se
permite a las moléculas con un peso molecular de hasta 500 pasar a
través de la membrana. En cuanto a una descripción más detallada
del proceso de ultrafiltración véase, por ejemplo, Quist et al.,
Beretning fra Statens Mejerifors\diameterg, 1986.
Se puede añadir a la leche un cultivo iniciador
antes de o simultáneamente con la adición del ácido aspártico
recombinante en la presente invención. El cultivo iniciador es un
cultivo de bacterias del ácido láctico utilizado para la producción
convencional del queso, para fermentar la lactosa presente en la
leche y provocar la siguiente descomposición de la caseína
coagulada en péptidos menores y aminoácidos libres como resultado
de su producción de proteasas y peptidasas. El cultivo iniciador se
puede añadir en cantidades convencionales para el presente
propósito, es decir, típicamente cantidades de aproximadamente 1 x
10^{4}-1 x 10^{5} bacterias/g de leche para
queso, y se puede añadir en forma de cultivos liofilizados,
congelados o líquidos. Cuando la leche utilizada en el proceso de
la invención es leche concentrada, es preferible añadir el cultivo
iniciador después de concentrar la leche, aunque esto no representa
un requisito absoluto, ya que las bacterias iniciadoras quedarán
retenidas durante la filtración.
Después de añadir la enzima de coagulación de la
leche, se pueden realizar los pasos subsecuentes del proceso de
producción del queso, es decir la salación, el prensado y
maduración del requesón, de la forma tradicional en la producción
del queso, por ejemplo según lo describe R. Scott, Cheesemaking
in Practise, 2ª Ed., Elsevier, Londres, 1986.
Actualmente se contempla que la mayoría de los
tipos de queso puede prepararse ventajosamente por el proceso de la
invención.
Las diferentes vías por las que se puede formular
la preparación de enzimas son bien conocidas en la técnica de las
enzimas, compare por ejemplo K. Aunstrup et al., "Production of
Microbial Enzymes", en Microbial Technology (H.J. Peppler
and D. Perlman, Eds.), 2ª ed., Vol. I, Academic Press 1979, páginas
295-297.
En el proceso de las presente invención varía la
cantidad de proteasa aspártica recombinante de acuerdo con el grado
de concentración de la leche, pero la enzima se añade,
normalmente, en cantidades de 1-10 KRU por 1 l de
leche entera.
1 RU es la unidad Novo para la potencia del
cuajo. 1 KRU = 1000 RU. La potencia del cuajo se determina
utilizando un método modificado de Berridge (N.J. Berridge,
Analyst, 77, 1952 p. 57) donde la potencia del cuajo se
determina utilizando una Rennilase® (proteasa aspártica
Rhizomucor miehei obtenible de Novo Nordisk A/S) siendo el
estándar de referencia en polvo.
El principio del método es que la enzima actúa en
una solución de leche desnatada en polvo que contiene cloruro
cálcico bajo condiciones estándar. Se mide el tiempo necesario
desde la adición de la enzima hasta que la mezcla de reacción
comience a mostrar floculación. Este tiempo es aproximadamente
inversamente proporcional a la concentración de la enzima y se
compara con el tiempo de floculación en una muestra con una
concentración conocida de la enzima. Estos tiempos no deberían
diferir substancialmente entre sí y deberían ser de 5,0 min. \pm
0,5 min.
La determinación de la potencia se realiza
visualmente y a 30ºC. Se utiliza "Barridge Substrate"
consistente en 12 g de leche desnatada en polvo deshidratada por
aspersión disuelta en 100 ml de 0,01 M de una solución de cloruro
cálcico. El substrato se deja descansar durante, como mínimo, 1
horas antes de poder utilizarlo.
El análisis se realiza en un baño de agua vidrio
en el que giran lentamente los tubos de ensayo por medio de un
motor alrededor de sus ejes longitudinales con una inclinación de
aproximadamente 30º relativa a la superficie del agua. De esta
manera se formará continuamente una película de leche en el tubo
por encima de la superficie de leche y es fácil ver la floculación
en esta película tan pronto comience.
Algunas veces se puede producir una coagulación
local en la leche. Estas coagulaciones no deben confundirse con la
floculación real que se caracteriza por la adherencia de pequeños
copos de caseína en el tubo de ensayo cerca de la superficie de la
leche.
Aproximadamente media hora antes de realizar el
análisis, coloque los tubos de ensayo taponados que contienen 10 ml
del substrato de leche en un baño de agua de temperatura constante
a 30ºC \pm 0,1ºC. El tiempo de floculación cambia ligeramente en
el tiempo durante el cual se mantiene caliente el substrato. Añada
ahora con una jeringa un ml de la solución de enzima diluida a cada
uno de los 3 tubos de ensayo y active simultáneamente una
cronómetro para cada tubo. El cronómetro arranca inmediatamente
después de inyectar la solución de enzima en el tubo de ensayo. La
solución de enzima se inyecta contra la pared del tubo para evitar
que la leche forme espuma. Inmediatamente después de la adición de
la enzima, se cierra el tubo de ensayo con un tapón limpio y seco y
se invierte 3 veces con el fin de lavar toda la enzima de la pared
del tubo y mezclarla con la leche. Inmediatamente después se puede
colocar el primer tubo de ensayo en el huso rotatorio. En el
momento en el que comienzan a sedimentar pequeños copos de coágulo
en el tubo se para el cronómetro del primer tubo, el tubo se
sustituye por el tubo nº 2 etc. Intente conseguir un tiempo de
floculación entre 4,5 y 5,5 min. El tiempo de floculación para los
3 tubos de ensayo no debe variar en más de 0,1 min. (6 seg.) y el
promedio se utiliza para calcular la potencia del cuajo.
Potencia de la muestra = \frac{Pot. \; del \;
estándar \; x \; tiempo \; de \; floculación \; de \; diluc. \; del
\; estánd.}{tiempo \; de \; floculación \; de \; la \; muestra} x
\frac{Dilución \; de \; la \; muestra}{Dilución \; del \;
estándar}
El método Berridge modificado solamente es
adecuado para la determinación de la potencia de cuajos sin sales
de calcio añadidas.
La invención se explica más en detalle en los
siguientes ejemplos sin que estos significan de ninguna forma una
limitación del alcance de la invención según se reivindica.
Proteasa producida de Aspergillus oryzae:
Se fermentó el transformante p777 (descrito en la EP 489 718)
durante aproximadamente 5 días en un fermentador convencional de
2,5 m^{3} con agitación y aireación en un medio que contenía
granos de soja alimentados con maltodextrina durante el
crecimiento; el pH se mantuvo por debajo de 6,0 mediante la adición
de ácido fosfórico. La proteasa aspártica se recuperó del caldo de
fermentación por técnicas convencionales de filtración,
ultrafiltración y evaporación. La proteasa aspártica se
inestabilizó según se describe en la patente US 4.357.357. El
concentrado de proteasa aspártica se diluyó a 54,63 KRU/g.
Proteasa aspártica producida de Rhizomucor
miehei: Se utilizó 51,42 KRU/g de Rennilase® XL (vendida por
Novo Nordisk A/S).
Ambas enzimas se utilizaron de manera que el
primer signo de floculación apareció después de aproximadamente 15
minutos. Las dosificaciones se mantuvieron a un nivel constante
durante todo el experimento. Las variaciones en la coagulabilidad
de la leche se compensaron mediante la variación de los tiempos de
corte.
A un vaso de precipitados de 5 l se añadieron
4000 g de leche entera pasteurizada (obtenible de MD Foods,
Karolinevej 1, DK-4200, Slagelse, Dinamarca). Se
incubó un cultivo iniciador CHL 113 lote 010691 (obtenible de Chr.
Hansen, B\diameterge Alle, 10, DK-2970
H\diameterrsholm. Dinamarca) durante 16 horas en una cantidad
suficiente de leche a temperatura ambiente y se congeló en
porciones de 40 g, suficientes porciones para todo el experimento.
Se añadieron CaCl_{2}, 0,8 g por porción, y una porción
descongelada de cultivo iniciador. Después de un tiempo de
maduración de 30 minutos se introdujo la enzima de coagulación de
la leche en una cantidad de 10,9 KRU por 4000 g de leche. Ambas
enzimas se utilizaron en cada prueba y su orden no se aleatorizó.
El tiempo de floculación era de aproximadamente 15 minutos y el
tiempo de corte aproximadamente 2 veces el tiempo de floculación
más 1 minutos. Después de un tiempo de curación de 4 minutos y un
tiempo de agitación de 15 minutos se transfirieron el requesón y el
suero hasta un molde con estopilla y se dejó drenar durante la
noche.
El suero total bien mezclado se filtró a través
de una capa de gasa para separar las partículas del requesón. Se
determinó el N total utilizando un método Kjeldal modificado en un
digestor Tecator y un sistema de destilación Kjeltec 1003. La
proteína se expresó como N x 6,38. Todos los análisis se realizaron
por triplicado.
Se utilizó una prueba por pares t en n = 61
diferencias en el contenido total de proteína del suero, utilizando
como estimación t = x_{promedio}/(s^{2}&n)^{1/2},
donde X representa la diferencia de la proteína de suero total
entre los correspondientes experimentos con las dos enzimas y
s^{2} es la variación estimada de X, t_{0,95}(60%) =
1,67, t_{0,995}(60%) = 3,23.
En la Tabla 1 se pueden ver algunos parámetros de
la producción de queso Feta. Los tiempos de coagulación medios
fueron de 15,41 min. para la proteasa aspártica y 15,35 min. para
Rennilase XL. La \Deltaproteína se calculó como la diferencia
entre la cantidad de Suero Rennilase XL por el porcentaje de
proteína y la cantidad de Suero de Proteasa Aspártica por el
porcentaje de proteína. La pérdida media de proteína fue de 30,30 g
con el suero de proteasa aspártica y 30,50 g con el suero de
Rennilase XL. Estas cifras pueden significar un aumento en el
rendimiento del queso del 0,2% cuando se cambia de Rennilase XL a
proteasa aspártica.
El X_{medio} en \Deltaproteína fue de -0,1953
y s = 0,4642 y n = 61, pudiendo así calcular una estimación para t
como
t_{o} =
-0,1953/(0,4642^{2}/61)^{1/2} = -3,2860, lo que significa
que la hipótesis de que no hay diferencia entre los rendimientos
puede rechazarse con una gran probabilidad (p < 0.001).
| Parámetro | promedio | n | s | |
| Leche, cantidad | 4000 g | constante | ||
| Iniciador | 1% | constante | ||
| Enzima de coagulación | proteasa | 10,9 | 61 | constante |
| de la leche KRU/4000 G | aspártica | |||
| Rennilase® L | 10,9 | 61 | constante | |
| CaCl_{2} | 0,02% | constante | ||
| Tiempos min. | maduración | 30 | 122 | constante |
| floculación | proteasa | 15,41 | 61 | \pm 0,63 |
| aspártica | ||||
| Rennilase XL | 15,35 | 60 | \pm 0,64 | |
| tiempo de corte | proteasa | 31,79 | 61 | \pm 1,25 |
| aspártica | ||||
| Rennilase XL | 31,82 | 60 | \pm 1,21 | |
| tiempo de curación | 4 | constante | ||
| agitación | 15 | constante | ||
| vaciado | 10 | constante | ||
| vaciado a la prensa | 120 | constante | ||
| pH | leche | 6,69 | 122 | - |
| sedimento | 6,57 | 122 | \pm 0,05 | |
| suero: proteasa | 6,53 | 56 | \pm 0,14 | |
| aspártica | ||||
| suero: | 6,53 | 51 | \pm 0,14 | |
| Rennilase XL | ||||
| Temperaturas ºC | solidificación | 33 | ||
| Pesos g | leche | 4000 | 122 | constante |
| suero | 3299,3 | 122 | \pm 27,5 | |
| requesón | 685,7 | 117 | \pm 20,6 | |
| Recuperación % | ||||
| \hskip0.5cm producción/alimentación | 99,9 | |||
| \hskip0.5cm suero/producción | 82,8 | |||
| \hskip0.5cm requesón/producción | 17,2 |
\newpage
La proteasa aspártica es una proteína glicosilada
tanto si se expresa de R. miehei como de A. oryzae.
La endoglicosidasa H puede liberar la parte glico de las proteínas
N-glicosiladas por hidrólisis específica entre dos
moléculas de N-acetil-glucosamina
unidas a Asn en proteínas N-glicosiladas.
La proteasa aspártica producida de Aspergillus
oryzae (producida según se describe en el Ejemplo 1) se
purificó a partir del caldo de cultivo por el método descrito en
Journal of Chromatography 476 (1989)
227-233.
La proteasa aspártica producida de Rhizomucor
miehei se purificó de Rennilase 150® L (obtenible de Novo
Nordisk A/S) por el método descrito en Journal of Chromatography
476: (1989) 227-233.
La proteasa aspártica producida de Aspergillus
oryzae y la proteasa aspártica producida de Rhizomucor
miehei se incubaron en una concentración de 1 mg/ml con EndoH
(genzima) durante 18 horas a 37ºC en 100 mM de tampón de fosfato
con un pH de 6,0. El grado de hidrólisis se determinó por el cambio
en MW por SDS-PAGE en geles del
5-20% de gradiente.
El experimento mostró que 0,02 U/ml de EndoH eran
suficientes para prácticamente la deglicosilación completa, y que
el MW de la molécula de proteasa aspártica no cambió al incubar
sin EndoH.
El MW de la proteasa aspártica deglicosilada era
de 38,3 kD tanto para R. miehei como A. oryzae,
mientras que la enzima glicosilada de R. miehei mostró un MW
de 41,5 kD y la enzima glicosilada de A. oryzae mostró un MW
de 44,7 kD.
El contenido de glicosilación de unión N de la
proteasa aspártica expresada de A. oryzae es entonces de 6,4
kD (44,7 kD menos 38,3 kD) por mol de proteína, siendo más en un
100% que la glicosilación de unión N de 3,2 kD (41,5 kD - 38,3 kD)
por mol de Rennilase (proteasa aspártica expresada de R.
miehei).
Se purificó la proteasa aspártica producida de
Aspergillus oryzae (según se describe en el Ejemplo 1) a
partir del caldo de cultivo por el método descrito en Journal of
Chromatography 476, (1988) 227-233.
Se purificó la proteasa aspártica producida de
Rhizomucor miehei a partir de Rennilase 150® L (que se puede
obtener de Novo Nordisk A/S) por el método descrito en Journal of
Chromatography 476: (1989) 227-233.
Ambas enzimas purificadas se liofilizaron.
En 2M TFA (ácido
trifluoro-acético) se hidrolizaron en un microhorno
muestras de 25 \mug.
Se separaron los monosacáridos y se detectaron
por una cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento
(HPAEC) de Dionex; las separaciones se realizaron por una elución
isocrática en 16 mM de NaOH. Se detectaron los monosacáridos por
detección amperométrica de impulsos (ref: Rocklin and Pohl; J. Liq.
Chromatography 6: 1577-1590).
Las muestras analizadas son equivalente a 20
\mug de material seca (muestra).
Las muestras se analizaron por triplicado.
Resultados
| Proteasa aspártica | Proteasa aspártica | |
| producida de | producida de | |
| Rhizomucor miehei | Aspergillus oryzae | |
| Galactosamina | 0 | 0 |
| Glucosamina | 265 | 635 |
| Galactosa | 170 | 500 |
| Glucosa | 200 | 100 |
| Manosa | 1300 | 2860 |
Los resultados se indican en cantidades
relativas.
Se observa que existen diferencias significativas
en el contenido de azúcar entre la proteasa aspártica expresada de
A. oryzae y la proteasa aspártica expresada de R.
miehei, y que la proteasa aspártica recombinante tiene un
contenido de enlace N de glucosamina, galactosa y manosa en un 100%
superior a la proteasa nativa.
Claims (10)
1. Un proceso para producir queso, en el que se
añade una proteasa aspártica recombinante a la leche en cantidades
suficientes para conseguir la coagulación de la leche, después de
lo cual se procesa el requesón resultante de la forma conocida
per se en la producción de queso, con el fin de mejorar los
rendimientos si se compara con la enzima nativa, en el que el gen
que codifica la proteasa aspártica procede de un hongo filamentoso,
en el que la proteasa aspártica se produce mediante técnicas de ADN
recombinante en un hongo filamentoso, y en el que la proteasa
aspártica recombinante tiene una glicosilación diferente de la
proteasa nativa.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el hongo filamentoso del que procede dicha proteasa
aspártica es del orden de los Mucorales.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el hongo filamentoso del que procede dicha proteasa
aspártica es del género Rhizomucor.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el hongo filamentoso del que procede dicha proteasa
aspártica es Rhizomucor miehei ó Rhizomucor
pusillus.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el hongo filamentoso en el que se produce la proteasa
aspártica pertenece al género de Aspergillus o
Trichoderma.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que el hongo filamentoso en el que se produce la proteasa
aspártica es una cepa de A. oryzae, A. niger, A.
nidulans o A. awamori, o en el que el hongo filamentoso
en el que se produce la proteasa aspártica es una cepa de
Trichoderma reesei.
7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la proteasa recombinante tiene un contenido de
carbohidrato de unión N de, como mínimo, un 50% superior al de la
proteasa nativa, de preferencia un contenido de carbohidrato de
unión N un 100% superior al de la proteasa nativa.
8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en el que dicha proteasa
aspártica se añade en una cantidad de 1-10 KRY por 1
l de leche.
9. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que la leche es leche
entera o concentrada.
10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que se añade un cultivo
iniciador a la leche antes o al mismo tiempo de la adición de la
proteasa aspártica recombinante.
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