CN1061991C

CN1061991C - 新型血吸虫疫苗肽(三)

Info

Publication number: CN1061991C
Application number: CN94105976A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟深; 许家喜; 杨军; 秦致辉
Original assignee: Beijing Medical University
Current assignee: Beijing Medical University
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 2001-02-14
Anticipated expiration: 2014-06-08
Also published as: CN1112931A

Abstract

本发明属于有机化合物。

具有下列基本序列的多肽：

X-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Y-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH

此式中X，Y均为氨基酸残基，该肽对血吸虫病有保护性免疫作用，可用于制备抗血吸虫病的疫苗类药物。

Description

新型血吸虫疫苗肽(三)

本发明属于有机化合物。

目前对血吸虫疫苗的研究主要集中在照射减毒活疫苗和可溶性抗原疫苗两方面。照射减毒活疫苗的研究历史较长，在制备和应用方面已积累了较成熟的经验，在实验室和动物实验上已取得了较好结果。但该种疫苗还存在以下有待解决的问题，(1)大量注射引起的局部炎症，(2)疫苗的安全性，如过敏反应，(3)疫苗的致病性，如灭活不完全造成的感染，(4)大规模制备疫苗时虫子的来源不足。为了避免上述缺点，人们正在积极从事合成的可溶性抗原疫苗的研究，此种疫苗的重要意义在于，可以采用人工大量合成，经人工合成的疫苗接种量小，可以减少异种蛋白的过敏反应，并可大量制备，且无灭活不完全造成的致病危险，有实际应用前景。已有技术，如中国专利，申请号94105038.6，给出了一种可用于制备血吸虫疫苗的肽。

本发明的目的在于提供了另一种可用于制备血吸虫多价疫苗的多肽，其优点在于用其制成的多价疫苗接种量小，且对多种血吸虫有免疫作用，可以减少异种蛋白的过敏反应，无灭活不完全造成的致病危险，并可以采用人工大量合成。

本发明所涉及的有机化合物--多肽，即是血吸虫可溶性抗原疫苗多肽，其特征在于化学结构如下所示：

在上式中：

A为氢，C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基或RCO-形式的基团。在这里：

(ⅰ)R是氢，C1-11烷基，C2-11烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。

(ⅱ)RCO还可以是

(a)天然的氨基酸残基，也可以是相应的D-构型氨基酸残基。

(b)一个二至五肽残基，其氨基酸残基可以是相同的也可以是不同的，其所用氨基酸残基如(a)中定义。

(ⅲ)RCO还可以是

(a)天然的四，五，六碳糖酸残基。

(b)一个二，三，四寡糖残基，其单糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用单糖残基为天然单糖残基，但与肽连接的单糖残基为糖酸残基。

A′为氢，或当A为C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基时，也为C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。

B为-His-,-Glu-,-Asp-,-Gln-,-Asn-,-Gly-,

C为-Lys-,-Glu-,-Asp-,-Gln-,-Asn-,-Ser-,-Thr-,

D为-Glu-,-Asp-,-Gln-,-Asn-,

E为-His-,-Cys-,-Lys-,

F为-Lys-,-Val-,

X可以为下列形式：-COOR₁,-CH₂OR₂或

在这里：

R₁是氢，C1-3的烃基，天然的四，五，六碳单糖或二，三，四寡糖，其单糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用单糖残基为天然四，五，六碳单糖残基。

R₂是氢，或是生理可接受的，并在生理条件下可水解的酯基。

R₃和R₄是氢，C1-3烃基，苯基，苄基，C9-10苯烃基。或R₃是氢，R₄为天然的氨基酸残基，也可以是相应的D-构型氨基酸残基。R₄也可以是一个二肽残基，其两个氨基酸残基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸残基为天然的氨基酸残基或相应的D-构型氨基酸残基。R₄还可以是天然的四，五，六碳糖残基，也还可以是一个二，三，四寡糖残基，其单糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用单糖残基为天然四，五，六碳单糖残基。

本发明涉及的多肽可以以其自由形式存在，也可以以盐的形式或复合物的形式存在。例如可以和有机酸，高聚物酸和无机酸形成盐，这种形式的盐如盐酸盐，乙酸盐。再如，可以和无机物，如无机盐或氢氧化物，形成象Ca²⁺或Zn²⁺盐。也可以和高聚有机物形成复合物，以及和药物可以接受的稀释剂和载体(如药物可以接受的蛋白载体)形成的复合物。

本发明涉及的多肽可以用已知的多肽化学方法来合成及生产，如下述实施例，并且也可用与本实施例明显等价的化学合成方法，溶液法或固相合成法(包括叔丁氧羰基保护法和芴甲氧羰基保护法)来合成及生产。

本发明涉及的多肽及其药物可以接受的盐和复合物在生物活性检测和动物实验中表明均有有价值的药物活性。特别是在抗血吸虫病方面，通过免疫小鼠实验表明有很高的减虫率。本发明涉及的多肽在动物实验中的用量范围为0.001到1000ug/kg体重。

实施例1

1．Boc-Phe-OCH₂-Resin的制备

1.1.Boc-Pbe-OCs的制备

1.656g(6.24mmole)Boc-Phe-OH溶于40mL乙醇和8mL水中，搅拌溶解，加入1.017g(3.12mmole)Cs₂CO₃，搅拌至反应完，减压抽干，加入4×20mL干燥苯，减压抽干，以除去水。放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥过夜，得白色铯盐。

1.2.Boc-Phe-OCH₂-Resin的制备

将上述制得的铯盐溶于10mL精制过的DMF中，加入3.0g(含氯量为3.12mmole)氯甲基树脂，在保持干燥状态下，于80℃适度搅拌反应24小时，过滤抽干，依次用3×10mLDMF,3×10mL DMF/H₂O(9∶1),3×10mL DMF,3×10mL无水EtOH洗涤，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥过夜，得白色Boc-Phe-OCH₂-Resin。

1.3.Boc-Phe-OCH₂-Resin的封氯

向上述Boc-Phe-OCH₂-Resin中加入2.558g(31.2mmole)无水乙酸钠，30mL精制过的DMF，在70℃适度搅拌反应24小时，过滤抽干，依次用2×10mL DMF,2×10mL DMF/H₂O(9∶1),2×10mL DMF,2×10mL无水EtOH洗涤，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥过夜，得白色封好氯的Boc-Phe-OCH₂-Resin。

1.4.Boc-Phe-OCH₂-Resin的封羟基

向上述封好氯的Boc-Phe-OCH₂-Resin中加入10mL(0.105mole)重蒸过的乙酸酐，20mL(0.25mole)处理过的无水无氨吡啶，20mL干燥苯，室温适度搅拌反应24小时，过滤抽干，依次用4×50mL DCM,3×10mL无水MeOH洗涤，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥过夜，得白色封好氯和羟基的Boc-Phe-OCH₂-Resin。

经茚三酮检测氨基含量为0.92mmole/g树脂。

2．Boc-Asp(OBzl)-Phe-OCH₂-Resin的制备

1.5g(氨基含量为1.38mmole)封好氯和羟基的Boc-Phe-OCH₂-Resin加入15mL DCM溶涨5分钟，抽干。

2.1.脱保护

向上述树脂中加入15mL TFA/DCM(3∶7)，摇搅30分钟，抽干，依次用10mL DCM,10mL MeOH各洗三次，抽干。

2.2.中和

加入10mL TEA/DCM(1∶9)，摇搅5分钟，抽干，再加入10mL TEA/DCM(1∶9)，摇搅10分钟，抽干，用10mL DCM洗三次，抽干。

2.3.偶联

加入0.969g(3mmlole)Boc-Asp(OBzl),0.608g(4.5mmole)HOBt,0.727g(4.5mmole)DCC,15mL DMF，摇搅反应6小时，抽干，10mL DMF洗三次，10mL MeOH洗三次，10mL DCM洗三次，抽干。

2.4.检测

取少许树脂加入试管中，加入茚三酮试剂1,2和3各3滴，105℃加热5分钟。若为淡黄色，说明偶联反应完全，可以进行下一步反应；若为蓝色或棕红色，说明偶联反应不完全，按2.2中和后，重新进行2.3偶联反应，但可根据反应具体情况减少投料。

按上述方法依次接下列氨基酸Boc-Pro,Boc-His(Tos),Boc-Thr(Bzl),Boc-Lys(Cbz),Boc-His(Tos),Boc-Asp(OBzl),Boc-Gly,Boc-Asn,Boc-Leu,Boc-Tyr(OBzl),Boc-Thr(Bzl),Boc-Asn,Boc-His(Tos)。

当前一个氨基酸为Pro,Gln和Asn时，由于在茚三酮试剂检测时其本身为黄色，所以可不检测，但为了保证偶联反应完全，应重新偶联1-2次。当所用氨基酸有Tos为侧连保护基时，把HOBt改为HOSu，以免HOBt的碱性把Tos保护基脱掉。在接上Trp后，脱出Boc保护时应在TFA/DCM中加入几滴苯甲硫醚和乙二硫醇。

最后得到联在树脂上的侧连保护肽His(Tos)-Asn-Thr(Bzl)-Tyr(OBzl)-Leu-Asn-Gly-Asp(OBzl)-His(Tos)-Lys(Cbz)-Thr(Bzl)-His(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Phe-Resin。附：茚三酮检测试剂

1．茚三酮试剂1,1mL 0.001N KCN+40mL吡啶；

2．茚三酮试剂2,40gB苯酚+10mL无水乙醇；

3．茚三酮试剂3,2g水合茚三酮+40mL无水乙醇。

3．H-His-Asn-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asp-His-Lys-Thr-His-

Pro-Asp-Phe-OH

在聚四氟乙烯肽脱保护装置中进行脱保护，向反应器中加入His(Tos)-Asn-Thr(Bzl)-Tyr(OBzl)-Leu-Asn-Gly-Asp(OBzl)-His(Tos)-Lys(Cbz)-Thr(Bzl)-His(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Phe-Resin,0.5mL苯甲醚，0.5mL苯甲硫醚和0.5mL乙二硫醇，在冰水浴冷却下放入10-15mL经无水三氟化钴干燥过的氟化氢，搅拌反应45分钟，减压抽干，用冷无水乙醚洗涤，得树脂及黏稠物，10％乙酸溶液溶解，过滤去掉残渣，冷冻干燥得干粉，以5％乙酸为洗脱剂在SephadexG15柱上纯化，纯化两次，冷冻干燥得固体1.68g，收率68％，[α]_D ¹⁸=-32.6°(C=0.67，水)。产品肽纯度由HPLC和氨基酸组成分析确定。

下列多肽也可以用实施例1中给出的相似方法来合成和生产，H - B - C - Thr - Tyr - Leu - Asn - Gly - D - E - F - Thr - His - Pro - Asp - Phe - X实施例编号 A B C D E F [α]_D ¹⁸

2 - His Lys Asp His Val -19.2(c=0.21,20％HOAc)

3 Arg-Leu-Cys His Lys Asp His Val -21.0(c=0.17,20％HOAc)

4 Glu-Asp-Arg Asn Lys Asn Cys Val -22.0(c=0.51,20％HOAc)

-Leu-Ser缩写词语表Ala 丙氨酸Asn 天冬酰胺Asp 天冬氨酸Boc 叔丁氧羰基Bzl 苄基Cbz 苄氧羰基DCC N,N′-二环己基碳二亚胺DCM 二氯甲烷DMF N,N-二甲基甲酰胺EtOH 乙醇Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸His 组氨酸HOAc 醋酸HOBt 1-羟基苯并三氮唑HOSu N-羟基琥珀酰亚胺HPLC 高压液相色谱Lys 赖氨酸MeOH 甲醇Phe 苯丙氨酸Pro 脯氨酸Resin 树脂Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Tos 对甲苯磺酰基Tyr 酪氨酸Val 颉氨酸

Claims

1．一种多肽或其药物学上可接受的盐，其特征在于化学结构如下式所示：

在式中：

A为氢或乙酰基，

A’为氢，

B为-His-,-Glu-,-Asp-,-Gln-,-Asn-,-Gly-,

C为-Lys-,-Glu-,-Asp-,-Gln-,-Asn-,-Ser-,-Thr-,

D为-Glu-,-Asp-,-Gln-,-Asn-,

E为-His-,-Cys-,-Lys-,

F为-Lys-,-Val-,

X可以为下列形式：

-COOR₁，或

在这里：

R₁是氢，C_1-3的烃基，R₂和R₃是氢，C_1-3烃基。

2．如权利要求1中所述的多肽或其药物学上可接受的盐，其特征在于

B为-His-,

C为-Asn-,

D为-Asp-,

E为-His-,

F为-Lys-。

3．如权利要求1中所述的多肰或其药物学上可接受的盐，其特征在于

B为-His-,

C为-Lys-,

D为-Asp-,

E为-His-,

F为-Val-。

4．如权利要求1中所述的多肰或其药物学上可接受的盐，其特征在于

B为-Asn-,

C为-Lys-,

D为-Asn-,

E为-Cys-,

F为-Val-。

5．如权利要求1或3中所述的多肰或其药物学上可接受的盐，其特征在于

B为-His-,

C为-Asn-,

D为-Asp-,

E为-His-,

F为-Lys-。

6．如权利要求1中所述的多肰或其药物学上可接受的盐，其特征在于下式

H-His-Asn-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asp-His-Lys-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH。

7．如权利要求1中所述的化合物或其药物学上可接受的盐，其特征在于化学结构如下式所示：

H-Arg-Leu-Cys-His-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asp-His-Val-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH,

H-Glu-Asp-Arg-Leu-Ser-Asn-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asn-Cys-Val-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH,

H-His-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asp-His-Val-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH,

H-Glu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asp-Lys-Lys-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH,

H-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Asn-Gly-Asp-His-Lys-Thr-His-Pro-Asp-Phe-OH。

8．一种治疗和预防血吸虫病的药物组合物，其中含有根据权利要求1-7中的任一种多肽，或其盐作为有效成份以及其药物学可以接受的稀释剂和载体。