CN107683089B - 用于控制节肢动物寄生虫和害虫侵扰的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供和公开了用于控制节肢动物寄生虫和害虫的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子和其钙调蛋白靶基因。具体来说，本申请提供并且公开了靶向瓦螨钙调蛋白基因序列的杀昆虫核酸分子。本申请还提供了用于控制和处理西方蜜蜂(蜜蜂)蜂巢中的寄生虫和害虫的方法和组合物。

Description

用于控制节肢动物寄生虫和害虫侵扰的组合物和方法
序列表的并入
计算机可读形式的序列表通过电子递交方式与本申请一起提交，并且以引用的方式整体并入本申请中。该序列表包括在2016年5月3日创建的文件中，该文件的文件名为“SEQUENCE_LISTING_61478_ST25.txt”，并且大小为67,223字节(如在
Figure BDA0001525850350000011
操作系统中所测量)。
本公开的领域
提供了用于控制节肢动物的寄生虫和害虫侵扰的方法和组合物。还提供了用于控制蜜蜂的瓦螨侵扰的方法和组合物。
背景
正越来越多地以工业规模培养各个种类的节肢动物。昆虫和它们的幼虫很有营养，而且在很多文化中被生食和烹熟食用。诸如蟹、龙虾、小龙虾、虾和对虾之类的甲壳类动物以大型商业规模养殖，并且成为了人类饮食的一个重要部分。除了培养节肢动物种类供食用以外，还培养节肢动物作为害虫控制策略的一部分，包括用于对其它节肢动物进行生物控制，例如培养寄生蜂用于控制蟑螂和火蚁。节肢动物还可以充当诸如染料、药品、药物和抗生素的原材料来源。随着节肢动物培养的重要性增加而增长的是各种害虫和寄生虫，它们破坏节肢动物群体或大大降低从节肢动物培养物获得的产物产量。因此，日益需要控制节肢动物害虫和寄生虫的方法。
培养的节肢动物中最重要的种类是蜜蜂。蜜蜂西方蜜蜂为作物有效授粉所需要，并且因此对世界农业非常重要。蜜蜂还产生了经济上重要的产物，包括蜂蜜和蜂蜡。蜜蜂易受众多寄生虫和病原体感染，包括外寄生螨狄斯瓦螨(Varroa destructor)。
瓦螨(狄斯瓦螨)是管控的蜜蜂(西方蜜蜂)的头号寄生虫，并且对商业养蜂来说是最大的全球性威胁(Rosenkranz等2010)。成螨通常被蜜蜂幼蜂信息素所吸引而在封盖前进入工蜂和雄蜂的抚幼室中。螨潜入蜜蜂放在预期封盖的巢室内的幼蜂食物中，从而最可能避免被保育蜂认出并去除。在保育蜂将幼蜂巢室封盖后，螨附着至幼虫并且开始吞食蜂幼虫的血淋巴。这个过程是为螨的卵子发生做准备，并且继而在几天后产下雄性卵和雌性卵。最终，成体瓦螨离开巢室并且紧紧抓住出房的蜜蜂。瓦螨用多种方式直接损害蜜蜂，最值得注意的是通过消耗资源、不利地影响先天蜜蜂免疫系统和通过作为非常有效的病毒载体(Di Prisco等2011)，已知其中一些在螨中复制，因此显著增加了病毒负载。
瓦螨问题的安全、有效且持久的解决方案是当前面临的一个有待解决的挑战。当前，养蜂人使用了过多的方法来控制瓦螨水平，包括各种化学杀螨剂，其中大部分已经失效并且有毒和/或在蜂蜡和蜂蜜中留有残留。其它方法包括施用草酸或甲酸、单萜类(百里酚)和各种其它控制操作，效果千差万别，包括对所处理的群体存在毒性。培育蜜蜂对瓦螨的抗性，诸如选择卫生的行为，从而除去受侵扰的幼蜂提供了有限的实际成果。
蜜蜂的蜂群崩溃失调症(CCD)对毁灭美国和世界农业存在威胁。实际上，在美国最近爆发CCD的2006年至2007年冬季，240万蜜蜂蜂巢有估计25％或更多由于CCD而蒙受损失。在2006年至2007年的冬季，美国有估计23％的养蜂经营遭受CCD，影响了平均45％的养蜂人经营。在2007年至2008年冬季，USDA-ARS的CCD行动小组估计所有商业经营蜂巢的总计36％被CCD破坏。
CCD以蜂群的成蜂群体快速损失为特征，死亡的成蜂通常在距蜂群一定距离处被发现。在崩溃的最后阶段，蜂王仅由少数新出房的成蜂照顾。崩溃的蜂群往往有大量封盖的幼蜂和食物储存。2006年首次报道了CCD现象；然而，养蜂人早在2004年就注意到了符合CCD的独特蜂群衰退。已经假定诸如螨和感染物、气候模式、电磁(蜂窝天线)辐射、杀虫剂、营养不良和应激之类的各种因素为诱因。迄今为止，CCD的控制集中在瓦螨控制、卫生和去除受影响的蜂巢、处理机会性感染(诸如小孢子虫属)和改善营养。迄今为止还没有开发出有效的预防措施。
瓦螨寄生于蛹和成蜂，并且在蛹抚幼室内繁殖。所述螨用它们的嘴刺破蜜蜂的外骨骼并以蜜蜂的血淋巴为食。外骨骼中的这些受伤部位藏有细菌感染，诸如引起欧洲蜜蜂幼虫腐烂病的蜂房蜜蜂球菌。除了它们的寄生作用以外，还怀疑瓦螨充当众多蜜蜂病原体，包括畸翅病毒(DWV)、喀什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)的媒介物，并且可以削弱它们的宿主的免疫系统，从而让它们易受感染。如果不处理，那么瓦螨侵扰通常造成蜂群层级的死亡。
当前处理瓦螨侵扰的方法被证明是无效的，因为螨对现有杀螨剂产生了抗性。另外，使用此类杀螨剂可能将有害化学品引入准备供人消费的蜂蜜中。
发明概要
本公开提供了并且包括选择性杀昆虫剂组合物，所述选择性杀昆虫剂组合物包含具有与钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上同一的序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子。在一些方面，所述组合物还包含赋形剂。
若干实施方案涉及一种抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与瓦螨钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上同一，并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的参考瓦螨钙调蛋白基因序列相比包括一个或多个核酸的缺失，使得所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述非靶生物体基因序列为瓦螨钙调蛋白基因序列的直系同源物。在一些实施方案中，所述非靶生物体基因序列为瓦螨钙调蛋白基因序列的同系物。在一些实施方案中，所述非靶生物体基因序列与瓦螨钙调蛋白基因序列无关。在一个方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与所述所靶向的钙调蛋白基因序列相比在所述区域中有至少一个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与所述所靶向的钙调蛋白基因序列相比在所述区域中有至少两个、至少三个或至少四个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。
在一个方面，所述选择性杀昆虫剂组合物中的核酸分子是dsRNA。在一些方面，所述dsRNA是siRNA。
在一个方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在另一个方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与选自SEQ IDNO:90-92和94的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子包含选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35和69-93的序列的至少18个连续核苷酸。在一些方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子由选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35和69-93的序列组成。
在一个方面，所述选择性杀昆虫剂组合物还包含与钙调蛋白基因序列的第一区域基本上互补或基本上同一的一种或多种抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子。在一些方面，所述一种或多种核酸分子包含与钙调蛋白基因序列的第二区域互补的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与靶钙调蛋白基因序列相比在所述第一区域和/或第二区域中有至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述靶钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列或其片段基本上同一或基本上互补。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述靶钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述靶钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92的序列基本上同一或基本上互补的序列。
在一个方面，所述选择性杀昆虫剂组合物为蜜蜂可摄取的、蜜蜂可吸收的、螨可摄取的或螨可吸收的。
在一个方面，所述赋形剂是选自由蛋白、花粉、碳水化合物、聚合物、液体溶剂、糖浆、糖固体和半固体饲料组成的组。在一些方面，所述液体溶剂是选自由蔗糖溶液和玉米糖浆溶液组成的组。在一些方面，所述蛋白是选自由花粉和大豆蛋白组成的组。在另一个方面，所述赋形剂是选自糖、糖替代物或糖补充剂的固体。在一些方面，所述糖固体包括浸渍有dsRNA核酸的糖微粒。
在一个方面，本申请公开了蜜蜂可摄取的组合物，所述蜜蜂可摄取的组合物包含蜜蜂饲料和具有与钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上同一或基本上互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子与瓦螨钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上同一，并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子与靶瓦螨钙调蛋白基因序列相比在所述一个或多个区域中有至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述靶瓦螨钙调蛋白基因序列与选自SEQ IDNO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列或其片段基本上互补或基本上同一。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述核酸分子包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。在一些方面，所述蜜蜂饲料包括选自由玉米糖浆、花粉替代物、花粉、花粉饼和方旦软糖组成的组的蜜蜂食物。在一些方面，所述蜜蜂饲料还包括矿物盐、精油、啤酒酵母、酵母提取物、海藻糖、胰蛋白胨、奶粉、卵磷脂和维生素C中的一种或多种。精油的实例包括但不限于冬青油、留兰香油、薄荷油、柠檬草油和茶树油。
在另一个方面，本申请公开了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码与钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上同一或互补的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸序列，可操作地连接至在宿主细胞中具有功能的启动子序列并且当被引入到所述宿主细胞中时能够产生dsRNA。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与所靶向的钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上同一，并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸序列与靶钙调蛋白基因序列相比包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，所述所靶向的钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列或其片段基本上同一或基本上互补。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。在一些方面，所述核酸构建体还包含选自由翻译前导序列、内含子、增强子、茎-环结构、阻遏物结合序列、终止序列、中止序列和多聚腺苷酸识别序列组成的组的至少一个调控元件。在一些方面，所述宿主细胞是细菌或酵母细胞。
在另一个方面，本申请公开了一种向蜜蜂提供组合物的方法，所述方法包括向所述蜜蜂提供有效量的包含与钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上同一或基本上互补的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸的组合物，借此使所述核酸存在于蜜蜂组织中。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与所靶向的钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上同一，并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述非靶生物体是蜜蜂。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶钙调蛋白基因序列相比在所述一个或多个区域中包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，所述所靶向的钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列或其片段基本上同一或基本上互补。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。在另一个方面，本申请公开了一种治疗或预防蜂群的疾病的方法，所述方法包括向蜜蜂提供有效量的包含与钙调蛋白基因序列的一个或多个区域基本上同一或基本上互补的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸的组合物，借此使所述核酸存在于蜜蜂组织中。在一些方面，所述钙调蛋白基因序列是狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与瓦螨钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上同一，并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶钙调蛋白基因序列相比在一个或多个区域中包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，所述靶钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的核酸序列或其片段基本上互补或基本上同一。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。
在另一个方面，本申请公开了一种减少狄斯瓦螨对蜜蜂的寄生的方法，所述方法包括向所述蜜蜂提供有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物，其中所述核酸与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上同一或基本上互补，从而减少狄斯瓦螨对所述蜜蜂的寄生。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。
在另一个方面，本申请公开了一种减少蜜蜂蜂巢的寄生虫负载的方法，所述方法包括向所述蜂巢提供有效量的与寄生虫钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上同一或基本上互补的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸，借此减少所述蜂巢的寄生虫负载。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与靶寄生虫钙调蛋白基因序列相比在一个或多个区域中包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，所述靶寄生虫钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的核酸序列基本上互补或基本上同一。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。
在另一个方面，本申请公开了一种选择性处理节肢动物种类的寄生虫的方法，所述方法包括向节肢动物物种递送有效量的与寄生虫钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上同一或基本上互补的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶节肢动物钙调蛋白基因序列相比在一个或多个区域中有至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述靶节肢动物钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列或其片段基本上互补或基本上同一。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92和94的序列基本上同一或基本上互补的序列。
在另一个方面，本申请提供并且公开了一种处理或预防蜂群的蜂群崩溃失调症的方法，所述方法包括向蜂群提供有效量的包含具有与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列的一个或多个区域基本上同一或基本上互补的序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子的组合物，借此降低或预防狄斯瓦螨侵扰的水平。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶钙调蛋白基因序列相比在一个或多个区域中有至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述靶节肢动物钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列或其片段基本上互补或基本上同一。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述所靶向的钙调蛋白基因序列中不是连续的。
附图简述
图1提供了来自不同的物种的钙调蛋白(CAM)基因的系统发生树。紧挨物种名称前的数字对应于序列标识号(SEQ ID NO)。
图2提供了在处理后第3天的直接饲喂生物测定中暴露于包含与SEQ ID NO:3(CAM373)同一或互补的序列的核酸的螨相对于未处理的对照组(CNTR)或非特异序列(SCRAM，SEQ ID NO:5)的存活率。
图3图A提供了在用包含与SEQ ID NO:3(CAM373)同一或互补的序列的核酸或者与SEQ ID NO:4(CAM186)同一或互补的序列的核酸处理后第五天相对于对照组的基因表达分析。图B示出了暴露于包含与SEQ ID NO:3(CAM373)或4(CAM186)同一或互补的序列的核酸的螨相对于对照组的存活率。
图4提供了经处理的蜂巢相对于未处理的对照组在不同的时间段内的螨负载/100只蜜蜂。
图5提供了用包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89同一或互补的序列的核酸处理的螨在处理后第5天(D％)或第6天(D6)相对于未处理(NTC)的存活率％。
图6提供了用包含与SEQ ID NO:3同一或互补的序列的核酸或者包含与SEQ IDNO:88或SEQ ID NO:89同一或互补的序列的核酸的混合物处理的螨在第5天(5)、第6天(6)和第7天(7)相对于未处理(NTC)的存活率％。
图7提供了经处理的蜂巢相对于未处理的对照组在17周时间段内的瓦螨负载/100只蜜蜂。最左侧的条形表示用非特异序列(SCRAM，SEQ ID NO:5)处理的蜂巢，中间的条形是未处理的蜂巢，而最右侧的条形是用SEQ ID NO:3(CAM 373)处理的蜂巢。
图8提供了用包含与SEQ ID NO:3同一或互补的序列的核酸、包含与SEQ ID NO:90同一或互补的序列的核酸或包含与SEQ ID NO:92同一或互补的序列的核酸处理的螨在第5天(D5)或第6天(D6)相对于未处理(NTC)的存活率％。
图9提供了用包含与SEQ ID NO:3同一或互补的序列的核酸、包含与SEQ ID NO:91同一或互补的序列的核酸或者包含与SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:92同一或互补的序列的核酸的混合物处理的螨在第4天(D4)相对于未处理(NTC)的存活率％。
图10提供了如在第4天通过QuantiGeneTM(QG)针对SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:92的混合物的处理相对于未处理(NTC)所测量的钙调蛋白基因表达分析。
图11提供了经处理的蜂巢相对于未处理的对照组在19周时间段内的瓦螨负载/100只蜜蜂。最左侧的条形表示未处理的蜂巢，中间的条形是用包含与SEQ ID NO:94同一或互补的序列的核酸处理的蜂巢，而最右侧的条形是用包含与SEQ ID NO:91同一或互补的序列的核酸处理的蜂巢。
详细描述
除非另外定义，否则如本文中所使用的技术和科学术语具有与普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本领域技术人员将会认识到，众多方法可以用于实施本公开。实际上，本公开决不限于所描述的方法和材料。本文中所引用的任何参考文献都以引用的方式整体并入。出于本公开的目的，在下文定义以下术语。
应该理解，本申请中公开的任何序列标识号(SEQ ID NO)都可以指DNA序列或RNA序列，这取决于提及SEQ ID NO之处的上下文，即使该SEQ ID NO仅以DNA序列形式或RNA序列形式表示。举例来说，SEQ ID NO:1是以DNA序列形式表示(例如，列出T表示胸腺嘧啶)，但其可以指对应于成熟狄斯瓦螨钙调蛋白核酸序列的DNA序列，或成熟狄斯瓦螨钙调蛋白分子核酸序列的RNA序列。类似地，尽管SEQ ID NO:3是以RNA序列形式表示(例如，列出U表示胸尿嘧啶)，但取决于所描述的分子的实际类型，SEQ ID NO:3可以指包括dsRNA的有义股或反义股，或者对应于所示出的RNA序列的DNA分子的序列。任何情况下，预见到带有任何取代的具有所公开的序列的DNA和RNA分子。
如本文中所使用，术语“约”是指±10％。
除非上下文另外明确指出，否则如本文中所使用，单数形式“一(a、an)”和“所述(the)”包括复数指代物。举例来说，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
如本文中所使用，“基本上同一”或“基本上互补”是指在生理条件下与内源基因、从其转录的RNA或其片段杂交从而实现对所述内源基因的调控或抑制的核酸(或双链核酸的至少一条链或其部分，或单链核酸的一部分)。举例来说，在一些方面，核酸当与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多个连续核苷酸的区域相比时具有100％序列同一性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些方面，核酸当与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多个连续核苷酸的区域相比时具有100％序列互补性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因(基因的编码或非编码序列)的一个等位基因或一个家族成员具有100％序列同一性或互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有100％序列同一性或互补性。
在一些方面，所述核酸与靶害虫的内源钙调蛋白基因或从其转录的RNA的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或更多个连续核苷酸基本上同一或基本上互补。在一些方面，所述核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些方面，所述核酸与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的靶钙调蛋白基因序列相比包含至少一个核苷酸缺失。在一方面，所述核酸序列与靶害虫的内源参考钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA相比有至少一个核苷酸缺失，使得所述核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。所述核酸可以是单链DNA、单链RNA、双链RNA、双链DNA或双链DNA/RNA杂合体。在一些方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:1的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:2的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:3的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:4的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:69的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:70的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:71-87的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:88的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:89的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列是选自SEQ ID NO:93的钙调蛋白基因序列。在一方面，所述核酸与靶害虫的内源钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA相比有至少一核苷酸缺失。在一方面，所述核酸与靶害虫的内源钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA相比有至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个核苷酸缺失。在一些方面，所述至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个缺失的核苷酸在靶内源钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它方面，所述至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个缺失的核苷酸在所述靶内源钙调蛋白基因序列中不是连续的。在一个方面，所述所靶向的钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列基本上互补或基本上同一。在一个方面，所述核酸包含选自SEQ ID NO:90-92和94的序列。
如本文中所使用，术语“处理”包括消除、实质上抑制、减缓或逆转病状的进展、实质上改善病状的临床或美学症状或者实质上预防病状的临床或美学症状的出现。在根据本公开的一方面，组合物可以用于处理生物体或生物体群体的寄生影响。在一方面，核酸组合物可以用于处理宿主生物体或群体的寄生虫。在一方面，所述宿主生物体是蜜蜂，并且所述寄生虫是螨狄斯瓦螨。
如本文中所使用，短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调控机制(例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制和翻译阻遏)，其引起对应的蛋白质编码基因或蜂病原体RNA序列的表达的抑制或“沉默”。已经在许多类型的生物体中观察到RNA沉默，包括植物、动物和真菌。在根据本公开的诸多方面，核酸组合物提供RNA沉默。在某些方面，所述核酸组合物在寄生虫中提供RNA沉默和致死性。
如本文中所使用，术语“RNA沉默剂”是指与靶基因或由所述靶基因或其片段表达的RNA的多核苷酸序列实质上同源或互补并且能够抑制或使靶基因表达“沉默”的核酸。一般关于RNA沉默剂所针对的靶序列来描述RNA沉默剂。所述靶序列可以包括但不限于启动子区、5'非翻译区、可以包括内含子区的转录物编码区、3'非翻译区或这些区域的组合。在一些实施方案中，所述靶序列可以包括编码序列或非编码序列或两者。在一些实施方案中，所述靶序列与信使RNA同一或互补，例如在所述靶序列是cDNA的实施方案中。在一些实施方案中，所述靶序列是靶害虫中内源表达的天然钙调蛋白基因序列。在一些实施方案中，所述靶序列是选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的钙调蛋白基因序列或其部分。在一些实施方案中，所述参考钙调蛋白基因序列包含选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35、69-89和93的序列的至少18个连续核苷酸、至少19个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、至少21个连续核苷酸、至少22个连续核苷酸或更多个。
在某些方面，所述RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mRNA分子的完整加工(例如，完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂可以是单链或双链RNA或者单链或双链DNA或者双链DNA/RNA杂合体或者其经修饰的类似物。在一些方面，所述RNA沉默剂是选自由以下各项组成的组：(a)单链RNA分子(ssRNA)、(b)自杂交而形成双链RNA分子的ssRNA、(c)双链RNA分子(dsRNA)、(d)单链DNA分子(ssDNA)、(e)自杂交而形成双链DNA分子的ssDNA以及(f)被转录为RNA分子的包括经修饰的Pol III基因的单链DNA分子、(g)双链DNA分子(dsDNA)、(h)被转录为RNA分子的包括经修饰的Pol III启动子的双链DNA分子、(i)双链杂交RNA/DNA分子或者其组合。在一些方面，这些多核苷酸包括经化学修饰的核苷酸或非典型核苷酸。在一些方面，所述RNA沉默剂是非编码RNA分子，例如包含配对股链的RNA双链体，以及可以由其产生此类小非编码RNA的前体RNA。在一些方面，所述RNA沉默剂为dsRNA，诸如siRNA、miRNA和shRNA。在一个方面，所述RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个方面，所述RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。在一方面，所述RNA沉默剂能够抑制钙调蛋白基因的表达。在另一个方面，所述RNA沉默剂能够用在抑制靶基因的表达并且由此杀死靶生物体的方法中。在某些方面，所述靶基因是钙调蛋白基因，并且所述靶生物体是狄斯瓦螨。
RNA干扰是指动物中由小RNA介导的序列特异性转录后基因沉默过程。在植物中，对应的过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，而在真菌中还称为压制。尽管并不局限于任何具体理论，但认为转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化上保守的细胞防御机制，并且被不同的植物群和门所共有。这种防止外来基因表达可以响应于来源于病毒感染或者来源于经由特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞应答而将转座子元件随机整合至宿主基因组中的双链RNA(dsRNA)的产生而进化。在根据本公开的诸多方面，核酸组合物在靶生物体中引起RNA干扰。在某些方面，所述核酸组合物在狄斯瓦螨存在于宿主生物体蜜蜂中时在狄斯瓦螨中引起RNA干扰。根据本公开的诸多方面，选择性杀昆虫剂可以在靶生物体中引起RNA干扰，而在非靶生物体中不具有RNA干扰活性。
如本文中所使用，“小RNA”是指长度为至少15个碱基对、一般15至30个核苷酸长、优选20至24个核苷酸长的任何RNA分子。在根据本公开的诸多方面，“小RNA”长度大于50个碱基对。在一方面，所述小RNA长度大于50个碱基对但小于约500个碱基对。在一方面，所述小RNA长度大于100个碱基对但小于约500个碱基对。在一方面，所述小RNA长度大于200个碱基对但小于约500个碱基对。小RNA可以是双链的或单链的。小RNA包括但不限于miRNA(微RNA)、ta-siRNA(反式激活siRNA)、siRNA、激活RNA(RNAa)、nat-siRNA(天然反义siRNA)、hc-siRNA(异染色质siRNA)、顺式作用siRNA、lmiRNA(长miRNA)、lsiRNA(长siRNA)和easiRNA(表观基因激活的siRNA)以及其相应的前体。在一些实施方案中，本公开的siRNA分子是miRNA分子、ta-siRNA分子和RNAa分子以及其相应的前体。小RNA可以由生物体在体内加工成活性形式。根据本公开的诸多方面，选择性杀昆虫剂可以是小RNA。
在根据本公开的诸多方面，直接提供呈组合物形式的小RNA。在其它方面，由生物体在体内从DNA或RNA前体产生小RNA。在一些方面，小RNA在生物体，例如酵母或细菌细胞中作为转基因产物产生。在某些方面，作为转基因产物产生的小RNA是作为前体产生，所述前体在被生物体摄取或吸收后在体内进行加工。在其它方面，作为转基因产物产生的小RNA是作为前体产生，所述前体在被生物体摄取或吸收后在体内进行加工。
在一些方面，所述RNA沉默剂可以是人工微RNA。如本文中所使用，“人工微RNA”(amiRNA)是一种类型的miRNA，它是通过从天然miRNA前体中置换天然miRNA双链体而得到。一般来说，人工miRNA是通过用对应于人工miRNA序列的目标序列交换天然存在的前miRNA分子的miRNA序列进行工程改造的由前miRNA分子骨架产生的非天然存在的miRNA分子。在根据本公开的诸多方面，核酸组合物可以是amiRNA组合物。
各种研究证明了长dsRNA可以用于使基因表达沉默，而不会诱导应激反应或引起明显的脱靶效应，参见例如(Strat等,Nucleic Acids Research,2006,第34卷,第13期,3803-3810；Bhargava A等,Brain Res.Protoc.2004；13:115-125；Diallo M.等,Oligonucleotides.2003；13:381-392；Paddison P.J.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA.2002；99:1443-1448；Tran N.等,FEBS Lett.2004；573:127-134)。本公开提供了并且包括具有长dsRNA的方法和组合物。
如本文中所使用，关于核酸序列、核酸分子或基因，术语“天然”或“原本”意指相应的序列或分子存在于野生型生物体中，没有经过人为基因修饰或操作。天然靶向靶基因的小RNA分子是指存在于野生型生物体中的小RNA分子，细胞没有经过人为基因修饰或操作，靶向相应的生物体中天然存在的靶基因。
如本文中所使用，术语“同源性”和“同一性”在关于核酸使用时描述两个或更多个核苷酸序列之间的相似性程度。两个序列之间的“序列同一性”百分比是通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列来确定，为了实现该两个序列的最佳对齐，所述比较窗口中的序列部分相较于参考序列(其不包含插入或缺失)可能包含插入或缺失(空位)。如下计算该百分比：通过确定两个序列中存在同一核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。相较于参考序列在每个位置上都同一的序列被称为与参考序列是同一的，反之亦然。可以使用任何合适的计算机程序来进行两个或更多个序列的比对。举例来说，用于进行序列比对的被广泛使用并接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等,Nucl.AcidsRes.,22:4673-4680,1994)。
如本文中所使用，关于生物体的术语“外源多核苷酸”和“外源核酸分子”是指天然情况下不表达于该生物体内的异源核酸序列。可以将外源核酸分子以稳定或瞬时方式引入生物体内。外源核酸分子可以包含与所述生物体或该生物体的害虫或病原体的内源核酸序列同一或部分同源的核酸序列。在某些方面，“外源多核苷酸”和“外源核酸分子”可以指在宿主中瞬时或稳定表达或存在的寄生虫核酸序列。本公开提供了并且包括包含外源多核苷酸和外源核酸分子的组合物以及将它们引入靶生物体中的方法。在一些方面，本公开提供了并且包括包含外源多核苷酸和外源核酸分子的组合物以及将它们引入作为靶生物体宿主的非靶生物体中的方法。
如本文中所使用，“对照生物体”意指不含为了控制害虫或寄生虫而提供的重组DNA、小RNA或其它核酸(例如，对蛋白质、miRNA、小RNA具有抗性的靶mRNA、dsRNA、靶模拟物)的生物体。对照生物体一般来自于相同的物种并且处于相同的发育阶段，它与经处理的生物体在相同的生长条件下生长。类似地，“对照群体”意指不含为了控制害虫或寄生虫而提供的重组DNA、小RNA或其它核酸(例如，对蛋白质、miRNA、小RNA具有抗性的靶mRNA、靶模拟物)的生物体的群体。对照生物体群体一般来自相同的物种并且处于相同的发育阶段，它们在与经处理的生物体群体相同的生长条件下生长。作为一个非限制性实例，对照生物体可以是提供了不含本公开的核酸的组合物的蜜蜂。在另一个非限制性实例中，对照生物体可以是提供了含有在蜜蜂或寄生虫内不充当RNA沉默剂的核酸，诸如SEQ ID NO:5的组合物的蜜蜂。
如本文中所使用，术语“改善”和“增加”是指相较于对照生物体或群体，生物体或群体总数增加、生物体或群体的产量增加(例如，蜂蜜产量增加)、生物体或群体的生长率增加或繁殖率增加的程度为至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。本公开提供了通过提供选择性杀昆虫组合物来改善生物体或群体的健康的方法。
如本文中所使用，诸如蛋白质或mRNA之类的试剂的水平的“降低”意指该水平相对于缺乏能够降低该试剂的核酸的生物体或群体而言有所降低。同样如本文中所使用，“降低”在提及寄生作用或寄生虫负载时意指该水平相对于缺乏能够降低寄生虫的存活力、繁殖力或数目的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言有所降低。本公开提供了并且包括降低蛋白质或mRNA的水平以及降低寄生虫的水平或数目的方法和组合物。
如本文中所使用，诸如蛋白质或mRNA之类的试剂的水平的术语“至少部分降低”意指该水平相对于缺乏能够降低该试剂的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言降低了至少25％。同样如本文中所使用，“至少部分降低”在提及寄生作用或寄生虫负载时意指该水平相对于缺乏能够降低寄生虫的存活力、繁殖力或数目的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言降低了至少25％。本公开提供了并且包括至少部分降低蛋白质或mRNA的水平以及至少部分降低寄生虫的水平或数目的方法和组合物。
如本文中所使用，诸如蛋白质或mRNA之类的试剂的水平的“大幅降低”指该水平相对于缺乏能够降低该试剂的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言有所降低，其中该试剂水平的降低是至少75％。如本文中所使用，“大幅降低”在提及寄生作用或寄生虫负载时意指该水平相对于缺乏能够降低寄生虫的存活力、繁殖力或数目的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言降低了至少75％。本公开提供了并且包括大幅降低蛋白质或mRNA的水平以及大幅降低寄生虫的水平或数目的方法和组合物。
如本文中所使用，诸如蛋白质或mRNA之类的试剂的“有效消除”是相对于缺乏能够降低该试剂的dsRNA分子的生物体或群体，其中该试剂水平的降低超过95％。诸如dsRNA分子之类的试剂优选能够提供诸如蛋白质或mRNA之类的另一种试剂或寄生虫的至少部分降低，更优选大幅降低，或最优选有效消除，其中该试剂基本上不影响、实质上不影响或部分地不影响第二试剂的水平或宿主生物体。同样如本文中所使用，“有效消除”在提及寄生作用或寄生虫负载时意指该水平相对于缺乏能够降低寄生虫的存活力、繁殖力或数目的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言降低了至少95％。本公开提供了并且包括有效消除蛋白质或mRNA以及有效消除寄生虫的方法和组合物。
如本文中所使用，术语“抑制”、“遏制”和“下调”当提及核酸分子在生物体内的表达或活性时在本文中等同使用，并且意指应用本公开的方法之后，所述核酸分子在生物体细胞内的表达或活性水平与应用该方法之前其在该生物体细胞内的表达或活性相比或者与缺乏本公开的核酸分子的对照生物体相比而言较低。本公开提供了并且包括抑制、遏制和下调蛋白质或mRNA的水平以及抑制、遏制和下调寄生虫的水平或数目的方法和组合物。
如本文中所使用，术语“受抑制”、“受遏制”和“受下调”是同义的，并且在本文中意指所所靶向的核酸分子的较低、优选明显较低的表达或活性。同样如本文中所使用，“受抑制”、“受遏制”和“受下调”在提及寄生作用或寄生虫负载时意指寄生作用或寄生虫负载的水平相对于缺乏能够降低寄生虫的存活力、繁殖力或数目的核酸(诸如dsRNA分子)的生物体或群体而言较低、优选明显较低。本公开提供了并且包括抑制、遏制和下调蛋白质或mRNA的表达或活性以及抑制、遏制和下调寄生虫的活性的方法和组合物。
如本文中所使用，诸如蛋白质、mRNA或RNA之类的试剂的水平或活性的“抑制”、“遏制”或“下调”意指该水平或活性相对于在实质上相同的条件下生长的缺乏本公开的核酸，例如缺乏与本公开的重组构建体或重组载体dsRNA或siRNA互补的区域的基本上相同的细胞、生物体或群体而言有所降低。如本文中所使用，对诸如由靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由靶基因编码的蛋白质产物之类的试剂的水平或活性的“抑制”、“遏制”或“下调”意指相对于缺乏本公开的重组核酸分子的细胞、生物体或群体而言，量降低了10％或更多，例如20％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，甚至更优选70％或更多，最优选80％或更多，例如90％。本公开提供了并且包括用于相较于未处理的生物体或群体抑制、遏制和下调诸如蛋白质、mRNA、RNA之类的试剂或寄生虫的方法和组合物。
如本文中所使用，术语“节肢动物”是指具有外骨骼(外部骨骼)、分节的身体和有关节的附肢的无脊椎动物的成体和蛹二者。节肢动物是节肢动物门的成员，并且包括昆虫、蜘蛛和甲壳类动物。根据本公开的节肢动物包括但不限于西方蜜蜂、东方蜜蜂(Apiscerana)、极小无刺蜂(Trigona minima)、集蜂科(Halictidae)、熊蜂属(Bombus sp.)、跳蚤、蝇蝇、虱、蜱、螨和有益昆虫。本公开提供了并且包括用于处理作为宿主或者作为寄生虫或害虫的节肢动物的方法和组合物。
在一方面，节肢动物可以是昆虫。在某些方面，昆虫可以是蜜蜂。如本文中所使用，术语“蜜蜂”是指成体蜜蜂和其蛹体。根据一个方面，该蜜蜂在蜂巢内。成体蜜蜂被定义为膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂总科(Apoidea)的几种有翅、身体有毛、通常有刺的昆虫中的任一种，包括独居和群居种类，并且以用于收集花蜜和花粉的吮吸式口器和咀嚼式口器为特征。蜜蜂种类的实例包括但不限于蜜蜂属(Apis)、熊蜂属、无刺蜂属(Trigona)、壁蜂属(Osmia)等等。在一个方面，蜜蜂包括但不限于大黄蜂(欧洲熊蜂(Bombus terrestris))、蜜蜂(西方蜜蜂)(包括采集蜂和蜂巢蜂)以及东方蜜蜂。本公开提供了并且包括用于处理作为诸如瓦螨之类的寄生虫的宿主的蜂类的方法和组合物。
根据一个方面，蜜蜂是蜂群的一部分。术语“蜂群”是指蜜蜂群体，包括几十只至通常几万只蜜蜂，它们在蜂巢搭建、食物收集和幼蜂抚养方面协作配合。蜂群正常情况下具有单个蜂王，其剩蜜蜂是“工蜂”(雌性)或“雄蜂”(雄性)。蜂群的社会结构由蜂王和工蜂维持，并且依赖于有效的交流系统。工蜂等级内的劳动分工主要取决于蜜蜂的年龄，但也随蜂群的需要而变化。繁殖和蜂群力度取决于蜂王、食物储存量和工蜂势力的大小。蜜蜂还可以细分为以下类别：“蜂巢蜂”，通常是工蜂一生的前一部分，在此期间“蜂巢蜂”在蜂巢内执行任务；和“采集蜂”，这是蜜蜂一生的后一部分，在此期间“采集蜂”从蜂巢外部找到并收集花粉和花蜜，并且将花蜜或花粉带进蜂巢以供消费和保存。本公开提供了并且包括用于处理昆虫群体的方法和组合物。
如本文中所使用，术语“害虫”是指侵扰性或多育性、有害的、令人烦恼的、有毒的、有破坏性的、危害植物或动物或生态系统的生物体的成体和幼虫形式。寄生虫是一种类型的害虫。生物体有可能在一种情况下是害虫，但在另一种情况下是有益的、驯养的或可接受的。
如本文中所使用，术语“寄生虫”是指直接从损害另一生物体获益，例如通过以宿主的血液或体液为食、在宿主生物体细胞内生存或在宿主生物体体内生存的生物体的成体和幼虫形式。寄生虫包括作为动物、真菌、细菌或植物的生物体，并且通过它们与宿主的消极或有害相互作用来鉴定。在一些方面，如本文中所使用，寄生虫又可以作为第二寄生虫的宿主。在一些方面，寄生虫和宿主可以是相同类型的生物体(例如，节肢动物宿主和节肢动物寄生虫)。寄生虫包括但不限于，蜱螨亚纲(Acari)(蜱、螨)、虱蝇科(Hippoboscoidea)(蝇)、姬蜂总科(Ichneumonoidea)(寄生蜂)、狂蝇科(Oestridae)(肤蝇)、虱目(Phthiraptera)(虱)、蚤目(Siphonaptera)(跳蚤)、微虾纲(Tantulocarida)、豆蟹和蟹奴(Sacculina)。如本文中所使用，害虫可以包括寄生和非寄生生命阶段。本公开提供了并且包括用于处理寄生虫的方法和组合物。在一方面，所述寄生虫可以是狄斯瓦螨。
如本公开中所提供和包括，寄生虫和/或害虫包括狄斯瓦螨、肩突硬蜱(Ixodesscapularis)、红火蚁(Solenopsis invicta)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)以及人虱(Pediculus humanus)。在根据本公开的诸多方面，选择性杀昆虫剂可以是对狄斯瓦螨、肩突硬蜱、红火蚁、二斑叶螨、埃及伊蚊、致倦库蚊、豌豆蚜以及人虱具有选择性，并且对非靶生物体诸如宿主生物体不具活性或具有显著较低的活性。
如本文中所使用，术语“赋形剂”是指制剂中的任何无活性物质，该制剂具有活性成分，诸如抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸，包括但不限于dsRNA、小RNA、miRNA和反义RNA。在一些实施方案中，赋形剂包括可以给组合物提供不同于抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸的额外功能性的物质。赋形剂包括但不限于“增积剂”、“填充剂”、“稀释剂”和“载体”。体积增大允许方便并精确地分配本公开的组合物。赋形剂还可以用来促进生物体摄取组合物，并且包括各种碳水化合物、蛋白质、脂肪酸、花粉和花粉替代物。赋形剂还可以用于促进生物体吸收组合物，并且包括例如活性成分的水性或非水性溶液。赋形剂的非限制性实例包括玉米糖浆、糖浆、糖固体、糖半固体、花粉、大豆蛋白、花粉和蛋白质混合物。赋形剂还可以包括引诱剂、缓冲剂和营养补充剂。本公开的组合物可以涂覆有赋形剂、包封在赋形剂中、溶解在赋形剂中、与赋形剂混合，或者以其它方式与赋形剂组合。如本文中所使用，术语赋形剂可以指非活性物质的混合物。
本申请提供并公开了抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，它们与钙调蛋白靶基因或从所述钙调蛋白靶基因表达的RNA或其片段的多肽序列实质上同源或互补，并且起抑制钙调蛋白靶基因的作用或者产生敲低表型。在一些方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。在一些方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与钙调蛋白靶基因相比包含一个或多个核酸的缺失，使得所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子能够抑制或使靶物种中的钙调蛋白靶基因的表达“沉默”。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不影响非靶生物体中的钙调蛋白基因的表达，又能够抑制或使靶物种中的钙调蛋白靶基因的表达“沉默”。一般在描述所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子时涉及其“靶序列”。在一些实施方案中，所述靶序列选自SEQ IDNO.1、2及6-77。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子与所述靶序列相比包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述至少一个、至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述靶序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少一个、至少两个、至少三个或至少四个缺失的核苷酸在所述靶序列中不是连续的。所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子可以是单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA/RNA杂合体。所述核酸分子可以包含天然存在的核苷酸、经修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。在一些实施方案中，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子可以并入更大的多核苷酸内，例如pri-miRNA分子中。在一些实施方案中，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子可以被加工成小干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中，提供或公开了选择性抗寄生虫或杀螨的核酸分子，和调节其靶基因的表达或活性以便从群体或群中减少或消除寄生虫的方法。在一些实施方案中，提供或公开了选择性抗寄生虫或杀螨、调节瓦螨钙调蛋白基因的表达或活性以便从蜜蜂群体或群中减少或消除瓦螨寄生虫而不影响非靶生物体中的钙调蛋白基因的核酸分子。
在根据本公开的诸多方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子包含与选自由SEQID NO:1至94组成的组的序列或序列的一部分具有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在某些方面，所述核酸分子是选自由ssDNA、ssRNA、dsRNA、dsDNA或DNA/RNA杂合体组成的组。若干实施方案涉及一种dsRNA，所述dsRNA包含与选自由SEQ ID NO:1至94组成的组的序列或序列的一部分具有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。若干个实施方案涉及一种dsRNA，所述dsRNA包含与选自由SEQ ID NO:1至94组成的组的序列或序列的一部分具有至少100％序列同一性的核苷酸序列。在另一个方面，提供了一种编码至少一种核酸，诸如ssRNA或dsRNA的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:1至94组成的组或与SEQID NO:1至94或其部分具有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分。在又另一个方面，提供了一种编码至少一种核酸，诸如ssRNA或dsRNA的重组DNA，所述重组DNA包含选自由SEQ ID NO:1至94组成的组的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分、异源启动子和转录终止子序列。在另一个方面，本公开提供了一种编码至少一种核酸，诸如ssRNA或dsRNA的重组DNA，所述重组DNA包含与选自由SEQ ID NO:1至94组成的组的序列或序列的一部分具有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，并且还包含异源启动子和转录终止子。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少25个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少35个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89或93的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ IDNO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:6-68的序列的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫组合物包含与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性的核酸分子。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少25个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少35个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与如以上提供的靶基因的区域具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％同一性。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89或93的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:6-68的序列的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因(基因的编码序列或非编码序列)的一个等位基因或一个家族成员中的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因)的一个等位基因或一个家族成员的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至多60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至多50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至多40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少25个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少35个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQID NO:6-68的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:93的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至多60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至多50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至多40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少25个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少35个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与如以上提供的靶基因的区域具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％同一性。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ IDNO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ IDNO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:6-68的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:93的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，该核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至多60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至多50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至多40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少25个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少35个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ IDNO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ IDNO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:6-68的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:93的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，该核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至多60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至多50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至多40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少25个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少35个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与跟给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有同一性或互补性的至少60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与如以上提供的靶基因的区域具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％同一性。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQID NO:6-68的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:93的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少25个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少35个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少40个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少50个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少60个连续核苷酸的区域具有100％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，靶基因可以是包含SEQ IDNO:1-89或93的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ IDNO:6-68的序列的基因。
在根据本公开的诸多方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10至17个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的18至25个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的20至30个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的25至35个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的30至40个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的40至50个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫组合物包含与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的50至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性的核酸分子，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的45至60个或更多个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至多40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少25个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少35个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少40个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少50个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，组合物包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子，所述核酸分子与靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的至少60个连续核苷酸的区域具有99％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少98％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少97％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少96％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少95％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少94％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少93％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一些方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少92％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因的区域具有至少91％序列同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与如以上提供的靶基因的区域具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％同一性，其中所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸100％同一或互补的序列。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1-89或93的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以是包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的基因。
在一些实施方案中，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶基因序列相比有至少一个核苷酸缺失。在一个方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸不含有与非靶向生物体中的基因序列同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列。在一个实施方案中，所述非靶向生物体是蜜蜂。在另一个实施方案中，所述非靶向生物体是人类。在另一个实施方案中，所述非靶向生物体是帝王蝶。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸与靶序列相比有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个或更多个核苷酸缺失。在一些实施方案中，所述至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个缺失的核苷酸在参考钙调蛋白基因序列中是连续的。在其它实施方案中，所述至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个或更多个缺失的核苷酸在所述靶序列中不是连续的。在一方面，所述靶序列可以选自SEQ ID NO:1-89、93或其部分。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:1或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:2或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:3或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:4或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:69或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:70或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:88或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含SEQ ID NO:89或其部分的基因。在一方面，靶序列可以是包含选自SEQ ID NO:71-87的序列或其部分的基因。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92或94的序列或其部分具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含与选自SEQ ID NO:90-92或94的序列或其部分具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的反向互补序列。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含选自SEQ IDNO:90-92或94的序列的至少18个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含选自SEQ ID NO:90-92或94的序列或其部分。在一些实施方案中，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包含选自SEQ ID NO:90-92或94的序列以及选自SEQ ID NO:90-92和94的序列的反向互补序列。
本申请提供并且公开了包含抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子以及赋形剂物质的组合物。在一方面，所述赋形剂可以是一种或多种无活性组分的组合。在一些方面，所述赋形剂包括糖。示例性的糖包括己糖类、二糖类、三糖类和高级糖类。赋形剂糖类包括，例如，果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖。在其它方面，所述赋形剂包含糖和溶剂。在其它方面，所述赋形剂包括蛋白质。在一方面，所述蛋白质为大豆蛋白。在其它方面，所述赋形剂可以是花粉。在根据本公开的诸多方面，所述赋形剂可以是蜂粮。在一些方面，所述赋形剂包括胰蛋白胨。在一些方面，所述赋形剂包括酵母提取物。在一些方面，所述赋形剂包括精油。
蜜蜂饲喂是养蜂人的常见做法，用于提供营养和其它，例如补充需要。蜜蜂通常以蜂蜜和花粉为食，但已知还摄取非天然饲料。可以用各种食品饲喂蜜蜂，包括但不限于乳清酵母(生长在白干酪上的奶制品酵母)、大豆粉、酵母(例如啤酒酵母、圆酵母)和酵母产品(单独或组合饲喂)和作为干混合物或湿润块状物在蜂巢内饲喂或者作为干混合物在蜂巢外部的敞开饲喂器中饲喂的大豆粉。还可用的是糖或糖浆。向喂给蜜蜂的补充物中加入10％至12％花粉改善了可口性。加入25％花粉改善了蜜蜂生命活动所需的必需营养物的质量和数量。甘蔗或甜菜糖、异构化玉米糖浆、以及50型糖浆是蜜蜂天然饮食中令人满意的蜂蜜替代品。后两者可以仅作为液体提供给蜜蜂。液体饲料可以在蜂巢内部提供给蜜蜂，例如通过以下方法中的任一种：摩擦顶部桶(friction-top pail)、育幼室内的脾、隔板饲喂器、博得曼(boardman)饲喂器等。可以通过将一镑或两镑放在倒置的内盖上来饲喂干糖。必须让蜜蜂随时可获得提供的水。在一方面，可以设想存在诸如木片、软木或塑料海绵之类的漂浮支撑物的盘子或碟子。关于蜜蜂补充饲料的详细描述可以在例如Standifer等1977年所著的标题为“Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies”的USDA出版物(USDA，Agriculture Information Bulletin第413期)中找到。
在根据本公开的诸多方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸，例如dsRNA是可吸收的。如本文中所使用，“可吸收的”是指为了不通过吞食来进行核酸摄取而提供的机制。在一方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸可以通过生物体的皮肤或节肢动物的外骨骼来吸收。在一方面，将可吸收的核酸溶解在赋形剂中。在其它方面，使可吸收的核酸悬浮在赋形剂中。用于溶解或悬浮的赋形剂可以是水性的或非水性的。在一些方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸通过饲喂被宿主生物体吸收并且转移至寄生虫生物体。在其它方面，所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸通过吸附被宿主生物体吸收并且转移至寄生虫生物体。在一方面，本公开的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸直接被寄生虫吸收。
在根据本公开的诸多方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸，例如dsRNA与赋形剂组合。在一方面，所述核酸可以作为一定的核酸对赋形剂的比率提供。在一方面，所述比率可以是一份核酸对4份赋形剂。在一方面，所述核酸对赋形剂的比率可以是1:1、1:2、1:5或1:10。在其它方面，所述核酸对赋形剂的比率可以是1:20、1:25、1:30、1:40或更多。在一方面，核酸对赋形剂的比率可以是1:50。在根据本公开的诸多方面，所述比率可以确定为体积对体积(v/v)比率、重量:重量(w/w)比率。在某些方面，所述比率可以表示为重量:体积(w/v)比率。在某些方面，核酸和赋形剂可以是dsRNA和赋形剂。
在根据本公开的诸多方面，所述组合物可以包含与赋形剂组合的一定重量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的总重量的一定百分比。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的约0.1重量％。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的约0.2重量％。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的约0.3重量％。在另一方面，该核酸可以构成组合物的约0.4重量％。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的多达0.5重量％。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的多达0.6重量％。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的多达0.7重量％。在一方面，所述核酸可以构成所述组合物的多达0.8重量％。在另一方面，该核酸可以构成组合物的多达1.0重量％。在其它方面，所述核酸可以构成所述组合物的多达1.5重量％。在其它方面，所述核酸可以构成所述组合物的多达2.0重量％或2.5重量％。在某些方面，核酸和赋形剂可以是dsRNA和赋形剂。
本公开提供了并且包括具有0.1重量％至5重量％的一种或多种抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸的组合物。在其它方面，组合物可以包含0.1重量％至4重量％、0.1重量％至3重量％、0.1重量％至2重量％、0.1重量％至1重量％、0.1重量％至2重量％、0.1重量％至3重量％或0.1重量％至4重量％的核酸。在一方面，组合物可以包含0.2重量％至5重量％的核酸。在其它方面，组合物可以包含0.2重量％至4重量％、0.2重量％至3重量％、0.2重量％至2重量％、0.2重量％至1重量％、0.2重量％至2重量％、0.2重量％至3重量％或0.2重量％至4重量％的核酸。在其它方面，组合物可以包含多达1％、多达2％、多达3％、多达4％或多达5％的核酸。在其它方面，组合物可以包含多达7.5％、多达10％或多达15％的核酸。在某些方面，核酸和赋形剂可以是dsRNA和赋形剂。
本公开提供了并且包括具有0.1mg/ml至10mg/ml的一种或多种抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸的组合物。在其它方面，组合物可以包含0.1mg/ml至1.0mg/ml、0.1mg/ml至2.0mg/ml、0.1mg/ml至2.5mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至15mg/ml或0.1mg/ml至20mg/ml核酸。在某些方面，组合物包含至少0.1μg/ml核酸。在某些其它方面，组合物包含至少1.0μg/ml核酸。在又其它方面，组合物包含至少10μg/ml核酸。在一方面，组合物可以包含0.5mg/ml至10mg/ml核酸。在其它方面，组合物可以包含0.5mg/ml至1.0mg/ml、0.5mg/ml至2.0mg/ml、0.5mg/ml至2.5mg/ml、0.5mg/ml至5mg/ml、0.5mg/ml至10mg/ml、0.5mg/ml至15mg/ml或0.5mg/ml至20mg/ml核酸。在一方面，组合物可以包含1.0mg/ml至10mg/ml核酸。在其它方面，组合物可以包含1.0mg/ml至2.0mg/ml、1.0mg/ml至2.5mg/ml、1.0mg/ml至5mg/ml、1.0mg/ml至10mg/ml、1.0mg/ml至15mg/ml或1.0mg/ml至20mg/ml核酸。在某些实施方案中，所述组合物中的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸包括dsRNA。
本公开提供了并且包括选择性杀昆虫剂组合物和使用选择性杀昆虫剂组合物的方法。
如本文中所使用，“选择性杀昆虫剂组合物”是对一种或多种节肢动物种类更有效而对一种或多种不同的节肢动物种类不太有效的组合物。选择性杀昆虫剂组合物包括杀死成体或未成熟节肢动物的组合物，并且包括作为杀幼虫剂和杀卵剂的组合物。选择性杀昆虫剂可以是通过处理过的食物而掺入的系统性杀昆虫剂，所述食物包括从宿主生物体获得的血液或血淋巴。选择性杀昆虫剂可以是接触性杀昆虫剂，它们对发生直接接触的某些昆虫有毒，而对某些其它昆虫无毒或低毒。在一些实施方案中，选择性杀昆虫剂组合物是抗害虫的。在一些实施方案中，选择性杀昆虫剂组合物是抗寄生虫的。在一些实施方案中，选择性杀昆虫剂组合物是杀螨剂。在一些实施方案中，选择性杀昆虫剂组合物对靶寄生虫或有害昆虫是有毒的，而对非靶生物体是无毒或低毒的。非靶生物体的实例包括但不限于有益昆虫、线虫类、鸟类、哺乳动物以及植物。在一些实施方案中，选择性杀昆虫剂组合物对寄生昆虫例如瓦螨是有毒的，而对宿主生物体例如蜜蜂是无毒或低毒的。在一些实施方案中，选择性杀昆虫剂组合物对选自由狄斯瓦螨、肩突硬蜱、红火蚁、二斑叶螨、埃及伊蚊、致倦库蚊、豌豆蚜以及人虱组成的组的一种或多种害虫或寄生昆虫是有毒的。
在根据本公开的某些方面，选择性杀昆虫剂可以通过基因修饰而并入细菌或酵母(例如，经工程改造以表达本公开的核酸的转基因细菌或酵母)中。通过对细菌或酵母进行基因修饰而引入的选择性杀昆虫剂可以直接作用于害虫生物体，或者通过被害虫生物体的宿主吞食而间接地起作用。
在根据本公开的一方面，选择性杀昆虫剂可以是相对于一种或多种第二昆虫而言对一种或多种第一昆虫更有效的杀昆虫剂。在一方面，选择性杀昆虫剂可以对第一昆虫有毒，而对第二昆虫无作用。在一方面，选择性杀昆虫剂可以对第一昆虫有毒，而需要明显更高的浓度或量才能对第二昆虫有作用。在一方面，选择性杀昆虫剂对第一昆虫的毒性与第二昆虫相比可以是2倍或更多倍。在一方面，选择性杀昆虫剂对第一昆虫的毒性与第二昆虫相比可以是4倍或更多倍。在一方面，选择性杀昆虫剂对第一昆虫的毒性与第二昆虫相比可以是5倍或更多倍。在一方面，选择性杀昆虫剂对第一昆虫的毒性与第二昆虫相比可以是10倍或更多倍。
在一方面，选择性杀昆虫剂可以抑制第一昆虫的生长、发育或繁殖，而对第二昆虫无作用。在一方面，选择性杀昆虫剂可以抑制第一昆虫的生长、发育或繁殖，而需要明显更高的浓度或量才能对第二昆虫有作用。在一方面，选择性杀昆虫剂可能需要2倍或更多倍的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或繁殖。在一方面，选择性杀昆虫剂可能需要4倍或更多倍的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或繁殖。在一方面，选择性杀昆虫剂可能需要5倍或更多倍的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或繁殖。在一方面，选择性杀昆虫剂可能需要10倍或更多倍的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或繁殖。
若干个实施方案涉及一种改变抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子以减少或消除与非靶生物体的基因序列具有序列互补性或同一性的区域的方法。在一些实施方案中，使用任何序列比对软件，诸如可获自NCBI服务器的BLAST软件(可获自因特网www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将潜在抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸序列与一种或多种非靶生物体(非靶生物体的非限制性实例包括人、蜜蜂、帝王蝶、小鼠、大鼠等)的适当基因组数据库相比较。在一些实施方案中，过滤掉表现出与一种或多种非靶生物体的基因序列存在明显同源性的推定抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子。在一些实施方案中，对表现出与非靶生物体的基因序列具有序列互补性或同一性的区域的推定抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子的核苷酸序列进行改变，以便减少、消除或破坏此种具有序列互补性或同一性的区域。在一些实施方案中，与靶序列相比，对一个或多个核苷酸进行改变、添加或缺失，以破坏具有与非靶生物体的基因序列同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，与靶序列相比，对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸进行改变、添加或缺失，以使得所述抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列同一或互补的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个连续核苷酸的序列。
本公开还包括并且提供了处理或预防蜂群的蜂群崩溃失调症的方法，所述方法包括向蜜蜂提供有效量的组合物，所述组合物包含与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列的区域基本上同一或基本上互补的核酸，借此降低狄斯瓦螨侵扰的水平。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:2的至少19个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:69的至少19个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:70的至少19个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:3一致并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:4一致并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:88一致并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:89一致并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:90一致的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:91一致的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:92一致的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:93一致的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:94一致的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:90一致的核酸和作为SEQ ID NO:90的反向互补序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ IDNO:91一致的核酸和作为SEQ ID NO:91的反向互补序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:92一致的核酸和作为SEQ ID NO:92的反向互补序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQID NO:93一致的核酸和作为SEQ ID NO:93的反向互补序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:94一致的核酸和作为SEQ ID NO:94的反向互补序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含具有选自由SEQ ID NO:3、4、88、89、90-93组成的组的序列的两种或更多种核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少19个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少23个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少30个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少40个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少50个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少60个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少70个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少80个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少90个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少100个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少110个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少120个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列的至少130个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQID NO:71-87的序列的至少140个连续核苷酸基本上同一或基本上互补并且不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列基本上同一或基本上互补的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:71-87的序列一致的核酸。在一方面，所述方法包括提供有效量的组合物，所述组合物包含与选自SEQ ID NO:90-94的序列一致的核酸。
本公开提供了并且包括降低宿主生物体的寄生虫负载的方法。在一方面，所述寄生虫负载是指每个单独宿主的寄生虫数目。在一方面，所述寄生虫负载是指每100个宿主生物体的平均寄生虫数目。在一方面，所述寄生虫负载是指每个寄生虫宿主群体的寄生虫数目。在本公开的诸多方面，所述寄生虫是狄斯瓦螨，并且所述宿主是蜜蜂，即西方蜜蜂。在某些方面，所述寄生虫负载是指群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生虫数目。在一些实施方案中，本公开提供了并且包括用于将寄生虫负载降至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生虫少于6个的方法和组合物。在一些实施方案中，本公开提供了并且包括用于将寄生虫负载降至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生虫少于5个的方法和组合物。在一些实施方案中，本公开提供了并且包括用于将寄生虫负载降至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生虫少于4个的方法和组合物。在一些实施方案中，本公开提供了并且包括用于将寄生虫负载降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生虫少于2个的方法和组合物。
在一方面，所述降低寄生虫负载的方法包括向宿主生物体提供有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物。有效量的本公开的组合物导致寄生虫负载在一段时间内降低。在一方面，可以在提供有效量的核酸组合物一天内测量寄生虫负载的降低。在一方面，可以在两天后测量寄生虫负载。在一方面，可以在3天后测量寄生虫负载。在其它方面，可以在5天后或1周后测量寄生虫负载。在另一方面，可以测量寄生虫负载不止一次，例如每3天、每5天、每周或每个月一次。在某些方面，根据本公开，可以测量寄生虫数目的减少，并且与未处理的对照生物体或群体进行比较。在根据本公开的诸多方面，所述寄生虫是狄斯瓦螨，并且所述宿主是蜜蜂，即西方蜜蜂。
在根据本公开的诸多方面，一段时间后寄生虫负载的降低意指寄生虫数目的减少。在一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少10％、20％、30％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少40％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少50％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少60％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少70％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少80％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少90％或更多。
在其它方面，寄生虫负载可以测量为每个宿主生物体的平均寄生虫数目。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于20个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于5个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于20个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于15个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于10个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于5个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于4个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于3个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于2个寄生虫。在一方面，降低的寄生虫负载可以包括每1000个宿主生物体少于1个寄生虫。
在根据本公开的诸多方面，宿主生物体群体在被提供有效量的核酸的来源之前具有初始寄生虫负载。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于20个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于5个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生虫。在一方面，初始寄生虫负载可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生虫。
在根据本公开的诸多方面，有效量可以周期性地或连续地提供。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每天提供一次、两次或三次。在其它方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每天提供一次。在另一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每隔一天提供一次或多次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每两天、每三天或每周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每两周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每三周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每个月提供一次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每两个月提供一次。在一方面，有效量的核酸组合物可以连续提供至有需要的生物体，例如通过提供连续的食物来源。在一个方面，有效量的核酸组合物可以作为蜜蜂可摄取的组合物连续提供。在根据本公开的诸多方面，所述寄生虫是狄斯瓦螨，并且所述宿主是蜜蜂，即西方蜜蜂。在根据本公开的诸多方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸可以是dsRNA。
在根据本公开的诸多方面，寄生虫负载可能在一段时间内降低。在一方面，寄生虫负载降低所必需的时间段可以是15周。在另一方面，用于寄生虫负载降低的时间段可以是12周。在一方面，寄生虫负载降低在10周的时间段发生。在一方面，寄生虫负载降低所必需的时间段可以是5周。在另一方面，用于寄生虫负载降低的时间段可以是2周。在一方面，寄生虫负载降低在1周的时间发生。在一些方面，寄生虫负载可以在一天、两天或三天后降低。
本公开提供了降低对蜜蜂群体的寄生作用的方法，所述方法包括向蜜蜂群体提供有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物。有效量的本公开的组合物导致寄生作用在一段时间内降低。在一方面，可以在提供有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物一天内测量寄生作用的降低。在一方面，可以在两天后测量寄生作用的降低。在一方面，可以在3天后测量寄生作用的降低。在其它方面，可以在5天后或1周后测量寄生作用的降低。在另一方面，可以不止一次测量寄生作用的降低，例如每3天、每5天、每周或每个月一次。在某些方面，根据本公开，可以测量寄生作用的降低，并且与未处理的对照生物体或群体进行比较。
在根据本公开的诸多方面，一段时间后寄生作用的降低意味着寄生虫总数目的减少。在一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少10％、20％、30％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少40％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少50％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少60％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少70％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少80％或更多。在另一方面，寄生虫的数目在测量之间可以减少90％或更多。
在其它方面，寄生作用的降低可以测量为每个宿主生物体的平均寄生虫数目。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于20个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于5个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生虫。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生虫。
在根据本公开的诸多方面，引起寄生作用降低的有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸可以周期性地或连续地提供。在一方面，有效量的核酸组合物可以每天提供一次、两次或三次。在其它方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每天提供一次。在另一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每隔一天提供一次或多次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以每两天、每三天或每周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以连续提供至有需要的生物体，例如通过提供连续的食物来源。在一个方面，有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物可以作为蜜蜂可摄取的组合物连续提供。在根据本公开的诸多方面，所述寄生虫是狄斯瓦螨，并且所述宿主是蜜蜂，即西方蜜蜂。在根据本公开的诸多方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子可以是dsRNA。
在根据本公开的诸多方面，寄生作用降低可以在一段时间内减少。在一方面，寄生作用降低所必需的时间段可以是15周。在另一方面，用于寄生作用降低的时间段可以是12周。在一方面，寄生作用降低在10周的时间段发生。在一方面，寄生作用降低所必需的时间段可以是5周。在另一方面，用于寄生作用降低的时间段可以是2周。在一方面，寄生作用降低在1周的时间段发生。在一些方面，寄生作用降低可以在一天、两天或三天后发生。
在根据本公开的诸多方面，通过将存活寄生虫数目与宿主生物体群体内的寄生虫数目的初始测量值进行比较来测量寄生作用降低。在一方面，所述寄生虫可以是狄斯瓦螨，并且所述宿主可以是蜜蜂，即西方蜜蜂。在一方面，存活寄生虫的数目可以是初始寄生虫数目的25％。在一方面，存活寄生虫的数目可以是初始寄生虫数目的15％。在一方面，存活寄生虫的数目可以是初始寄生虫数目的10％。在一方面，存活寄生虫的数目可以是初始寄生虫数目的5％。在一方面，在向宿主群体提供有效量的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸组合物之后，存活寄生虫的数目可能少于5％或者甚至检测不到。
在一方面，本公开提供了用于降低蜜蜂对瓦螨侵扰的易感性的方法和组合物。在其它方面，本公开提供了用于防止侵扰蜜蜂群体的方法和组合物。在另一方面，本公开提供了用于降低蜜蜂被螨狄斯瓦螨寄生的方法和组合物。
根据本公开，提供有抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸来源的宿主生物体可以在宿主体内、通常是血淋巴内积累核酸。通过带有核酸，此类宿主生物体变得对寄生作用具有抗性或者不太易感。在其它方面，提供有核酸来源的宿主生物体群体可以在所述群体的众多成员的宿主体内积累核酸，由此提供对寄生虫的抗性或降低易感性。可以使用本领域普通技术人员已知的方法来检测提供有核酸来源的宿主生物体内存在的核酸。在根据本公开的诸多方面，抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸分子可以是dsRNA。
在本公开的一方面，提供了通过下调钙调蛋白和钙调蛋白相关的瓦螨基因产物来处理蜜蜂的瓦螨侵扰的方法和组合物。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一些方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71-87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4和88-93的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一些方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71-87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:90-93的序列的小RNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一些方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71-87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQID NO:90-93的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ IDNO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，所述组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一些方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71-87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在另一方面，所述组合物包含对应于选自SEQ ID NO:90-93的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在根据本公开的诸多方面，所述组合物可以包含对应于SEQ ID NO:1或2的区域的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在根据本公开的其它方面，所述组合物可以包含对应于SEQ ID NO:69或70的区域的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸。在根据本公开的又其它方面，所述组合物可以包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的序列的区域的核酸。在根据本公开的又其它方面，所述组合物可以包含对应于选自SEQ ID NO:90-94的序列的区域的核酸。
瓦螨寄生于蛹和成体蜜蜂，并且在蛹抚幼室内繁殖。所述螨用它们的嘴刺破蜜蜂的外骨骼并且以蜜蜂的血淋巴为食。诸位发明人意外地发现，施用至蜜蜂以处理瓦螨侵扰的多核苷酸试剂存在于蜜蜂的血淋巴中，由此变得对螨有效。
诸位发明人已经证明，靶向钙调蛋白的dsRNA片段可以成功地转移至瓦螨(参见例如图2)，dsRNA可以在瓦螨中起下调钙调蛋白基因表达的作用(参见例如图3A)，以及还证明靶向钙调蛋白基因以便下调可以降低瓦螨的数目(参见例如图3B)。
因此，根据本公开的一个方面，提供了预防或处理蜜蜂的狄斯瓦螨侵扰的方法，所述方法包括对蜜蜂施用有效量的核酸试剂，所述核酸试剂包含下调狄斯瓦螨钙调蛋白基因表达的核酸序列，由此预防或处理蜜蜂的狄斯瓦螨侵扰。
根据本公开的这个方面，本公开的试剂用于防止狄斯瓦螨作为寄生虫生活在蜜蜂或其幼虫上。短语“狄斯瓦螨”是指侵袭蜜蜂东方蜜蜂和西方蜜蜂的外部寄生螨。该螨可以处于以蜜蜂为食的成虫阶段，或者处于待在蜜蜂抚幼室内部的幼虫阶段。
如所提到的，本公开的试剂能够选择性地下调狄斯瓦螨的基因产物的表达。如本文中所使用，短语“基因产物”是指RNA分子或蛋白质。根据一个方面，所述狄斯瓦螨基因产物是螨生存所必需的基因产物。此类基因产物的下调典型地将杀死瓦螨。根据另一方面，所述狄斯瓦螨基因产物是螨繁殖所必需的基因产物。此类基因产物的下调典型地将防止瓦螨繁殖并且最终清除螨群。根据又另一方面，所述狄斯瓦螨基因产物是在蜜蜂中产生致病性症状所需的基因产物。在一些方面，所述狄斯瓦螨基因产物是钙调蛋白基因。在某些方面，所述钙调蛋白基因可以包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2一致的核酸序列。在某些方面，所述钙调蛋白基因可以包含与SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70一致的核酸序列。
根据本公开的这个方面可以下调的基因产物的实例包括但不限于钙调蛋白基因。
在根据本公开的一方面，能够下调狄斯瓦螨或其它寄生虫的基因产物的表达的试剂可以将所述基因产物在其它动物(诸如蜜蜂或其它非靶生物体)内的表达下调至较小程度。因此，本公开的某些试剂能够区分螨基因与蜜蜂基因，从而将前者下调至比后者更大的程度。在一些方面，本公开的某些试剂能够区分靶生物体内的靶基因与非靶生物体内的直系同源物，从而将前者下调至比后者更大的程度。在其它方面，下调寄生虫的靶基因，而不下调同源宿主基因。在又另一方面，寄生虫的靶基因在宿主内没有同源物。根据另一方面，本公开的试剂不下调任何蜜蜂基因。举例来说，这可以通过靶向在螨中差异性表达而在蜜蜂中不表达的基因，例如螨钠通道基因-FJ216963来实现。替代地，本公开的试剂可以靶向在螨和蜜蜂二者中都得以表达的基因的螨特异性序列。
根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于5个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于6个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于7个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于8个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于9个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于10个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于11个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于12个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于13个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于14个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于15个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于16个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于17个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于18个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于19个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于20个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于21个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于22个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于23个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于24个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于25个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于26个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于27个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于28个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于29个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因中至少100个碱基长并且不携带任何长于30个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列的区段。尽管应当了解，可以靶向不止一个基因以便使对瓦螨的细胞毒性作用最大化，，但是包含一种或几种小RNA的组合物将因为可以减少与其它昆虫的交叉反应性而增加了作为选择性杀昆虫剂组合物的可能性。
根据一个方面，可以制备对应于狄斯瓦螨钙调蛋白-1和钙调蛋白-2基因的dsRNA组合物(例如，使用具有如SEQ ID NO:1-4以及69-89中所阐述的序列、它们的互补序列或针对其区域的核酸的核酸试剂)。
应当了解，除了下调众多基因以外，本公开还提供了并且包括使用众多试剂来下调同一基因(例如，众多核酸或dsRNA，每一种与同一基因的不同区段杂交)。举例来说，在一方面，一种或多种对应于选自由SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35以及69-89组成的组的序列的核酸的组合可以用于增强组合物的细胞毒性作用和抗寄生虫作用。能够鉴定物种特异性序列的工具可以用于这个目的，例如BLASTN和其它这类计算机程序。美国专利公布号20090118214和20120108497提供了dsRNA用于预防和处理蜜蜂的病毒感染的用途。美国专利公布号20120258646提供了dsRNA用于控制蜜蜂的狄斯瓦螨的用途。每一公布整体并入在此。
本公开提供了并且包括用于下调靶生物体内的基因表达的组合物和方法。在一方面，所述靶生物体可以是寄生虫。在某些方面，所述寄生虫可以是狄斯瓦螨。如本文中所使用，术语“下调表达”是指直接或间接地引起所期望的基因的转录的下降、所述基因的转录产物(例如RNA)的量、稳定性或可翻译性的下降，和/或由所期望的基因编码的多肽的翻译的下降。下调狄斯瓦螨的基因产物的表达可以监测，例如，通过直接检测基因转录物(例如，通过PCR)、通过检测由基因或蜜蜂病原体RNA编码的多肽(例如，通过免疫印迹或免疫沉淀)、通过检测由基因编码的多肽的生物学活性(例如，催化活性、配体结合等等)，或者通过监测狄斯瓦螨的变化(例如，所述螨的增殖下降、所述螨的病毒性下降、所述螨的活动力下降等)以及通过测试蜜蜂感染性/致病性。
可以使用各种干扰转录和/或翻译的试剂(例如，RNA沉默试剂、核酶、脱氧核酶和反义核酸分子)在基因组和/或转录物层级上实现害虫或寄生虫基因产物的下调。可以使用各种干扰转录和/或翻译的试剂(例如，RNA沉默试剂、核酶、脱氧核酶和反义核酸分子)在基因组和/或转录物层级上实现狄斯瓦螨基因产物的下调。
根据一个方面，该下调害虫或寄生虫基因产物的表达的试剂是小RNA，诸如RNA沉默试剂。根据这个方面，所述小RNA的长度大于15个碱基对。在另一方面，所述小RNA的长度大于50个碱基对。在一方面，所述小RNA的长度大于50个碱基对，但小于约500个碱基对。在一方面，所述小RNA的长度大于100个碱基对，但小于约500个碱基对。在一方面，所述小RNA的长度大于200个碱基对，但小于约500个碱基对。在一方面，所述害虫或寄生虫可以是狄斯瓦螨。
另一种下调害虫或寄生虫基因产物的方法是通过引入小抑制性RNA(siRNA)。另一种下调瓦螨基因产物的方法是通过引入小抑制性RNA(siRNA)。
在本公开的一个方面，可以如下实现适用于本公开的RNA沉默试剂的合成。首先，在AUG起始密码子下游扫描害虫或寄生虫靶mRNA中的AA二核苷酸序列。将每一AA的出现以及3'相邻的19个核苷酸记录为潜在siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点是选自开放阅读框，这是因为非翻译区(UTR)富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译引发复合物可能干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合(Tuschl ChemBiochem.2:239-245)。但应当了解，针对非翻译区的siRNA也可能是有效的，如针对GAPDH所证明，其中针对5'UTR的siRNA介导了细胞GAPDH mRNA减少约90％并且完全消除了蛋白质水平(可获自因特网www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。
其次，使用任何序列比对软件，例如可获自NCBI服务器的BLAST软件(可获自因特网www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将潜在靶位点与非靶生物体(例如，人、蜜蜂、帝王蝶、小鼠、大鼠等)的适当基因组数据库进行比较。在一些实施方案中，过滤掉表现出与其他编码序列存在明显同源性的推定靶位点。在一些实施方案中，与靶序列相比，对一个或多个核苷酸进行改变或缺失，以破坏具有与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸的序列。
选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的序列，因为这些已经被证明在介导基因沉默方面与具有高于55％的G/C含量的那些相比更有效。优选沿着用于评价的靶基因或序列的长度选择若干个靶位点。为了更好地评价所选siRNA，优选联合使用阴性对照物。阴性对照siRNA优选包括与所述siRNA相同的核苷酸组成，但缺乏与基因组的明显同源性。因此，优选使用siRNA的乱序核苷酸序列，只要其不显示出与任何其它基因或害虫或寄生虫靶序列存在任何明显同源性即可。乱序核苷酸序列的实例提供在SEQ ID NO.5。
举例来说，可以用在本公开的这个方面siRNA是靶向螨特异性钙调蛋白基因的siRNA。siRNA的实例提供在SEQ ID NO:3、4、88和89中。
应当了解，本公开的RNA沉默试剂并不限于仅含有RNA的那些分子，而是还涵盖化学修饰过的核苷酸和非核苷酸。
在一些方面，本文中所提供的RNA沉默试剂可能在功能上与细胞穿透肽相关联。如本文中所使用，“细胞穿透肽”是包含短(约12个残基)氨基酸序列或功能基序的肽，其赋予与输送穿膜复合物越过细胞的质膜和/或核膜相关的能量无关性(即，非内吞性)易位特性。用在本公开的穿膜复合物中的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能性半胱氨酸残基，所述残基或者是游离的，或者是经过衍生化而与双链核糖核酸形成二硫键，所述核糖核酸因此类键合而经修饰。赋予此类特性的代表性氨基酸基序在美国专利号6,348,185中列出，所述专利的内容通过引用明确并入本文中。本公开的细胞穿透肽优选包括但不限于穿膜肽(penetratin)、转运素(transportan)、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS、以及MAP。
另一种能够下调害虫或寄生虫基因产物的试剂是能够特异性切割蜜蜂病原体多肽的mRNA转录物或DNA序列的脱氧核酶分子。脱氧核酶是单链多核苷酸，其能够切割单链和双链靶序列(Breaker,R.R.和Joyce,G.Chemistry and Biology 1995；2:655；Santoro,S.W.&Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA1997；943:4262)。已经提出了脱氧核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有存在15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，所述催化结构域侧接两个各存在七至九个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域。这种类型的脱氧核酶可以在嘌呤:嘧啶连接处有效地切割其底物RNA(Santoro,S.W.&Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA 199；关于脱氧核酶的综述，参见Khachigian,LM,Curr OpinMol Ther 4:119-21(2002))。在一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是瓦螨基因产物。害虫或寄生虫基因产物的下调还可以通过使用能够与编码所述害虫或寄生虫基因产物的mRNA转录物特异性杂交的反义多核苷酸来实现。必须在考虑对反义方法重要的两方面的同时实现对可用于有效下调害虫或寄生虫基因产物的反义分子的设计。第一方面是将寡核苷酸递送至适当细胞的细胞质中，而第二方面是设计以抑制翻译的方式特异性结合细胞内的指定mRNA或RNA靶序列的寡核苷酸。在一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是瓦螨基因产物。在另一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是钙调蛋白基因产物。
众多递送策略可以用于将寡核苷酸有效地递送至多种细胞类型中(参见例如LuftJ Mol Med 76:75-6(1998)；Kronenwett等,Blood 91:852-62(1998)；Rajur等,BioconjugChem 8:935-40(1997)；Lavigne等,Biochem Biophys Res Commun 237:566-71(1997)；及Aoki等,(1997)Biochem Biophys Res Commun231:540-5(1997))。
另外，还可获得基于热力学循环来鉴定与它们的靶mRNA具有最高预测结合亲和力的那些序列的算法，所述热力学循环解释了靶mRNA和寡核苷酸二者内的结构变化的能量学(参见例如，Walton等,Biotechnol Bioeng 65:1-9(1999))。此类算法已经被成功地用于在细胞内实施反义方法。举例来说，由Walton等开发的算法使得科学家能够成功地设计针对兔β球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNFα)转录物的反义寡核苷酸。该研究小组最近已经报告如通过动态PCR技术所评价，合理选择的针对细胞培养物中的三种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B以及大鼠gp1)的寡核苷酸的反义活性在几乎所有情况下都被证明是有效的，包括利用磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化学性质进行的对两个细胞类型中的三种不同靶标的试验。另外，还公布了使用体外系统设计和预测特定寡核苷酸的有效性的若干种方法(Matveeva等,Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998)]。
另一种能够下调害虫或寄生虫基因产物的试剂是能够特异性切割编码瓦螨基因产物的mRNA转录物的核酶分子。核酶正在被越来越多地用于通过切割编码目标蛋白质的mRNA而序列特异性地抑制基因表达(Welch等,Curr Opin Biotechnol.9:486-96(1998))。设计核酶来切割任何特定靶RNA(包括病毒RNA)的可能性使得它们在基础研究和治疗应用中都是有价值的工具。在一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是瓦螨基因产物。在另一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是钙调蛋白基因产物。
另外的下调细胞内害虫或寄生虫基因产物表达的方法是经由三链体形成寡核苷酸(TFO)。最近的研究已经证明，可以设计能以序列特异方式识别并且结合至双链螺旋DNA中的聚嘌呤/聚嘧啶区域的TFO。以下文献概述了这些识别规则：Maher III,L.J.等,Science(1989)245:725-7；Moser,H.E.等,Science,(1987)238:645-6；Beal,P.A.等,Science(1992)251:1360-1363；Cooney,M.等,Science(1988)241:456-459；及Hogan,M.E.等,欧洲专利公布375408。寡核苷酸的修饰诸如引入嵌入剂和骨架取代，以及优化结合条件(pH值和阳离子浓度)，有助于克服TFO活性的固有障碍，诸如电荷排斥和不稳定，并且最近证明，合成的寡核苷酸可以靶向特定序列(关于最近的综述，参见Seidman和Glazer,J ClinInvest 2003；112:487-94)。在一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是瓦螨基因产物。在另一方面，所述害虫或寄生虫基因产物可以是钙调蛋白基因产物。
一般来说，形成三链体的寡核苷酸具有序列对应性：
Figure BDA0001525850350000651
但是，已经证明，A-AT和G-GC三链体具有最大的三螺旋稳定性(Reither和Jeltsch,BMC Biochem,2002年9月12日,电子公布)。其作者已经证明，根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不形成非特异性三链体，表明三链体形成实际上是序列特异性的。
三链体形成寡核苷酸的长度优选至少15个、更优选25个、又更优选或更多个核苷酸，多达50或100bp。
用TFO转染细胞(例如，经由阳离子脂质体)并且与靶DNA形成三螺旋结构诱导了空间和功能变化，从而阻断了转录起始和延长，允许在内源DNA中引入所期望的序列变化并且导致基因表达的特异性下调。
有效TFO的设计、合成和施用的详细描述可以在颁予Froehler等的美国专利公布号2003/017068和2003/0096980以及颁予Emanuele等的2002/0128218和2002/0123476以及颁予Lawn的美国专利号5,721,138中找到。
本公开的多核苷酸下调试剂可以根据本领域中已知的任何多核苷酸合成方法生成，诸如酶合成或固相合成。用于执行固相合成的设备和试剂是例如从AppliedBiosystems商购。还可以采用任何其它的用于此类合成的手段；多核苷酸的实际合成完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以经由例如以下文献中所详述的方法：“Molecular Cloning:Alaboratory Manual”Sambrook等,(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”第I-III卷,Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等,“Current Protocolsin Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“APractical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；及“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.编(1984)，利用固相化学反应(例如，氰基乙基亚磷酰胺)，继而进行去保护、脱盐并且通过例如自动化加三苯甲基法(trityl-on method)或HPLC进行纯化来实现。
本公开的多核苷酸试剂可以包含由键合在3'至5'5磷酸二酯键合中的嘌呤类和嘧啶类碱基组成的杂环核苷酸。优选使用的多核苷酸试剂是在骨架、核苷间键合或碱基中经过修饰的那些，如在下文中广泛描述的。
根据本公开的这个方面，可用的多核苷酸的具体实例包括含有经修饰的骨架或非天然核苷间键合的多核苷酸试剂。具有经修饰的骨架的多核苷酸试剂包括在骨架中保留了磷原子的那些，例如美国专利号4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050中所公开。
经修饰的多核苷酸骨架包括例如具有正常3'-5'键合的硫代磷酸酯类、手性硫代磷酸酯类、二硫代磷酸酯类、磷酸三酯类、氨基烷基磷酸三酯类、甲基和其它烷基膦酸酯类(包括3'-亚烷基膦酸酯类和手性膦酸酯类)、次膦酸酯类、亚磷酰胺类(包括3'-氨基亚磷酰胺类和氨基烷基亚磷酰胺类)、硫羰基亚磷酰胺类、硫羰基烷基膦酸酯类、硫羰基烷基磷酸三酯类以及硼磷酸酯类、这些多核苷酸骨架的2'-5'连接的类似物，以及具有反转极性的那些多核苷酸骨架，其中相邻的核苷单元对是连接的3'-5'与5'-3'或2'-5'与5'-2'。还可以使用各种盐、混合盐或游离酸形式。
替代地，其中不包括磷原子的经修饰的多核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成的骨架。这些包括具有吗啉基键合(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲缩醛和硫代甲缩醛骨架；亚甲基甲缩醛和硫代甲缩醛骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其它具有混合的N、0、S和CH2组成部分的骨架的那些，如美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,214,134、5,466,677、5,610,289、5,633,360、5,677,437和5,677,439中所公开。
可以根据本公开使用的其它多核苷酸试剂是核苷酸单元的糖和核苷间键合二者(即，骨架)都经过修饰、被新的基团置换的那些。维持碱基单元与适当的多核苷酸靶标互补。此类多核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA多核苷酸是指其中糖骨架被含酰胺的骨架、具体来说是氨基乙基甘氨酸骨架置换的多核苷酸。碱基得以保留，并且直接或间接地与所述骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导了PNA化合物的制备的美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，所述美国专利各自通过引用并入本文中。可以用在本公开中的其它骨架修饰在美国专利号6,303,374中有公开。
本公开的多核苷酸试剂还可以包括碱基修饰或取代。如本文中所使用，“未修饰的”或“天然的”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的碱基包括但不限于其它合成或天然碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代具体来说是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它碱基包括美国专利号3,687,808中所公开的那些、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.编,John Wiley&Sons,1990中所公开的那些、Englisch等,Angewandte Chemie,国际版,1991,613中所公开的那些，以及Sanghvi,Y.S.,Antisense Research and Applications,第15章,第289-2页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,CRC Press,1993中所公开的那些。此类碱基对于增加本公开的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经被证明使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi YS等,(1993)Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton 276-278)，并且是当前优选的碱基取代，甚至更具体来说是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
在合成后，本公开的多核苷酸试剂可以任选地进行纯化。举例来说，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、光谱或其组合而从混合物中纯化出多核苷酸。替代地，多核苷酸可以不经过纯化或经过最低程度的纯化便使用，以避免由于样品处理带来的损失。多核苷酸可以经过干燥以便保存，或者溶解在水性溶液中。所述溶液可以含有缓冲剂或盐以促进退火和/或稳定双链体。
应当了解，本公开的多核苷酸试剂可以作为其本身提供，或者作为包含编码所述多核苷酸试剂的核酸序列的核酸构建体来提供。通常，所述核酸构建体包含在宿主细胞中有功能的启动子序列，如下文所详述。
在可操作地连接的启动子序列控制下的本公开的多核苷酸序列还可以进一步侧接其它的有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的序列。此类序列一般位于启动子上游和/或表达构建体3'端的下游。
如在提及调控序列和结构核苷酸序列时所使用，术语“可操作地连接的”是指所述调控序列引起所连接的结构核苷酸序列的受调控的表达。“调控序列”或“控制元件”是指位于结构核苷酸序列上游、内部或下游的核苷酸序列，它们影响转录的时序和水平或量、RNA加工或稳定性，或者相关联的结构核苷酸序列的翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏物结合序列、终止序列、中止序列、多聚腺苷酸化识别序列等等。
应当了解，核酸试剂可以用多种方式递送至害虫或寄生虫。根据一个方面，所述核酸试剂被直接递送至害虫或寄生虫(例如，通过对螨侵扰的蜂巢进行喷雾)。所述核酸试剂或编码所述核酸试剂的构建体可以通过扩散进入螨体内。在这个方面，所述核酸构建体的启动子在螨细胞内通常是起作用的。在一方面，所述害虫或寄生虫可以是狄斯瓦螨。
应当了解，因为很多寄生虫使用它们的嘴刺破宿主节肢动物外骨骼并且以节肢动物的血淋巴为食，所以本公开考虑将本公开的多核苷酸试剂递送至所述节肢动物，借此使它们存在于节肢动物血淋巴中，由此变得对害虫或寄生虫有效。因此，根据另一方面，所述核酸试剂被间接递送至害虫或寄生虫(例如，经由宿主蜜蜂至螨)。在这个方面，所述核酸构建体的启动子在宿主细胞内通常是起作用的。在某些方面，所述害虫或寄生虫可以是狄斯瓦螨，并且所述宿主节肢动物可以是蜜蜂。
根据一个方面，通过喷雾将所述核酸试剂递送至受侵扰的宿主。所述核酸试剂或编码所述核酸试剂的构建体可以通过扩散进入宿主体内。在某些方面，所述害虫或寄生虫可以是狄斯瓦螨，并且所述宿主节肢动物可以是蜜蜂。
根据另一方面，经由宿主的食物将所述核酸试剂递送至宿主。诸位发明人考虑到，在吞食本公开的核酸试剂后，所述试剂可以存在于例如宿主节肢动物的宿主血淋巴中，借此对寄生虫，例如瓦螨有效。
因此，可以在体外或体内(例如在细菌或酵母细胞中)合成本公开的多核苷酸，并且加入到食物中。举例来说，可以通过在基因区段的末端添加两个相对的启动子(例如T7启动子)来合成双链RNA，其中将所述启动子放在紧接所述基因的5'处，并且在相对的方向上将所述启动子放在紧接所述基因区段的3'处。然后，可以通过用T7RNA聚合酶在体外转录来制备dsRNA。
根据本公开的诸多方面，用于合成核酸，包括dsRNA的序列的实例提供在SEQ IDNO:1-4、6、23、26-35以及69-93中。
应当了解，一些害虫或寄生虫在宿主节肢动物的外骨骼中造成损伤位点。此类损伤位点藏有细菌感染。举例来说，宿主蜜蜂损伤位点可能藏有细菌，诸如蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)，所述细菌引起欧洲蜜蜂幼虫腐臭病。除了它们的寄生影响以外，已知寄生虫还充当多种其它病原体和寄生虫的媒介物。举例来说，怀疑瓦螨充当多种蜜蜂病原体，包括畸翅病毒(deformed wing virus，DWV)、喀什米尔蜜蜂病毒(Kashmir beevirus，KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(acute bee paralysis virus，ABPV)和黑蜂王台病毒(black queen cell virus，BQCV)的媒介物，并且可以削弱它们宿主的免疫系统，让它们易受感染。
因此，通过杀死害虫或寄生虫(或防止它们繁殖)，本公开的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫试剂可以用于预防和/或处理宿主生物体的细菌感染。举例来说，以上指出的病毒在宿主蜜蜂中引起蜂房蜜蜂球菌和病毒感染。因为瓦螨侵扰和病毒感染被认为是蜂群崩溃失调症(CCD)的原因，所以本试剂还可以用于预防或降低蜜蜂群体对CCD的易感性。
应当了解，除了饲喂抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫核酸试剂以用于降低蜜蜂病原体感染和侵染外以，加强适当的卫生条件(例如，制止再使用受侵染的蜂巢)可以增强处理效果和预防感染。
本公开还包括并且提供了表达选择性杀昆虫剂的转基因细菌和酵母细胞。在一个方面，将编码本文中所使用的小RNA、dsRNA、miRNA或者抗小RNA或miRNA的靶核酸分子的核酸可操作地连接至启动子和任选地终止子。在一些实施方案中，例如通过施加热或者压力将所述转基因细菌和酵母细胞杀死。在一些实施方案中，在向靶生物体提供选择性杀昆虫剂之前将所述转基因细菌和酵母细胞溶解。在一些实施方案中，没有溶解所述转基因细菌和酵母细胞。
在一个方面，本文中所使用的外源核酸分子是小RNA或编码小RNA，或者在具体方面是siRNA，其可以调节靶生物体内的基因表达。在一方面，外源核酸编码与选自由SEQ IDNO:1-4和6-94组成的组的序列有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的小RNA。在另外一方面，本文中所使用的外源核酸分子是dsRNA分子或编码dsRNA分子。在另一方面，本文中所使用的外源核酸分子是人工miRNA或编码人工miRNA。在另外一方面，本文中所使用的外源核酸分子是siRNA或编码siRNA。在一个方面，本文中所使用的外源核酸分子是小RNA前体或编码小RNA前体。在另一方面，本文中所使用的外源核酸分子是miRNA或siRNA前体或编码miRNA或siRNA前体。在一个方面，本文中所使用的外源核酸分子是天然存在的分子。在另一方面，本文中所使用的外源核酸分子是合成的分子。
在一个方面，本文中所使用的外源核酸分子是小RNA的茎环前体或编码小RNA的茎环前体，或者在具体方面，是miRNA的茎环前体或编码miRNA的茎环前体，它包含与选自由SEQ ID NO:1-4和6-94组成的组的序列具有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。本文中所使用的茎环前体包含与选自由SEQ ID NO:1-4和6-94组成的组的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一个方面，本文中所使用的外源核酸分子是裸RNA或者从核酸表达构建体表达而来，其中它被可操作地连接至调控序列。
在一个方面，本文中所公开的重组DNA构建体或转基因还包含转录终止子。
可以预料，在从本申请成熟为专利期间，可能开发出很多用于下调基因产物表达的相关方法，并且术语“下调狄斯瓦螨基因产物的表达”意在预先包括所有此类新技术。
应当了解，出于清楚性的原因而在单独的方面的内容中加以描述的本公开的某些特征还可以以组合形式在单个方面中提供。相反地，出于简便性的原因而在单个方面的内容中加以描述的本公开的各种特征还可以分开地或者以任何合适的次组合形式或者在适合时在本公开的任何其它所描述的方面中提供。各个方面的内容中所描述的某些特征不应当被视为那些方面的必需特征，除非所述方面没有那些要素便不起作用。如上文所描绘和如所附权利要求书部分中所要求保护的各个方面和本公开的诸多方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
实施例1.瓦螨钙调蛋白基因序列
将表1中提供的钙调蛋白(CAM)基因(SEQ ID NO:1和2)或它们的对应转录物用作多核苷酸组合物的靶标，所述多核苷酸组合物包含作为与那些基因或转录物同一或互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。将表1中提供的基因序列、由那些基因编码的蛋白质序列或那些基因内含有的序列用于从其它节肢动物害虫和寄生虫种类获得表1中未列出的直系同源钙调蛋白(CAM)基因。然后，此类直系同源基因和它们的转录物可以充当本文中提供的多核苷酸的靶标，或者作为特别设计用来靶向所述直系同源基因或转录物的抗寄生虫、抗害虫或杀昆虫多核苷酸的来源。
表1.狄斯瓦螨的靶钙调蛋白(CAM)基因
Figure BDA0001525850350000721
Figure BDA0001525850350000731
对于SEQ ID NO:1和2中提供的每一种钙调蛋白DNA基因序列，对生长在皮氏培养皿上的瓦螨体外饲喂有义或反义方向或双向的单链或双链DNA或RNA片段，或者局部施用至蜂巢以影响CAM靶基因的表达并且实现减少狄斯瓦螨螨群。
实施例2.抑制狄斯瓦螨的钙调蛋白(CAM)基因。
提供了对应于SEQ ID NO:3和4(表2)的用于抑制狄斯瓦螨中的钙调蛋白(CAM)基因表达的多核苷酸，并且用于抑制狄斯瓦螨中的钙调蛋白(CAM)基因的表达。SEQ ID NO:3和4分别描述了选自CAM-1(SEQ ID NO:1)的373bp dsRNA多核苷酸序列和186bp dsRNA多核苷酸序列。对应于dsRNA多核苷酸CAM_L/CAM373的SEQ ID NO:3涵盖了钙调蛋白CAM-1(SEQID NO:1)基因的大部分开放阅读框。对应于dsRNA多核苷酸CAM_S/CAM186的SEQ ID NO 4是CAM_L/CAM373(SEQ ID NO:3)的部分片段，并且也源自于CAM-1(SEQ ID NO:1)。表2中的SEQID NO:5是与任何已知的狄斯瓦螨基因具有不超过19bp序列同一性的对照dsRNA序列多核苷酸。
表2.靶向狄斯瓦螨钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA
Figure BDA0001525850350000732
实施例3.在用特异性dsRNA处理后第3天的狄斯瓦螨生物测定
从蜜蜂群体中收集成体雌性螨，并且放在皮氏培养皿内的人工食物溶液上，所述人工食物溶液含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合物。在本实施例中，对所述食物补充50μg卡那霉素/1mL食物溶液。对所述食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的dsRNA，并且将所得溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:5(SCRAM)组成。将十五个螨施加至每一皿，并且以一式三份进行实验。在29℃和50-60％相对湿度下孵育存在螨的食物皿。在特定的时间间隔对皿进行检查，并且对死亡的螨进行计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后三天时对螨进行计数(图2)。图2显示，与未处理的皿或者螨以补充了非特异(SCRAM)dsRNA多核苷酸的食物为食的皿相比，所有的螨在处理后三天都死了。
实施例4.用靶向钙调蛋白的dsRNA处理后第5天的狄斯瓦螨生物测定
从蜜蜂群体中收集成体雌性螨，并且放在皮氏培养皿内的人工食物溶液上。所述人工食物含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合物。在本实施例中，对所述食物进一步补充8×最终浓度的抗霉菌溶液(100×，Sigma Aldrich)、500μg/mL卡那霉素和220U/mL制霉菌素。对所述食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的dsRNA，并且将所得溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:4(CAM_S/CAM186)或SEQ ID NO:5(SCRAM)组成。将十五个螨施加至每一皿，并且以一式三份进行实验。在29℃和50-60％相对湿度下孵育存在螨的食物皿。在特定的时间间隔对皿进行检查，并且对死亡的螨进行计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后五天时对螨进行计数(图3)。对于分子分析，从皿中取出活螨，在液氮中速冻并且进行TAQMANTM分析以评价钙调蛋白(CAM)RNA的水平。图3A.暴露于SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:4(CAM_S/CAM186)的螨中的钙调蛋白(CAM)基因的RNA水平与非特异性(SCRAM)处理或未处理(CNTR)相比大大降低。图3B.处理后5天时在暴露于针对钙调蛋白(CAM)的dsRNA的螨中观察到统计学上显著的死亡率。
实施例5.使用喷雾干燥或半固体制剂递送靶向瓦螨基因的dsRNA多核苷酸的方 法。
如表3中所说明将用于抑制瓦螨靶钙调蛋白(CAM)基因表达的dsRNA制备成制剂，所述制剂含有处于磷酸盐缓冲液(1.15mM KH2PO4(一价)和8mM Na2HPO4(二价)的溶液，pH8.0)中的1份dsRNA和约14份海藻糖。使用Büchi B-290迷你喷雾干燥器，将液体制剂雾化成小滴，并且用气体加热以制造可流动的粉末。
表3.制剂制备
Figure BDA0001525850350000751
将所得颗粒与粉末状糖一起配制，并且通过将粉末状糖均匀散布在蜂巢架顶上而均匀地施用至蜂巢。在其它方面，将喷雾干燥物质的半固体制剂与水一起制备，并且通过允许蜜蜂以此为食而将糖水(“蜜蜂糖果”)制剂供应给蜜蜂蜂巢。
实施例6.用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后蜂巢中的瓦螨的体内减少。
收集侵扰蜂巢中的成体蜜蜂的瓦螨，并且使用标准螨计数方法进行计数。根据实施例7用包含SEQ ID NO:3(CAM-L)、SEQ ID NO:4(CAM-S)的喷雾干燥的dsRNA或无处理(对照)来处理蜂巢。在实验开始时以及处理后2周、4周和12周时评价每一蜂巢的螨负载。图4示出了经过处理的蜂巢与未接受处理的蜂巢相比的螨负载。将计数的螨数目相对于100只成体蜜蜂进行正规化，并且代表瓦螨负载。
实施例7.用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后对瓦螨中的过渡性小RNA的检 测。
从用SEQ ID NO:3dsRNA多核苷酸处理过的蜂巢中收集瓦螨，并且在处理后7天时从蜂巢收集瓦螨。提取瓦螨RNA，并且使用SOLiD平台进行小RNA测序分析。检测到大多数的小RNA分子在dsRNA序列区域之外，并且特异性朝向SEQ ID NO:3的dsRNA区域的3'部分。另外，大多数的过渡性读数相对于钙调蛋白(CAM)基因转录物序列呈反义取向。此外，尽管用据预测对CAM-1(SEQ ID NO:1)具有特异性的SEQ ID NO:3dsRNA处理蜂巢，但本实验中检测到对CAM-2(SEQ ID NO:2)具有特异性的小RNA。这一观察结果支持了这样的假设：即使当两个基因之间仅有小片段在DNA层级上共有完全同一性(在这种情况下，23个核苷酸)时，抑制瓦螨的RNA表达和过渡性小RNA生成也起作用。
实施例8.来自节肢动物害虫和寄生虫种类的钙调蛋白(CAM)基因同源物以及对应 的dsRNA多核苷酸。
使用标准生物信息学技术和狄斯瓦螨的序列SEQ ID NO:1和2，在侵扰其它节肢动物或哺乳动物并且将被靶向以进行基因调控的节肢动物害虫种类中鉴定出一组31个保守钙调蛋白(CAM)基因序列。鉴定这些序列，并且作为系统发生树呈现在图1中。通过鉴定每一序列内对应于SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)的保守373bp结构域来对图1中的DNA序列进行进一步分析。表4列出了新鉴定的钙调蛋白(CAM)基因序列的SEQ ID NO以及对应的373bpdsRNA多核苷酸触发序列。将在直接饲喂测定中针对它们相应的节肢动物种类对所述373bp多核苷酸dsRNA序列进行单独或组合测试。
表4.从节肢动物害虫或寄生虫鉴定的钙调蛋白(CAM)基因序列以及它们对应的373bp RNA多核苷酸。
Figure BDA0001525850350000761
Figure BDA0001525850350000771
Figure BDA0001525850350000781
实施例9.瓦螨钙调蛋白(CAM)基因转录物和dsRNA触发序列。
将表5中提供的钙调蛋白(CAM)序列(SEQ ID NO:69和70)或它们对应的转录物用作多核苷酸组合物的靶标，所述多核苷酸组合物包含作为与那些基因或转录物同一或互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。通过RNA测序来鉴定瓦螨钙调蛋白序列的5'和3'UTR序列。
表5.狄斯瓦螨钙调蛋白(CAM)基因的目标转录物
基因名称和物种 SEQ ID NO 类型
CAM-1；狄斯瓦螨 69 RNA
CAM-2；狄斯瓦螨 70 RNA
将SEQ ID NO:69和70平铺在150bp的片段中。表6示出了平铺在SEQ ID NO:69和70上的150bp片段的上部链(5'-3')。
表6.CAM-1和CAM-2基因的平铺多核苷酸序列
Figure BDA0001525850350000791
将包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的一种或多种dsRNA体外提供给生长在皮氏培养皿上的瓦螨，或局部施用至蜜蜂蜂巢，以影响CAM靶基因的表达并且实现狄斯瓦螨螨群的减少。
实施例10.瓦螨中靶向钙调蛋白(CAM)的触发剂的体外生物测定
基于CAM-1与CAM-2序列之间的保守序列重叠生成了靶向钙调蛋白(CAM)-1和CAM-2的多核苷酸触发序列。这些呈现为SEQ ID NO:88和89(分别靶向CAM-1和CAM-2)。
在体外生物测定中测试选自SEQ ID NO:88和89的多核苷酸序列抑制成体瓦螨存活力的能力。从蜜蜂群体中收集成体雌性螨，并且放在皮氏培养皿内的人工食物溶液顶上。所述人工食物含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合物。在本实施例中，对所述食物进一步补充8×最终浓度的抗霉菌溶液(100×，Sigma Aldrich)、500μg/mL卡那霉素和220U/mL制霉菌素。对所述食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的dsRNA，并且将所得溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3(CAM373)、SEQ ID NO:88(CAM-1)或SEQ ID NO:89(CAM-2)或未处理的对照(NTC)组成。将十五个螨施加至每一皿，并且以一式三份进行实验。在29℃和50-60％相对湿度下孵育存在螨的食物皿。在特定的时间间隔对皿进行检查，并且对死亡的螨进行计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后五天和六天时对螨进行计数(图5)。另外，将SEQ ID NO:88(CAM-1)和SEQ ID NO:89(CAM-2)的dsRNA以等摩尔量混合，并且如以上所描述饲喂给螨。图6示出了这种施用的结果。
对于分子分析，从皿中取出活螨，在液氮中速冻并且进行TAQMANTM分析，以评价钙调蛋白(CAM)RNA的水平。
实施例11.用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后现场处理的蜜蜂蜂巢中的瓦 螨侵扰的体内现场减少。
通过将磷酸盐缓冲液中的dsRNA储备液与66％糖浆混合来制备用于抑制瓦螨所靶向的钙调蛋白(CAM)基因的表达的dsRNA。将液体制剂作为糖浆供应给蜜蜂，允许以它为食，直至完全消耗(大约2至3天)。每一现场试验组由33个蜂巢组成。诸组由未处理的蜂巢、非特异性触发剂处理的蜂巢(SEQ ID NO:5)和特异性触发剂处理的蜂巢(SEQ ID NO:3)组成。对蜜蜂进行两轮处理，每一轮由间隔两周的两次饲喂组成：在递送开始时(第0周)和两周后(第2周)，然后在第13周和第15周重复。在第4周、第9周、第13周、第15周和第17周进行蜜蜂存活率评价(图7)。在用特异性触发剂(SEQ ID NO:3)处理后第9周观察到对瓦螨群的显著抑制。
实施例12.瓦螨中靶向钙调蛋白(CAM)的触发剂的体外生物测定
基于CAM-1与CAM-2序列之间的保守序列重叠生成了靶向钙调蛋白(CAM)-1和CAM-2的多核苷酸触发序列。这些在表7中被呈现为SEQ ID NO:3。另外，对所述多核苷酸序列进行修饰，以避免含有与非靶生物体的基因序列同一或互补的19个碱基的连续序列串。这些修饰得到了多核苷酸SEQ ID NO:90-92。
表7.靶向CAM-1和CAM-2的触发剂
基因靶标 SEQ ID NO 天然的还是经过修饰的
CAM-1 3 天然
CAM-1 90 4bp缺失
CAM-1 91 4bp缺失
CAM-2 92 1bp缺失
在体外生物测定中测试多核苷酸序列抑制成体瓦螨存活力的能力。从蜜蜂群体中收集成体雌性螨，并且放在皮氏培养皿内的人工食物溶液顶上。所述人工食物含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合物。在本实施例中，对所述食物进一步补充8×最终浓度的抗霉菌溶液(100×，Sigma Aldrich)、500μg/mL卡那霉素和220U/mL制霉菌素。对所述食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的dsRNA(SEQ ID NO:3(CAM373)、SEQ ID NO:90(CAM-1)或SEQ ID NO:92(CAM-2))，并且将所得溶液倾倒在皮氏培养皿上。还制备了盛有不含dsRNA的人工食物的皿(未处理的对照(NTC))。将十五个螨施加至每一皿，并且以一式三份进行实验。在29℃和50-60％相对湿度下孵育存在螨的食物皿。在特定的时间间隔对皿进行检查，并且对死亡的螨进行计数并移除。在置于食物上之后五天和六天时对螨进行计数以确定死亡率。
如图8中所示，用dsRNA(SEQ ID NO:3(CAM373)、SEQ ID NO:90(CAM-1)或SEQ IDNO:92(CAM-2)处理过的螨与未接受RNA的螨相比在处理后5天和6天时表现出增加的死亡率。
如以上所描述进行进一步体外生物测定，其中用以下项的等摩尔混合物对螨进行处理：包含SEQ ID NO:90(CAM-1)和SEQ ID NO:92(CAM-2)的dsRNA；包含SEQ ID NO:3(CAM373)的dsRNA；或包含SEQ ID NO:91(CAM-1)的dsRNA。如图9中所示，用包含SEQ ID NO:3的dsRNA、包含SEQ ID NO:91的dsRNA或者包含SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:92的dsRNA混合物处理过的螨在第4天(D4)时表现出存活力下降。对活螨进行分子分析。从皿中取出螨，在液氮中速冻并且进行QuantiGeneTM分析，以评价钙调蛋白(CAM)RNA的水平。结果在图10中示出。
实施例13.用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后现场处理的蜜蜂蜂巢中的瓦 螨侵扰的体内现场减少。
通过将磷酸盐缓冲液中的dsRNA储备液与66％糖浆混合来制备用于抑制瓦螨所靶向的钙调蛋白(CAM)基因的表达的dsRNA。将液体制剂作为糖浆供应给蜜蜂，允许以它为食，直至完全消耗(大约2至3天)。每一现场试验组由40个蜂巢组成。诸组由未处理的蜂巢和特异性触发剂处理的蜂巢(SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:94)组成。SEQ ID NO 94与SEQ ID NO3同一，除了在所述触发剂的5'端添加三个碱基。对蜜蜂进行两轮处理，每一轮由间隔两周的两次饲喂组成：在递送开始时(第0周)和两周后(第2周)，然后在第13周和第15周重复。剂量由每个蜂巢大约200mg触发剂组成。在第0周、第3周、第6周、第8周、第14周和第19周进行蜜蜂存活率评价(图11)。在用特异性触发剂(SEQ ID NO:91和94)处理后第3周已经观察到对瓦螨群的显著抑制。
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Claims (30)

1.一种用于控制狄斯瓦螨的选择性杀昆虫剂组合物，其包含具有与所靶向的钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域互补或同一的序列的核酸分子，其中所述核酸分子是由选自SEQ ID NO:90-92和94的序列及其互补序列组成的双链RNA(dsRNA)，并且其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。
2.一种组合物，其包含蜜蜂饲料和具有与所靶向的钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域互补或同一的序列的核酸分子，其中所述核酸分子是由选自SEQ ID NO:90-92和94的序列及其互补序列组成的dsRNA，并且其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。
3.一种核酸构建体，其包含与所靶向的钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域同一或互补的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至在宿主细胞中具有功能的启动子序列并且当被引入到所述宿主细胞中时能够产生dsRNA，其中所述核酸分子是由选自SEQ IDNO:90-92和94的序列及其互补序列组成的dsRNA，并且其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。
4.一种向瓦螨提供组合物的方法，其包括向所述瓦螨提供有效量的包含与靶钙调蛋白基因序列或从其转录的RNA的区域同一或互补的核酸分子的组合物，其中所述核酸分子是由选自SEQ ID NO:90-92和94的序列及其互补序列组成的dsRNA，并且其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列，并且借此使所述核酸存在于瓦螨组织中。
5.核酸分子组合物在制备用于减少狄斯瓦螨对蜜蜂的寄生的药物中的用途，其包括向所述蜜蜂提供所述核酸分子，其中所述核酸分子是由选自SEQ ID NO:90-92和94的序列及其互补序列组成的dsRNA，并且其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列，由此减少狄斯瓦螨对所述蜜蜂的所述寄生。
6.核酸分子在制备用于减少蜜蜂蜂巢的狄斯瓦螨负荷的药物中的用途，其包括向所述蜂巢提供所述核酸分子，其中所述核酸分子是由选自SEQ ID NO:90-92和94的序列及其互补序列组成的dsRNA，其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列，并且借此减少所述蜂巢的所述狄斯瓦螨负荷。
7.核酸分子在制备用于选择性地处理节肢动物种类的寄生虫狄斯瓦螨的药物中的用途，其包括向所述节肢动物种类提供所述核酸分子，其中所述核酸分子是由选自SEQ IDNO:90-92和94的序列及其互补序列组成的dsRNA，并且其中所述核酸分子不包含与非靶生物体的基因序列100％同一或互补的19个或更多个连续核苷酸的序列。
8.如权利要求1所述的选择性杀昆虫剂组合物，其还包含赋形剂。
9.如权利要求8所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述组合物是螨可摄取的或螨可吸收的。
10.如权利要求8所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述赋形剂是选自由蛋白质、花粉、碳水化合物、聚合物、液体溶剂、糖浆、糖固体和半固体饲料组成的组。
11.如权利要求10所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述液体溶剂是选自由蔗糖溶液和玉米糖浆溶液组成的组。
12.如权利要求10所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述蛋白质是选自由花粉和大豆蛋白组成的组。
13.如权利要求10所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述赋形剂是选自糖固体、糖替代物或糖补充剂。
14.如权利要求13所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述糖固体包括浸渍有所述核酸分子的糖微粒。
15.如权利要求1所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述组合物还包含一种或多种核酸分子。
16.如权利要求15所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述一种或多种核酸分子包含与所靶向的钙调蛋白基因序列的第二区域互补的第二核酸序列。
17.如权利要求16所述的选择性杀昆虫剂组合物，其中所述第二核酸序列包含一个或多个核酸片段。
18.如权利要求2所述的组合物，其中所述蜜蜂饲料包括选自由玉米糖浆、花粉替代物、花粉、花粉饼和方旦软糖组成的组的蜜蜂食物。
19.如权利要求3所述的核酸构建体，其还包含选自由翻译前导序列、内含子、增强子、茎-环结构、阻遏物结合序列、终止序列、中止序列和多聚腺苷酸识别序列组成的组的至少一个调控元件。
20.如权利要求3所述的核酸构建体，其中所述宿主细胞是选自由细菌细胞和酵母细胞组成的组。
21.如权利要求5所述的用途，其中所述蜜蜂是采集蜂或蜂巢蜂。
22.如权利要求5所述的用途，其中所述蜜蜂是属于某个蜂群的蜜蜂，并且所述提供减少了狄斯瓦螨对所述蜂群的寄生。
23.如权利要求22所述的用途，其中对所述蜂群的寄生的所述减少包括所述狄斯瓦螨的存活率低于25％、15％、10％或5％。
24.如权利要求6所述的用途，其中所述蜜蜂蜂巢具有每100只蜜蜂至少1个、2个、3个、5个、10个或更多个狄斯瓦螨的初始狄斯瓦螨负荷。
25.如权利要求24所述的用途，其中将所述狄斯瓦螨负荷降至每100只蜜蜂少于2个、少于3个、少于5个或少于10个狄斯瓦螨。
26.如权利要求7所述的用途，其中所述处理降低所述节肢动物种类的狄斯瓦螨负荷、减少所述节肢动物种类的死亡或预防对所述节肢动物种类的狄斯瓦螨寄生。
27.如权利要求7所述的用途，其中所述节肢动物种类是选自由西方蜜蜂、东方蜜蜂、极小无刺蜂、集蜂科、熊蜂某种、姬蜂总科、跳蚤、蝇、虱、蜱和螨组成的组。
28.如权利要求7所述的用途，其中所述节肢动物种类是群体种类。
29.如权利要求7所述的用途，其中所述节肢动物种类是西方蜜蜂。
30.如权利要求7所述的用途，其中所述提供包括选自由通过饲喂器递送、喷洒在蜂巢架上和使用浸渍有所述核酸分子的蜂巢内装置来接触组成的组的方法。
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