CN115190884A

CN115190884A - 新型细胞递送方法

Info

Publication number: CN115190884A
Application number: CN202080093916.XA
Authority: CN
Inventors: 沙恩·斯通; 克林顿·哈尔; 安雅·施蒂恩魏斯; 保拉·坎宁安
Original assignee: Pyc Therapeutics Ltd
Current assignee: Pyc Therapeutics Ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: JP7684971B2; CN115190884B; JP2023511501A; KR20220117914A; IL294050A; BR112022012057A2; AU2020406670A1; WO2021119756A1; EP4077354A4; EP4077354A1; AU2020406670B2; US20230048338A1; CA3161901A1

Abstract

一种经分离的、非天然存在的细胞穿透肽(CPP)，其包含氨基酸序列：RRSRTARAGRPGRNSSRPSAPR[SEQ ID NO：1]和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列。

Description

新型细胞递送方法

技术领域

本公开总体上涉及细胞穿透肽和相关组合物。

背景技术

由于肽的高功效和靶特异性，它们是有吸引力的诊断剂和治疗剂。然而，更广泛地采用肽作为治疗剂的挑战之一在于，大多数肽不能进入器官(诸如眼睛)内的不同组织，因为各种组织层通常充当肽进入细胞内的屏障。此外，现有的肽和任何相缔合货物通常被截留在细胞内体区室和溶酶体区室中。

细胞穿透肽(CPP)是一类促进各种分子货物(从纳米级颗粒到小化学分子、其他肽、蛋白质、寡核苷酸和DNA片段)的细胞摄入/摄取的肽。“货物”通过经由共价键的化学键联或者通过非共价相互作用与肽缔合。CPP的功能是将货物递送到细胞中，这是一个通常通过胞吞作用发生的过程。目前的用途受到CPP介导的货物递送的细胞特异性缺乏的限制。

大多数体外验证的CPP模式在体内失败通过临床中CPP-递送的药物的缺乏得到证明。问题是从体外单细胞进入步入体内环境显著增加了CPP介导的递送问题的复杂性。诸如R8、Tat和细胞穿膜肽(Penetratin)的典型CPP显示出体外和体内摄取，正如通过荧光标记的CPP追踪得到证明。然而，当与治疗货物偶联时，这些例子中没有一个已经转化为病理学中的有意义的功能变化。似乎CPP介导的货物递送的效用受到现有肽的限制，并且任何缔合的货物通常被截留在细胞内体区室和溶酶体区室中，同时缺乏细胞特异性。

在体内，已知包含具有相邻带正电荷氨基酸的电荷密集阳离子肽的线性CPP通过碳水化合物结合而被隔离，被截留在内体/溶酶体中，并已被证明结合引起膜变形的磷脂头基。通过增加其两亲性特性来增强CPP活性(一种已知的增加体外摄取的设计策略)不能改进体内递送，这可能是由于增加的膜变形和破坏所引起的毒性所致。

此外，体内胰蛋白酶和丝氨酸内肽酶以及其他蛋白酶的普遍存在引起富含阳离子的肽快速降解。

因而，为了充分利用细胞穿透肽递送的治疗剂的优点，对于开发用于将肽和相缔合的有效负载递送至体内组织和器官内特定组织的组合物和方法存在着持续需要。

本发明寻求提供改进的或替代的细胞穿透肽。

背景的先前讨论仅仅意在便于理解本发明。所述讨论并不承认或认可所提及的任何材料在本申请的优先权日是或曾经是公知常识的一部分。

发明内容

本发明提供了一种分离的、非天然存在的细胞穿透肽(CPP)，其包含氨基酸序列：

和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列。

本发明的序列在氨基酸水平上可以与SEQ ID NO：1具有至少65％、70％、75％、80％或85％的相似性，优选至少约90％、95％或98％的相似性。

优选地，通过以下一者或多者修饰CPP：使用非典型氨基酸、脂肪酸、可检测标记物、寡核苷酸、胆固醇和反应性基团。

优选地，CPP与感兴趣的分子缀合。感兴趣的分子可选自以下物质：治疗剂、寡核苷酸、另外的肽或蛋白质、反应性基团、脂肪酸、胆固醇或可检测标记物。优选地，使用共价键或非共价相互作用进行所述缀合。

本发明进一步提供了包含具有SEQ ID NO：1的CPP和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列或具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列的修饰的细胞。

本发明进一步提供了具有SEQ ID NO：1的CPP和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列、具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列或包含这些序列任一者的修饰的细胞在制造药剂或诊断剂中的用途。

具有SEQ ID NO：1的CPP和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列、具有SEQID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列或包含这些序列任一者的修饰的细胞作为药剂或诊断剂的用途。

一种试剂盒，其包括(i)具有SEQ ID NO：1的CPP和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列、具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列或包含这些序列任一者的修饰的细胞；和(ii)使用说明书。

附图说明

本发明的进一步特征在其几个非限制性实施方案的以下说明中得以更完全地描述。所包括的本说明仅用于举例说明本发明的目的。这不应该被理解为对如上所述的本发明的概括总结、公开或说明的限制。将参考附图来进行描述，其中：

图1是用肽-SMN1缀合物和仅用SMN1处理后48h的SMN1外显子7-跳跃的功效的图。

图2是用肽-SMN1缀合物和仅用SMN1处理后48h的细胞存活力的图。

图3是在RPE/脉络膜细胞中由具有SEQ ID NO：1的CPP产生的Smn外显子7-跳跃的功效的图，所述CPP与Smn PMO体内缀合。

图4是在视网膜细胞中由具有SEQ ID NO：1的CPP产生的Smn外显子7-跳跃的功效的图，所述CPP与Smn PMO体内缀合。

图5是具有SEQ ID NO：1的CPP在注射后五天的GFAP体内毒性的图，所述CPP与SmnPMO缀合。

发明描述

具体实施方式

细胞穿透肽

细胞穿透肽(CPP)特征，例如包含具有相邻带正电荷氨基酸的电荷密集阳离子肽的线性CPP，是体外性能增强的原因，但通常不转化为体内结果。CPP的功效与毒性密切相关，成功的体外和体内CPP都需要功效和毒性之间的良好平衡。要克服的关键障碍之一是CPP-货物部分在内体和溶酶体内的截留。在这里，我们提出了一种需要将CPP-货物定位于细胞核以实现功能性读出的测定法，因而，如果有效的话，所述测定法证明内体/溶酶体逃逸和/或核递送。我们已经鉴定了成功地将货物递送至细胞核的CPP，诸如包括反义寡核苷酸在内的氨基酸序列。

因此，提供了一种分离的、非天然存在的细胞穿透肽(CPP)，其包含氨基酸序列：

和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列。

优选地，CPP包含10至100个残基。例如，CPP可包含10至50个残基、20至30个残基、20至40个残基、30至70个残基、40至60个残基或25至50个残基。

所述SEQ ID NO：1氨基酸序列类似物包括具有其中一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代的氨基酸序列的类似物，所述取代基本上不改变所述分子的生物活性(细胞穿透能力)。这些氨基酸序列类似物与SEQ ID NO：1相比时优选地具有保守氨基酸取代。

在本发明的上下文中，类似的序列被认为包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、100或200个氨基酸上具有至少60％、65％、70％、75％、80％或85％相似性以及优选至少约90％、95％或98％相似性的CCP氨基酸序列。具体而言，通常应该考虑关于与那些已知对于由SEQ ID NO：1编码的CPP的功能必需的序列而不是非必需相邻序列的区域的相似性。

类似的序列可以具有与SEQ ID NO：1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％同一性以及优选至少约90％、95％或98％同一性的序列(即相同的残基)。类似的序列可以具有与SEQ ID NO：1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％相似性以及优选至少约90％、95％或98％相似性的序列(即具有相似物理化学性质的保守残基)。

可以通过肉眼、或更通常地借助于易得的序列比较程序来进行相似性比较。这些商业上可获得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的相似性％。可以计算在连续序列上的相似性％，即，将一个序列与另一个序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接进行比较，一次比较一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，这样的无空位比对仅仅在较少数目的残基上进行(例如少于50个连续氨基酸)。

虽然这是一种非常简单和一致的方法，但是它未能考虑的是，例如，在其他方面几乎完全相同的序列对中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基被排除在比对之外，因而当进行全局比对时可能导致在相似性和同一性％上的大幅降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生考虑到可能的插入和缺失的优化比对，而没有过度地使总体相似性评分不利。这是通过在序列比对中插入“空位”来实现的，以便试图将局部同源性最大化。

可以使用可从欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)获得的EMBOSS成对比对算法工具来确定氨基酸序列的同一性和相似性，所述研究所是欧洲分子生物学实验室的一部分。这个工具可从位于www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/的网站取得。这个工具利用了Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch，1970)。利用默认设置，包括空位开放：10.0，以及空位延伸0.5。将默认矩阵“Blosum62”用于氨基酸序列和默认矩阵。

术语“细胞穿透肽”(CPP)是指能够穿过细胞膜的肽。在一个实例中，CPP能够跨哺乳动物细胞膜转运并进入细胞。在另一个实例中，CPP可以将缀合物导向至期望的亚细胞区室。因而，CPP可以指导或促进感兴趣的分子穿透磷脂膜、细胞膜、线粒体膜、内体膜、溶酶体膜、囊泡膜或核膜。CPP可以跨膜转运，其氨基酸序列完整无缺，或可替代地被部分降解。

CPP可以引导感兴趣的分子从细胞外穿过质膜，并且进入细胞质或期望的亚细胞区室。可替代地，或另外地，CPP可以引导感兴趣的分子穿过血脑屏障、跨粘膜屏障、血视网膜屏障、皮肤屏障、胃肠屏障和/或肺屏障。

CPP跨膜转运的能力可以是能量依赖的或非依赖的和/或受体依赖的或非依赖的。在一些实例中，CPP是一种如本文所述方法所确定的被证明跨质膜转运肽。CPP包括：(i)被细胞内化但随后被截留在内体或溶酶体内的肽；和(ii)这样的肽，其不仅被细胞内化，而且一旦被细胞内化，就能够逃离内体和/或溶酶体区室，此外能够介导细胞内递送，进入胞质溶胶和细胞核、线粒体、高尔基体和其他细胞内区室。

在一些实例中，相对于本文所述的任何序列，肽将包含一个至二个、一个至五个或十个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个保守氨基酸取代。保守置换(也称为保守突变或保守取代)是一种氨基酸置换，其中一个氨基酸残基被另一个具有相似物理化学性质的侧链的氨基酸残基置换，产生具有不同氨基酸序列但具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的蛋白质。

带有具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基是本领域已知的，并且包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守氨基酸取代包括那些已经被非天然存在的氨基酸和非蛋白原氨基酸取代的因此它们不在遗传密码编码的常规氨基酸之列的氨基酸。保守氨基酸取代进一步包括D-氨基酸。

术语“碱性氨基酸”涉及任何氨基酸，包括具有高于6.3的等电点的天然和非天然氨基酸，所述等电点的测量的根据为Kice和Marvell″Modern Principles of organicChemistry″(Macmillan，1974)或Matthews和van Holde″Biochemistry″CummingsPublishing Company，1996。包括在该定义内的是精氨酸、赖氨酸、组氨酸和高精氨酸(Har)及其衍生物。适合的非天然碱性氨基酸描述在US 6,858,396中。

在一些实例中，任何CPP肽的氨基酸序列由20个到100个残基组成，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95个或20个到100个的其他数量的残基。在其他实例中，任何前述肽的氨基酸序列由30个到70个残基组成，例如35、40、45、48、50、52、60、65个残基或30个到70个残基的其他数量的残基。在其他实例中，任何前述肽的氨基酸序列由40个到60个残基组成，例如42、43、45、48、50、52、54、57、58个或40个到60个残基的其他数量的残基。在一些实例中，任何前述肽的氨基酸序列由35个到50个残基组成，例如36、38、40、42、43、45、57、58个残基或35个到50个残基的其他数量的残基。仍然在其他实例中，任何前述肽的氨基酸序列由20个到50个残基组成，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、37、38、40、42、46、48个或20个到50个的其他数量的残基。

在一个实例中，所述肽的氨基酸序列由对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。为避免疑问，应当理解的是，在这样的实例中，虽然所述肽的氨基酸序列由对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成，然而，所述肽可以包含不改变氨基酸序列的化学修饰。这样的修饰包括但不限于：使用非典型氨基酸、脂肪酸、可检测标记物、多核苷酸、胆固醇和反应性基团；CPP与非肽接头缀合；CPP与感兴趣的分子(包括治疗剂、寡核苷酸和可检测标记物)缀合。在其他实例中，所述CPP由对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述CCP包含对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多个拷贝和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列，在本文中称为多聚体肽。在一些实例中，多聚体肽包含对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的二个到十个拷贝，例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝。在一个实施方案中，所述CCP包含对应于SEQID NO：1的氨基酸序列的多个拷贝和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列。

修饰的CPP

通过使用非典型氨基酸、脂肪酸、可检测标记物、多核苷酸、胆固醇和反应性基团，可以修饰CPP。这样的修饰肽可以给CPP赋予另外的功能性，诸如促进肽进入的检测、在细胞内的定位、增强的细胞进入和/或减少的体外或体内肽降解。

非典型氨基酸

在一些实例中，CPP是包含非典型氨基酸的修饰肽。适合的非典型氨基酸包括但不限于α-氨基-正丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、叔亮氨酸、鸟氨酸、别苏氨酸、β-丙氨酸、β-氨基-正丁酸、n-异丙基甘氨酸、异丝氨酸、肌氨酸、6-氨基己酸、γ-氨基丁酸和5-氨基戊酸。

反应性基团

在其他实例中，所述修饰的CPP可以包含反应性基团。适合的反应性基团包括但不限于叠氮化物基团、胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实例中，所述反应性基团是化学标签的一部分。适合的化学标签包括但不限于，SNAP标签、CLIP标签、Halo标签或TMP标签。在一个实例中，所述化学标签是SNAP标签或CLIP标签。SNAP和CLIP融合蛋白能够使几乎任何分子特异性共价连接到感兴趣的蛋白质或肽上，正如例如描述于

2015(Methods Mol Biol，1266：55-79)。在另一个实例中，所述化学标签是Halo标签。Halo标签涉及模块化蛋白质标签化系统，所述系统允许不同的分子共价连接，无论是在溶液中，在活细胞中，还是在化学固定的细胞中。在另一个实例中，所述化学标签是TMP标签。TMP标签能够以高选择性标记细胞内蛋白质，而不是细胞表面蛋白质。

脂肪酸

在一些实例中，所述修饰的CPP可以包含脂肪酸。适合于修饰肽的脂肪酸包括但不限于，棕榈酸、肉豆蔻酸、辛酸、月桂酸、正辛酸和正癸酸。

胆固醇

在其他实例中，所述修饰的CPP可以包含胆固醇。

寡核苷酸

在一些实例中，所述修饰的CPP可以包含寡核苷酸。在这样的情况下，寡核苷酸可以是反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA、RNAi、单链DNA或RNA寡核苷酸、双链DNA寡核苷酸、mRNA或质粒。

可检测标记物

在一些实例中，所述修饰的CPP可以包含可检测标记物。术语“可检测标记物”是指可以通过光学、荧光、同位素成像或通过质谱技术或通过进行简单的酶测定法进行检测的任何类型的分子。可以使用本领域已知的的任何可检测标记物。在一些实例中，可检测标记物选自：报告蛋白、荧光团、荧光底物、发光底物和生物素。

可检测标记物可以是报告蛋白。适合的报告蛋白包括本文所述的荧光蛋白、在Qureshi(2007)年Biotechniques，42(1)：91-95中描述的β内酰胺酶、卤代烷脱卤酶或萤光素酶。在一些实例中，报告蛋白包含β-内酰胺酶的氨基酸序列。

可检测标记物可以是荧光标签。例如，荧光标签可以是荧光团，诸如异硫氰酸荧光素、氨基硫脲荧光素、罗丹明、德克萨斯红、CyDye(诸如Cy3、Cy5和Cy5.5)、Alexa Fluor(诸如Alexa488、Alexa555、Alexa594和Alexa647)或近红外荧光染料。荧光标签可以是荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、AcGFP或TurboGFP、祖母绿、Azami绿、ZsGreen、EBFP、蓝宝石、T-蓝宝石、ECFP、mCFP、天蓝色、CyPet、AmCyanl、Midori-Ishi Cyan、mTFPl(Teal)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、黄玉色、金色(Venus)、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellowl、mBanana、Kusabira、ange、mOrange、dTomato、dTomato-Tandem、AsRed2、mRFPl、Jred、mCherry、HcRedl、mRaspberry、HcRedl、HcRed-Tandem、mPlum、AQ 143。荧光标签可以是量子点。荧光标签可以是pH敏感荧光团，诸如萘并荧光素、pHrodo^TM Green(ThermoFisher)和pHrodo^TM Red(ThermoFisher)。可以使用荧光显微镜诸如落射荧光显微镜或共聚焦显微镜、荧光扫描仪诸如微阵列读取器、荧光分光光度计、微孔板读取器和/或流式细胞仪来检测荧光标签。

可检测标记物可以是发光基质。适合的发光底物包括但不限于D-萤光素、L-萤光素、腔肠素。

可检测标记物可以是表位标签。例如，表位标签可以是多聚组氨酸标签，诸如六组氨酸标签或十二组氨酸(dodecahistidine)、FLAG标签、Myc标签、HA标签、GST标签或V5标签。常规地用商业上可获得的抗体检测表位标签。本领域技术人员将知道表位标签可以促进纯化和/或检测。例如，可以使用本领域已知的方法纯化包含六组氨酸标签的CPP，例如，通过使包含蛋白质的样品与镍-次氮基三乙酸(镍-NTA)接触，所述镍-次氮基三乙酸特异性地结合固定在固体或半固体支持物上的六组氨酸标签，洗涤样品以去除未结合的蛋白质，随后洗脱结合的蛋白质。可替代地，或另外地，与表位标签结合的配体或抗体可用于亲和纯化方法中。

可检测标记物可以是质量标签或等压标签。这样的标签可用于相对绝对定量(iTRAQ)。质量标签是一种用于基于质谱的蛋白质和肽的定量的化学标记物。在这样的方法中，质谱仪识别蛋白质或肽的标记形式和未标记形式之间的质量差异，并且通过比较它们各自的信号强度来实现定量，例如由Bantscheff等人(2007)所述。质量标签的实例包括TMTzero、TMTduplex、TMTsixplex和TMT 10-plex。用于相对绝对定量的等压标签(iTRAQ)是在定量蛋白质组学中通过串联质谱法使用的化学标签，以在单个实验中确定来自不同来源的蛋白质的量，正如例如由Wiese等人(2007)所述。

缀合货物

CPP可以与感兴趣的分子(即“货物”)缀合，以增加感兴趣的分子向细胞中递送。感兴趣的分子包括：治疗剂、寡核苷酸、另外的肽或蛋白质、反应性基团、脂肪酸、胆固醇或可检测标记物。可以通过共价键或非共价相互作用进行缀合。例如，CPP可以经由“肽接头”与寡核苷酸缀合。所述部分可被设计成作用于特定的细胞内靶标或指导其转运至特定的亚细胞区室。

可以将感兴趣的分子共价连接到CPP肽中的氨基酸上。在一个实例中，将共价连接的感兴趣的分子共价连接到CPP氨基酸序列的N末端。在另一个实例中，将共价连接的感兴趣的分子共价连接到CPP氨基酸序列的C末端。在其他实例中，将共价连接的感兴趣的分子通过CPP的氨基酸残基侧链共价连接(例如，在内部赖氨酸或半胱氨酸残基处)。本领域技术人员认识到，这可以通过各种化学反应来实现，包括但不限于肽键形成、酰胺键形成、经由反应性胺的连接、腙形成、二硫化物形成、醚键、点击化学(铜催化的和应变促进的)、施陶丁格(Staudinger)反应、天然化学连接和缀合化学(诸如SpyCatcher/SpyTag异肽键形成)。

在一些实例中，例如，经由CPP中一个或多个带电荷的氨基酸残基与感兴趣的分子中的一个或多个官能团之间的非共价相互作用，将感兴趣的分子与CPP非共价连接，所述一个或多个官能团与一个或多个CPP氨基酸残基带相反电荷。非共价相互作用可以是静电相互作用、范德华力、π键相互作用和疏水相互作用。

治疗剂

在一些实例中，感兴趣的缀合分子可以是治疗剂，优选小分子化合物(通常大小小于约900道尔顿)。在一些实例中，小分子治疗剂是化学治疗剂、细胞毒性分子或细胞抑制分子。

寡核苷酸

在一些实例中，感兴趣的缀合分子可以是寡核苷酸。寡核苷酸可以是反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA、RNAi、单链DNA或RNA寡核苷酸、双链DNA寡核苷酸、mRNA或质粒。寡核苷酸可以包括吗啉代寡核苷酸(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2’-O-甲基寡核苷酸。寡核苷酸可以具有(i)修饰的主链结构，例如不同于在天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键的主链，和/或(ii)修饰的糖部分，例如不同于核糖或脱氧核糖部分的吗啉代部分。

肽或蛋白质

在一些实例中，感兴趣的缀合分子可以是蛋白质或肽。蛋白质或肽可以是：促凋亡肽、靶向蛋白、细胞毒性蛋白、酶蛋白、报告蛋白、基于肽的蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂、蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)肽和显性负肽。

在一些实例中，酶蛋白可以是ASS-1(Quinonez和Thoene 2004年)或β-内酰胺酶(Stone等人2018年)；肽相互作用抑制剂可以是KRAS/SOS-1蛋白相互作用阻断肽(例如Leshchiner等人2015)；蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)肽序列可以是来自Sakamoto等人2001或Gu等人2018的序列。

在一些实例中，蛋白质或肽可以是促凋亡肽。

在一些实例中，蛋白质或肽可以是靶向蛋白。通过与特异性细胞表面抗原(例如，受体)结合，靶向蛋白可以提供针对肽缀合物的增强的特异性，所述抗原然后被内化到内体中。靶向蛋白的实例包括但不限于亲和体、scFv、单链抗体和其他使用替代支架(例如肽适体)的选择性结合蛋白。可替代地，靶向蛋白可以是基因组靶向蛋白(例如，Cas9基因组靶向蛋白或Cpf1基因组靶向蛋白)。

在其他实例中，蛋白质或肽可以是细胞毒性蛋白(例如，三角梅核糖体失活蛋白或白喉毒素)，其在内化时诱导快速细胞死亡并且从内体逃逸。

在一些实例中，蛋白质或肽可以是显性负肽。通常显性负性肽的作用为干扰衍生它们的蛋白质的一种或多种功能和/或干扰全长蛋白的相互作用配偶体的功能。通常，它们通过干扰蛋白质与其结合配偶体中的一种或多种的相互作用而起作用。在一些实例中，显性负转录因子肽是抗癌肽。适合的抗癌肽包括但不限于：Omomyc，一种如Massler等人(2016)在Clin Cancer Res，22(18)：4698-4711中所述的激活转录因子5(ATF5)显性负肽d/n-ATF5-S1；抗Ras-p21显性负性肽，诸如ras-p21 96-110(PNC-2)和ras-p21 35-47，如Adler等人(2008)在Cancer Chemother Pharmacol，62(3)：491-498中所述。

反应性基团

在一些实例中，感兴趣的缀合分子可以是反应性基团。适合的反应性基团包括但不限于叠氮化物基团、胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实例中，所述反应性基团是化学标签的一部分。适合的化学标签包括但不限于，SNAP标签、CLIP标签、Halo标签或TMP标签。在一个实例中，所述化学标签是SNAP标签或CLIP标签。SNAP和CLIP融合蛋白能够使几乎任何分子特异性共价连接到感兴趣的蛋白质或肽上，正如例如描述于

脂肪酸

在一些实例中，感兴趣的缀合分子可以是脂肪酸。适合于修饰肽的脂肪酸包括但不限于，棕榈酸、肉豆蔻酸、辛酸、月桂酸、正辛酸和正癸酸。

胆固醇

在一些实例中，感兴趣的缀合分子可以是胆固醇。

可检测标记物

在一些例子中，感兴趣的缀合分子是可检测标记物。可检测标记物可以是通过光学、荧光、同位素成像或通过质谱技术或通过进行简单的酶测定法进行检测的任何类型的分子。可以使用本领域已知的的任何可检测标记物。在一些实例中，可检测标记物选自：报告蛋白、荧光团、荧光底物、发光底物和生物素。

可检测标记物可以是质量标签或等压标签。这样的标签可用于相对绝对定量(iTRAQ)。质量标签是一种用于基于质谱的蛋白质和肽的定量的化学标记物。在这样的方法中，质谱仪识别蛋白质或肽的标记形式和未标记形式之间的质量差异，并且通过比较它们各自的信号强度来实现定量，例如由Bantscheff等人(2007)所述。。质量标签的实例包括TMTzero、TMTduplex、TMTsixplex和TMT 10-plex。用于相对绝对定量的等压标签(iTRAQ)是在定量蛋白质组学中通过串联质谱法使用的化学标签，以在单个实验中确定来自不同来源的蛋白质的量，正如例如由Wiese等人(2007)所述。

合成

可以使用技术人员已知的化学方法合成本公开的任何CPP。例如，使用固相、液相或肽缩合的已知技术或其任何组合制备合成肽，并且所述合成肽可以包含天然和/或非天然氨基酸。

可以通过重组方式表达本公开的任何肽。例如，可以将编码所述肽的核酸置于与启动子或其他能够调控细胞系统或生物中的表达的调控序列可操作连接。适合于在细菌细胞中表达的典型启动子包括，例如，lacz启动子、Ipp启动子、温度敏感的λL或λR启动子、T7启动子、T3启动子、SP6启动子或半人工启动子，诸如IPTG诱导型tac启动子或lacUV5启动子。用于在细菌细胞中表达本发明的肽的许多其他基因构建体系统是本领域公知的，并且描述于例如Ausubel等人(1988)以及Sambrook等人(2001)。

已经描述了许多用于在细菌细胞中表达重组肽的表达载体，包括例如PKC3、pKK173-3、pET28、pCR载体套件(Invitrogen)、pGEM-T Easy载体(Promega)、pL表达载体套件(Invitrogen)或含有阿拉伯糖诱导型启动子的pBAD/thio-TOPO系列载体(Invitrogen)等。

适合于在酵母细胞中表达的典型启动子包括但不限于，ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PH05启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子，所述酵母细胞选自包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的组。

用于在酵母细胞中表达的表达载体是优选的，并且包括例如pACT载体(Clontech)、pDBleu-X载体、pPIC载体套件(Invitrogen)、pGAPZ载体套件(Invitrogen)、pHYB载体(Invitrogen)、pYD 1载体(Invitrogen)以及pNMT 1、pNMT41、pNMT81 TOPO载体(Invitrogen)、pPC86-Y载体(Invitrogen)、pRH系列载体(Invitrogen)、pYESTrp系列载体(Invitrogen)。

用于在哺乳动物细胞中表达的优选载体包括，例如，pcDNA载体套件(Invitrogen)、pTARGET系列载体(Promega)和pSV载体套件(Promega)。

适合的用于转化和转染宿主细胞的方法可以发现于Sambrook等人(2001)和其他实验室教科书。在一个实例中，可以使用例如电穿孔或氯化钙介导的转化将核酸引入到原核细胞中。在另一个实例中，可以使用例如显微注射、磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、通过脂质体诸如使用Lipofectamine(Invitrogen)和/或cellfectin(Invitrogen)介导的转染、PEG介导的DNA摄取、电穿孔，通过腺病毒、疱疹病毒、披膜病毒或逆转录病毒的转导，以及微粒轰击，诸如通过使用DNA包被的钨或金颗粒，将核酸引入到哺乳动物细胞中。可替代地，可以使用常规技术，例如电穿孔和PEG介导的转化，将核酸引入到酵母细胞中。

在生产/表达/合成之后，可以使用诸如HPLC的本领域已知的方法纯化本公开的任何蛋白质或肽，参见例如Scopes(见于：Protein purification：principles andpractice，第三版，Springer Verlag，1994)。

细胞表达

本文还描述了修饰的细胞，其包含任何CPP或与本文所述的感兴趣分子缀合的CPP。

因此，本发明提供了一种修饰的细胞，其包含具有SEQ ID NO：1的的CPP和与SEQID NO：1具有至少60％相似性的序列或具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列。

在一些实例中，修饰的细胞是原核细胞。在其他实例中，修饰的细胞是真核细胞。适合的真核细胞包括酵母细胞和哺乳动物细胞，包括但不限于人类细胞。在一些实例中，修饰的哺乳动物细胞来自细胞系。适合的细胞系包括但不限于ARPE-19、CHO-K1、HEK-293、COS7、HeLa、N2a和NIH 3T3。

在一些实例中，修饰的细胞表达一种或多种遗传编码的CPP或与感兴趣的分子缀合的CPP。在其他实例中，修饰的细胞是原代哺乳动物细胞。

在其他实施例中，修饰的细胞不包含编码CPP或与感兴趣的分子缀合的CPP的外源核酸，但是通过CPP或与感兴趣的分子缀合的CPP的蛋白质转导而被修饰。

优选地，修饰的细胞是真核细胞。更优选地，真核细胞是哺乳动物细胞。最优选地，哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实例中，人类细胞是人类干细胞。这样的人类干细胞包括但不限于胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和间充质干细胞。在进一步的实例中，人类细胞包括但不限于心肌细胞、神经元、肝细胞和胰岛细胞。在其他实例中，哺乳动物细胞是癌细胞(例如，人类癌细胞)。

用途

本公开还提供了用作药剂或诊断剂的CPP、与感兴趣的分子缀合的CPP或修饰的细胞中的任何一种。本公开还提供了用于制造药剂或诊断剂的CPP、与感兴趣的分子缀合的CPP或修饰的细胞中的任何一种。

因此，本发明提供了具有SEQ ID NO：1的CPP和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列、具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列或包含这些序列任一者的修饰的细胞在制造药剂或诊断剂中的用途。

本发明进一步提供了具有SEQ ID NO：1的CPP和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列、具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列或包含这些序列任一者的修饰的细胞作为药剂或诊断剂的用途。

试剂盒

本公开还提供了包括本发明的CPP和使用说明书的试剂盒。

因此，本发明提供了一种试剂盒，其包括(i)具有SEQ ID NO：1的的CPP和与SEQ IDNO：1具有至少60％相似性的序列、具有SEQ ID NO：1的CPP和与感兴趣的分子缀合的与SEQID NO：1具有至少60％相似性的序列或包含这些序列任一者的修饰的细胞；和(ii)使用说明书。

定义

术语“典型氨基酸”是指由通用遗传密码的密码子直接编码的氨基酸。典型氨基酸是：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

关于核苷酸或氨基酸序列的术语“内源的”或“内源编码的”表示所讨论的序列对于没有经过实验修饰的病毒、细胞或生物体而言是天然的，以编码或表达所讨论的氨基酸序列。

关于肽的术语“非天然存在”将被理解为表示：(i)没有内源基因或编码由所讨论的肽的氨基酸序列组成的氨基酸序列的开放阅读框；和(ii)没有其氨基酸序列由所讨论的肽组成的内源性蛋白质片段。例如，由内源表达的蛋白质的片段的氨基酸序列组成的肽被认为是非天然存在的肽，条件是该蛋白质片段本身不是天然表达的或者通常不是作为内源表达的蛋白质的副产物而存在。

术语“肽”旨在包括由酰胺键连接的氨基酸残基组成的化合物。所述肽可以是天然的或非天然的、核糖体编码的或合成衍生的。通常，所述肽将由2个至200个氨基酸组成。例如，所述肽可以具有在10个至20个氨基酸或10个至30个氨基酸或10个至40个氨基酸或10个至50个氨基酸或10个至60个氨基酸或10个至70个氨基酸或10个至80个氨基酸或10个至90个氨基酸或10个至100个氨基酸的范围内的长度，包括所述范围内的任何长度。所述肽可以包含少于约150个氨基酸或少于约125个氨基酸或少于约100个氨基酸或少于约90个氨基酸或少于约80个氨基酸或少于约70个氨基酸或少于约60个氨基酸或少于约50个氨基酸或由其组成。

本文所指的肽，包括其中所有L-氨基酸被相应的D-氨基酸取代的“倒位”肽，以及其中氨基酸的序列是反的并且所有L-氨基酸被D-氨基酸代替的“反倒位”肽。

肽可以包含呈L-型和/或D-型的氨基酸。例如，L-型和D-型两者都可用于同一肽序列中的不同氨基酸。在一些实例中，在肽序列内的氨基酸为L-型，诸如天然氨基酸。在一些实例中，在肽序列内的氨基酸为L-型和D-型的组合。在一些实例中，在肽序列内的氨基酸都是D-型的。

可以使用公知的固相肽合成技术和纯化技术来合成肽。

术语“蛋白质”应该理解为包括单个多肽链，即，由肽键连接的一系列连续氨基酸，或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即，多肽复合物)。例如，可以使用适合的化学键或二硫键将一系列多肽链共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。

概述

本领域技术人员将理解的是，本文所述的发明易于作出除了具体描述的那些以外的变化和修改。本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及任何和所有组合或任何两个或更多个所述步骤或特征。

在本文中引用的每个文件、参考文献、专利申请或专利都通过引用明确地完整地并入本文，这意味着读者应该将其作为本文的一部分来阅读和考虑。在本文中引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复，这仅仅是出于简洁的原因。

针对本文提及的或在通过引用并入本文的任何文件中的任何制造商的说明、描述、产品规格和任何产品的产品表都通过引用特此并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。

本发明在范围上不受本文所述的任何具体实施方案的限制。这些实施方案仅仅是为了举例说明的目的。功能等同的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明范围内。

本文描述的发明可以包括一个或多个范围的值(例如尺寸、位移和场强等)。值的范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括限定该范围的值，以及与该范围相邻的值，其导致与紧邻限定该范围的边界的值相同或基本相同的结果。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望特性而变化。因此，“约80％”表示“约80％”，以及还有“80％”。至少，应该根据有效数字的数目和普通的舍入方法来解释每个数值参数。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解成意指包括所陈述的整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。还应当指出的是，在本公开中尤其是在权利要求书和/或段落中，术语如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等等；并且这些术语如“基本上由......组成(consistingessentially of)”和“基本上由......组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被清楚叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。

本文使用的选定术语的其他定义可以在本发明的详细说明中找到，并且适用于全文。除非另外定义，本文使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。术语“活性剂”可以表示一种活性剂，或者可以包括两种或更多种活性剂。

以下实施例用于更全面地描述使用上述发明的方式，以及阐述设想的实现本发明各个方面的最佳模式。应当理解的是，这些方法决不用于限制本发明的真实范围，而是为了说明的目的提出的。

实施例

本发明的进一步特征在以下非限制性实施例中得以更完全地描述。所包括的本说明仅用于举例说明本发明的目的。这不应该被理解为对如上所述的本发明的概括说明的限制。

实施例1

使用应变促进的(SPAAC)点击化学(Agard等人2004年，Dommerholt等人2016年)，将潜在的CPP肽与靶向SMN1基因的外显子7的磷酸二酰胺寡核苷酸(PMO)连接(Flynn等人2018年)。将肽-PMO缀合物在全培养基中的ARPE-19细胞上孵育2天。通过RNA提取，通过SMN1基因RNA转录物中的外显子7跳跃的程度来测量内化的功效。其中d7转录物％高于单独PMO处理的肽-PMO被认为是CPP。

体外CPP-SMN1测定法简介

存活运动神经元(SMN1)基因普遍表达，并在剪接体的装配和核糖核蛋白的生物发生中起重要作用。已经阐明了SMN1基因的剪接调控(Singh等人2012.)。SMN1的剪接变体，其中外显子-7被跳过，是一种已知的同工型，产生较短的SMN蛋白，表示为D7-SMN1。使用细胞穿透肽递送的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)的外显子跳跃已被确立为测试CPP功效的可行途径(Wu等人2007)。

使用SMN1基因，我们使用与不同CPP缀合的磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)建立了一种靶向SMN1基因的在外显子-7处的外显子跳跃测定法(Flynn等人2018)。这种测定法用于鉴定可以有效地将PMO货物递送至细胞核并影响SMN1的外显子跳跃的CPP。使用RNA提取、cDNA生成和使用SMN1特异性引物的PCR，通过测量D7-SMN1RNA转录物的变化来确定递送和功能的效率。将效率解释为D7-SMN1转录物的百分比越高，通过CPP向细胞核的递送越好。

鉴于这种测定法的性质，由于在全培养基存在下的蛋白酶消化，天然L-肽的特征是不希望的。为了充分评估肽CPP能力，将肽合成为含有混合L/D氨基酸的肽，其中所有的碱性残基都是D-氨基酸，或合成为含有全D氨基酸的肽。这两种方法都保护肽在细胞上孵育期间免于蛋白水解降解。

方法

哺乳动物组织培养

从ATCC(

CRL-2302)获得ARPE-19细胞。将细胞系维持在37℃的具有5％CO₂的加湿孵育箱中，并在完全培养基(DMEM/F12 1∶1，10％FCS；10mM HEPES，1xGlutaMAX^TM，Pen/Strep 100u/ml；Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中培养。

肽和PMO合成以及PPMO缀合

使用标准的基于Fmoc SPPS的方法(Pepscan GmbH，Lelystad，The Netherlands和Mimotopes，Mulgrave，VIC，Australia)合成CPP。所有序列都含有C-末端叠氮赖氨酸残基，以允许与PMO偶联；所有的N-末端被乙酰化，并且C-末端被酰胺化。

具有5’环辛炔柄的SMN1 PMO(ACTTTCCTTCTTTTTTATTTTGTCT)[SEQ ID NO：2]是使用由Summerton和Weller(1997)开发的方法通过Gene Tools(Gene Tools LLC，Philomath，OR，USA)产生的。

使用应变促进的点击化学将具有C-末端叠氮赖氨酸的CPP肽与5′-环辛炔PMO化学选择性缀合(SPAAC；Agard等人2004；Dommerholt等人2016)。在37℃下在具有5％DMSO的磷酸盐缓冲盐水中进行叠氮基官能化的肽和环辛炔官能化的PMO之间的环加成反应3-4天。通过离子交换色谱法(IEX)从未反应的物质中分离出肽-PMO(PPMO)缀合物并脱盐。通过分析型反相HPLC和LC/MS分析最终级分。

体外SMN1功效测定法

根据公开的方案进行外显子跳跃测定法和PCR检测(Mann等人2002，Gene Med，4，644-654)。

用各种浓度(4uM、2uM、1uM，一式两份)的CPP-PMO缀合物处理视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)永生化细胞，并在处理后48h通过RNA提取和纯化、随后的cDNA生成和PCR评估SMN1转录物水平。

将细胞接种在24孔板(ARPE-19，2.5x10⁴个细胞/孔)的完全培养基(DMEM/F12 1∶1，10％FCS；10mM HEPES，1xGlutaMAX^TM，Pen/Strep 100u/ml；Gibco，Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)中。将细胞孵育过夜(37℃，5％CO₂)以允许细胞粘附。在测定法当天，吸出培养基并用CPP-PMO或PMO(仅在处理培养基(DMEM/F12 1∶1，10％FCS；10mMHEPES；1xGlutaMAX^TM，Pen/Strep 100u/ml；Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中稀释)代替，随后孵育(37℃，5％CO₂)24h。第二天加入1∶1的新鲜培养基，并将细胞放回孵育箱继续24h。

处理后48h，小心地吸出细胞培养基，并用PBS冲洗细胞。根据制造商的方案，使用商业RNA提取试剂盒(Bio-Rad Aurum总RNA 96试剂盒；Quantify RNA产率；Quant-iT RNABR试剂盒)从处理的细胞获得RNA。

将提取的RNA纯化，定量，然后稀释至10ng/ul。根据制造商的方案(BioRadiScript)，使用商业逆转录试剂盒产生cDNA。将产生的cDNA用作模板，其中引物被设计为扩增感兴趣的区域，以扩增DNA。通过将SMN1基因的全长(FL SMN1)和外显子-7跳跃片段(D7-SMN1)定量(LC-GX核酸分析仪)并计算百分比，确定外显子跳跃的功效。D7-SMN1DNA的百分比越高，CPP递送效率越高。

体外SMN1存活力测定法

将细胞接种在96孔板(ARPE-19，4x10³个细胞/孔)的完全培养基(DMEM/F12 1∶1，10％FCS；10mM HEPES，1xGlutaMAX^TM，Pen/Strep 100u/ml；Gibco，Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)中。将细胞孵育过夜(37℃，5％CO₂)以允许细胞粘附。在测定法当天，吸出培养基并用CPP-PMO或PMO(仅在各种浓度(32、16、8、4、2和1uM)的处理培养基(DMEM/F12 1∶1，10％FCS；10mM HEPES，1xGlutaMAX^TM，Pen/Strep 100u/ml；Gibco，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)中稀释)代替，随后孵育(37℃，5％CO₂)24h。第二天加入1∶1的新鲜培养基，并将细胞放回孵育箱继续培养24h。

处理后48h，使用商业

发光细胞存活力测定法(Promega，Australia)测量细胞存活力。简言之，CellTiter-Glo试剂使细胞裂解并生成发光信号，所述发光信号与存在的ATP的量成比例，这进而与存在于培养物中的活细胞的数量成正比。所有测定法都是用已知的细胞毒性剂蜂毒肽(Renata等人2007)和仅细胞对照进行的。使用细胞存活力来确定由CPP-PMO缀合物引起的毒性水平，其中，对应地，高存活力等同于低毒性，并且低存活力等同于高毒性。

结果

在图1和表1中，相比于单独的SMN1 PMO，与SMN1 PMO缀合的4uM、2uM和1uM的SEQID NO：1的CPP产生了更多的截短的D7-SMN1转录物。对于应用的肽-PMO缀合物，诱导的SMN1外显子跳跃的功效遵循剂量-响应曲线。在诱导SMN1外显子跳跃方面，肽-PMO缀合物比仅SMN1 PMO处理更有效(2uM时为1.2倍)。因而，描述于SEQ ID NO：1中的肽是有效的细胞穿透和核递送剂。

在图2和表2中，将肽-PMO缀合物对于仅用PMO相比以32uM处理ARPE-19细胞48小时的存活力清楚地表明，添加肽-PMO缀合物对细胞存活力的损害比单独的PMO更小(1.05倍)。这表明肽的细胞穿透和核递送作用对细胞健康无害，并且未引起通常与阳离子细胞穿透肽相关的固有毒性。

表1：CPP增强的SMN1反义寡核苷酸递送的功效结果

表2：CPP增强的SMN1反义寡核苷酸递送的存活力结果

实施例2

考虑到Smn基因在小鼠体内的普遍分布，实施例1中描述的体外SMN1功效测定法同样适用于体内环境，Smn是人SMN1的小鼠直向同源物。由于体内大量蛋白酶的存在，不希望在体内环境中使用天然L-肽。为了充分评估所述肽的细胞穿透能力，将肽合成为含有混合L/D氨基酸的肽，其中所有的碱性残基都是D-氨基酸，或合成为含有全D氨基酸的肽。两种方法都被建立为在全身施用到动物体内的过程中保护肽免于蛋白水解降解。

评估了CPP-PMO稍后将Smn货物体内递送到眼睛中的RPE细胞的能力，这是通过施用到小鼠的玻璃体液中并在第5、7、21和28天之后测量视网膜、RPE和脉络膜细胞层中的Smn转录物水平的变化来实现的。将本发明的CPP(SEQ ID NO：1)和对照CPP Pip6a(SEQ ID NO：3)(其与Smn PMO(SEQ ID NO：2)缀合)以每只眼睛1.6ug(0.5ul体积)通过玻璃体内注射施用。在处理后的期望时间点，挑选动物，并解剖眼睛，将组织层均质化，并使用按照实施例1的相同方案提取RNA。

对照CPP Pip6a含有非天然氨基酸(X和B)：

Arg Ahx Arg Arg beta-Ala Arg Arg Ahx Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg AhxArg beta-Ala Arg Ahx Arg beta-Ala

X＝Ahx＝氨基己酸；B＝β-Ala＝β-丙氨酸

使用RNA提取、cDNA生成和使用Smn特异性引物的PCR，通过测量Smn RNA转录物从全长到外显子-7跳跃片段(D7-Smn)RNA转录物的变化来确定对于各种器官的递送和功能的效率。将效率解释为D7-Smn转录物的百分比越高，通过CPP向组织的递送越好。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种中间丝细胞骨架蛋白。在一些细胞类型中的GFAP的水平受到损伤或应激的强烈影响，并且GFAP表达已经成为中枢神经系统损伤的重要标志。在眼睛中，米勒胶质细胞通常表达低水平的GFAP，其在视网膜损伤后大大增加。玻璃体内(IVT)施用后引出GFAP表达相对增加的肽被认为毒性更大。

方法

肽和PMO合成以及肽-PMO缀合

Smn PMO(ACTTTCCTTCTTTTTTATTTTGTCT；SEQ ID NO：2)，其具有5’环辛炔柄，是通过Gene Tools(Gene Tools LLC，Philomath，OR，USA)产生的。

将具有C-末端叠氮赖氨酸的CPP肽使用应变促进的点击化学与5′-环辛炔PMO化学选择性缀合(SPAAC；Agard等人2004；Dommerholt等人2016)并通过离子交换色谱法进行纯化和通过LC-MS进行定量。

体内Smn功效测定法(IVT施用)

根据公开的方案进行外显子跳跃测定法和RT-PCR检测(Mann等人2002，Gene Med，4，644-654)。

小鼠(C57B/6；7周龄)来源于Australian BioResources(ABR)。将选择的CPP-PMO以每只眼睛1.6ug(0.5ul)注射到玻璃体中，其中每个处理组一至三只小鼠。

处理后48h，挑选小鼠，并收获以下眼组织：视网膜、RPE层或RPE/脉络膜的组合。将组织均质化，并根据制造商的方案，使用商业RNA提取试剂盒(Bio-Rad Aurum总RNA 96试剂盒；Quantity RNA产率；Quant-iT RNA BR试剂盒)获得RNA。

将提取的RNA纯化，定量，然后稀释至10ng/ul。根据制造商的方案(BioRadiScript)，使用商业逆转录试剂盒产生cDNA。将产生的cDNA用作模板，其中引物被设计为扩增感兴趣的区域，以扩增DNA。通过将Smn基因的全长(FL Smn)和外显子-7跳跃片段(D7-Smn)定量(LC-GX核酸分析仪)并计算百分比，确定外显子跳跃的功效。D7-Smn DNA的百分比越高，CPP递送效率越高。

GFAP体内毒性测定法

作为上述体内Smn功效测定法的一部分，通过扩增获得的cDNA将GFAP mRNA的表达定量。使用BioRad微滴发生器和读取器(QX200 DG8)和热循环仪(T100)、鼠Gfap(dMmuCPE5116126)和管家基因Gapdh、Eefla1和Rp127(dMmuCPE5195283、dMmuCPE5101732和dMmuCPE5197083)的特异性探针以及探针(编号1863024)的ddPCR母液混合物和来自BioRad的其他ddPCR特异性消耗品(编号1863005、12001925、1863004、1864007)，进行ddPCR。

通过BioRad ddPCR软件获得测定结果，以拷贝/uL计。然后，将其归一化为管家基因，用于跨实验比较。引出GFAP表达相对增加的肽被认为毒性更大。

结果

在图3和图4以及表3和表4中，相比于单独的Smn PMO，与Smn PMO缀合的SEQ IDNO：1的CPP产生了更多的截短的D7-Smn转录物。在诱导Smn外显子跳跃方面，肽-PMO缀合物比仅Smn PMO处理或竞争剂CPP Pip6a更有效(Betts等人2012)。因而，描述于SEQ ID NO：1中的肽是有效的体内细胞穿透和核递送剂。

在图5和表5中，与Smn PMO缀合的SEQ ID NO：1的CPP引出非常少的GFAP表达，在第5天时不高于单独的PMO，并且远低于竞争剂CPP Pip6a。因而，描述于SEQ ID NO：1中的肽当以临床相关浓度经玻璃体内施用时被认为是体内无毒的。

表3：CPP增强的Smn反义寡核苷酸体内递送的功效结果(RPE/脉络膜)

表4：CPP增强的Smn反义寡核苷酸体内递送的功效结果(视网膜)

表5：CPP增强的Smn反义寡核苷酸体内递送的存活力结果(GFAP)

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Claims

1.一种经分离的、非天然存在的细胞穿透肽(CPP)，其包含氨基酸序列：

RRSRTARAGRPGRNSSRPSAPR[SEQ ID NO：1]

和与SEQ ID NO：1具有至少60％相似性的序列。

2.如权利要求1所述的CPP，其在氨基酸水平上与SEQ ID NO：1具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的相似性。

3.如权利要求1所述的CPP，其通过以下一者或多者修饰：使用非典型氨基酸、脂肪酸、可检测标记物、寡核苷酸、胆固醇和反应性基团。

4.如权利要求1所述的CPP，其与感兴趣的分子缀合。

5.如权利要求4所述的CPP，其中所述感兴趣的分子选自以下物质：治疗剂、寡核苷酸、另外的肽或蛋白质、反应性基团、脂肪酸、胆固醇或可检测标记物。

6.如权利要求4所述的CPP，其中使用共价键或非共价相互作用进行所述缀合。

7.一种经修饰的细胞，其包含如权利要求1所述的CPP或如权利要求4所述的与感兴趣的分子缀合的CPP。

8.如权利要求1所述的CPP、如权利要求4所述的与感兴趣的分子缀合的CPP或如权利要求7所述的经修饰的细胞在制造药剂或诊断剂中的用途。

9.如权利要求1所述的CPP、如权利要求4所述的与感兴趣的分子缀合的CPP或如权利要求7所述的经修饰的细胞作为药剂或诊断剂中的用途。

10.一种试剂盒，其包括(i)如权利要求1所述的CPP，如权利要求4所述的与感兴趣的分子缀合的CPP或如权利要求7所述的经修饰的细胞；和(ii)使用说明书。