CN120392995A - 利用预先存在的微生物免疫的癌症治疗 - Google Patents

利用预先存在的微生物免疫的癌症治疗

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Abstract

提供了利用预先存在的微生物免疫的癌症治疗。本申请涉及用于重导向个体中预先存在的免疫应答以减少或稳定个体中癌症的方法、组合物和试剂盒。

Description

利用预先存在的微生物免疫的癌症治疗
本申请是申请日2018年11月6日，申请号：201880071646.5，发明名称“利用预先存在的微生物免疫的癌症治疗”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及免疫学和癌症疗法，包括用于将患者的存在的免疫应答导向到癌症的方法、组合物和试剂盒。
背景技术
在健康个体中，持久性无症状病毒感染通常由细胞介导的免疫和/或体液免疫控制，但在免疫受损的个体中可以重新激活。细胞介导的针对一些慢性病毒感染的免疫随着年龄而增加，并导致了许多全功能性病毒特异性T细胞的诱导。巨细胞病毒(CMV)是一种β疱疹病毒，其在全球范围内高度流行(感染50-90%的人口)，并且在健康个体中通常无症状。CMV建立了终身持续感染，其需要长期的细胞免疫以防止疾病。因此，CMV重新激活在免疫抑制的情况下(例如在造血干细胞移植中)是一种威胁。在免疫活性个体中，针对CMV的CD4和CD8 T细胞应答表现出针对多种CMV抗原的广泛反应性和高强度，在普通人群中高度普遍，并且随着年龄而增加(M. Bajwa et al., J Infect Dis 215, 1212-20 (2017))。记忆膨胀(memory inflation)是持续性巨细胞病毒感染的标志，已在人类中进行了广泛研究。CMV特异性CD8+ T细胞应答可以分为两种类型，取决于它们是否随时间扩增(膨胀性)或在原发感染消退后保持静止(非膨胀性) (G. A. O'Hara, Trends Immunol 33:84-90 (2012))。在持续性CMV感染期间，抗原的性质和抗原表达的模式导致具有记忆表型(非膨胀性)或效应物表型(膨胀性)的CD8+ T细胞。小鼠CMV感染也通过诱导模仿人类中针对CMV的免疫应答的免疫应答来建立终身持续感染(Id)。
抗肿瘤T细胞应答的诱导在开发针对癌症的有效免疫疗法中至关重要。仅一部分癌症患者对当前的免疫疗法响应。产生针对癌症抗原的T细胞免疫通常需要高度个性化的方法或依赖于预先存在的抗癌T细胞。在癌症患者中，特别是在老年人中，也难以产生有力的新生T细胞免疫。个性化方法依赖于针对肿瘤相关抗原、新抗原(即突变的自身抗原)或病毒癌蛋白的疫苗。其他方法基于嵌合抗原受体转导的T细胞的过继转移或单克隆抗体的输注，所述单克隆抗体需要费力地鉴定肿瘤特异性抗原，并且仅适用于一部分癌症类型或亚型。最后，离体扩增的肿瘤特异性淋巴细胞的过继转移是一种旨在利用天然存在的抗肿瘤应答的方法。所有这些方法都是高度个性化的，并需要鉴定肿瘤表位和/或患者自体细胞的离体扩增。
平行地，已经使用了基于细胞因子或TLR配体的原位肿瘤免疫疗法，但它们主要靶向先天免疫识别机制以改变肿瘤免疫微环境，从而触发免疫原性癌细胞死亡并促进抗原表位扩散。
因此，仍然需要一种简单、广泛适用的、抗原不可知的免疫疗法方法，以分别通过直接杀伤和促进表位扩散来利用免疫系统在早期和长期癌症控制中的作用。
发明内容
本发明人已经认识到，多年来发展以强烈控制衰老的人中的慢性病毒感染的复杂的适应性细胞介导的免疫是有效控制肿瘤生长的细胞介导的免疫的类型。为了利用这种类型的抗病毒免疫来治疗癌症，发明人开发了一种新的原位免疫疗法的方法，通过使用嗜肿瘤性(tumor-tropic)乳头瘤病毒假病毒体或通过原位注射最低限度的病毒CD8和CD4 T细胞巨细胞病毒(CMV)表位，直接用高功能性预先存在的抗病毒T细胞靶向肿瘤环境进行。病毒表位在肿瘤环境中的呈现导致病毒抗原特异性T细胞的原位募集和激活，从而导致其它情况下病毒阴性肿瘤细胞的杀伤和肿瘤微环境中的改变。这种方法响应了未满足的需求，因为它通过促进和建立早期和长期癌细胞杀伤和表位扩散两者来满足了成功免疫疗法的所有标准。
因此，本公开内容提供了治疗个体中的癌症的方法，其通过将预先存在的免疫应答募集到癌症的部位，从而治疗癌症来进行。预先存在的免疫应答可以是诊断为癌症前个体中存在的免疫记忆应答。预先存在的免疫应答可以是天然存在的预先存在的免疫应答。
在这些方法中，将预先存在的免疫应答募集到癌细胞可以包括在治疗开始之前将不由癌细胞表达的抗原引入到癌症中，其中抗原由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别。
这些方法可以包括在将抗原引入到肿瘤中之前，确认个体具有针对抗原的预先存在的免疫应答。这些方法还可以包括评估个体针对抗原的预先存在的免疫应答。在这些方法中，确认预先存在的免疫应答的存在可以包括在来自个体的样品中鉴定针对抗原的T细胞应答。
在这些方法中，引入抗原可以包括将抗原注射到癌症中。另外地或替代地，引入抗原可以通过将编码抗原的核酸分子引入到癌症中来完成。在这些方法中，核酸分子可以是DNA或RNA。对于RNA的使用，RNA可以经修饰，使得其对降解更具抗性。可以通过注射将核酸分子引入到癌症细胞中。另外地或替代地，可以使用病毒载体或假病毒体如乳头瘤病毒假病毒体将核酸分子引入到癌症中。
在这些方法中，抗原可以是病毒抗原。例如，抗原可以是包含来自巨细胞病毒(CMV)蛋白的至少一个表位的多肽，其由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别。在这些方法中，CMV蛋白可以选自下组：pp50、pp65、pp150、IE-1、IE-2、gB、US2、US6、UL16和UL18。多肽可以是9-15聚体的MHC I限制性肽。另外地或替代地，多肽可以是至少15聚体的MHC II限制性肽。另外地或替代地，抗原包含与选自SEQ ID NO: 1-67的序列的序列至少90%相同的序列。在这些方法中，免疫应答的一种或多种组分可以是T细胞。
在这些方法中，预先存在的免疫应答的募集可以改变癌症的微环境。
在这些方法中，抗原可以与增强免疫应答的试剂组合施用。示例性试剂包括选自以下的试剂：TLR激动剂；IL-1R8细胞因子拮抗剂；静脉内免疫球蛋白(IVIG)；从革兰氏阳性细菌分离的肽聚糖；从革兰氏阳性细菌分离的脂磷壁酸；从革兰氏阳性细菌分离的脂蛋白；从分枝杆菌分离的脂质阿拉伯甘露聚糖，从酵母细胞壁分离的酵母聚糖；聚腺苷酸-聚尿苷酸；聚(IC) (poly (IC))；脂多糖；单磷酰脂质A；鞭毛蛋白；嘎德莫特(Gardiquimod)；咪喹莫特(Imiquimod)；R848；含有CpG基序的寡核苷、CD40激动剂和23S核糖体RNA。在示例性方法中，抗原可以与聚-IC组合施用。
另一方面提供了用于测试患者并在患者中将预先存在的免疫应答募集到癌症的部位的试剂盒。这些试剂盒可以包括至少一种CMV肽抗原或编码肽的核酸、药学上可接受的载体、容器以及指示CMV肽的施用的包装插页或标签，所述试剂盒用于减少患者中癌症的至少一种症状。
本发明内容既无意也不应解释为代表本发明的全部程度和范围。此外，本文中对“本公开内容”或其各个方面的引用应理解为表示本发明的某些实施方案，而不应必然解释为将所有实施方案限制为特定的描述。在本发明内容以及附图和具体实施方式中以各种详细程度阐述了本公开内容，并且在此发明内容中不意图通过包括或不包括要素、组成部分等限制本公开内容的范围。从具体实施方式中，特别是当与附图一起使用时，本发明的其他方面将变得明显。
附图说明
图1A显示鼠巨细胞病毒(mCMV)感染诱导针对mCMV肽库(peptide pool)的大规模细胞因子应答。图1B显示在用指示的MHC-I和MHC-II限制性mCMV肽进行肽再刺激后，脾CD4+和CD8+ T细胞的IFN-gamma产生。
图2A显示用于用表达mCMV抗原的HPV Psv进行实体瘤的肿瘤内转导的注射方案。图2B和2C分别显示肿瘤内注射表达m122和m45的HPV16 Psv或表达红色荧光蛋白(RFP)的HPV Psv后的肿瘤体积。
图3A描绘了用于用与聚(I:C)(PIC)组合的表达mCMV抗原的HPV Psv进行实体瘤的肿瘤内转导的注射方案。图3B-3E显示这种肿瘤内转导方案减慢了肿瘤生长。图3F和3G显示通过MHC-I四聚体染色和FACS分析的E7、m45和m122特异性CD8+ T细胞对肿瘤的浸润。
图4A显示对生存的影响，并且图4B显示感染鼠巨细胞病毒(mCMV)的C57Bl/6小鼠中肿瘤内注射MCMV MHC-I限制性肽后对肿瘤生长的影响。
图5显示不同剂量的mCMV MHC-I限制性肽肿瘤内注射对感染鼠巨细胞病毒(mCMV)的C57Bl/6小鼠中肿瘤生长的影响。
图6A和6B显示肿瘤内注射mCMV MHC-I和MHC-II限制性肽的组合对感染mCMV的C57Bl/6小鼠中肿瘤生长的影响。图6C显示如通过对每种肽使用MHC-I四聚体进行的FACS所分析的，血液中的E7、m45、m122特异性CD8+ T细胞应答，证明了用mCMV CD4，然后用CD8表位进行顺序肿瘤内接种优先诱导抗肿瘤免疫。
图7显示了完全清除原发性肿瘤对针对继发性肿瘤攻击的长期保护的影响。
图8显示mCMV感染诱导C57Bl/6小鼠中膨胀性CD8+ T细胞应答。
图9A显示膨胀性和非膨胀性CD8+ T细胞产生IFN-γ以及CD4+ T细胞产生IFN-γ。图9B显示针对MHC-I限制性肽库由mCMV CD8+ T细胞的细胞因子产生。
图10A显示用于肿瘤内施用mCMV肽的小鼠TC1肿瘤模型的实验方案时机。图10B和10C显示mCMV特异性CD8+ T细胞在荷瘤小鼠中的分布。使用MHC-I四聚体染色通过FACS检测了膨胀性(IE3；图10B)和非膨胀性(m45；图10C)特异性CD8+ T细胞。
图11A显示用于肿瘤微环境的基因表达分析的小鼠TC1肿瘤模型的实验方案时机。图11B-11F显示肿瘤内治疗后CD45+细胞(图11B)、Th1细胞(图11C)、细胞毒性CD8 T细胞(图11D)、NK细胞(图11E)或树突细胞(图11F)的肿瘤浸润。
图12A和12B显示肿瘤内注射mCMV CD8表位延迟了肿瘤生长。聚(I:C)共注射改善了肿瘤控制。图12A显示肿瘤内注射单独的MHC-I限制性mCMV肽+/-聚(I:C)的作用。图12B显示肿瘤内注射MHC-I限制性mCMV肽滴定的作用。
图13A和13B显示通过肿瘤内注射mCMV MHC-I和/或MHC-II肽与聚(I:C)提供保护而免受TC1肿瘤攻击。用CD4，然后用CD8 MCMV表位的顺序肿瘤内接种抑制肿瘤生长(图13A)并促进长期生存(图13B)。
图14显示在有或没有聚(I:C) (30ug)的情况下用MHC-I限制性选择的m38、m45和m122肽和/或MHC-II限制性m139选择的肽和作为对照的盐水或单独的聚(I:C)处理6次后血液中的E7四聚体阳性CD8+ T细胞应答。
图15显示完全清除原发性肿瘤赋予长期针对继发性肿瘤攻击的保护。
图16显示通过肿瘤内注射mCMV MHC-I和MHC-II肽与聚(I:C)提供保护而免受MC38肿瘤攻击。
具体实施方式
本发明涉及治疗癌症的新方法。具体而言，本发明涉及利用个体自身的免疫系统攻击癌细胞的治疗个体中癌症的方法。该方法利用以下事实：个体具有预先存在的免疫应答，该免疫应答最初不是响应癌症而引发的，而是由环境中的微生物引发的。因为癌细胞通常不表达引起预先存在的免疫应答的微生物抗原，所以不能预期此类免疫应答会攻击癌症。然而，发明人发现可以募集此类预先存在的免疫应答来攻击癌症。可以实现这点的一种方法是，通过将一种或多种由预先存在的免疫应答识别的抗原引入到癌症中，从而导致免疫应答的细胞攻击展示抗原的癌细胞。因此，这些方法不针对在治疗癌症患者之前表达抗原的癌细胞。例如，发现许多胶质母细胞瘤癌细胞表达CMV抗原，而本公开内容的方法将不用于使用个体针对CMV的预先存在的免疫治疗此类胶质母细胞瘤。此外，癌细胞的破坏可以导致预先存在的免疫应答的组分暴露于癌细胞抗原。这可以导致引发针对癌细胞抗原的免疫应答。因此，本发明的一般方法可以通过将个体中预先存在的免疫应答募集到癌症的部位，从而使得预先存在的免疫应答攻击癌症来实践。例如，可以通过将至少一种由个体的预先存在的免疫应答的组分(例如T细胞)识别的抗原引入到癌症中来实现募集。
本发明不限于本文描述的特定实施方案，因为它们可以变化。本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限制。
如本文中以及所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示对象。例如，核酸分子是指一个或多个核酸分子。因此，术语“一个”、“一种”，“一个或多个”和“至少一个”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。还应注意，权利要求书可以撰写为排除任何可选要素。因此，该陈述旨在充当先行基础以就权利要求元素的叙述而言使用排他性术语如“唯一地”、“仅”等或使用“负”限制。
在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。实施方案的所有组合都被本发明明确地涵盖，并且就好像每个组合都被单独地并且明确地公开了一样地在本文中公开。另外，所有子组合也被本发明明确地涵盖并且就像每个此类子组合在本文中被单独地并且明确地公开一样地在本文中公开。
本文讨论的出版物仅提供其在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立确认。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
一方面是一种治疗个体中癌症的方法，其包括将预先存在的免疫应答募集到癌症，从而治疗癌症。
如本文所用，癌症是指其中异常细胞分裂而没有适当控制细胞分裂和/或细胞衰老的疾病。术语癌症意在涵盖实体瘤以及血源性癌症。通常，肿瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(不危及生命)或恶性的(危及生命)。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的实例包括肉瘤、癌和淋巴瘤。血液癌(也称为血液学癌症)是始于血液形成组织(如骨髓)或免疫系统的细胞中的癌症。血液癌的实例包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些癌症中，细胞可以侵袭除原始癌细胞起源的组织以外的组织。在一些癌症中，癌细胞可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。因此，癌症通常以其开始的器官或细胞类型来命名。例如，起源于结肠的癌症称为结肠癌；起源于皮肤的黑色素细胞的癌症称为黑色素瘤等。如本文所用，癌症可以指癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体和淋巴样癌，胃(gastric)癌，肾癌，乳腺癌，肺癌(包括非小细胞和小细胞肺癌)，膀胱癌，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，胃(stomach)癌，脑癌，头颈癌，皮肤癌，子宫癌，睾丸癌，食道癌，肝癌(liver cancer)(包括肝癌(hepatocarcinoma))，淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特氏、小细胞和大细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤，白血病和多发性骨髓瘤。在示例性的实施方案中，癌症是肺癌或腺癌。
如本文所用，术语个体、受试者、患者等旨在涵盖能够形成癌症的任何哺乳动物，其中优选的哺乳动物是人。术语个体、受试者和患者本身并不表示特定的年龄、性别、种族等。因此，本公开内容意图涵盖任何年龄、无论男性或女性的个体。同样，本发明的方法可以应用于任何人的种族，包括例如高加索人(白人)、非裔美国人(黑人)、美洲原住民、夏威夷原住民、西班牙裔、拉丁美洲人、亚洲人和欧洲人。此类特征可能是重要的。在此类情况下，将指出重要的特征(例如年龄、性别、种族等)。这些术语也涵盖人和非人动物两者。测试或治疗癌症的合适的非人动物包括但不限于伴侣动物(即宠物)、食用动物、工作动物或动物园动物。
如本文所用，免疫或免疫学应答是指个体中针对一种或多种抗原的体液和/或细胞应答的存在。为了本公开内容的目的，“体液应答”是指由B细胞和抗体分子(包括分泌性(IgA)或IgG分子)介导的免疫应答，而“细胞应答”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T细胞(CTL)的抗原特异性应答。CTL对肽抗原具有特异性，该肽抗原与由细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)编码的蛋白质缔合呈递。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的破坏，或裂解由此类微生物感染的细胞。细胞免疫的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞发挥作用以帮助刺激针对下述细胞的非特异性效应细胞的功能并聚焦该非特异性效应细胞的活性，所述细胞在其表面上展示与MHC分子缔合的肽抗原。细胞免疫应答还指由活化的T细胞和/或其他白细胞(包括衍生自CD4+和CD8+ T细胞的那些)产生的细胞因子、趋化因子和其他此类分子的产生。
因此，免疫学应答可以是刺激CTL，和/或辅助T细胞的产生或活化的应答。还可以刺激趋化因子和/或细胞因子的产生。免疫应答也可以包含抗体介导的免疫应答。因此，免疫学应答可以包括以下作用的一种或多种：B细胞产生抗体(例如IgA或IgG)；和/或抑制性、细胞毒性或辅助T细胞和/或特异性针对抗原的T细胞的活化。可以使用本领域已知的标准免疫测定法和中和测定法来确定此类应答。
如本文所用，预先存在的免疫应答是在癌症治疗开始之前存在于个体中的免疫应答。因此，在使用抗原治疗癌症的治疗开始之前，具有预先存在的免疫应答的个体具有针对抗原的免疫应答。预先存在的免疫应答可以是天然存在的免疫应答，或者其可以是诱导的免疫应答。如本文所用，天然存在的预先存在的免疫应答是响应于个体无意间接触的抗原(如细菌或病毒抗原)所引起的个体中的免疫应答。也就是说，具有预先存在的免疫应答的个体没有故意暴露于抗原以生成针对抗原的免疫应答。诱导的预先存在的免疫应答是由于有意暴露于抗原(如接受疫苗时)而产生的免疫应答。预先存在的免疫应答可以是天然存在的免疫应答，或者预先存在的免疫应答可以是诱导的免疫应答。
如本文所用，短语“募集免疫应答”是指以下过程，其中将抗原施用于个体，使得预先存在的免疫应答的组分通过身体行进至施用抗原的位置，从而导致通过免疫系统组分攻击展示抗原的细胞。如本文所用，“免疫应答的组分”是指可以结合抗原并启动针对抗原的免疫应答的细胞。可用于实践本发明的抗原是可以由预先存在的免疫系统的细胞(特别是T细胞)识别的任何分子。此类化合物的一个实例是蛋白质，如细菌或病毒蛋白质。
如本文所用，短语“治疗癌症”是指关于癌症的各种结果。治疗癌症包括降低经治疗的个体中癌细胞的数量的增加速率。此类增加速率的降低可以是由于癌细胞复制的减慢。或者，癌细胞的复制速率可以不受影响，可以通过预先存在的免疫应答杀伤增加数量的癌细胞。在某些方面，治疗癌症是指癌细胞的数量停止增加但保持在恒定水平的情况。此类情况可以由于通过募集预先存在的免疫应答而抑制癌细胞复制引起，或者它可以是由于通过募集的预先存在的免疫应答进行癌细胞杀伤的速率平衡了新癌细胞的产生速率。治疗癌症是指使癌症稳定，使得癌症的生长减少或停止，或在经治疗的个体和/或无癌症的个体(即，没有可检测到的癌细胞)中减少癌细胞的数量。
在实施方案中，募集预先存在的免疫应答的步骤包括将由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别的抗原引入到癌症中。在优选的实施方案中，抗原在治疗之前不存在于癌症中。因此，一个实施方案是一种治疗个体中癌症的方法，其包括通过将由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别的抗原引入癌症来将预先存在的免疫应答募集到癌症，其中该抗原在治疗癌症之前不存在于癌症中。因此，如上所述，预先存在的免疫应答可以是天然存在的免疫应答或诱导的免疫应答。可以使用本领域已知的方法将抗原引入癌症，并且可以根据所治疗的癌症的类型而变化。例如，一种类型的癌症是实体瘤。在此类癌症中，癌细胞复制并保持与其亲本癌细胞相邻，从而导致由相邻癌细胞形成的组织块的形成。由于此类癌症是细胞块，因此抗原可以直接递送至团块或递送到团块中。一个实施方案是治疗个体中癌症的方法，其中癌症是实体瘤，包括通过将由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别的抗原引入实体瘤来将预先存在的免疫应答募集到实体瘤，其中抗原在治疗前不存在于实体瘤中。在一个实施方案中，预先存在的免疫应答是天然存在的免疫应答。在一个实施方案中，预先存在的免疫应答是诱导的免疫应答。在一个实施方案中，通过将抗原注射到癌症(例如实体瘤)中来将抗原递送至癌症(例如实体瘤)。在此类实施方案中，将抗原直接递送到癌症中，通过直接结合此类分子或通过癌细胞对抗原的摄取和加工，从而允许抗原展示在细胞的MHC I分子上。在这些方法中，抗原可以与增强抗原的摄取和/或抗原对免疫系统的呈递的其他分子或化合物组合。
如前所述，在这些方法中，抗原可以是蛋白质。如上所述，这些蛋白质抗原可以直接注射到癌症(例如肿瘤)中。因此，一个实施方案是治疗个体中癌症的方法，其中癌症是实体瘤，包括通过用抗原性蛋白质注射实体瘤来将预先存在的免疫应答募集到实体瘤，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于实体瘤中。或者，可以通过将编码蛋白质的核酸分子引入到癌症中来将蛋白质抗原引入癌症。因此，一个实施方案是治疗个体中癌症的方法，其中癌症是实体瘤，包括通过将编码抗原性蛋白质的核酸分子引入实体瘤来将预先存在的免疫应答募集到实体瘤，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于实体瘤中。可以使用本领域已知的任何合适的方法将编码抗原的核酸分子引入癌症。一个实施方案是治疗个体中癌症的方法，其中癌症是实体瘤，包括通过将编码抗原性蛋白质的核酸分子注射到实体瘤中来将预先存在的免疫应答募集到实体瘤，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于实体瘤中。在这些方法中，可以将编码抗原的核酸分子作为裸露的核酸分子(即，不与旨在增强核酸分子的稳定性的递送的其他分子复合的核酸分子)进行注射或者注射的编码抗原的核酸分子可以与一种或多种旨在增强核酸分子的递送、稳定性或寿命的化合物复合。此类化合物的实例包括脂质、蛋白质、碳水化合物和聚合物，包括合成聚合物。
也可以使用递送媒介物如重组病毒或假病毒(假病毒体)将编码一种以上抗原的核酸分子引入癌症。可用于实践本发明的方法的病毒的实例包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和乳头瘤病毒。此类病毒用于递送核酸分子的使用是本领域技术人员已知的，并且也公开于美国专利号8,394,411中，其通过引用并入本文。可用于实践本发明的方法的假病毒的实例包括但不限于肝炎假病毒、流感假病毒和乳头状瘤假病毒。如本文所用，假病毒是指包含装配成病毒样颗粒(VLP)的病毒衣壳蛋白的颗粒，其能够结合并进入癌细胞。此类假病毒体可以但优选不包装亚基因组量的病毒核酸分子。生产和使用假病毒体的方法在本领域中是已知的，并且还描述在美国专利号6,599,739；7,205,126；和6,416,945中，其全部以其整体通过引用并入本文。因此，本公开内容提供了治疗个体中癌症的方法，其中癌症是实体瘤，包括通过将包含编码抗原性蛋白质的核酸分子的重组病毒或假病毒引入肿瘤来将预先存在的免疫应答募集到实体瘤，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于实体瘤中。携带本公开内容的核酸分子的假病毒进入细胞导致细胞表达编码的抗原性蛋白质，并随后将抗原展示给免疫系统。在这些方法中，假病毒是乳头状瘤假病毒。
可以使用本领域已知的任何合适的方法来实现将包含编码抗原的核酸分子的病毒或假病毒引入癌症。例如，可以将包含编码抗原的核酸分子的重组病毒或假病毒注射到癌症附近或直接注射到癌症中。或者，可以通过导致将重组病毒或假病毒递送至癌症的途径，将包含编码抗原的核酸分子的重组病毒或假病毒施用于个体。此类途径的实例包括但不限于静脉内(IV)注射、肌内(IM)注射、腹膜内(IP)注射、皮下(SC)注射和口服递送。因此，一个实施方案是治疗个体中癌症的方法，包括将包含编码抗原性蛋白质的核酸分子的重组病毒或假病毒施用于个体，其中癌症是实体瘤，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于实体瘤中。在这些方法中，可以将重组病毒或假病毒直接注射到实体瘤中，或者可以使用选自IV注射、IM注射、IP注射、SC注射和口服递送的方法递送重组病毒或假病毒。
本公开内容的方法可以用于治疗血源性癌症。血源性癌症、血液癌、血液学癌症等开始于血液形成组织(如骨髓)或免疫系统的细胞中。血液癌的实例包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。当血液形成组织的细胞或免疫系统的细胞失去对细胞复制的控制并开始以不受控制的方式复制时，此类癌症就开始了。血液癌细胞一旦形成，便可以进入血液或淋巴系统，从而导致血液和/或淋巴系统中癌细胞的数量显著增加。例如，白血病是在血液和骨髓中发现的癌症。白血病由于白细胞的不受控制的复制而引起，导致血液和淋巴组织中异常白细胞的数量大大增加。这些异常的白细胞无法正常发挥功能，并因此患有白血病的个体不能抵抗感染。因此，本公开内容提供了治疗个体中血液学癌症的方法，包括通过将由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别的抗原引入血液学癌症细胞来在个体中将预先存在的免疫应答募集到血液学癌症细胞，其中抗原在治疗前不存在于血液学癌症细胞中，或血液学癌症细胞上。在这些方法中，预先存在的免疫应答可以是天然存在的免疫应答或诱导的免疫应答。可以使用任何合适的方法进行抗原引入血液学癌症细胞。在这些方法中，可以通过以导致抗原递送至血液学癌症细胞的形式将抗原施用于个体来将抗原引入到血液学癌症细胞中。例如，可以使用选自IV注射、IM注射、IP注射、SC注射和口服施用的方法将抗原施用于个体。在这些方法中，可以例如通过将抗原与结合血液学癌症细胞上的分子的蛋白质接合而将抗原靶向血液学癌症细胞。
也可以通过将编码抗原性蛋白质的核酸分子引入个体中的血液学癌症细胞来将抗原引入血液学癌症细胞。因此，本公开提供了治疗个体中血液学癌症的方法，其包括通过将编码抗原性蛋白质的核酸分子施用于个体来募集针对血液学癌症的预先存在的免疫应答，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于血液学癌症细胞中，或血液学癌症细胞上。可以使用本领域已知的任何合适的方法将编码抗原的核酸分子施用于个体。例如，可以将编码抗原的核酸分子作为裸露的核酸分子进行注射。替代地或另外地，编码抗原的核酸分子可以与一种或多种旨在增强核酸分子的递送、稳定性或寿命的化合物复合。此类化合物的实例包括脂质、蛋白质、碳水化合物和聚合物，包括合成聚合物。
也可以使用递送媒介物如重组病毒或假病毒将编码一种以上抗原的核酸分子引入血液学癌症细胞。此类递送媒介物的实例已在本文前面进行了描述。可用于实践本发明的方法的病毒的实例包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和乳头瘤病毒。可用于实践本发明的方法的假病毒的实例包括但不限于肝炎假病毒、流感假病毒和乳头状瘤假病毒。因此，本公开提供了治疗个体中血液学癌症的方法，包括通过将包含编码抗原性蛋白质的核酸分子的重组病毒或假病毒引入肿瘤来募集针对实体瘤的预先存在的免疫应答，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于血液学癌症细胞中，或血液学癌症细胞上。
可以使用本领域已知的任何合适的方法来实现将包含编码抗原的核酸分子的病毒或假病毒引入癌症。例如，可以通过导致将重组病毒或假病毒递送至癌症的途径，将包含编码抗原的核酸分子的重组病毒或假病毒施用于个体。此类途径的实例包括但不限于静脉内(IV)注射、肌内(IM)注射、腹膜内(IP)注射、皮下(SC)注射和口服施用。因此，本公开内容提供了治疗个体中血液学癌症的方法，包括将包含编码抗原性蛋白质的核酸分子的重组病毒或假病毒施用于个体，其中抗原性蛋白质由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中抗原性蛋白质在治疗前不存在于血液学癌症细胞中，或血液学癌症细胞上。可以使用选自下组的方法递送重组病毒或假病毒：IV注射、IM注射、IP注射、SC注射和口服施用。
本文公开的方法使用一种或多种抗原来将预先存在的免疫应答募集到癌症。可以使用任何抗原，只要该抗原由预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且该抗原在治疗之前不存在于癌细胞中或癌细胞上。有用的抗原的实例包括但不限于病毒和细菌抗原。可用于实践本发明的方法的病毒抗原的一个实例是包含至少一个来自巨细胞病毒蛋白的表位的抗原。如本文所用，表位是由免疫系统识别，从而引发免疫应答的氨基酸残基的簇。此类表位可以由连续的氨基酸残基(即，蛋白质中彼此相邻的氨基酸残基)组成，或者它们可以由非连续的(即，蛋白质中彼此不相邻的氨基酸残基)，但在最终折叠的蛋白质中紧密特别接近的氨基酸残基组成。本领域技术人员通常理解，表位需要最少六个氨基酸残基以被免疫系统识别。因此，本发明的方法可以包括使用包含至少一个来自巨细胞病毒蛋白的表位的抗原。任何合适的CMV蛋白都可以用于产生可用于实施实践本发明的方法的抗原，只要该抗原将预先存在的免疫应答募集到癌症。适用于本文公开的方法的CMV蛋白的实例包括但不限于CMV pp50、CMV pp65、CMV pp150、CMV IE-1、CMV IE-2、CMV gB、CMV US2、CMVUL16和CMV UL18。此类蛋白质及其有用片段的实例公开于美国专利公开号2005/00193344和2010/0183647中，两者均以其整体通过引用并入本文。有用的片段还可以包括包含SEQID NO: 1-67的氨基酸序列的肽的任何一种或组合。
还可以使用一种或多种抗原来实践公开的方法，每种抗原独立地包含作为来自CMV蛋白的至少8个连续氨基酸序列的变体的氨基酸序列。如本文所用，变体是指蛋白质或核酸分子，其序列与参考序列相似但不相同，其中变体蛋白质(或由变体核酸分子编码的蛋白质)的活性(例如免疫原性)没有明显改变。这些序列变异可以是天然存在的变异，或者它们可以使用本领域技术人员已知的遗传工程技术进行工程化改造。此类技术的实例可见于Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., 于Molecular Cloning-A LaboratoryManual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第9.31-9.57页或Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),6.3.1-6.3.6中。
关于变体，氨基酸序列的任何类型的改变都是允许的，只要所得的变体蛋白质保留引起免疫应答的能力即可。此类变异的实例包括但不限于缺失、插入、取代及其组合。例如，对于蛋白质，本领域技术人员众所周知，通常可以将一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸从蛋白质的氨基和/或羧基末端去除而不显著影响该蛋白质的活性。类似地，通常可以将一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸插入到蛋白质中而不显著影响该蛋白质的活性。
如所述，相对于参考蛋白质(例如，野生型蛋白质)，变体蛋白质可以含有氨基酸取代。任何氨基酸取代都是允许的，只要不显著影响蛋白质的活性。就这点而言，在本领域中可以理解，可以基于氨基酸的物理性质对氨基酸进行分类。此类组的实例包括但不限于带电荷的氨基酸、不带电荷的氨基酸、极性的不带电荷的氨基酸和疏水性氨基酸。含有取代的优选变体是其中用来自相同组的氨基酸取代氨基酸的那些。此类取代称为保守取代。
天然存在的残基可以基于共同的侧链特性分类：1) 疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；2) 中性亲水性：Cys、Ser、Thr；3) 酸性：Asp、Glu；4) 碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；5)影响链定向的残基：Gly、Pro；and 6) 芳香：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可以涉及将这些类别之一的成员交换为来自另一类别的成员。
在进行氨基酸改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。每个氨基酸都基于其疏水性和电荷特性指定亲水指数。亲水指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。本领域通常理解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物学功能中的重要性(Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31)。已知可以用某些氨基酸取代具有相似的亲水指数或得分的其他氨基酸，并且仍然保留相似的生物学活性。在基于亲水指数进行改变时，亲水指数在±2之内的氨基酸的取代是优选的，在±1之内的氨基酸的取代是特别优选的，并且在±0.5之内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。
在本领域中还应理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物学功能上等效的蛋白质或肽意图用于免疫学发明中的情况下，如在本案中。蛋白质的最大局部平均亲水性(受其相邻氨基酸的亲水性控制)与其免疫原性和抗原性，即与蛋白质的生物学特性相关。以下亲水性值已分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；以及色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，亲水性值在±2之内的氨基酸的取代是优选的，在±1之内的氨基酸的取代是特别优选的，并且在±0.5之内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。也可以基于亲水性从一级氨基酸序列中鉴定表位。
期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员在期望此类取代时确定。例如，氨基酸取代可以用于鉴定蛋白质的重要残基，或用于增加或降低蛋白质的免疫原性、溶解性或稳定性。示例性氨基酸取代显示于下表中：
如本文所用，短语“显著影响蛋白质活性”是指蛋白质活性降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%。关于本发明，此类活性可以例如作为蛋白质引起中和抗体或引起T细胞应答的能力来测量。确定此类活性的方法是本领域技术人员已知的。
本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其各自独立地包含来自CMV蛋白的至少6个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸或至少100个连续氨基酸。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其各自独立地包含与来自CMV蛋白的至少10个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸或至少100个连续氨基酸至少85%相同、至少95%相同、至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其各自独立地包含来自CMV蛋白的至少6个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸或至少100个连续氨基酸。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其各自独立地包含与来自CMV蛋白的9至15个连续氨基酸残基至少95%相同、至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列，其中抗原是MHC I限制性抗原。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其各自独立地包含来自CMV蛋白的9至15个连续氨基酸残基，其中抗原是MHC I限制性抗原。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其包含与来自CMV蛋白的至少15个连续氨基酸残基至少95%相同、至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列，其中抗原是MHC II限制性抗原。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其包含来自CMV蛋白的至少15个连续氨基酸残基，其中抗原是MHC II限制性抗原。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其包含与由选自下组的序列组成的肽至少95%相同、至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列：包含SEQ ID NO: 1-67的氨基酸序列的肽或其任何组合。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其由与选自下组的序列至少95%相同、至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列组成：包含SEQ ID NO: 1-67的氨基酸序列的肽或其任何组合。本公开内容的方法可以使用一种或多种抗原，其由选自下组的序列组成：包含SEQ IDNO: 1-67的氨基酸序列的肽或其任何组合。
本发明的方法包括对个体治疗癌症，其通过将预先存在的免疫应答募集到癌症来进行。在这些方法中，可以已知在癌症治疗开始之前个体具有针对抗原的预先存在的免疫应答。在开始癌症治疗之前，可以对个体进行测试以确认预先存在的免疫应答的存在。因此，这些方法可以包括通过确认个体具有针对抗原的预先存在的免疫应答来治疗个体中的癌症，其中该抗原不存在于癌症中或癌症上。然后将抗原施用于确认具有预先存在的免疫的个体，使得将抗原引入癌症，从而治疗癌症。
此类方法可以用于治疗本文已经描述的任何癌症，包括任何实体瘤和/或血液学癌症。
确认待治疗的个体具有针对抗原的预先存在的免疫应答的任何方法都可以用于实践本发明的方法。此类方法的实例包括在来自个体的样品中鉴定识别特定抗原的B细胞，识别特定抗原的抗体，识别特定抗原的T细胞或响应于特定抗原启动的T细胞活性。来自个体的任何合适的样品可以用于鉴定预先存在的免疫应答。合适样品的实例包括但不限于全血、血清、血浆和组织样品。如本文所用，B细胞、T细胞或抗体识别特定抗原是指此类B细胞、T细胞或抗体特异性结合抗原的能力。B细胞、T细胞或抗体对抗原的特异性结合是指B细胞、T细胞或抗体以大于相同B细胞、T细胞或抗体对于与抗原不相关的分子的结合亲和力的亲和力与特异性抗原结合。例如，识别来自CMV pp50蛋白的抗原或对来自CMV pp50蛋白的抗原具有特异性的B细胞、T细胞或抗体以显著大于相同B细胞、T细胞或抗体对于与CMV pp50蛋白不相关的蛋白(如人白蛋白)的结合亲和力的亲和力结合CMV pp50抗原。两个实体之间的特异性结合可以通过其解离常数来科学地表示，该解离常数通常小于约10-6，小于约10-7或小于约10-8 M。分子之间以及细胞和分子之间的特异性结合的概念和测量此类结合的方法是本领域普通技术人员众所周知的，包括但不限于酶免疫测定法(例如ELISA)、免疫沉淀、免疫印迹测定法和其他免疫测定法，如例如Sambrook et al., 见上文, 和Harlow etal., Antibodies, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988)中所述。此类方法也描述于美国专利号7,172,873，其通过引用并入本文。测量来自个体的样品中的T细胞活化的方法也是本领域技术人员已知的。此类方法的实例公开于美国专利公开号2003/003485和美国专利号5,750,356中，两者通过引用并入本文。
此类方法通常包括使来自个体的含有T细胞的样品与抗原接触，并测量样品的T细胞活化。测量T细胞活化的方法在本领域中也是众所周知的，并且还公开于Walker, S., etal., Transplant Infectious Disease, 2007:9:165-70；和Kotton, C.N. et al.(2013) Transplantation 96, 333中。
商业上可获得的CMV测试(QuantiFERON™-CMV, QIAGEN Sciences Inc.,Germantown, MD)可用作体外诊断测试，其使用模拟人巨细胞病毒蛋白(CMV)的肽混合物刺激肝素化全血中的细胞进行。暴露于疾病/感染的个体在其血液中具有特定的T细胞淋巴细胞，它们维持针对引发中的疾病/感染的抗原(免疫反应分子)的免疫记忆。向从经引发的个体收集的血液中添加抗原导致抗原特异性效应T细胞的快速再刺激，从而导致细胞因子(例如IFN-γ)的释放。暴露于引发抗原时，效应T细胞能够快速应答。因此，响应于抗原暴露的IFN-γ的产生是针对该抗原的细胞免疫应答的特异性标志物。该IFN-γ应答可以用于定量免疫应答。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测干扰素-gamma(IFN-γ)用于鉴定针对与CMV感染相关的肽抗原的体外应答。QuantiFERON™-CMV的意图用途是监测人的抗CMV免疫水平。
因此，在本公开内容的用于治疗个体中癌症的任何方法中，可以首先确认个体具有针对不存在于癌症中或癌症上的抗原的预先存在的免疫应答。这种预先存在的免疫应答可以通过在来自个体的样品中鉴定以下各项来确认：
i) 识别特定抗原的B细胞；
ii) 识别特定抗原的抗体；
iii) 识别特定抗原的T细胞；和，
iv) 响应于特定抗原而启动的T细胞活性。
然后可以将特定抗原施用于确认具有预先存在的免疫应答的个体，使得将抗原引入癌症，从而治疗癌症。
在本公开内容中提供的任何方法中，可以与CMV抗原组合使用(即，施用)其他试剂，在本发明的实践内以增强免疫调控或募集。此类其他试剂包括TLR激动剂；静脉内免疫球蛋白(IVIG)；从革兰氏阳性细菌分离的肽聚糖；从革兰氏阳性细菌分离的脂磷壁酸；从革兰氏阳性细菌分离的脂蛋白；从分枝杆菌分离的脂质阿拉伯甘露聚糖，从酵母细胞壁分离的酵母聚糖；聚腺苷酸-聚尿苷酸；聚(IC)；脂多糖；单磷酰脂质A；鞭毛蛋白；嘎德莫特(Gardiquimod)；咪喹莫特(Imiquimod)；R848；含有CpG基序的寡核苷、CD40激动剂和23S核糖体RNA。在这些方法的优选方面，TLR激动剂是聚-IC。
本公开内容的另一方面是用于测试个体并在个体中将预先存在的免疫应答募集到癌症的试剂盒。试剂盒可以包含至少一种CMV肽抗原或编码肽的核酸、药学上可接受的载体、容器以及指示CMV肽的施用以减少患者中癌症的至少一种症状的包装插页或标签。这些试剂盒可以进一步包括用于测试患者对CMV抗原的抗原性响应的手段(means)。例如，试剂盒可以包括灭菌的塑料制品，用于获取和测试全血样品以及体外测试针对CMV肽抗原的应答和/或通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测干扰素-gamma(IFN-γ)以鉴定针对这些肽抗原的体外应答。
实施例
通常由宿主良好控制的慢性病毒感染，例如人巨细胞病毒(hCMV)，通常随着年龄的增长而导致诱导越来越多的全功能性病毒特异性T细胞。使用模仿针对hCMV的人免疫应答的关键方面的小鼠mCMV模型，本发明人开发了将这些抗病毒T细胞吸引至肿瘤，随后杀伤肿瘤细胞并诱导向肿瘤新抗原的有力表位扩散的方法和试剂，所述表位扩散导致适应性免疫应答，其赋予肿瘤生长的长期控制并提供保护而免受同源肿瘤细胞的再攻击。
实施例1
鼠巨细胞病毒感染诱导针对mCMV肽库的细胞因子应答
用1x10^4 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后第12天收集血液样品。用来自m38、m45、m57、m122、1m39、m141和m164 mCMV蛋白的所选择的免疫原性肽的库再刺激血液白细胞。通过细胞内细胞因子染色评价CD8+ T细胞的IFN-gamma、TNF-alpha和IL-2细胞因子产生，并通过荧光激活细胞分选(FACS)进行分析(图1A)。感染后两个月收集血液样品。使用MHC-I四聚体染色通过FACS检测膨胀(m122)和非膨胀(m45)特异性CD8+ T细胞。针对mCMV对记忆CD8+ T细胞应答进行定位。感染后六个月收集脾。通过细胞内细胞因子染色评价在用m38、m45、m122 MHC-I限制性和m139560-574 MHC-II限制性mCMV肽体外刺激后，CD8+和CD4+ T细胞的IFN-gamma产生(图1B)。
实施例2
用表达mCMV抗原的HPV Psv对实体瘤进行肿瘤内转导
用1x10^4 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后六个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠(注射方案，图2A)。使用电子卡尺测量肿瘤生长。肿瘤注射后第13天和第15天，肿瘤内注射表达m122和m45的HPV16 Psv(图2B)或表达红色荧光蛋白(RFP)的HPV Psv(图2C) (每PsV 10^8个感染单位)。
实施例3
用与聚(I:C)组合的mCMV抗原对实体瘤进行肿瘤内转导
用1x10^4 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠(图3A)。在有或没有聚(I:C)(30µg)(PIC)的情况下，在第11天和第13天用表达m122、m38和m45或对照RFP的HPV16，在第16天和第18天用表达m122、m38和m45或对照RFP的HPV45，在第21天和第23天用表达m122、m38和m45或对照RFP的HPV58 (每PsV 10^8个感染单位)对肿瘤进行肿瘤内注射。使用电子卡尺测量肿瘤生长(图3B-3E)。这些肿瘤体积/生长数据表明，用表达mCMV抗原的HPV Psv对实体瘤进行肿瘤内转导减慢了肿瘤的生长，并且与聚(I:C)的共施用进一步减慢了肿瘤生长(比较图3B和3D；并且比较图3C和3E)。通过MHC-I四聚体染色和FACS分析了E7(图3F)、m45和m122(图3G)特异性CD8+ T细胞对肿瘤的浸润。这些数据表明，当这些CMV抗原与聚(IC)组合施用时，CD8+ T细胞的肿瘤浸润显著增强。
实施例4
肿瘤内注射mCMV MHC-I限制性肽赋予增加的生存
用1x10^4 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠(图3A)。在第11、13、16、18、21和23天在有或没有聚(I:C)(30µg)的情况下用选择的m38、m45和m122肽(各1μg)，和用作为对照的盐水或单独的聚(I:C)对肿瘤进行肿瘤内注射。记录动物死亡(图4A)，并使用电子卡尺测量肿瘤生长(图4B)。这些数据表明肿瘤内注射mCMV MHC-I限制性肽延迟了肿瘤生长并赋予了增加的生存。
实施例5
肿瘤内注射mCMV MHC-I限制肽延迟肿瘤生长
用1x10^4 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠。在第11、13、16、18、21和23天在有或没有聚(I:C)(30µg)的情况下用逐渐减少剂量的(1 µg、0.1 µg和0.01 µg)选择的m38、m45和m122肽，和用作为对照盐水或单独的聚(I:C)对肿瘤进行肿瘤内注射。使用电子卡尺测量肿瘤生长(图5)。这些数据表明肿瘤内注射mCMV MHC-I限制性肽延迟了肿瘤生长。
实施例6
mCMV MHC-I和MHC-II限制性肽的组合延迟肿瘤生长
用2.5x10^5 mCMV感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠。从第12天到第28天用MHC-I限制性选择的m38、m45和m122肽和/或MHC-II限制性m139选择的肽或盐水对肿瘤进行肿瘤内注射6次。所有肽都与聚(I:C)(30μg)一起注射。对组进行注射6次MHC-I，或6次MHC-II肽，或6次注射一起的MHCI和MHCII肽，或顺序3次MHC-I肽随后3次MHC-II肽，或3次MHC-II肽随后3次MHC-I肽。使用电子卡尺测量肿瘤生长(图6A和6B)。这些数据表明肿瘤内注射mCMV MHC-I和MHC-II限制性肽的组合延迟了肿瘤生长。针对每种肽还通过使用MHC-I四聚体的FACS分析了血液中的E7、m45、m122特异性CD8+ T细胞应答(图6C)。这些数据表明，顺序用mCMV CD4，然后CD8表位进行肿瘤内接种优先诱导抗肿瘤免疫。
实施例7
完全清除原发性肿瘤赋予长期肿瘤保护
用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞在原发性攻击的相反体侧对在如实施例6中所述的幸免于原发性肿瘤攻击的受保护的C57Bl/6小鼠进行s.c.注射。作为肿瘤捕获量(tumor take)的对照，用TC-1肿瘤细胞攻击幼(12周龄)和龄期匹配(10月龄)小鼠。使用电子卡尺测量肿瘤生长(图7)。这些数据表明对原发性肿瘤的完全清除赋予了针对继发性肿瘤攻击的长期保护。
实施例8
肿瘤内注射MCMV改变肿瘤免疫微环境
最后一次肿瘤内治疗结束后两天，使用纳米线癌免疫学基因集(NanostringCancer immunology gene set) (nCounter)在用于免疫基因表达的RNA样品中分析了在有或没有聚IC的情况下肿瘤内注射mCMV MHC-I和MHC-II限制肽对肿瘤免疫微环境的影响。通过每个分析的基因集的得分变化总结结果。相对于盐水处理的组，进行了基因集的差异表达的总体评分(每组n=4)。评估的微环境特征包括：B细胞功能、白介素、TNF超家族、抗原加工、MHC、适应性、转运蛋白功能、粘附、NK细胞功能、T细胞功能、CD分子、白细胞功能、补体途径、小胶质(microglial)功能、体液、TLR、炎症、树突细胞功能、干扰素、先天性、巨噬细胞功能、趋化因子和受体、衰老、凋亡、细胞因子和受体、癌症进展、基本细胞功能、细胞周期和病原体响应。
实施例9
mCMV感染在C57BL/6小鼠中诱导膨胀性CD8+ T细胞应答
用5x10^3 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后1或5个月收集血液样品。使用MHC-I四聚体染色通过FACS检测了膨胀性(IE3)和非膨胀性(m45)特异性CD8+ T细胞。如图8中所示，mCMV感染诱导了明显的效应和记忆CD8+ T细胞应答。
实施例10
mCMV感染在C57BL/6小鼠中诱导有力的CD8+和CD4+ T细胞应答
用5x10^3 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后第12天收集血液样品。用指示的肽再刺激脾细胞，并用具有来自m38、m45、m57、m122、m139、m141和m164 mCMV蛋白的选择的免疫原性肽库再刺激血液细胞。通过细胞内细胞因子染色评价CD4+和CD8+ T细胞的IFN-gamma、TNF-alpha和IL-2细胞因子产生，并通过FACS进行分析(图9A、9B)。这些结果表明，鼠巨细胞病毒感染诱导大量的细胞因子应答。
实施例11
mCMV特异性CD8+ T细胞的组织分布
研究了mCMV特异性CD8+ T细胞在荷瘤小鼠中的分布。用5x10^3 mCMV感染C57Bl/6小鼠。实验时间表显示在图10A中。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠。收集淋巴结、脾、唾液腺和肿瘤组织，并通过使用MHC-I四聚体染色的FACS检测膨胀性(IE3；图10B)和非膨胀性(m45；图10C)特异性CD8+ T细胞。使用CD69和CD103抗体评价驻留的记忆T细胞标志物的表达。这些结果表明TC1肿瘤被mCMV特异性CD8+T细胞浸润。
实施例12
肿瘤微环境的基因表达分析
研究了用以下进行肿瘤内治疗(每组4只动物)后，小鼠模型中肿瘤细胞中基因的表达：盐水；聚I:C (PIC) (50μg)；mCMV m139肽(MHC-II限制性/CD4) (CD4) (3μg)；mCMVm38、m122、m45肽(MHC-I限制性/CD8) (CD8) (各1μg)；mCMV m139 + 聚I:C (PIC CD4) (各3μg)；mCMV m38、m122、m45肽(MHC-I限制性/CD8) + 聚I:C (PIC CD8) (各1μg)。皮下放置TC1肿瘤细胞后第11、13和16周，对肿瘤进行了3次治疗。实验方案时间表显示在图11A中。治疗和收获肿瘤后，使用QIACube提取肿瘤RNA。使用测量肿瘤PanCancer免疫概貌分析组(PanCancer Immune Profiling Panel)中770个基因的基因转录物形式的纳米线癌免疫学基因集(NS_MM_CANCERIMM_C3400)分析肿瘤细胞基因表达。简而言之，归一化的数据表示为特定生物过程中基因集表达的热图(适应性免疫、抗原加工、T细胞功能、树突细胞功能、NK细胞功能、干扰素、TNF超家族基因)；构建了相对于盐水处理的基因表达变化的火山图(该图表示相对于对照处理(盐水)的治疗组中的变化(表示为倍数增加或减少)，具有统计学意义)；应用细胞浸润定量算法(CD45、细胞毒性CD8、CD4 Th1、NK细胞和树突细胞)。结果显示，在MHC-I限制性/CD8和MHC-I限制性/CD8 + 聚(I:C)处理的动物中，全局显著性得分变化最大。
肿瘤内治疗后，整个肿瘤RNA中的免疫基因的概貌分析显示三组中免疫基因的显著上调：
1) mCMV m139肽：MHC-II限制性/CD4 - 3mg (230个基因上调，而4个基因下调)；
2) mCMV m38、IE3、m45肽：MHC-I限制性/CD8 - 1mg (359个基因上调，而43个基因下调)；
3) mCMV m38、IE3、m45肽：MHC-I限制性/CD8 + 聚(I:C) (309个基因上调，而49个基因下调)。
肿瘤内治疗后，还分析了白细胞对肿瘤的浸润。图11B-11F显示不同白细胞的肿瘤浸润。这些数据表明，肿瘤内注射CD8 mCMV表位(有或没有聚(I:C))诱导肿瘤中T细胞和非T细胞(NK)的募集；并且肿瘤内注射CD4 mCMV表位与聚(I:C)诱导肿瘤中T细胞和非T细胞(NK)的募集；并且用CD8或CD4表位的聚(I:C)肿瘤内注射诱导肿瘤中树突细胞的募集。
实施例13
肿瘤内注射mCMV CD8表位延迟肿瘤生长
用5x10^3 pfu鼠巨细胞病毒(mCMV)感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠。使用电子卡尺测量肿瘤生长。在第11、13、16、18、21和23天在有或没有聚(I:C)(30µg)的情况下用选择的MHC-I限制性m38、m45和m122肽(各0.01、0.1或1µg)，和用作为对照的盐水或单独的聚(I:C)对肿瘤进行肿瘤内注射。图12A和12B显示肿瘤内注射mCMV MHC-I限制性肽延迟了肿瘤生长，并且聚(I:C)共注射改善了肿瘤控制。
实施例14
通过肿瘤内注射mCMV MHC-I和/或MHC-II肽与聚(I:C)提供保护而免受TC1和MC38肿瘤攻击
用5x10^3 mCMV感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠。监测肿瘤生长和生存。从第12天到第28天在有或没有聚(I:C)(30µg)的情况下用MHC-I限制性选择的m38、m45和m122肽和/或MHC-II限制性m139选择的肽，和用作为对照的盐水或单独的聚(I:C)对肿瘤进行肿瘤内注射6次。对组注射6次MHC-I，或6次MHC-II肽，或6次一起的MHCI和MHCII肽，或顺序3次MHC-I肽随后3次MHC-II肽，或3次MHC-II肽随后3次MHC-I肽。图13A显示肿瘤内注射mCMV MHC-I和MHC-II限制性肽的组合延迟了肿瘤生长，并且图13B显示顺序用CD4 (MHC-II)，然后CD8 (MHC-I) mCMV表位进行肿瘤内接种促进长期生存。
实施例15
治疗后血液中的E7四聚体阳性CD8+ T细胞应答
用5x10^3 mCMV感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞s.c.注射小鼠。使用电子卡尺测量肿瘤大小。从第12天到第28天在有或没有聚(I:C)(30µg)的情况下用MHC-I限制性选择的m38、m45和m122肽和/或MHC-II限制性m139选择的肽，和用作为对照的盐水或单独的聚(I:C)对肿瘤进行肿瘤内注射6次。所有肽都与聚(I:C)(30μg)一起注射。对组注射6次MHC-I，或6次MHC-II肽，或6次一起d MHCI和MHCII肽，或顺序3次MHC-I肽随后3次MHC-II肽，或3次MHC-II肽随后3次MHC-I肽。针对每种肽通过使用MHC-I四聚体的FACS分析了血液中的E7、m45、m122特异性CD8+ T细胞应答。图14显示顺序用mCMV CD4，然后CD8表位进行肿瘤内接种优先诱导抗肿瘤免疫。
实施例16
针对继发性肿瘤攻击的长期保护
用2x10^5个表达E6和E7癌蛋白的TC-1肿瘤细胞在原发性攻击的相反体侧对如上所述的幸免于原发性肿瘤攻击的受保护的C57Bl/6小鼠进行s.c.注射。使用电子卡尺测量肿瘤生长。作为肿瘤捕获量的对照，用TC-1肿瘤细胞攻击幼(12周龄)和龄期匹配(10月龄)小鼠。图15显示对原发性肿瘤的完全清除赋予了针对继发性肿瘤攻击的长期保护。
实施例17
通过肿瘤内注射mCMV MHC-I和MHC-II肽与聚(I:C)提供保护而免受MC38肿瘤攻击
用5x10^3 mCMV感染C57Bl/6小鼠。感染后四个月，用5x10^5个来自小鼠结肠腺癌的MC38肿瘤细胞s.c.注射小鼠，所述小鼠结肠腺癌展示出超突变和微卫星不稳定性。监测肿瘤生长。从第12天到第28天在具有聚(I:C)(30μg)的情况下用MHC-I限制性选择的m38、m45和m122肽和MHC-II限制性m139选择的肽，或在具有聚(I:C)(30μg)的情况下单独的MHC-II限制性m139选择的肽和作为对照的单独的盐水对肿瘤进行肿瘤内注射6次。图16显示对原发性肿瘤的完全清除赋予了针对继发性肿瘤攻击的长期保护。图16显示肿瘤内注射mCMVMHC-I和MHC-II限制性肽的组合延迟了肿瘤生长并导致肿瘤清除。
实施例1-17中所述的研究表明，在潜在的mCMV感染期间，非膨胀性和膨胀性mCMV特异性T细胞均浸润肿瘤，并将已建立的抗病毒T细胞重导向到实体瘤中导致肿瘤消退、肿瘤免疫微环境的极大改变。数据还显示，将已建立的抗病毒CD4+ T细胞重导向到实体瘤中促进向肿瘤相关抗原的表位扩散和完全肿瘤清除。因此，这些方法基于预先存在的抗病毒T细胞提供了广泛适用的“抗原不可知的(antigen agnostic)”肿瘤疗法。HPV L1和L2颗粒对众多肿瘤细胞表现出强烈的向性，但不结合或感染完整的上皮。因此，HPV PsV或VLP可以用于以遗传方式或直接作为载体将抗肿瘤剂导向肿瘤细胞。
尽管已经参考具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变，并且可以替换等同物。另外，可以做出许多修改以使特定情况、材料、物质组成、工艺、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有此类修改旨在落入权利要求书的范围内。本发明提供了以下实施方案。
1. 治疗个体中的癌症的方法，其包括将预先存在的免疫应答募集到所述癌症的部位，从而治疗所述癌症。
2. 项1的方法，其中所述预先存在的免疫应答是天然存在的预先存在的免疫应答。
3. 项1或2的方法，其中将所述预先存在的免疫应答募集到癌细胞包括在治疗开始之前将不由癌细胞表达的抗原引入到所述癌症中，其中所述抗原由所述预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别。
4. 前述项中任一项的方法，其中在将所述抗原引入到肿瘤中之前，确认所述个体具有针对所述抗原的预先存在的免疫应答。
5. 项4的方法，其中确认所述预先存在的免疫应答的存在的步骤包括在来自所述个体的样品中鉴定针对所述抗原的T细胞应答。
6. 前述项中任一项的方法，其中引入所述抗原的步骤包括将所述抗原注射到所述癌症中。
7. 前述项中任一项的方法，其中引入所述抗原的步骤包括将编码所述抗原的核酸分子引入到所述癌症中。
8. 项7的方法，其中所述核酸分子是DNA。
9. 项7的方法，其中所述核酸分子是RNA。
10. 项9的方法，其中所述RNA经修饰而使得其对降解更具抗性。
11. 项7的方法，其中通过注射将所述核酸分子引入到所述癌症中。
12. 项7的方法，其中使用病毒载体将所述核酸分子引入到所述癌症中。
13. 项12的方法，其中使用假病毒体将所述病毒载体引入到所述癌症中。
14. 项13的方法，其中所述假病毒体是乳头瘤病毒假病毒体。
15. 项3-14中任一项的方法，其中所述抗原是病毒抗原。
16. 项3-14中任一项的方法，其中所述抗原是包含来自巨细胞病毒(CMV)蛋白的至少一个表位的多肽，并且其中所述至少一个表位由所述预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别。
17. 项16的方法，其中所述一种或多种组分是T细胞。
18. 项16的方法，其中所述CMV蛋白选自下组：pp50、pp65、pp150、IE-1、IE-2、gB、US2、US6、UL16和UL18。
19. 项16的方法，其中所述多肽是9-15个氨基酸的MHC I限制性肽。
20. 项16的方法，其中所述多肽是至少15个氨基酸的MHC II限制性肽。
21. 项16的方法，其中所述抗原包含与选自下组的序列至少90%相同的序列：SEQID NO: 1-67。
22. 项16的方法，其中所述抗原包含选自SEQ ID NO: 1-67的序列。
23. 项3-22中任一项的方法，其中所述预先存在的免疫应答的募集改变所述癌症的微环境，其选自B细胞功能、白介素、TNF超家族、抗原加工、MHC、适应性、转运蛋白功能、粘附、NK细胞功能、T细胞功能、CD分子、白细胞功能、补体途径、小胶质功能、体液、TLR、炎症、树突细胞功能、干扰素、先天性、巨噬细胞功能、趋化因子和受体、衰老、凋亡、细胞因子和受体、癌症进展、基本细胞功能、细胞周期和病原体响应。
24. 项3-23中任一项的方法，其中所述抗原与增强所述免疫应答的试剂组合施用，所述试剂选自TLR激动剂；IL-1R8细胞因子拮抗剂；静脉内免疫球蛋白(IVIG)；从革兰氏阳性细菌分离的肽聚糖；从革兰氏阳性细菌分离的脂磷壁酸；从革兰氏阳性细菌分离的脂蛋白；从分枝杆菌分离的脂质阿拉伯甘露聚糖，从酵母细胞壁分离的酵母聚糖；聚腺苷酸-聚尿苷酸；聚(IC)；脂多糖；单磷酰脂质A；鞭毛蛋白；嘎德莫特(Gardiquimod)；咪喹莫特(Imiquimod)；R848；含有CpG基序的寡核苷、CD40激动剂和23S核糖体RNA。
25. 项3-23中任一项的方法，其中所述抗原与聚-IC组合施用。
26. 前述项中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤。
27. 前述项中任一项的方法，其中所述癌症是血液学癌症。
28. 用于在个体中将预先存在的免疫应答募集到癌症的试剂盒，其包含至少一种CMV肽抗原或编码所述肽的核酸、药学上可接受的载体、容器以及描述所述CMV肽的施用以减少患者中的癌症的包装插页或标签。
29. 用于测试患者并在所述患者中将预先存在的免疫应答募集到癌症部位的试剂盒。

Claims (5)

1.至少一种来自巨细胞病毒(CMV)蛋白的免疫原性抗原和聚(IC)在制备用于治疗个体中的实体瘤的药物中的用途，其中每个抗原独立地包含SEQ ID NO: 1-33之一的序列，其中所述抗原将天然存在的预先存在的针对CMV的免疫应答募集到所述实体瘤，其中所述抗原不由所述个体中所述实体瘤的任何癌细胞表达，其中所述抗原由所述预先存在的免疫应答的一种或多种组分识别，并且其中所述药物用于注射到所述实体瘤中。
2.权利要求1的用途，其中所述药物包含所述抗原，所述抗原包含SEQ ID NO: 1-33。
3.权利要求1-2中任一项的用途，其中在将所述抗原引入到所述肿瘤中之前，确认所述个体具有针对所述抗原的预先存在的免疫应答。
4.权利要求3的用途，其中确认所述预先存在的免疫应答的存在的步骤包括在来自所述个体的样品中鉴定针对所述抗原的T细胞应答。
5.权利要求1-4中任一项的用途，进一步包括至少一种CMV肽的用途，所述CMV肽包含SEQ ID NO: 34-67之一所示的序列。
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