CS201491A3 - Analogs of oligonucleotides with terminal 3'-3' - optionally 5'-5' - internucleotide bonds, process of their preparation and use - Google Patents

Analogs of oligonucleotides with terminal 3'-3' - optionally 5'-5' - internucleotide bonds, process of their preparation and use Download PDF

Info

Publication number
CS201491A3
CS201491A3 CS912014A CS201491A CS201491A3 CS 201491 A3 CS201491 A3 CS 201491A3 CS 912014 A CS912014 A CS 912014A CS 201491 A CS201491 A CS 201491A CS 201491 A3 CS201491 A3 CS 201491A3
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
oligonucleotides
carbon atoms
alkyl
formula
radical
Prior art date
Application number
CS912014A
Other languages
English (en)
Inventor
Hannelore Rosch
Anja Frohlich
Jose Flavio Ramalho-Ortigao
Matthias Prof Dr Montenarh
Hartmut Prof Dr Seliger
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of CS201491A3 publication Critical patent/CS201491A3/cs
Publication of CZ285408B6 publication Critical patent/CZ285408B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R15/00—Details of measuring arrangements of the types provided for in groups G01R17/00 - G01R29/00, G01R33/00 - G01R33/26 or G01R35/00
    • G01R15/14—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks
    • G01R15/18—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers
    • G01R15/186—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers using current transformers with a core consisting of two or more parts, e.g. clamp-on type

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)

Description

·.! advokáttí§04 PRAHA 1, Žitné 25
fZV7
Analogy oligonukleotidů s terminálními 3'-3*- popřípadě 5-T*-internukleotidními vazbami, způsob jejich výroby a použití.
Oblast techniky
Vynález se týká biologie, konkrétná analogů oligonukleotidů s ter-minálními 3^-3^- popřípadě.. 5/.-5*-internukleotidnímÍ vazbami. ·
Dosavadní stav techniky
Jako oligonukleotidy s řetězcem proti smyslu kódu se označují fra-gmenty nukleových kyselin, jejichž, řetězec je komplementární kekódovému řetězci vé"'smyslu kódu mRNA popřípadě ke kodogennímu ře-tězci DNA. Takové oligonukleotidy se ve vzrůstající míře použí-vají k inhibici exprese genů in vitro-nebo v buněčných kulturo-vých systémech. Použití těchto látek v mědícinsko-therapeutické oblasti, například jako protivirových farmak, je předmětem-roz-sáhlého výzkumu. V biologii jsou již dlouho známé RNA řetězce proti smyslu kódujako přírodní regulátory exprese genů v prokaryotických organis-mech (I. Lčizuno, M.Y. Chou a M. Inouye, Proč. Natí. Acad. Sci. USA 81,1966-1570 (1984) a také v eukaryotických organismech(3.M. Heywood, Nucleic Acids.Res. 14, '6771-6772 (1986)). Působí inhibování translace hybridisací u příslušných, mRNA. V mnoha,experimentech bylo mezitím možno dokázat, že tyto PNA řetězceproti smyslu-kódu, když se injikují v bakteriích (A. Hirashima, 3. Sawaki, Y. Inokuchi a M. Inouye, PNAS.USA 83, 7726-^7730(1986)) nebo eukaryotických. buňkách (J.G. Izant. a H. Weintraub,Cell-36, 1007-1015 (1984)), i tam mohou zabraňovat'expresi ge- nů a ukazují jak protivirový (L. J. Chang a C. M. Stolzfus, J. .Virology 61, 921-924 (1987) tak také protinádorový účinek(J.T. Holt, I.V. Gopal, A.D. Moutton a A.Ví. Nienhuis, PNAS USA83, 4794-4798 (1986). Pro tyto výzkumy mají synthetické oligo-nukleotidy proti'biologickým PNA proti smyslu kódu výhodu vetší'stability a snazší přístupnosti. Snazší přístupnost je důsled-kem zlepšené techniky synthesy v poslední době, která dnes re- lativně snadno zpřístupňuje kratší oligomery (o např. 12-30 bá-zích)(£. Sonveaux, Bioořganic Chemistry 14, 274-325 (1986);Qligodeoxynuclaotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression,J-.S. Gohen, ed.Macmillan Press, 1989}· str. 7ff). -.·. Ukázalo se., že již:, takové krátké oligomery jsou účinné ja-kó modulátory exprese. Mimo to spohou tyto oligonukleotidy taképůsobit'vazbou na"DNA-dvojitý řetězec za vzniku trojitého heli-xu. Aby se oligonukleotidy s řetězcem proti smyslu kódu a oligo-nukíeotidy ve formě triplexu mohly nasadit v biologických systé-mech, musí ovšem být splněny následující předpoklady {Oligodeoxy-nukleotides, Antisense Inhibitors of‘Gene Expression,J.8. Coheneď. Macmillan Press, 1989, str·. lff): 1. musí jednak být dobře rozpustné ve vodě, jednak vsak snadnoprocházet lipofilní buněčnou membránou 2. musí být uvnitř buňky dostatečně stabilní proti odbourání, t.j. stabilní proti nukleasam . 3* musí s intrabuněčnými nukleovými kyselinami při fýsiologic-kých teplotách tvořit stabilní hybridy 4. hybridisace- musí být selektivní} rozdíl dissociační teplotyk .oligonukleotidjr, který poskytuje defektní párování, musí býtdostatečně velký, aby se poslední mohlo ještě specificky vymý- vat. ·. . ... 1978 mohli Zamecžnik a Stephěnson," PNA3 USA 75, 280-284 a285-288 (1978) poprvé ukázat, že nemodofikované oligonukleotidymohou omezovat viry Rous Sarcom. Oligonukleotidy byly ovšem, po-užity ve velmi vysokých, koncentracích, k tomu byly experimentyvětšinou prováděny v předem vyhřátých mediích,, aby se nukleasyínaktivovaly. Nutnost těchto opatření se vysvětluje; rychlým en-zymatickým odbouráním, kterému jsou cizí nukleové kyseliny v se-ru a buňkách vystaveny.
Proto se již dříve prováděly pokusy s cílem modifikovatoligonukleotidy strukturně tak, aby lépe splňovaly výše jmeno-vané požadavky, zejména aby byly lépe chráněny proti nukleasní-mu odbourání. Tyto pokusy se především koncentrují na modifika-ci fosfodiesterovou internukleotidní vazbu, poněvadž tato je'po- sledním-koncem působiště všech nukleas. Strukturně modifikovanéinternukleotidové vazby se zásadně mohou dělit v ?- · · a) ~nukleosidové vazby s fosforem jako centrálním atomem.Tyto ; opět mohou být Λ·ΐ - ionicky/chirální iionicky/achirélní neutralňě/chirální b) neutrálně/achirální bezfosfořové nukleosidové vazby
Ka strukturně modifikovaným, jako dříve k ionickým internu-kieosidoýým vazbám náleží’thiofosfátové a dithiofosfátové vazby.Thiofosfátem modifikované oligonukleotidy (Oligodeoxynueleotiden,Antisense Inhibitore of Gene Expression,. J.S. Cohen ed. Macmil-lan Press, 1969, str. 97ff)_,ukazuji toho Sasu nejlepší efekty in-hibice exprese, genů .v buněčných kulturách, ovšem-nezdá se, že jetato inhibice. vázána na-specifický řetězec, poněvadž i takové,thiofosfáty modifikované oligonukleotidy ukazují inhibicní efek-ty, které sestávají jen ze základu nukleové kyseliny, napříkladthiofosfátové analogy oligocytidylatu. Ohraničením pro nasazeníthiofosfátem. modifikovaných oligonukleotidů- je dále jejich chi-ralita. . . Poněvadž .při-přípravě oligonukleotidů o n'·bází-2n"^ se;tvo-J' ří diastereomeřy, má pouze, nejmenší podíl preparátu obsahujícího . thiof osfátové vazby dobré hybridisační vlastnosti. —~ ; _7 'ti oligonukleotidů" s" dl thiof osfžtbvými internukle os iďními . vazbami (A. iGrandas,. William S. Marshall,.John Nielsen a MartinH. Caruthers, Tetrahedron Lett. 20, 543-546 (1969), G.M. Porritt, I. ' ,·. G.B. Reese, Tetrahedron Lett. 30, 4713-4716 (1969·)), se problémý . chirality obchází. Tyto sloučeniny však jsou dosud přístupné pou-A ze pomocí komplikovaných a ztrátových, mnohastupňových synthes. 1 Proto se dosud nemohly' provádět rozsáhlejší pokusy s ohledem na hybridisační chování, především v buněčných kulturách.
Další-třídou chemicky modifikovaných oligonukleotidů jsou'oligonukleotidy s neionickými, t.j. neutrálními internukleosid-ními vazbami. K- tomuto druhu modifikovaných struktur náleží oli-gonukleotidy s fosfotriesterovými nebo methylfosfonátovými inter- nukleosidními vazbami (Oligodeoxynucleotides., Antisense Inhibi-tors. of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillian Press, str.
' kýQtijjina /třídám sloučenin je společné, že ionisovatelný foš -fátový zbytek:iAje nahrazen nenabitou skupinou. Zavedením, takovévazby se stávají oligonukleotidní analogy resistentními vůči nu-kleasam, mají však nevýhodu spatné rozpustnosti ve vodném pro-středí*
Oligonukíeotidy s neutrálně/achirální,internukleošidní vaz-bou se dosud mohly získávat pouze tím, že atom fosforu internu-klaosidní vazby byl nahrazen jiným centrálním atomem. Vazbě este-ru kyseliny fosforečné je podobná siloxanová vazba. Oligonukleo-r-tidy se siloxanovými internukleosidními vazbami ( K.X. Ogilvie,J*P. Cormier, Tetrahedron Lett. 26, 4159 (1985), H. Seliger, G.Feger, Nucl. Nucl. 6 (182), 483-484 (1987) byly syn.the tis ovanea jsou stabilní vůči nukleasam.'
Oligonukíeotidy s uhličitanovými, acetalovými nebo karbox-amidovými internukleosidními vazbami .jsou známé z M. Matteucci,Tetrahedron Lett. 31, 2385-2388 (1990), J.S. Tittensor, J. Chem.Soc. C. 1971, str. 2656 a J. Coull et al., Tetrahedron Lett. 28,745 (1987).
Nukleasně., resistentní analogy nukleotidů, mohly také být vy- ráběné bez změny fosfodiesterové internukleotidní vazby tím, ěěbyly nasázeny cukrové zbytky změněné konfigurace. To se prove-dlo,.; syn the sou oligonukleotidnich analogů, u kterých jsou. nukleo-béze vázané ť)í-glykosidicky (Oligodeoxynucleotides, AntisenseInhibitore of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillan Press,1989, str·. 119ff). Tyto analogy oligonukleotidů však jsou prepa-rát ivně těžko přístupné, poněvadž se musí stavět od cukrů a bá-zí. K tomu ukazují, co se týká sniyslu směru hybridisace, částeč-ně nenormální chování.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou oligonukíeotidy vzorců I nebo II
kde
značí vodík, nebo zbytek vzorce III
(III) Ϊ &
značí vodík nebo zbytek vzorce IV
(IV) z' - p = w'
I 6 _ ν χ 2 přičemž, však alespoň jeden ze zbytků R nebo R představu-je zbytek vzorce III nebo 17,
Bpředstavuje bázi, jako například přírodní báze jako adenin.,thymin, cytosin, guanin nebo nepřírodní báze, jako napříkladpurin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaquanin,.lA-ethanocytosin popřípadě je jich pre.kur^.ordyá ..formy W a W* nezávisle na-sobě značí kyslík nebo síru, Z a Z* nezávisle na sobě značí Oj 3} alkoxyskupínu s 1 až 18. atomy uhlíku, výhodně- alkoxyskupínu s 1 až 8 atomy uhlí-ku, zvlášť výhodně alkoxyskupínu s 1 až 3 atomy uhlíku,zejména méthoxyskupinuj alkyl· s 1 až 18 atomy uhlíku,výhodně, alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku, zvlášt výhodně- al-kyl s 1 až 3 atomy uhlíku, zejména methyl} NHR s R zna-menajícím výhodně alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, zvláštvýhodně alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku, zejména alkyl s 1až 4 atomy uhlíku nebo alkoxy-alkyl s 1 až 4 atomy uhlí-ku v alkoxyzbytku a s 1 až 6 atomy uhlku v alkylovémzbytku, výhodně methoxyethyl; NR^R^, kde R^ má shorauvedený význam a R^ značí výhodně alkyl s 1 až 18 ato-my uhlíku, zvlášt výhodně alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku,zejména alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo kde R^ a R^-spolu s nosným atomem dusíku značí 5 až 6 členný hete-rocyklický kruh,, který může. navíc obsahovat další hete-roatom z řady 0, S, N, jako například morfolin, Y značí zbytek z řady 0-Si(R)2, OCIt,, C(O)NR nebo 0CH2-C(0), kde R představuje alkyl, s 1 až ó atomy uhlíku, arylnebo cykloalkyl s 5 popřípadě 6' atomy uhlíku}a’ n znamená celé číslo 5 až oO, výhodně 10 až 40 a zejména 15 až 25, jakož-i jejich fysiologicky snášenlivé sole. tj J ? V“ *ί- f. - £/ ’ - 7 -. • ,’-ΐ’ί ···.. . / t· ií
Pod arylem se v této souvislosti rozumí například fenyl, fenylsubstituovaný (1 až 3-;krát) alkylem s 1 až o atomy uhlíku, alko-xyskupinou s 1 až 6/atomy. uhlíku a/nebo halogenem. : Přednost mají oligonukleotidý'vzorce I.· . · ' ' *rt . ' · 2 . .. Dále jsou výhodné oligonukleotidý vzorce I, ve kterém R ' i i '2 znamená zbytek vzorce IV a R značí vodík; R . popřípadě Rznamená zbytek vzorců III popřípadě IV; nebo R^ značí vodík a / . R^. zbytek vzorce III, přičemž bučí W nebo Z v posledním pří- . páde'neznamenají kyslík.
Zvláší je dále třeba jmenovat oligonukleotidý vzorce I,kde Ví znamená kyslík nebo Z a W oba představují' kyslík»
Zcela zvlášt výhodné jsou oligonukleotidý vzorce I, kde 2 · 1R ’ představuje zbytek vzorce IV a R značí vodík. Dále je třeba jmenovat oligonukleotidý vzorců I a II, kteréjsou navíc substituované skupinami, které. podporu jí intrabuněčné..absorpce, které slouží .jako značící skupiny in vitro nebo in vi-vo a/nebo skupiny které při hybridisaci oligonukleotidu na bio-logické DNA nebo RNA tyto molekuly DNA nebo RNA napadají za vá-zání nebo štěpení.
Jako příklad skupin, které podporují intrabuněčnou absorpcijsou lipofilní zbytky, jako alkylové zbytky například až s 18atomy, uhlíku nebo cholesteryl, nebo konjugáty, které využívají.·přírodní přenášecí systémy, jako například kyselinu. Žlučovou ne-bo peptidy’pró příslušné receptory (např. endocytosu). ... pro'"značíčí skupiny jsou"fluoreskovácí skupiny .(na- příklad akridinyl, dansýl, fluoresceinyl) nebo chemiluminescen-ční skupiny, jako například akridiniumesterové skupiny.
Oligonukleotidní konjugáty, které nukleové kyseliny vážou a/nebo štěpí, obsahují akridin (N. Thuong et al., TetrahedronLe.tt. 29, str. 5905, (1968), psoraly (U. Peiles·. et al., NucleicAcid Res. sv. 17, str. 285, 1989), nebo chlorethylaminoarylovékonjugáty (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitore of GeneExpression, J.S. Cohen, ed. Mc Millou Press,·· 1989, str. 173 ff).
Charakteristická strukturní modifikace olígonukleotidů po- dle vynálezu spočívá v tom, že internukleotidní vazby na obou I· I· ! jj
ίΛ ,1
I !í
ři; 8 - i, koncích řetězce jsou změněné, t.j. jsou místo biologických3*-5*- vazeb vazby 3*-3*- popřípadě 5 *-5*-· Překvapivě bylo na-lezeno, že tato minimální strukturní modifikace stačí, aby setyto sloučeniny stabilisovaly proti nukleasnímu odbourání.
Jak se, popisuje dále, způsobuje tato pouze malá strukturnímodifikace hybridisační chování, která se téměř, rovné chováníbiologických oligonukleotidů. Z toho také vyplývá obecná použi-telnost těchto sloučenin jako exprese genů v buněčných kulturách. Z. literatury není dosud známa žádná zmínka o výrobě analogůoligonukleotidů s 3 *-3* a 5z-5*internuklesidními vazbami na oboukoncích řetězce a jejich nasazení jako antisensní oligonukleoti-dy. Analogy dinukleosidfosfátů, které obsahují 3*-3*- nebo 5*-5*-vazby byly získány a zkoušeny již před mnoha léty jako hlavníprodukty-(A. Myles, Ví. Hutzenlaub, G. Reits a Ví. Pfleiderer, .ChemSer. 108, 2857-2871 (1975)i H. Kokos, A. Myles, W. Hutzenlaub aVí. Pfleiderer, Chem. Ser. 2872-2877 (19750» J· Tomasz, Nucl. Nucl2(1), 51-61 (1983) j M. Nemer, N. Theriault, A. Schifmann a· K.K.Ogilvie., Vith International Kound Table, Nucleosides, Nucleoti-des and their biological Applications, La Grande Motte, ed. J.L.Imbach, 94-96 (1984)), popřípadě jako vedlejší produkty (R. Let-singer, K.K. Ogilvie, J. Arner. 3oc. 89, 4801-4802 .61967))· Tyto.dimerý-však na základě příliš nízké teploty-tání zásadně nejsouzpůsobilé ke stabilní hybridisaci buněčnými: nukleovými kyselina-mi. Oligonukleotidy, které mají 5.ř-5*-važbu pouze na jednom kon-ci, byly připraveny, aby se zavedlo příchytné místo pro značícískupiny při genetických-softdách (3. Agrawal, C. Christodoulou»M.J. Gait., Nuc-leic Aciós Res 14-, 6227-6245 (1986)). Nebyly však^losud zkoušené na své hybridisační chování. Pro biofysikální
V zkoušky se připravily samokomplementární oligonukleotidy, kteréuprostřed molekuly mají jednotlivou 3'-3*- popřípadě Š^-S-T-vaz-bu (J.H.-van de Sande, N.B. Ramsin, M.W. German, W. Elhorst, B. Ví. Kalisch, E.7. Kitzíng, R.T. Pon, R.c. Clegg, Τ.Μ». Jovin, Sci-ence 241, 551-557 "(1968)). Příprava oligonukleotidů s terminálne invertovanou 3 -3*- a 5'-5'- vazbou se provádí stejným způsobem jako synthesa bio- logických oligonukleotidů. v roztoku nebo v pevné fázi, popřípa-dě za pomoci automatického synthesního přístroje. Předmětem·, vynálezu je tedy dále způsob výroby oligonukleo-tidů vzorce I, který spočívá v tom, že. se' j a) nukleotidní jednotka s 3#- popřípadě: 5z-terminálními skupi-namí fosforu(III) nebo fosforu(V) nebo její aktivovaný deri- vát nechá reagovat s další nukleotidní jednotkous ^'-'po-případě 5*- terminálně volnou hydroxyskupinou,nebo ť b) oligonukleoid připraví z fragmentů stejným způsobem, v oligonukleotidech získaných podle (a) nebo (b) se popřípa-dě jedna nebo několik ochranných skupin zavedených dočasněk ochraně ostatních funkcí odštěpí a takto získané.oligonu-kleotidy vzorce I- se popřípadě převedou ve svou fys-ioiogic-ky snášenlivou sůl.
Jako výchozí komponenta k ^výrobě oligonukleotidů s termi-nálně invertovanou 3'-2'-vazbou se pro synznesu pevné"fáze na-sadí nosná pryskyřice, na které je přes 5*-QH skupinu vázán prv-ní nukleosidní monomer. K 'výrobě' této komponenty s.e použije nos- i -na pryskyřice vyrobená methodamí známými z literatury (T. Atkin-jk son, lvi. Smith v Oligonucíeotide' Synthesis, Itf.J. Geit (eď), 35 - "49 <1984)·), zejména sllikagel. nebo regulované pórovité sklo, kte-ré je funkcionalisováno aminoskupinami. Nechá se reagovat s nu-kleosídním derivátem chráněným na nukleobázi a na 3'-0H skupině,který byl napřed přeměněn v 5*-p-nitro-fenylsukcinát. Jako bá-zické ochranné skupiny se používají zejména acylové skupiny, na-příklad benzoyl, isobutyryl nebo· fenoxyace tyl. Poloha 3'še vý-hodně chrání dimethoxytritylovou ochrannou skupinou, která semůže zavádět podle M.D. fóatteucci, M.H.Caruthers, TetraheďronLetters 21 (1980), str. 3243-3246. Další skladba oligonukleotid-ního řetězce až k předposlednímu řetězcovému členu se-provádímethodami známými z literatury, výhodně za použití na 5*-0Hskupině diméthoxýtritylovými skupinami chráněných esteramidů .kyseliny nukleosid-3-fosforité nebo nukleosid-3'-H-fosfonátů.
Jako poslední člen řetězce se opět nasadí na 3*-0H skupině, vý- &amp; i. tř í 5 - 10 - hodně: dimethoxytritylem chráněný esteramid kyseliny nukleosid-í^-fosforité, popřípadě nukleosid-H-fosfonét. Příprava takovéhooligonukleotidního řetězce s terminálně převrácenými ^nternukle-otidními vazbami, je déle. znázorněna: schematicky (fosforamiditcy-kl k přípravě oligonukleotidů s 3 *-3*- a 5*^5 vazbami na kon-cích).. Příprava oligonukleotidů s 3 *-3*-· nebo 5*-5*- vazbami seprovádí' 'odpovídajícím způsobem. 11
- 12 -
Strukturní a řetězcová analysa .se provádí tím způsobem, žese oligonukleoid. s 3*-3*- a 5'-5'- konci nejdříve terminálně ~-znáčůje. To se provede radioaktivním značkováním, výhodně porno-cí 5*-^- r-ATP/polynukleotidkinasy. Toto radioaktivní značko-vání ‘ se ' provede na volné 5*-0H - skupině,.t.j. proti oligonukle-otidu s pouze biologickou 3 *-5'-vazbou na opačném’konci nukleo-tidního··řetězce. Řetězcová analysa se’ pak provede postupem zná-mým z literatury, výhodně -pro báze. specifickým, statistickým,štěpením, jak popsáno (A.M. Maxam and W..Gilbert, Methods in.Enzymology 65, 499-560 (1980)).
Na·, základě radioaktivního· značkování na "opačném"· konci mo-lekuly se nyní provede také odečtení řetězce, srovnáním s oligo-nukleotidem s biologickou 3*-5*- vazbou v opačném směru. Prove-ditelný popis testu je uveden v příkladu 6.
Oligonukleotidy vzorců I a II se používají pro hybridis.ač-ně-chemičké, na^adioi u nukleových kyselin s dvojitým nebo jed-ním řetězcem spočívající’ postupy regulace nebo potlačování bio-logické funkce nukleových kyselin,k selektivnímu potlačování ex-prese virélních funkcí genomu a k profylaxi a therapii virovýchfunkcí, k potlačování nádorových funkcí a k therapii rakovinnýchonemocnění
Jako míra stability in vivo.se může pokládat, chování v krev-ním seru rozpuštěného, podle vynálezu stavěného oligonukleotiduvzorce I nebo II. Obecný test je popsán v příkladu 7; odpovída-jící test in vitro s roztokem fosfodiesterasy hadího jedu v pří-kladu 8. Oligonukleotidy podle vynálezu se v protikladu k 3*-5#-oligonukleotidům odbourávají mnohem pomaleji. Příklad 11 demonstruje sérovou stabilitu oligonukleotidů sterminálněinvertovanou 3 *-3*- vazbou.
Hybridisační chování vyplývá z modelových pokusů, jak pop-sáno v příkladu 9, ve kterých řada SV-40-specifických řetězců,které podle vynálezu byly připraveny vždy s 3 *-3 *- a 5z-5*- kon-cem,' v hybridisaci s odpovídajícím řetězcem proti smyslu kóduS740-DWA ukazují teplotu tání, která leží nepodstatně níže nežteplota tání, která se měří při hybridisaci s odpovídajícím ře- - 13 - tězcem, který nebyl staven podle vynálezu, t. j. bez 3 -3 - akonců. . z- Účinnost^ oligonukleotidů opatřených podle vynálezu termi-nálními 3 *-3 *- popřípadě 5 *-5 vazbami, jako inhibitorů expre-se genů vyplývá z potlačování růstu viru 3V4-O (příklad 10) ja-kož i zýinhibice in vitro exprese nádorového produktu p53 (pří-klad 12). -·'· - Příklady provedení vynálezu Příklad 1 '
Synthesa esteramidu kyseliny 3*-0-DMTr~desoxyribonukleosid-5,-(Ν,Ν-bís-diisopropyl-amino- ^-kyanethoxy)-f osforité
Reakční schéma vycházející z bázemi chráněných nukleosidů jeznázorněno následně:
2a-d nítromethan' 2nBr<
HO
DMTrO 3a-d
0-P
OCH2CH2CH
4a-d a:. B = 'thymin5 b: 3 = N -benzoyladenwc: 3 ~ N^-benzoylcytosin - 14 -
'X d: B = řr-isobutyrylguanin DMTř = 4,4 -dimsthoxytrityl * * A) Příprava 3 ,5 -O-bis-DMTr-desoxyribonukleosidu 2 Násada . 6 mmol dT, dAbz , dCbz nebo . 14,4 mmol DMTr-Cl 14,9 mmol' TEA. abs. 7
Desoxyribonukleosid 1 se rozpustí v 50 ml' absolutního pyri-dinu a při 0 °C‘ se přidá triethylamin a dimethoxytritylchlorid.'Potom se 24 h míchá při teploto místnosti, přičemž, se reakce sle-duje chromatografii na tenké vrstvě (rozpouštědlo: CH^O^/^eOH9:1). Reakce, se ukončí přidáním methanolu, rozpouštědlo se- od-táhne a. zbytek se vyjme, do dichlormethanu. Organická fáze· se. ně-kolikrát promyje 1 M roztokem (NH^JHCO^ a vodou, suší se NagSO^a odstředí se. 3Zy5z-ditritylovaný produkt 2 se může Čistit od přebytečné- ho tritanolu popřípadě 5 ř-LS\£Tr-dN sloupcovou chromatografií (slou-pcový, materiál: silikagel 60H, eluační prostředek: CH^Gl^ sestoupajícím obsahem methanolu, přičemž se při 1-1,5% HeOH eluu-jí ditritylované desoxy-nuklesidy). .Výtěžek; 73~85 % teorie. 3) Specifické odštěpení 5*-d hnethoxytritylové skupiny
mV
Literatura.: M.D. Mateucci a M.H. Garuthers, Tetrahedron Lett· 21,3243-3246 (1980) Násada: 3 mmol. '3'*-yb--Q-bis-DMTr-dN 2. 15 mmol ZnBr^ ' 200 ml absolutního nitromethanu Ί·· Roztok 3 *-,5*-O-bis-DMTr-dN 2 ve . 100 ml nitromethanu se při dOj°C dá k suspěnsi bromidu zinečnateho v dalších 100 ml nitrome- thanu. V případe'chráněného desoxyadenosinu byla reakce dále ve-, děna za’ chlazení, aby se zamétilo depurinisaci. Přesto je u to- hoto nukleosidu odštěpení úplné již po 60 min., jak je možno zji- stit chromatografii na tenké vrstvě. 0 thymidinu a desoxyguanosi- - 15 - nu. je rovněž reakce ukončena při teplotě místností po 60 min.,zatím co 5'-detritylace: bis-DMTr-desoxycytidinu probíhá jen ne-úplně. Zde se reakce přerušila po 3 hodinách, aby se zabrániloodštěpení také 3*-dimethoxy-tritylové skupiny. Přerušení reakce se provede přidáním 200 ml 1 M roztokuNH^Acj produkt. 3 se extrahuje 200 ml CH^Ol·^, organická fáze seještě promyje nasyceným roztokem NaCl a vodou, suší se' Na^SO^ arozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu.
Hlavní množství tritanolu se muže oddělit vysrážením suro-vého produktu v ca. 500 ml n-hexanu při -15 °C:. Čištěni se pro-vede. chromátograficky přes: sloupec silikage.lu. 6QH dichlormetha- nem se stoupajícím: obsahem methane] jako eluaČním prostředkem Hodnoty R„. 3 •DMTr-desoxyribonukleosidů se lisí od odpoví· dajících 5 z-tritylovaných monomerů. následovně-(rozpouštědlo: CH^Ol^/MeH' 24:1): 3 '-DMTr-dN 5 '-DMTr-dN dT.‘ ‘ 0,28 0,21 Dabz 0,55 0,29 dCbz; 0,53 0,3*1 dGlbu'·· 0,32 0,14 Výtěžky:·· 42-65 % teorie. C) Příprava esteramidu . kyseliny 3'“0-DMTr-desoxytrib.onukleo---------------sid-5 -0—(K,-N-dii-sopropylamino-^-kyanoethoxy—)fosforité
Literatura: H. KSster, Nucleic- Acids Hes. 12, 4539-4557 (1984) Násada: 1 mmol 3-0-DMTr-desoxyribonukleosidu 3 1,5 mmol chloro-KjN-diisopropylamino-^-kyanoethoxy- fosfinu 4 mmol diisopropylaminu
Posfitylační reakce byly provedeny analogicky methode pop-sané KOs.terem et al. k výrobě esteramidukyseliny 5*-0-DKTr-de-soxytribonuklaosió-3x-0-fosforlté. K rozpuštění chráněných-pu-kle osidů v absolutním O^Clg byl pod argonem přidán diisopropyl- - 16 - amin, potom fosforylační prostředek. Po 30 min byla reakce ukon-čena přidáním 30 -ml ethylacetatu, roztok 3x extrahován nasyceným-,roztokem WaGl, organická fáze. sušena a rozpouštědlo odde- stilbváno.ve vakuu. Surový produkt byl čištěn sloupcovou chroma-tografií -(sloupcový materiál: silikagel‘60H, eluační prostředek:petrcfether/dichlormethan/triethylamin 45:45:10) Výtěžek 4a: '23 % teorie.· "Přiklad 2 Příprava thymidilyl-thymidinu. s 3z-3z-fosfodiesterovou vazbou Dále. je uveden průběh reakce- k přípravě, dimerního bloku 0
6 17 -
I
O = P -0CH2CH2CN
HAc
O = P - OH
10 - 18.' A) Příprava 5 *-O-dimethoxytritylthymidinu 5 Násada : 20 mmol. thymidinu (4,84 g) 24 mmol 4,4/^dimethoxytritylchloridu (8,-2 g) 1 mmol diaiethylaminopyridinu (122 mg) 28 mmol abs. triethylaminu (3,8 ml) Příprava se provede methodou R.A. Jonese (G.S. Ti, 3.L.Gaffney and R.A. Jones, H. Amer. Chem. Soc. 104, 1316-1319.(1982))Tnymidin se suší 3 násobným- odpařením vždy s 50 ml absolutníhopyridinu, vyjme se do 100 ml pyridinu a za chlazení ledem se. při-?dá 4,4 *-DMTr-Cl a DMAP jako katalysator·. Reakce se kontroluje-chromatografií na tenké vrstvě (rozpouštědlo CH^Cig/MeOH 9:1); 'Po 4 hodinách je možné, reakci přerušit přidáním 100 ml vody. Roz-tok se 3x extrahuje etherem, organická fáze.se suší a odstředía zbytek se čistí překr.ystalováním z benzenu. Výtěžek: 9,68 g DMTr-dT (89 %) B) Příprava- esteramidu kyseliny 5*-0-dimethoxytritvlthymidin-3 *-0-(Κ,Ν-diisopropylamino-^-cyanoethoxy-)fosf orité 6 t Příprava a čištění 6 se provádí přiměřeně synthese esteru-kyseliny. 3 "-O-DMTr-5*-0-fosforité- 4 (příklad,.1, C). · C) Příprava 5*-Q-acetylthymidinu 8 ’ ; Násada: 2,0 .mmol 3 '-0-DMTr-dT. 3a (1,1 g) 0,2 mmol dimethylaminopyridinu (12,2 mg) 4 ml acetanhydridu .1
Literatura: A.M. Michelson and A.R. Todd, J. Org. Chem. 1955,2632-2638 (modifikováno) / K roztoku 3 z-O-DMTr-dT a DMAP ve 20 ml absolutního pyridinu► se za chlazení ledem přikape Ac^O. Po 3 hodinách reakční doby je .
reakce úplná (kontrola chromatograficky, rozpouštědlo CP^CIg/MeOH 24:1). Produkt se vvsráží 400 ml ledové vody, bílá sraženina se odsaje, promyje ledovou vodou a suší se. 19-- Výtěžek: l}02 g 3'-0-DMTr-5'-0-Ac-dT (88 %) K odštěpení 4,4*-dimethoxytritylové skupiny se 7 při te-plotě .místnosti míchá v 10 ml 80%.kyseliny octové. Přidáním 100ml ledové vody se~reákce po 3 hodinách ukončí; při tom 4,4*-di-methoxytritanol vypadne jako bílá sraženina. Odsaje se a vodnýfiltrát, se, odstředí.--Ole jovitý zbytek se vyjme do malého množ-ství GH^Clg a při -15 °C 'se-vysráží ve 200 ml n-hexanu. Výtěžek: 455 mg .5‘"-O-acetylthymidinu (94 %). D) Příprava a .thymidilyl- (3 *-3 /)thymidinul’..-,10 Násada: 1,0 mmol esteramidu kyseliny 5*-0-DMTr-thymidin-3*-0-(N,N-diisopropylamino-/^-kyanoethoxy-)-fosfo-rité ó (705,8 mg) 0,9 mmol 5*-O-acetylthymidinu. 8 (253 mg) 2,6 mmol tetrazolu (182 mg) 9,0 mmol Jg (Í>Í4 g)
Synthesa dimerovéhó bloku 10 se může provést methodou popsa-nou- KQsterem (H. Kflster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557 (1984))k výrobě 3*-5*-nukleosiddimerů. Směs 5z~O-acetylthymidinu a te-trazolu se rozpustí v" 30 .ml absolutního CH^CN.-a pod argonem se. dák "estěramidů kyseliny fosforite. Přidá se 9 mmol v-30 ml smě- i si acetonitril/pyridln/voda (24:5^1) a po, dalších 15 minutách se-,.....—; - pře by t e č n.ý j od-. - r eduku-j e 5 -ml· 4 0% - r o z toku SOp - -Roz tok ~ se pak---------- zahustí, zbytek se vyjme do CH^Clg, 2x se pr omyje nasyceným roz-tokem NaHCO^ a rozpouštědlo se oddestiluje. Surový produkt' se mů-že čistit na sloupcové chromatografii (sloupcový materiál: sili-kagel 60H, eluační prostředek: ethylacetát/dichlormethan 50:50).Výtěžek: 66? mg (75 %)· ' K odštěpení acetylové a -kyanoethylóvé skupiny se. na di- mer 1 hodinu působí 5 ml koncentrovaného-NIL při teplotě místno- * 1 t -3 . sti; 4,4 -dimethoxy tri tylová skupina se může odstranit 80% kyse- linou'octovou. Příklad 3 - 20 - _ 14 Příprava thymidilyl-thymidinu s 5z-5-fosfodiesterovou vazbouNásledující schéma ukazuje přípravu 14.
12
NC.GH2CH20x
4a 1. tetrazol2,. Jn
OH
13 i
Jednotlivé reakční kroky k synthese mezistupňů se provádějí metho-dami odpovídajícími methodám-popsaným v příkladu 2
Struktura obou dimerových bloků se může prokázat FAB-hmoto-. vou spektrometrií a spektroskopií 1H-jaderné resonance. ' * Příklad 4
Uchycení 3 z-0-dimethoxytrityl-desoxyribonukleosid-5 z-O-sukc.inátuna nosném materiálu CPU 10-1400 - 21 -
Funkcionalisace CPO-nosiče. 3-aminopropylovými řetězci seprovádí podle předpisu Atkinsona a Smitha (T. Atkinson, M. Smithv Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait (ed), 35-49 (1984))· A) Příprava 3 z-O-DMTr-desoxyribonukleosid-5 z-Q-sukcinátu 15 Násada 1,0-mmol 3 '-O-DMTr-dN 3 0,8 mmol ánhydridu kyseliny jantarové (80 mg)0,5 mmol dimethylaminopyridinu (61 mg)
Reakce, ánhydridu· kyseliny jantarové s 5*-0H skupinou' deso-xyribonukleosidu se provádí přes noc při teplotě místnosti vždyv 5 ml absolutního pyridinu s DMAP jako katalysatorem. Po dokon-čení reakce se roztok zahustí a pyridin se odstraní 3násobnouazeotropní destilací s toluenem. Zbytek se vyjme do dichlorme-thanu, promyje se ledově, studeným roztokem kyseliny citrónové(10%) a HgO a organická fáze se odstředí ve vakuu. Surový produktse rozpustí v ca. 3 ml toluenu a vysréží se v 200 ml hexanu.Výtěžek: 79-84 % 3) Příprava 3 *-Q-DMTr-desoxyribonukleosid-5*-0-sukcinyl-p-nltro-fenylesteru 16 a zachycení na nosiči { vilz následné schéma) u % zí Λ £ Λ V; - 22
Násada: 0,8 mmol 3 *-0-Dií/ÍTr-dN-5 ^-O-sukcinátu lp 0,8 mmol p-nitrofenolu (112 mg) 2,0 mmol dicyklohexylkarbodiimidu (412 mg) 3 £ funkcionalisovaného CFG 10-1400'
Chráněný sukcinylovaný desoxytribonukleosiď. se dá k rozto-ku p-nitrofenolu v 5 ml absolutního dioxanu a 0,2 ml pyridinu apotom se přidá DCC1 jako kondensaění prostředek. Po krátké doběvypadává dicyklohexylmočovina a po 3 hodinách ukazuje chromato-grafie na tenké vrstvě (CH^Cl^/MeOH 9:1) úplné zreagování. Sra- - 23 ženina se pod argonem odsaje a filtrát se přímo dá-k suspensi | * J . . funkeionalisováného nosného materiálu v 15 ml absolutního DMF. $ · ΐ X Λ . '1 Přidá se 0,8 ml triethylaminu a násada se třepe přes noc. Zátí- ’ $ zeny nosič se pak odsaje, promyje methanolem a etherem a v exi- s | * Sl kátoru se suší. !i I Í1 í .
Zatížení nosiče se stanoví spektrometricky. Působením 10 · ? ? . »’ . ml 0,1 W roztoku kyseliny p-toluensulfonové v acetonitrilu na í vzorek nosiče- (ca. 2 mg) se 4,4z-dimethoxytritylkation odštěpí í a měřením absdrpce. roztoku při 498' nm Se podle vzorce $
(I • l OD^Qg/ml x 10 ml x 14,3 (konst.) . — — . mg nosiče i <. nechá vypočítat, zatížení, nosiče v yumol/g.. Výsledky: 3 z-DMTr-dT- nosič: 23. yumol/g 3'-DLíTr-dG^bU-nosič : 21 ^imol/g 3z-DMTr-dA.bz -nosič: 21.jimol/g 3 z-OiiíTr-dCbz -nosič: 15 yumol/g K blokování nezreagováných aminoskupin se zatížený nosič' 1' -hodinu při teplotě'místnosti třepe s roztokem 1 ml anhydridukyseliny octové a 50 mg dimethylaminopyridinu v 15 ml absolutní-ho pyridinu, potom se odsaje, promyje methanolem a ^etherem a_su- to A 0 Příklad 5 i $ 1 h · · JÍ
a) Synthesa oligonukleotidů s terminální 3 *-3-- a 5*-5*-vazbou r J ·· ’ ' ' b • ' . ' . ' ;í A j. ki , Synthesy se provádějí v- DNA -synthesizeru firmy Applied ; í ’ ,
Biosystems, Forster Gity, USA, Modell 3S1A, za použití 0,2 ^umol g standartního programu pro kondensaČní kroky. Synthesnfcykl' je j ukázán dříve (str. 11). Jako nosný materiál slouží CPI 10-1400 í popsaný v příkladu 4- Kondensace se provádějí s obvyklými estery | kyselin^fosforité; pouze v posledním reakčním cyklu se nasadí nukíeosid-3- í v - 24 - η· -v příkladu 1 popsané esteramidy kyseliny 3/-0-DíáTr-nukleosid->/- 0-(N,W-diisopropylamino-/5-kyano-ethoxy-)fosforíté. Po odštěpe-ní oligónukleotidu z nosiče- konc. KH-^ a odstranění všech fosfá-tových a bas ických ochranných skupin zahříváním amoniakálníhoroztoku na 60 C přes noc se yzorek odsolí vysráženínr v ethano-lu a cílový, řetězec se .elektroforesou na polyakrylamidovém gelu,čistí' od kratších fragmentu. -Pro pokusy, se synthetisoval eicosathymidylat s pouze. 3Z-5Z“ .vazbami jakož i scterminálními 3*-3*- a 5z-5*- vazbami. Mimo tose volily řetězce z SV40 - genomu. Byly synthetisovány následu-jící oligonukleotidy: dT20 ’ dT2O(3*-3z, 5*-5*)í SV40TS17: 17-mer, řetězec ve smyslu kódu z S740-genom. na polo-hách >159-5176; 5 '-AGC TTT GGA. AAG ATG GA-3 ' SV4OTAS17: 17-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV4OTS17í5*-TCG: ATC TTT. GCA AAG CT-3* 3V4OTAS17 (3 *-3 *,.5 ^5.7): 17-mer, řetězec ..proti,-smyslu kódu k -i .. 3740T317 s 3'-3'- popřípadě .5'-5*-vazbou na koncích} 3 '-T (5 '-5 ')CC ATG TTT' GCA. AAG. C(3 '-3 *)T-5* SV4OTS35; 35-mer, řetězec ve smyslu kódu z SV40-genomu na polo-hách 5142-5176; 5*-AGG TTT GGA AAGaGAT AAA GTT TTA AAG AGA AG-3*
ATG 5740AS35; 35-mer, řetězec proti smyslu kódu k'SV4OTS35; 5*-TCT CTG TTT AAA AG'T TTA TGG ATG TTT GCA AAG CT-3* S740TAS35(3*y3*,5*-5*): 35-mer, řetězec proti-smyslu kódu k 3V40T335 s 3#-3*- popřípadě 5 '-5*- vaz-bou na koncích; 3z-T(5'-5')CT CTG TTT AAA ACT TTA TGG ATG TTT GCA AAGC (33*)T-5* - 25.- b) Synthesa oligonukleotidů s terminální 3'-3'-vazbou
Jako,nosný materiál slouží GPG 10-1400 popsaný v příkladu 4.
Kondensace se provede s obvyklými estery kyseliny nukleosid-3*-fosforité.
Po odštěpení oligonukleotidu z nosiče konc. a odstraně-ní všech fosfátových a-.basickýčhJóchranných· skupin zahřívánímamoniakálního roztoku na-60 °C přes noc se vzorek odsolí vysrá-žením v ěthanolu a cílový řetězec se elektroforesou na polyakryl-amidovém gelu čistí od krátkých fragmentů. 3V40TAS17 (3'-3'): 17-mer, řetězec proti smyslu kódu k 3V40TS17 s 3'-3'- vazbou na konci 3'-TCC ATG TTT GCA AAG 0(3 '-3 ')T.-5* c) Synthesa oligonukleotidů s terminální 5'-vazbou a 2 terminál-ními thiofosfátovými zbytky
Jako nosný materiál slouží komerční CPG-materiál s 5'-O-di-methoxytritylthymidinem vázaným přes 3 '-hydroxyskupinu. Kondensa-ce se provede s obvyklými estery kyseliny nukleosÍd-3'-fosforitéjpouze v posledním reakčním cyklu se nasadí esteramidy kyseliny3 *-O-DMTr-nukleosid-5· '-0- (Ν-,Ν-diisopropylaminů-^3 -kyano-ethoxy)-fosforitéýpopsaně.·’ v.-příkladu 1. U prvých dvou'reakčních. cyklů se mís.to obvyklé oxidace jodemprovede'"“oxi'dace eleměntarní’sírou (W. "Stec et aí. J.A.G.Š. 106,str. 6077, 1984).
Po odštěpení oligonukleotidu od nosiče- konc. KH^ a odstra-nění všech fosfátových, a basických ochranných skupin zahřívánímamoniakálního roztoku na 60 C přes noc se vzorek odsolí vysré-žením v ethanolu a cílový řetězec se Čistí od kratších fragmen-tů elektroforesou na pólyakrylamidovém gelu·
Synthetisuje se následující oligonukleotid: SV4OTAS17{5*-5'); 17-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV40TS17 s 5'-5.'- vazbou na 5'- konci a dvěmi thiofos-fatinternukleotidnimi vazbami na 3'- konci - 26 - 3'-T(5'-5')CC ATC ΤΤΓ GGA AAG(P ) C(P )T-3* S. 3 Příklad r.6
Analysa struktury a řetězce oligonukleotidu s terminální 3*-3'- a 5 -5 - vazbou
Analysa řetězce oligonukleotidu se provádí methodou Maxamaa Gilberta (A.M. ifexam a V/. Gilbert, Methods, in Lnzymology 65,499— 56Q (1960)). Vždy 100 pmol vzorku se v přítomnost i (^*-^P )-ATP/T4- polynukleotidkinasy na 5'-0H-skupině radioaktivně značía potom se provedou následující bazicky specifické reakce; (A+G) - reakce;G . - reakce;(T+0) - reakce;C - reakce; protonace bází kyselinou mravenčíreakce s dimethylsulfátemhydrazinolysa reakce s hydrazinem v přítomnosti 5 M NaCl V- Působením 1 ií piperidinu při 95 C se oligonukleotidové ře-tězce štěpí na modifikovaných místech; zlomky se mohou elektrofo-resou na polyakrylamidovém gelu oddělit (20 % .akrylamiďu, 7 M mo-čoviny) a autoradiografií detektovat. Obr. 1 ukazuje autoradio-gram analysy řetězce' SV4OTS17, 3V40TAŠ1? a 3V40TA517 (3 '-3 *,5 '-5 ')"(popis oligonukleotidu- viz příklad 5)* Poněvadž jsou řetězce na5ř-0H skupině značené, může se sled bází ύ pouze 3'-5'-vazeb ode-čítat ve směru 3'-5'-směru. V důsledku- 3'-3'- konce má však oli-
gonukleotid 3V4OTAS17(3'-3',5'-5') radioaktivně značenou 5'-0H « skupinu na svérkoncové části; směr odečítání řetězce se tím otá-čí (obr.jl). To je také důkazem pro 5'-5'-fosfodiesterovou vaz-bu na 5'- koncová části řetězce s volnou 3skupinou, kteráse enzymem polynukleotidkinasy nemůže fosforylovat. Příklad 7
Zkouška stability oligonukleotidu s 3'-3' a 5'-5' konci v testukrevního sera - 27i A) Kinasace eicosathymidylatu s 3*- 3*- a 5*- 5*- konciLiteratury: Τ. Mizuno, M.Y. Chou a Lí. Inouya, Proč. Nati. Acad.Sci. USA 81, 1966-1970 (1984) Násada: 1 /ul ollgonukleotid (0,01 OD26q) 1 /ul 10 x kihasa - pufr 1 yul T4-polynukleótidkinasa 1 Z“1 <T- ? -dATP (spec. aktivita: 6000 Ci/mmol)· 6. /ul ^0 Násada se 30 min inkubuje při 37 °C, potom se přidáním 90/ul H2O ukončí a frakciohuje se přes- sloupec ® Sephadex G 50.Produkční frakce sě- spojí a lyofilisují se. 8)· Test krevního sera,
Literatura: S.M. Heywood, Nucleic Acids Pes. 14., 6771-6772 (1986) Násada: 0,01 0D2^q .radioaktivně fosfořylovaného oligonukleoti-du pro kontrolní vzorek, 0,01 ODggQ T^q pro zkoušku0,01 0^260^20 s 3- *-3/- a'5*-5z- koncovými .vazbami - s 50 ul čerstvého lidského sera .
Serum.se dá ke vzorku a krátce: se. ručně, třepe. Potom se: . ihned pro. 0-hodnotu odpipetuji 3 /ul a dají se do 3 /uí. pufru sformamidem, aby se přerušila aktivita enzymu. Potom se vzorekíňkubuje “pr Γ 17“'°07 ' ------- -
Pro kinetiku se po určitých, časových úsecích odeberou 3 úla přeruší se. jak popsáno shora. ?
Kontrolní vzorek: 5min. , 8 min., 11 min.'·, 15 min., 30 min.
Zkouška·: 5 min., 8'min., 11 min., 15 min., 30 min., 90. min.
Vzorky se dají na 20% polyakrylamidový gel, dělí se elektrofo-resou na gelu a potom se autoradiografují. Áutoraďiogřam-štěpení s čerstvým lidským .šerem zleva (viz. obr.2):
Kontrolní vzorek: O-hodnota, 5 min.,8 min.,11 min.,15 min. ,30-min.Zkouška: O-hodnota, 5 min.,8 min., 11 min., 15 min., 30 min., 90 min. - 28 - _
Již. po 5 minutách se ukazuje, že začalo i odbourávání přírod-ního- oligonukleotidů. Štěpení se. zvyšuje s přibývajícím časem.Modifikovaný oligonukléotid' zůstává, i po 90 minutách, inkubaceprakticky nezměněn.- Slabé pásy, které jsou vidět při všech hod-
- I notách kinetiky, résultují z aktivity endonukleas,,které, jsou,přítomné v.seru. Toto štěpení je důležité pro therapeutické pou-žití těchto oligonukleotidů, poněvadž zaručuje-pomalé odbourává-ní účinné .substance a nemůže tím dojít k' akumulaci těchto subs-tancí v těle., Příklad 8
Zkouška chování oligonukleotidů s terminélní 3 *-3'- a 5*-5Z- vaz-bou proti fosfodiesterase z hadího-.jedu A) Kinasace eicosathymidylatu s 3?-3*- a 5*-5konciJak popsáno v přikladu 7 B) fíydrolysa eicosathymidylatu .s-3 ?-3 *- a 5^-5^- konci pomocífosfodiesterasy z hadího jedu
Literatura: A..Hirashima, 3. Sawaki,.Y. lnokuchi a M..Inouye,. PNAS" USA 83,- 7726-7730' (19S5) Násada: 5' yul 50 yul
1 pX RNA- nosiče-SQ - pufruSVpdE (1,5 u/ul)
Radioaktivně fosforyl.ovaný vzorek (standart: T^q, zkouška: T'2q s terminální 3*“3*- a 5r-5*- vazbou) se lyofilisuje, k tomu se dá RNA - nosič a SQ - pufr. Od této směsi se pro 0-hodnotu odpipetuje 5 ul, ke zbytku roztoku se přidá enzym a při 37 °0 se. inkubuje. Pro kinet.iku standartu se odebere po 5 min., po 15 min. a oo 30 inin. no 5/ul, pro kinetiku eicosathymidylatu s 3 *-3*, / .- do’ . ' . , _ , ' . a 5 -5 -konci sé 5 mm., 30 mm., 45 mm. , óO mm. a 90 mm. ode-bere po 5yul. K desaktivaci enzymu se vzorky přímo po odběru za-hřívají na vodní lázni 2 min. na 95 °G. Vzorky se lyofilisují a - 29. -
I nanesou se na analytický 20% polyakrylamidový gel. Po gelelektro-lytickém dělení se autorádiografuje.
Autoradiogramm SVpdS - štěpení (viz obr. 3) zleva: T£q(standart), s terminélními 3'-3'- a 5'-5'-vazbami, kině tiká zkoušky: po 5 min., 15 min., 30 min., 45'min., 60 min.,90 min., mix z. 0 min./15 min., mix z 0 min./30. min., kinetikastandartu: po 5, min.,· 15 min., 30. min. , 45 min.
Vazba'5*- 5' se, jak již popsáno, ihned štěpí. Že dalšíŠtěpení ve srovnání se standartem pokračuje ještě jen velmi po-malu, je značný strukturní průkaz. Po štěpení 5'-5·*- fosfordi-esterové vazby vznikne .molekula, která na místě· štěpení, nese 5*"hydroxylovou funkci. Na druhérkoncové části je molekula 5'-fosf'o-rylovaná. Obě koncové části jsou pro fosfodiesterasu z hadího je-du nenapadnutelné. Pomalé',· ale velmi značné další odbourávání jepravděpodobně., podle výrobce popsaných přísad (J.G.- Izant a H. 'Weintraub, Cell 36, 1007-1015(1964}), možné odvozovat od jedňo-řetězcově -specifické endonukleasy, která PM2 DNA mění v otevřenéformy. Krásně je možné' odečíst dálku řetězce. Je však možné ode-číst pouzeΊ9 pásů, poněvadž při první hodnotě kinetiky, po 5min., je 5*- 5*-fosfodiesterová vazbu jíž odštěpena. Příklad 9 '2'koušky hýbridisáčního chování oligonukleotidů opatřených termi-nálními 3Z-3*- a 5 5 '-'konci
Ke zkouškám hýbridisáčního chování se zaznamenávají křivkytavení vždy ekvimolárního množství (5,23 nmol) SV40TS17 a SV40-TA317 (3 '-3 5 '-5 J (popis oligonukleotidů: viz příklad 5), rozpu- stí se v 1 ml 10 nM Na-kakodylátu/100 mM NaCl-pufru, pH 7,0, za-hřeje se na 70 °C a průběh renaturace se zjištuje při pomalémochlazování (1 stupeň/min) měřením absorpce roztoku. X záznamukřivky standartu se použijí stejná množství 3V40TA317. Analogic-ky se v pufru mísí vždy- 4,75 nmol 3V4OTS35 a 3V4OTAS35 popřípadě37401339 a SV4OTAS35(3'-3 5 '-i')> zahřeje se na 90 °G a absorp- ce se měří při ochlazování. "Byly zjištěny křivky tavení, které -30-^ poskytují následující hodnoty Tm S740TS17 * 5V40TAS17 54,1 °C SV4.0T317 · SV4OTAS17(3'-3',5'-5') 53,3 °C SV4OTS35 · 3V40TAS35 65,5 °C 3V40TS35 . · 3V4OTAS35(3*-3z,5z-5*) 64,2 °c
Teploty tavení se tedy abiologiekými vazbami snižují jeno 0,ó °n.. 17neru popřípadě o 1,3 °C u 35meru. Příklad 10
Inhibice biosynthesy S740 T-antigenu! oligonukleotidy s terminál-ní 3Z-3Z- a 5 "*-5*- vazbou (DIVEM) A) Buněčná kultura B.uňky G0S1 se v Eaglově prostředí, v Dulbeccově modifikaňThkultivují s 10 % fetalního telecího sera. Misky pro tkáňové kul-tury .se,,, inkubu jí při 37 °C'a 7,5 °C’ CO^· 3) Radioaktivní značení a rozrušení buněk Z Z · v ·
Asi 4 x. 10 buněk se jako monolayer ds do misek pro tkáňovékultury. Buňky se třikrát -prómyjí DMEM· bez methioninu- a potomse značí lOQyuCi -?S-methioninu. Pro zkoušky modulace proti sray- , sluhkódu se. buňky současné 30 min. pří 37 °C inkubují s olígonu-kíeotiďem· 3V4OTAS17 (3 *-3 z,5z-5*) a radioaktivním methioninem. Po- ; tom se buňky dvakrát, promyjí DIVEM obsahujícím 10 % fetalního te-lecího sera a neznačený methionin a v tomto prostředí se nechají dalších 30 min. K rozrušení se na buňky působí ledové studenýmfosfátem, pufrovaný^ssiologickým roztokem NaCl (PBS), od misek seodskrábňou a 2 min se při 4.00 g odstřelují. Usazenina buněk sepak 45 min na ledě lysuje 0,4 ml rozrusovacího pufru (0,5 % no-nidetu P40, 100 mlvl tris-HCl, pH 9,0, 0,1. M NaCl) pro 3 x 103 * S bu-něk. K zamezení proteolysy 'se k·rozrušovacímu pufru. přidá 1 %trasylolu. a fenylmethylsulfonylfluorid až do konečné koncentra-ce 0,25 mg/ml. Lysat se pak 30 min. při 4 °G v ultraodstředivce(105 000 g) odstřeluje do čirá. Podíl 10yul se odebere a měří se - 31 - obsah proteinu methodou Lowry-ho. K imunopre.cipitaci se nasadístejná množství celkového proteinu. " C) Imunoprecipitace
Jak pro imunoprecipitaci 3V 40 T.-antigenu, tak taká mutant·'·.'·· T-antigenu lokali.sovaných v cytóplasmě se použije monoklonální ,: .* protilátka PAblOB. Protilátka se chromatografií na proteinu A-sefarose čistí od přebytku hybridomu. Buněčný extrakt se před-1 běžně přes noc. při 4' °C' sráží 100 pl 10% suspense teplem inakti-vovaných a formaldehydem fixovaných .bakterií kmene' Staphylokok-kus aureus (Oowanl). Bakterie se pak odstředí, zbytek se ales-pon 2 hodiny při 4 C inkubuje ε monoklonální protilátkou apřidáním 3. aureus se tvoří vysocespecifické imunokomplexy. Ten-to postup se 3 x opakuje, aby se zajistila úplná precipitace. ’····· Potom se imúnoprecipitáty promývají: třikrát 50 mM tris-HCl, pH 6,0,' 500. mM LÍCI, 1 mM DTT, 1 mlvl EDTA, 1 % trasylolujdvakrát 50 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA , 1 %,nonidetu P40 a jednou 50 mTÍ KH^HOO^. Potom se 45 min. při 4 °Celuuje- 20.0. yul elučního pufru (5Ó mM 1 % SDS, 1 % -měr- ka p.toethanolu), lyofylisuje se·, 10 minutovým varem se rozpustí vé 20yul pufru (65 mií tris-HCl, pH 6,8, 5# ^.-merkaptoethanolu,' ·" '' 1 % glycerinu, 0,01 % bromfenotové modře) a uloží se na 3% polv- ' akrylamidový gel (10 % SDS). Proteiny se rozdělí diskontinuelní ---------—elektroforesou· na-geluj-pásy se-mohou-lokal-isovat- fluorograf-i-í-—--- na rentgenovém filmu (Kodak X-AH). S oligonukleotidy připravenými podle vynálezu tak, že pro-dlouží začátek translace pro T-antigen,'bylo při použití extra-buněčné koncentrace 30yu-molérní registrována 70% ihhibice vi-rového růstu. Tb je protikladem k účinnosti odpovídajících ře- ' tezců, které nebyly staveny podle vynálezu, t.j. řetězců bez
3*73*- a 5 *-5'-vazeb. Zde při použití stejné koncentrace neby- J la zjištěna
Obr, 4tření buněk žádná inhibice.ukazuje zřejmou inhibici T-Ag-biosynthesy při ose-30 yuM SV4OTAS17 (3 ,-3 · l ť;
V í r Ϊ
V s 1) $
I š *£ ί £ (; ?. $ ř A' r; - 32 - Příklad 11
Srovnání, sérové, stability oligonukleotidů, které jsou.· modifiko-vané pouze na 3z- konci popřípadě pouze na 5*~ konci invertova-nými fosfodiesterovými vazbami
Oligonukleofidy. se ňukleasou odbourávají od své 3*- konco- vé části (J.p. Shaw, K. Kent, J. 3ird, J. Fishback, 3. Froehler,Nucleid Acids Pes. 19, 747-750 (1991). Melo by se proto zkoušet,zda sama terminální 3*-3*-fosfodiesterová vazba stačí ke stabi-lisaci oligonukleotidu v krevním seru. Poněvadž s 32p značenýfosfátový zbytek, zejména při delším působení šerem na vzorek,,se fosfatasami odštěpuje, bylo k detekci oligonukleotidu použitofluoresceinu.
Syňthetisovány byly následující řetězce z genomu XenopuS'levis:
Xelev 1: 3'-A(5'-5')GC CTG AAA C*AT. GTG TGA CG-3*
Xalev 2: 5'-AGC CTC AAA C*AT GTG TGA C(3'-3')G-5'
Synthesy se provádějí jak popsáno v příkladu 5, přičemž sepro 10. kondensaci nasadí esterámid kyseliny cytidin-fosforitéC*, který umožňuje dodatečnou kovalentní vazbu s fluoresceinem. . Vestavba fluoresceinu se provádí podle..návodu firmy-Pharmacia.(Pharmacia LKB Biotechnblogy Auto Primer ' Synthesis Kit instruc-tions-(XY-O23-OO-O1). Modifikované oligonukleotidy se Čis.tí ele-ktroforesou na polyakrylamidpvém gelu. ♦ . Sérový test: 10 pmol oligonukleotidu .140 yuL čerstvého lidského sera
Vzorky se inkubují při 37 °C..Po 15 min., 30 min., 45 min.,45 min. , 60 min., 8 hodinách a 72 hodinách, se odebere vády 20 /ml., $ 2 x. se extrahuje směsí fenol/chloroform/isoamylalkohol 25:24:1 a oligo.nukleotidy se. srazí ethanolem. Produkty štěpení se dělí a detektují na 16% polyakrylamidovém gelu v automatickém· sequen- ceru A.L.F (Pharmacia, Freiburg). Jak ukazuje obr. 5, vykazuje pouze řetězec opatřený na 5*-konci invertovanou internukleotidní vazbou již po 15 min. působení sera produkty odbourání a po 60 - 33.- min. je již téměř úplně odbourán. Oligonukleotid "chráněný” na3*-konci 3*-3*-vasbou je sám nákotí tomu po 72. hodinách teprvěčástečně odbourán. > Příklad 12
Inhibice exprese, genů v in vitro-expresním systému
Aby se kvantifikovala exprese genů INV-oligonukleotidy,byl zkoušen účinek odpovídajících oligonukleotidů s řetězcemproti.'smyslu kódu na expresi p53 v systému in vitro, aby p53obsahoval mRKA (E. Reihsaus,· M. Kohler, S. Kraiss., M. Oren, M.Montenarli, Oncogene 5j 137-144 (1990)).
Byly synthe tis ováné řetězce, proti smyslu kódu NH2(CH2)6pTAA TCA GTC GTT. GGT.: CCA CAC CTT(3 *-3 *)T" a jako' srovnávací vzorek odpovídající řetězec ve smyslů kódu NH2(CK2)ópAAÁ. GGT GTG GAG CAA CGA CTG ATT(3 '-3')A'
Oligonukleotid s řetězcem proti smyslu kódu je řízen protipočátku translace onkoproteinu p53
Zkoušeny byly exprese proteinu 1..bez přidání oligonukleotidu. · 2. při přidání 30 /uM řetězce ve smyslu kódu 3·. při přidání .1 yuM řetězce proti smyslu kódu- ^-£d^řIÍ-T0" — pp;ofT-smýšlu^kódu’· ~
Ke kvantifikaci bylo stanoveno černé zbarvení proteinových I . ' , . , ····-*·; pásů densitometrieky (E. Reihaus, M. Kohler,· S. Kraiss, Mí Oren,M. Montenarli, Oncogene 5j 137-144 (1990)).
Obr. 6 ukazuje, že přídavek 10 yuM oligonukleotidu s řetěz-cem.proti smyslu kódu kúsyštému exprese, působí ca. 70% inhibici.'Při snížení koncentrace, na 1 jjM. není více možné.7 z jistit téměřžádnou inhibici, rovněž při přídavku řetězce ve smyslu kódu,který neváže na mRlíá.·- ··

Claims (7)

  1. - 34. - advokát PATENTOVÉ NÁROKY 1 .· Analogy ' olígoniikleotiňů·. vzorců I nebo. II
  2. 2. - Oligonukleotidy vzorce I podle nároku 1, vyznačené tím, že 2 1 1R představuje zbytek vzorce 17 a R značí vodík; R popří- 2 ., , 2pádě R představují zbytek vzorců III. popřípadě IV; nebo R 1 značí vodík a R znamená zbytek vzorce III, přičemž bud W. ne-bo Z v posledním případě neznamenají kyslík.
  3. 3. Oligonukleotidy vzorce I, podle nároků 1 nebo 2, vyznačenétím, že W představuje kyslík, nebo Z a W oba znamenají ky-slík.· t 4· Oligonukleotidy vzorce I, podle nároků 1 až 3» vyznačenétím., že R představuje zbytek vzorce Γ7 a R. 2načí vodík. i · ?
  4. 4¼ - 35 R2 značí vodík nebo zbytek vzorce IV' ·(' V
    Z* - P = V/ l a* (IV) přičemž, však alespoň jeden ze zbytků R nebo R představuje zbytek vzorce. III nebo IV \ · ’ 3 představuje bázi, jako například přírodní báze jako;adenin,cytosin, guanin nebo.nepřír.odní báze., .jako .například,pur.in,2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, lA-ethano-cytosin popřípadě jejich prekursorové formy l’ Ϊ Λ c y £ í5 % <*: $ $ í5 0' jí £ £/* .y £ £ k £ I § W a- W* nezávisle na sobě značí kyslík, nebo síru,.. I- Z" a Z* nezávisle na sobě značí 0; S; alkoxyskupinu s 1 až'18 atomy uhlíku,· výhodně akloxyskupinu 's: 1 až 8 atomy uhlí-ku, 2vlášt výhodně alkoxyskupinu s I až 3 atomy, uhlíku,zejména methoxyskupinu; alkyl s'l až 18 atomy, uhlíku, i . váhodně alkyl s l .aš 8 atomy uhlíku, zvlášt výhodně'· al-: 3 3 kyl s 1 až 3 atomy uhlíku, zejména methylj. NHRJ s Rznamenajícím výhodně alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, zvlá-št výhodně: alkyl sl až 8 atomy uhlíku, ze jména.alkyls 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkoxy-alkyl s 1 až 4 atomyuhlíku v alkoxyzbytku a s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylo- vém zbytku, výhodně methoxyethylj NR^R^", kde má sho-A ra uvedený význam a R značí výhodně alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, zvlásí.výhodně alkyl s 1 až 8 atomy'uhlí-3 ku, zejména alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo kde R aspolu s nosným atomem dusíku značí 5 až 6 členný ,he- 1 .'íl “ 36 ~ iterocyklický kruh,, který muže navíc: obsahovat další he-teroatom 2 rady 0, S, Ν', jako například morfolin, Y značí zbytek z řady O-SitR)^» OGH^, C(O)NR nebo í ! - OCH^-CÍO), kde R představuje, alkyl s I až 6 atomy uhlíku, aryl nebo cykloalkyl s 5 popřípadě 6 atomy uhlí-ku j n znamená celé číslo 5 až 60, výhodně 10 až 40 a zejména 15 až 25, jakož: i jejich fysiologicky snášenlivé sole.
  5. 5. Oligonukleotidy vzorců I a II, podle nároků 1 až 4, vyznače-né tím, že jsou navíc· substituované skupinami, které podporujíintrabuněčný příjem, které slouží jako značící skupiny in vitronebo in vivo a/nebo skupiny, které při hybridisaci oligonukleo-tidu na biologické DNA nebo RNA tyto DNA- nebo RNA molekuly zavázání nebo .Štěpení napadají.
  6. 6* Způsob výroby oligonukleotidů vzorce I, podle nároků 1 až, 5,vyznačený tím, že se - 37 - >* ,·1. fA. a) nukleotidní jednotka· s 3 *- popřípadě 5^-terminálními skupi-nami fosforu(III) nebo fosforu(T) nebo její aktivovaný deri-vát nechá reagovat s další nukleotidní jednotkou s 3*- po-případě.^ 5 *-terminálně -.volnou- hydř oxyskupinou, nebo '· ·;.μ b) ' oligonukleotid připraví z fragmentů stejným způsobem, v oligonukleotidech získaných podle (a)'nebo (b) se popřípa-dě jedna nebo několik ochranných skupin- zavedených dočasně k ochraně ostatních funkcí odštěpí a takto získané .oligonu-kleotidy vzorce I se popřípadě převedou ve svou fyšiologic- ky snášenlivou sůl.
  7. 7· Oligonukleotidy vzorců I a II, podle nároků 1 až 5 k použi-tí pro hybridisacněchemické, na adici na nukleové kyseliny s dvoj-ným nebo jedním řetězcem'spočívá jícím, postupu regulace nebo po-tlačování biologických funkcí nukleových kyselin, jakož I k se-lektivnímu potlačování exprese funkcí virového genomu a k profy-laxi a therapii virových funkcí, k potlačování nádorové funkcea k.therapii rakovinných onemocnění. Ϊ 8». Léčiva obsahující jednu nebo několik- sloučenin podle náro- t . ků 1 až 5, popřípadě spolu s. fysiol-ogicky- snášenlivými .pomocný-mi a/nebo nosnými látkami zejména pro intravenosní nebo topic- kou aplikaci..
    I
CS912014A 1990-07-02 1991-07-01 Analogy oligonukleotidů s terminálními 3`-3` -popřípadě 5`-5`-internukleotidními vazbami, způs ob jejich výroby a použití CZ285408B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4021019 1990-07-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS201491A3 true CS201491A3 (en) 1992-01-15
CZ285408B6 CZ285408B6 (cs) 1999-08-11

Family

ID=6409497

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5750669A (cs)
EP (1) EP0464638B1 (cs)
JP (1) JP3186795B2 (cs)
KR (1) KR100200400B1 (cs)
AT (1) ATE151076T1 (cs)
AU (1) AU647143B2 (cs)
CA (1) CA2045891C (cs)
CZ (1) CZ285408B6 (cs)
DE (1) DE59108644D1 (cs)
DK (1) DK0464638T3 (cs)
ES (1) ES2099718T3 (cs)
FI (1) FI104177B1 (cs)
GR (1) GR3023432T3 (cs)
HU (1) HU215147B (cs)
IE (1) IE912309A1 (cs)
IL (1) IL98672A (cs)
NO (1) NO303018B1 (cs)
NZ (1) NZ238769A (cs)
PT (1) PT98169B (cs)
SK (1) SK279544B6 (cs)
TW (1) TW206232B (cs)
ZA (1) ZA915056B (cs)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223618A (en) * 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
EP0593901B2 (de) * 1992-09-24 2008-04-09 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Oligoribonucleotid- und Ribozym-Analoga mit terminalen 3'-3'-bzw.5'-5'-Verknüpfungen
HU9501974D0 (en) * 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US6015886A (en) * 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6605708B1 (en) * 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20080119427A1 (en) * 1996-06-06 2008-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US7309692B1 (en) * 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
CN1060177C (zh) * 1997-06-28 2001-01-03 中国科学院上海生物化学研究所 3′－单磷酸化寡核苷酸
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US20030180789A1 (en) * 1998-12-30 2003-09-25 Dale Roderic M.K. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
DE19935756A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation
DE19935303A1 (de) 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US6271360B1 (en) 1999-08-27 2001-08-07 Valigen (Us), Inc. Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors
EP1702983A3 (en) 2000-04-13 2007-01-10 Medical University of South Carolina Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, DNAzymes and antisense oligonucleotides and methods of use thereof
JP2004503560A (ja) * 2000-06-13 2004-02-05 プロリゴ・エルエルシー 固相オリゴ合成の普遍固形支持体とその製造及び使用の方法
AU2001294750C1 (en) * 2000-09-26 2008-09-18 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
GB0114007D0 (en) * 2001-06-08 2001-08-01 Isis Innovation Oilgonucleotides
US7070933B2 (en) * 2001-09-28 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Inversion probes
US20040043950A1 (en) * 2002-01-03 2004-03-04 Board Of Regents, The University Of Texas System WT1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
WO2003066649A1 (en) * 2002-02-04 2003-08-14 Biomira Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
CA2504720C (en) 2002-11-05 2013-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
CA2679750A1 (en) 2008-09-23 2010-03-23 Nexus Dx, Inc. Methods for detecting nucleic acids in a sample
EP2781523A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Miltenyi Biotec GmbH Lipophilic oligonucleotide analogs
KR101323476B1 (ko) * 2013-06-12 2013-10-31 조선미 건물용 층간소음 방지재와 이를 이용한 층간소음 방지구조 및 그 시공 방법
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
EP3825400B1 (en) * 2016-04-08 2024-12-25 Translate Bio, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
JP2020522510A (ja) 2017-06-02 2020-07-30 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法
CA3094598A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Tsinghua University Methods of sequencing and producing nucleic acid sequences
SG11202009877XA (en) * 2018-04-12 2020-11-27 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
US12391942B2 (en) 2018-05-11 2025-08-19 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4123610A (en) * 1977-03-09 1978-10-31 The United States Government Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
DE3332068A1 (de) * 1983-09-06 1985-03-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur herstellung von nukleosidalkyl-, aralkyl- und arylphosphoniten und -phosphonaten
US4795700A (en) * 1985-01-25 1989-01-03 California Institute Of Technology Nucleic acid probes and methods of using same
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
JPH03503894A (ja) * 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
WO1990012022A1 (en) * 1989-03-31 1990-10-18 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections

Also Published As

Publication number Publication date
US5750669A (en) 1998-05-12
EP0464638A2 (de) 1992-01-08
IL98672A0 (en) 1992-07-15
FI913169L (fi) 1992-01-03
AU647143B2 (en) 1994-03-17
FI104177B (fi) 1999-11-30
PT98169B (pt) 1998-12-31
FI913169A0 (fi) 1991-06-28
HUT62010A (en) 1993-03-29
ES2099718T3 (es) 1997-06-01
EP0464638B1 (de) 1997-04-02
ZA915056B (en) 1992-03-25
DE59108644D1 (de) 1997-05-07
JP3186795B2 (ja) 2001-07-11
NO303018B1 (no) 1998-05-18
KR920002625A (ko) 1992-02-28
NO912585D0 (no) 1991-07-01
ATE151076T1 (de) 1997-04-15
IL98672A (en) 1995-12-08
FI104177B1 (fi) 1999-11-30
DK0464638T3 (da) 1997-10-13
JPH05222088A (ja) 1993-08-31
HU215147B (hu) 2000-03-28
PT98169A (pt) 1993-09-30
GR3023432T3 (en) 1997-08-29
SK279544B6 (sk) 1998-12-02
EP0464638A3 (en) 1992-09-02
TW206232B (cs) 1993-05-21
IE912309A1 (en) 1992-01-15
HU912215D0 (en) 1991-12-30
KR100200400B1 (ko) 1999-06-15
AU7947591A (en) 1992-01-02
NO912585L (no) 1992-01-03
NZ238769A (en) 1993-11-25
CZ285408B6 (cs) 1999-08-11
CA2045891C (en) 2003-07-22
CA2045891A1 (en) 1992-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS201491A3 (en) Analogs of oligonucleotides with terminal 3&#39;-3&#39; - optionally 5&#39;-5&#39; - internucleotide bonds, process of their preparation and use
JP3170241B2 (ja) ヌクレオチド試薬
US5955599A (en) Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
EP1113020B1 (en) Nucleosides and oligonucleotides containing boron clusters
JP3653102B2 (ja) 末端３′−３′および／または５′−５′連鎖を有するオリゴリボヌクレオチドおよびリボザイム類縁体
JP2004500330A (ja) グアニジニウム官能化オリゴマーとその製造法
JP2000507928A (ja) ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法
JPH09505306A (ja) 非ホスホネートヌクレオシド間結合と混合している不確定キラリティーのホスホネートヌクレオシド間結合を有する合成オリゴマー
CA2087817C (en) 3&#39;-derivatized oligonucleotide analogs with non-nucleotidic groupings, their preparation and use
EP0749436A1 (en) Compositions and methods for use in the synthesis of oligonucleotides
RU2088588C1 (ru) Олигонуклеотиды и способ их получения
WO2000004189A1 (en) Modified oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20110701