CZ285408B6 - Analogy oligonukleotidů s terminálními 3`-3` -popřípadě 5`-5`-internukleotidními vazbami, způs ob jejich výroby a použití - Google Patents
Analogy oligonukleotidů s terminálními 3`-3` -popřípadě 5`-5`-internukleotidními vazbami, způs ob jejich výroby a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285408B6 CZ285408B6 CS912014A CS201491A CZ285408B6 CZ 285408 B6 CZ285408 B6 CZ 285408B6 CS 912014 A CS912014 A CS 912014A CS 201491 A CS201491 A CS 201491A CZ 285408 B6 CZ285408 B6 CZ 285408B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- carbon atoms
- formula
- oligonucleotides
- alkyl
- groups
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 107
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 18
- -1 alkoxy radical Chemical class 0.000 claims description 16
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 14
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000006569 (C5-C6) heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910003849 O-Si Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910003872 O—Si Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000004183 alkoxy alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol group Chemical group [C@@H]1(CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)[C@H](C)CCCC(C)C HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical group C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical group C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 claims 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ACYSKFODOKGJMA-IVZWLZJFSA-N [(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl acetate Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 ACYSKFODOKGJMA-IVZWLZJFSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 1-[5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OCC1C(O)CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2,7-diazaspiro[4.5]decane-7-carboxylate Chemical compound C1N(C(=O)OC(C)(C)C)CCCC11CNCC1 ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 2
- LZTRCELOJRDYMQ-UHFFFAOYSA-N triphenylmethanol Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(O)C1=CC=CC=C1 LZTRCELOJRDYMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical compound Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFIBTBBTJWHPQV-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-(6-oxo-3,7-dihydropurin-2-yl)propanamide Chemical group N1C(NC(=O)C(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 CFIBTBBTJWHPQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 3-n-(2-benzyl-1,3-dihydroxypropan-2-yl)-1-n-[(1r)-1-(4-fluorophenyl)ethyl]-5-[methyl(methylsulfonyl)amino]benzene-1,3-dicarboxamide Chemical compound N([C@H](C)C=1C=CC(F)=CC=1)C(=O)C(C=1)=CC(N(C)S(C)(=O)=O)=CC=1C(=O)NC(CO)(CO)CC1=CC=CC=C1 ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTRXFCGYDLPIDD-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1-benzoylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1C(=O)C1=CC=CC=C1 ZTRXFCGYDLPIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000911790 Homo sapiens Sister chromatid cohesion protein DCC1 Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102100027040 Sister chromatid cohesion protein DCC1 Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- XESTYUYENKNHHR-UHFFFAOYSA-N bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethanol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(O)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 XESTYUYENKNHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M dimethylarsinate Chemical compound C[As](C)([O-])=O OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002862 dinucleoside phosphate Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N oxidanium;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound O.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000002367 phosphate rock Substances 0.000 description 1
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229940102001 zinc bromide Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
- G01R15/00—Details of measuring arrangements of the types provided for in groups G01R17/00 - G01R29/00, G01R33/00 - G01R33/26 or G01R35/00
- G01R15/14—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks
- G01R15/18—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers
- G01R15/186—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers using current transformers with a core consisting of two or more parts, e.g. clamp-on type
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
Abstract
Therapeuticky použitelné oligonukleotidy vzorců I a II se získají zavedením terminálních 3'-3'popřípadě 5'-5'- vazeb. Tyto vůči nukleasam stabilní sloučeniny potlačují biologickou funkci nukleových kyselin.ŕ
Description
Analogy oligonukleotidů s terminálními 3‘-3 -, popřípadě 5‘-5‘-internukleotidovými vazbami, způsob jejich výroby a použití (57) Anotace:
Řešeni se týká analogů oligonukleotidů s terminálními 3’-3’-, popřípadě 5’-5’- internukleotidovými vazbami obecného vzorce I, ve kterém mají substituenty významy uvedené v popise, způsobu jejich výroby, farmaceutických prostředků tyto látky obsahujících a Jejich použití pro regulací nebo potlačování funkce nukleových kyselin.
Analogy oligonukleotidů s terminálními 3'-3'-, popřípadě 5'-5'-internukleotidovými vazbami, způsob jejich výroby a použití
Oblast techniky
Vynález se týká biologie, konkrétně analogů oligonukleotidů s terminálními 3'-3'-, popřípadě 5'-5'-intemukleotidovými vazbami.
Dosavadní stav techniky
Jako oligonukleotidy s řetězcem proti smyslu kódu se označují fragmenty nukleových kyselin, jejichž řetězec je komplementární ke kódovému řetězci ve smyslu kódu mRNA popřípadě ke kódujícímu řetězci DNA. Takové oligonukleotidy se ve vzrůstající míře používají k inhibici exprese genů in vitro nebo v systémech buněčných kultur. Použití těchto látek v medicínskoterapeutické oblasti, například jako protivirových farmak, je předmětem rozsáhlého výzkumu.
V biologii jsou již dlouho známé RNA řetězce proti smyslu kódu jako přírodní regulátory exprese genů v prokaryotických organismech (T. Mizuno, Μ. Y. Chou a M. Inouye, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1966-1970 (1984) a také v eukaryotických organismech (S. M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772 (1986)). Působí inhibování translace hybridisací u příslušných mRNA. V mnoha experimentech bylo mezitím možno dokázat, že tyto RNA řetězce proti smyslu kódu v bakteriích (A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi a M. Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)) nebo eukaryotických buňkách (J. G. Izant a H. Weintraub, Cell 36, 1007— 1015 (1984)) mohou zabraňovat expresi genů a ukazují jak protivirový (L. J. Chang a C. M. Stolzfus, J. Virology 61, 921-924 (1987), tak také protinádorový účinek (J. T. Holt, T. V. Gopal, A. D. Moutton a A. W. Neinhuis, PNAS USA 83, 4784—4798 (1986). Pro tyto výzkumy mají synthetické oligonukleotidy proti biologickým RNA proti smyslu kódu výhodu větší stability a snazší přístupnosti. Snazší přístupnost je důsledkem zlepšené techniky syntézy v poslední době, která dnes relativně snadno zpřístupňuje kratší oligomeiy (o např. 12-30 bázích) (E. Sonveaux, Bioorganic Chemistiy 14, 274-325 (1986); Oligodeoxynuclaotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed., Macmillan Press, 1989; str. 7ff).
Ukázalo se, že již takové krátké oligomery jsou účinné jako modulátory exprese. Mimo to mohou tyto oligonukleotidy také působit vazbou na DNA-dvojitý řetězec za vzniku trojitého helixu. Aby se oligonukleotidy s řetězcem proti smyslu kódu a oligonukleotidy ve formě triplexu mohly nasadit v biologických systémech, musí ovšem být splněny následující předpoklady (Oligodeoxynukleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen ed. Macmillan Press, 1989, str. lff):
1. musí jednak být dobře rozpustné ve vodě, jednak však snadno procházet lipofilní buněčnou membránou
2. musí být uvnitř buňky dostatečně stabilní proti odbourání, tj. stabilní proti nukleázam
3. musí s intrabuněčnými nukleovými kyselinami při fyziologických teplotách tvořit stabilní hybridy
4. hybridizace musí být selektivní; rozdíl disociační teploty k oligonukleotidů, který poskytuje defektní párování, musí být dostatečně velký, aby se poslední mohlo ještě specificky vymývat.
-1 CZ 285408 B6
1978 mohli Zamecznik a Stephenson, PNAS USA 75, 280-284 a 285-288 (1978) poprvé ukázat, že nemodifikované oligonukleotidy mohou omezovat viry Rous Sarcom. Oligonukleotidy byly ovšem použity ve velmi vysokých koncentracích, k tomu byly experimenty většinou prováděny v předem vyhřátých médiích, aby se nukleázy inaktivovaly. Nutnost těchto opatření se vysvětluje rychlým enzymatickým odbouráním, kterému jsou cizí nukleové kyseliny v séru a buňkách vystaveny.
Proto se již dříve prováděly pokusy s cílem modifikovat oligonukleotidy strukturně tak, aby lépe splňovaly výše jmenované požadavky, zejména aby byly lépe chráněny proti nukleázovému odbourání. Tyto pokusy se především koncentrují na modifikaci fosfodiesterové intemukleotidové vazby, poněvadž tato je posledním koncem působiště všech nukleáz. Strukturně modifikované intemukleotidové vazby se zásadně mohou dělit v
a) nukleosidové vazby s fosforem jako centrálním atomem.
Tyto opět mohou být ionicky/chirální ionicky/achirální neutrálně/chirální
b) neutrálně/achirální bezfosforové nukleosidové vazby.
Ke strukturně modifikovaným, jako dříve k ionickým intemukleosidovým vazbám náleží thiofosfátové a dithiofosfátové vazby. Thiofosfátem modifikované oligonukleotidy (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen ed. Macmillan Press, 1989, str. 97ff) ukazují toho času nejlepší efekty inhibice exprese genů v buněčných kulturách, ovšem nezdá se, že je tato inhibice vázána na specifický řetězec, poněvadž i takové, thiofosfáty modifikované oligonukleotidy ukazují inhibiční efekty, které sestávají jen ze základu nukleové kyseliny, například thiofosfátové analogy oligocytidylatu. Omezením pro nasazení thiofosfátem modifikovaných oligonukleotidů je dále jejich chiralita.
Poněvadž při přípravě oligonukleotidů o n bází 2-1 se tvoří diastereomery, má pouze nejmenší podíl preparátu obsahujícího thiofosfátové vazby dobré hybridizační vlastnosti.
U oligonukleotidů s dithiofosfátovými intemukleosidovými vazbami (A. Grandas, William S. Marshall, John Nielsen a Martin H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 20, 543-546 (1989), G. M. Porritt, C. B. Reese, Tetrahedron Lett. 30, 4713-4716 (1989)), se problém chirality obchází. Tyto sloučeniny však jsou dosud přístupné pouze pomocí komplikovaných a ztrátových, mnohastupňových syntéz. Proto se dosud nemohly provádět rozsáhlejší pokusy s ohledem na hybridizační chování, především v buněčných kulturách.
Další třídou chemicky modifikovaných oligonukleotidů jsou oligonukleotidy s neionickými, tj. neutrálními intemukleosidovými vazbami. K tomuto druhu modifikovaných struktur náleží oligonukleotidy s fosfotriesterovými nebo methylfosfonátovými intemukleosidovými vazbami (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillian Press, str. 79ff).
Oběma třídám sloučenin je společné, že ionizovatelný fosfátový zbytek je nahrazen nenabitou skupinou. Zavedením takové vazby se stávají oligonukleotidové analogy resistentními vůči nukleázám, mají však nevýhodu špatné rozpustnosti ve vodném prostředí.
Oligonukleotidy s neutrálně/achirální intemukleosidovou vazbou se dosud mohly získávat pouze tím, že atom fosforu intemukleosidové vazby byl nahrazen jiným centrálním atomem. Vazbě esteru kyseliny fosforečné je podobná siloxanová vazba. Oligonukleotidy se siloxanovými
-2CZ 285408 B6 intemukleosidovými vazbami (K. K. Ogilvie, J. F. Cormier, Tetrahedron Lett. 26, 4159 (1985),
H. Seliger, G. Feger, Nucl. Nucl. 6 (182), 483-484 (1987) byly syntetizované a jsou stabilní vůči nukleázám.
Oligonukleotidy s uhličitanovými, acetalovými nebo karboxamidovými intemukleosidovými vazbami jsou známé z M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 31, 2385-2388 (1990), J. R. Tittensor, J. Chem. Soc. C. 1971, str. 2656 a J. Coull et al., Tetrahedron Lett. 28, 745 (1987).
Nukleázově resistentní analogy nukleotidů mohly také být vyráběné bez změny fosfodiesterové intemukleotidové vazby tím, že byly nasazeny cukerné zbytky změněné konfigurace. To se provedlo syntézou oligonukleotidových analogů, u kterých jsou nukleobáze vázané aglykosidicky (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, str. 119ff). Tyto analogy oligonukleotidů však jsou preparativně těžko přístupné, poněvadž se musí stavět od cukrů a bází. K tomu vykazují, co se týká smyslu směru hybridizace, částečně nenormální chování.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu jsou analogy oligonukleotidů sterminálními 3-3'-, popřípadě 5'-5'-intemukleotidovými vazbami obecného vzorce I
| r1 O |
| r > I (I |
| Ϊ------1 |
| Ύγ’ |
| V 0 L.................. I i |
| R2 n |
| kde |
| R1 značí vodík nebo zbytek vzorce III |
| B ’ |
| = O-P-W. \—( v 011) CH |
| R2 značí vodík nebo zbytek vzorce IV |
| -3 - |
HO
(IV) přičemž však alespoň jeden ze zbytků R1 nebo R2 představuje zbytek vzorce ΙΠ nebo IV,
B představuje bázi, vybranou ze skupiny zahrnující adenin, cytosin, guanin nebo nepřírodní báze purin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, N4-ethanocytosin popřípadě jejich prekurzorové formy
Y značí zbytek z řady O-Si(R)2, OCH2, C(O)NR nebo OCH2-C(O), kde R představuje alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu, fenylovou skupinu, substituovanou jednou až třikrát alkylovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy, alkoxyskupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy a/nebo atomem halogenu, cykloalkylovou skupinu s 5 nebo 6 uhlíkovými atomy nebo skupinu
Ον/ a W' nezávisle na sobě značí kyslík nebo síru,
Za Z' nezávisle na sobě značí O; S~; alkoxyskupinu s 1 až 18 atomy uhlíku; alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku; skupinu NHR3 s R3 znamenajícím alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, nebo alkoxyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém zbytku; skupinu NR3R4, kde R3 má shora uvedený význam a R4 značí alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, nebo kde R3 a R4 spolu s nosným atomem dusíku značí 5 až 6 členný heterocyklický kruh, který může navíc obsahovat další heteroatom z řady O, S, N a n znamená celé číslo 5 až 60, jakož i jejich fyziologicky snášenlivé sole a tyto sloučeniny, substituované skupinami, podporujícími intrabuněčnou absorpci, skupinami, které slouží jako značící skupiny in vitro nebo in vivo, chemiluminiscenčními skupinami a/nebo skupinami, které při hybridizaci oligonukleotidů na biologické DNA nebo RNA napadají tyto DNA- nebo RNA-molekuly za vazby nebo štěpení.
Dále jsou výhodné oligonukleotidy vzorce I, ve kterém R2 znamená zbytek vzorce IV a R1 značí vodík; R1 popřípadě R2 znamená zbytek vzorců III popřípadě IV; nebo R2 značí vodík a R1 zbytek vzorce III, přičemž buď W, nebo Z v posledním případě neznamenají kyslík.
Zvlášť je dále třeba jmenovat oligonukleotidy vzorce I, kde W znamená kyslík nebo Z a W oba představují kyslík.
Zcela zvlášť výhodné jsou oligonukleotidy vzorce I, kde
R2 představuje zbytek vzorce IV a R1 značí vodík.
-4CZ 285408 B6
Dále je třeba jmenovat oligonukleotidy vzorců I, které jsou navíc substituované skupinami, které podporují intrabuněčné absorpce, které slouží jako značící skupiny in vitro nebo in vivo a/nebo skupiny, které při hybridizaci oligonukleotidů na biologické DNA nebo RNA tyto molekuly
DNA nebo RNA napadají za vázání nebo štěpení.
Jako příklad skupin, které podporují intrabuněčnou absorpci, jsou lipofilní zbytky, jako alkylové zbytky například až s 18 atomy uhlíku nebo cholesteryl, nebo konjugáty, které využívají přírodní přenášecí systémy, jako například kyselinu žlučovou nebo peptidy pro příslušné receptory (např. endocytosu).
Příklady pro značící skupiny jsou fluoreskující skupiny (například akridinyl, dansyl, fluoresceinyl) nebo chemiluminescenční skupiny, jako například akridiniumesterové skupiny.
Oligonukleotidové konjugáty, které nukleové kyseliny vážou a/nebo štěpí, obsahují akridin (N. Thuong et al., Tetrahedron Lett. 29, str. 5905, (1988), psoraly (U. Peiles et al., Nucleic Acid Res. sv. 17, str. 285, 1989) nebo chlorethylaminoarylové konjugáty (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Mc Millou Press, 1989, str. 173 ff).
Charakteristická strukturní modifikace oligonukleotidů podle vynálezu spočívá vtom, že intemukleotidové vazby na obou koncích řetězce jsou změněné, tj. jsou místo biologických 3'5'- vazeb vazby 3-3'-popřípadě 5'—5'—. Překvapivě bylo nalezeno, že tato minimální strukturní modifikace stačí, aby se tyto sloučeniny stabilizovaly proti nukleázovému odbourání.
Jak se popisuje dále, způsobuje tato pouze malá strukturní modifikace hybridizační chování, které se téměř rovná chování biologických oligonukleotidů. Z toho také vyplývá obecná použitelnost těchto sloučenin jako inhibitorů exprese genů v buněčných kulturách.
Z literatury není dosud známa žádná zmínka o výrobě analogů oligonukleotidů s 3-3' a 5'5'intemukleosidovými vazbami na obou koncích řetězce a jejich nasazení jako protisměrných oligonukleotidů. Analogy dinukleosidfosfátů, které obsahují 3'-3'- nebo 5'-5'-vazby, byly získány a zkoušeny již před mnoha léty jako hlavní produkty (A. Myles, W. Hutzenlaub, G. Reits a W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2857-2871 (1975); H. Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub a W. Pfleiderer, Chem. Ber. 2872-2877 (1975); J. Tomasz, Nucl. Nucl. 2(1), 51-61 (1983); M. Nemer, N. Theriault, A. Schifmann a K. K. Ogilvie, Vlth Intemational Round Table, Nucleosides, Nucleotides and their biological Applications, La Grande Motte, ed. J. L. Imbach, 94-96 (1984)), popřípadě jako vedlejší produkty (R. Letsinger, K. K. Ogilvie, J. Amer. Soc. 89, 4801-4802 (1967)). Tyto dimery však na základě příliš nízké teploty tání zásadně nejsou způsobilé ke stabilní hybridizaci buněčnými nukleovými kyselinami. Oligonukleotidy, které mají 5'-5'-vazbu pouze na jednom konci, byly připraveny, aby se zavedlo příchytné místo pro značící skupiny při genetických sondách (S. Agrawal, C. Christodoulou, M. J. Gait, Nucleic Acids Res. 14, 6227-6245 (1986)). Nebyly však dosud zkoušené na své hybridisační chování. Pro biofysikální zkoušky se připravily samokomplementámí oligonukleotidy, které uprostřed molekuly mají jednotlivou 3'—3'— popřípadě 5'-5'-vazbu (J. H. van de Sande, N. B. Ramsin, M. W. German, W. Elhorst, B. W. Kalisch, E. V. Kitzing, R. T. Pon, R.c. Clegg, T. M. Jovin, Science 241,551-557(1988).
Příprava oligonukleotidů s terminálně invertovanou 3'—3’— a 5'—5’— vazbou se provádí stejným způsobem jako syntéza biologických oligonukleotidů v roztoku nebo v pevné fázi, popřípadě za pomoci automatického syntézního přístroje.
Předmětem vynálezu je tedy dále způsob výroby oligonukleotidů vzorce I, který spočívá v tom, že se
-5CZ 285408 B6
a) nukleotidovájednotkas 3'-popřípadě 5-terminálními skupinami fosforu(III)nebo fosforu(V) nebo její aktivovaný derivát nechá reagovat s další nukleotidovou jednotkou s 3'- popřípadě 5'terminálně volnou hydroxyskupinou, nebo
b) oligonukleotid připraví z fragmentů stejným způsobem, v oligonukleotidech získaných podle (a) nebo (b) se popřípadě jedna nebo několik ochranných skupin zavedených dočasně k ochraně ostatních funkcí odštěpí a takto získané oligonukleotidy vzorce I se popřípadě převedou ve svou fyziologicky snášenlivou sůl.
Jako výchozí komponenta k výrobě oligonukleotidů s terminálně invertovanou 3'-3'-vazbou se pro syntézu v pevné fázi nasadí nosná pryskyřice, na které je přes 5'-OH skupinu vázán první nukleosidový monomer. K výrobě této komponenty se použije nosná pryskyřice vyrobená metodami známými z literatury (T. Atkinson, M. Smith v Oligonucleotide Syntézis, M. J. Geit (ed), 35 - 49 (1984)), zejména silikagel nebo regulované pórovité sklo, které je funkcionalisováno aminoskupinami. Nechá se reagovat s nukleosidovým derivátem chráněným na nukleobázi a na 3'-OH skupině, kteiý byl napřed přeměněn v 5'-p-nitro-fenylsukcinát. Jako bazické ochranné skupiny se používají zejména acylové skupiny, například benzoyl, isobutyryl nebo fenoxyacetyl. Poloha 3' se výhodně chrání dimethoxytritylovou ochrannou skupinou, která se může zavádět podle M. D. Matteucci, Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21 (1980), str. 3243-3246. Další skladba oligonukleotidového řetězce až k předposlednímu řetězcovému členu se provádí metodami známými z literatuiy, výhodně za použití na 5'-OH skupině dimethoxytritylovými skupinami chráněných esteramidů kyseliny nukleosid-3-fosforité nebo nukleosid-3'-H-fosfonátů. Jako poslední člen řetězce se opět nasadí na 3'-OH skupině, výhodně dimethoxytritylem chráněný esteramid kyseliny nukleosid-5'-fosforité, popřípadě nukleosid-Hfosfonát. Příprava takového oligonukleotidového řetězce s terminálně převrácenými intemukleotidovými vazbami je dále znázorněna schematicky (fosforamiditcykl k přípravě oligonukleotidů s 3'-3'- a 5'-5'~ vazbami na koncích). Příprava oligonukleotidů s 3'-3'- nebo 5'-5'- vazbami se provádí odpovídajícím způsobem.
-6CZ 285408 B6
o
RO —P —O
O
Strukturní a řetězcová analýza se provádí tím způsobem, že se oligonukleotid s 3'-3'- a 5'-5'konci nejdříve terminálně označuje. To se provede radioaktivním značkováním, výhodně pomocí 5 5'-y-32P-ATP/polynukleotidkinasy. Toto radioaktivní značkování se provede na volné 5'-OHskupině, tj. proti oligonukleotidu s pouze biologickou 3'-5'-vazbou na opačném konci nukleotidového řetězce. Řetězcová analýza se pak provede postupem známým z literatury, výhodně pro báze specifickým, statistickým štěpením, jak popsáno (A. M. Maxam and W.
Gilbert, Metods in Enzymology 65,499-560 (1980)).
Na základě radioaktivního značkování na „opačném“ konci molekuly se nyní provede také odečtení řetězce, srovnáním s oligonukleotidem s biologickou 3'-5'- vazbou v opačném směru. Proveditelný popis testuje uveden v příkladu 6.
Oligonukleotidy vzorců I se používají pro hybridizačně-chemické, na adici nukleových kyselin s dvojitým nebo jedním řetězcem spočívající postupy regulace nebo potlačování biologické funkce nukleových kyselin, k selektivnímu potlačování exprese virálnich funkcí genomu a k profylaxi a terapii virových funkcí, k potlačování nádorových funkcí a k terapii rakovinných onemocnění.
Jako míra stability in vivo se může pokládat chování v krevním séru rozpuštěného, podle vynálezu stavěného oligonukleotidu vzorce I. Obecný test je popsán v příkladu 7; odpovídající test in vitro s roztokem fosfodiesterázy hadího jedu v příkladu 8. Oligonukleotidy podle vynálezu se v protikladu k 3'-5'-oligonukleotidům odbourávají mnohem pomaleji.
Příklad 11 demonstruje sérovou stabilitu oligonukleotidů sterminálně invertovanou 3'-3'vazbou.
Hybridizační chování vyplývá z modelových pokusů, jak popsáno v příkladu 9, ve kterých řada SV-40-specifických řetězců, které podle vynálezu byly připraveny vždy s 3'-3'- a 5'-5'koncem, vhybridizaci s odpovídajícím řetězcem proti smyslu kódu SV40-DNA ukazují teplotu tání, která leží nepodstatně níže než teplota tání, která se měří při hybridizaci s odpovídajícím řetězcem, který nebyl stavěn podle vynálezu, tj. bez 3-3'- a 5-5'- konců.
Účinnost oligonukleotidů opatřených podle vynálezu terminálními 3'-3'- popřípadě 5'-5'vazbami, jako inhibitorů exprese genů vyplývá z potlačování růstu viru SV40 (příklad 10) jakož i z inhibice in vitro exprese nádorového produktu p53 (příklad 12).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza esteramidu kyseliny 3'-0-DMTr-desoxyribonukleosid-5'-(N,N-bis-diisopropylamino-|3-kyanethoxy)-fosforité
Reakční schéma vycházející z bázemi chráněných nukleosidů je znázorněno následně:
-8CZ 285408 B6
DMTrO DMTra
HO
----1 - I HO----1 i
Tj—Ύ5 w Nitromethan
OH
1a-d
DMTrO
2a-d
NCCHptjO^
OCHLCHjCN
DMTrO
3&d
DMTrO
4a-d a: B = Thymin b: B=NS-Benzoyladenin c: B = N+Benzoylcytosin d: B=N2-lsobutyrylguanin
DMTr = 414’-Dimethoxytrityl
A) Příprava 3,5-O-bis-DMTr-desoxyribonukleosidu 2
Násada mmol dT, dAbz, dCbz nebo dGlbu
14,4 mmol DMTr-Cl
14,9 mmol TEAabs.
Desoxyribonukleosid 1 se rozpustí v 50 ml absolutního pyridinu a při 0 °C se přidá triethylamin a dimethoxytritylchlorid. Potom se 24 h míchá při teplotě místnosti, přičemž se reakce sleduje chromatografii na tenké vrstvě (rozpouštědlo: CH2CI2/MeOH 9:1). Reakce se ukončí přidáním methanolu, rozpouštědlo se odtáhne a zbytek se vyjme do dichlormethanu. Organická fáze se několikrát promyje 1 M roztokem (NH4)HCO3 a vodou, suší se Na2SO4 a odstředí se.
3',5'-ditritylovaný produkt 2 se může čistit od přebytečného tritanolu popřípadě 5'-DMTr-dN sloupcovou chromatografii (sloupcový materiál: silikagel 60H, eluční prostředek: CH2C12 se stoupajícím obsahem methanolu, přičemž se při 1-1,5% MeOH eluují ditritylované desoxynukleosidy).
Výtěžek: 73-85 % teorie.
B) Specifické odštěpení 5'-dimethoxytritylové skupiny
Literatura: M. D. Mateucci a Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 3243-3246 (1980)
Násada:
mmol 3'-,5'-O-bis-DMTr-dN 2 mmol ZnBr2
200 ml absolutního nitromethanu
Roztok 3'-,5'-O-bis-DMTr-dN 2 ve 100 ml nitromethanu se při 0 °C dá k suspensi bromidu zinečnatého v dalších 100 ml nitromethanu. V případě chráněného desoxyadenosinu byla reakce dále vedena za chlazení, aby se zamezilo depurinizaci. Přesto je u tohoto nukleosidu odštěpení úplné již po 60 min, jak je možno zjistit chromatografii na tenké vrstvě. U thymidinu a desoxyguanosinu je rovněž reakce ukončena při teplotě místnosti po 60 min, zatím co 5'detritylace bis-DMTr-desoxycytidinu probíhá jen neúplně. Zde se reakce přerušila po 3 hodinách, aby se zabránilo odštěpení také 3'-dimethoxy-tritylové skupiny.
-9CZ 285408 B6
Přerušení reakce se provede přidáním 200 ml 1 M roztoku NFLAc; produkt 3 se extrahuje 200 ml
CH2C1, organická fáze se ještě promyje nasyceným roztokem NaCl a vodou, suší se Na2SO4 a rozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu.
Hlavní množství tritanolu se může oddělit vysrážením surového produktu v cca 500 ml n-hexanu při -15 °C. Čištění se provede chromatograficky přes sloupec silikagelu 60H dichlormethanem se stoupajícím obsahem methanolu jako elučním prostředkem.
Hodnoty Rf 3'-DMTr-desoxyribonukleosidů se liší od odpovídajících 5'-tritylovaných 10 monomerů následovně (rozpouštědlo: CH2CI2/MeH 24:1):
3'-DMTr-dN 5'-DMTr-dN
| dT | 0,28 | 0,21 |
| Dabz | 0,55 | 0,29 |
| dCbz | 0,53 | 0,31 |
| dGIbu | 0,32 | 0,14 |
Výtěžky: 48-65 % teorie.
C) Příprava esteramidu kyseliny 3'-O-DMTr-desoxyribonukleosid-5'-O-(N,N-diisopropylamino-p-kyanoethoxy-)fosforité 4,
Literatura: H. Koster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557 (1984)
Násada:
mmol 3'-O-DMTr-desoxyribonukleosidu 3
1,5 mmol chloro-N,N-diisopropylamino-|3-kyanoethoxyfosfinu mmol diisopropylaminu
Fosfitylační reakce byly provedeny analogicky metodě popsané Kosterem et al. k výrobě 30 esteramidu kyseliny 5'-O-DMTr-desoxyribonukleosid-3'-O-fosforité. K rozpuštění chráněných nukleosidů v absolutním CH2C12 byl pod argonem přidán diisopropylamin, potom fosforylační prostředek. Po 30 min byla reakce ukončena přidáním 30 ml ethylacetátu, roztok 3x extrahován nasyceným roztokem NaCl, organická fáze sušena Na2SO4 a rozpouštědlo oddestilováno ve vakuu. Surový produkt byl čištěn sloupcovou chromatografií (sloupcový materiál: silikagel 60H, 35 eluační prostředek: petrolether/dichlormethan/triethylamin 45:45:10)
Výtěžek 4a: 93 % teorie.
Příklad 2
Příprava thymidilyl-thymidinu s 3'-3'-fosfodiesterovou vazbou
Dále je uveden průběh reakce k přípravě dimemího bloku
-10CZ 285408 B6
DMTrO
NCCH2CH2O
-11CZ 285408 B6
DMTrO
ACoO —
HAc
8
1. tetrazol --------> 2 J2
1. NH^
HAc
I = P - OH
I
-12CZ 285408 B6
A) Příprava 5'-O-dimethoxytritylthymidinu 5
Násada:
mmol thymidinu (4,84 g) mmol 4,4'-dimethoxytritylchloridu (8,2 g) mmol dimethylaminopyridinu (122 mg) mmol abs. triethylaminu (3,8 ml)
Příprava se provede metodou R. A. Jonese (G. S. Ti, B. L. Gaffney and R. A. Jones, H. Amer. Chem. Soc. 104, 1316-1319 (1982)) Thymidin se suší 3 násobným odpařením vždy s 50 ml absolutního pyridinu, vyjme se do 100 ml pyridinu a za chlazení ledem se přidá 4,4'-DMTr-Cl a DMAP jako katalyzátor. Reakce se kontroluje chromatografii na tenké vrstvě (rozpouštědlo CH2Cl2/MeOH 9:1); Po 4 hodinách je možné reakci přerušit přidáním 100 ml vody. Roztok se 3x extrahuje etherem, organická fáze se suší a odstředí a zbytek se čistí překrystalováním z benzenu. Výtěžek: 9,68 g DMTr-dT (89 %)
B) Příprava esteramidu kyseliny 5'-0-dimethoxytritylthymidin-3'-0-(N,N-diisopropylamino(3-cyanoethoxy-)fosforité 6
Příprava a čištění 6 se provádí přiměřeně syntéze esteru kyseliny 3'-0-DMTr-5'-0-fosforité 4 (příklad 1, C).
C) Příprava 5'-O-acetylthymidinu 8
Násada:
2,0 mmol 3'-O-DMTr-dT 3a (1,1 g)
0,2 mmol dimethylaminopyridinu (12,2 mg) ml acetanhydridu
Literatura: A. M. Michelson and A. R. Todd, J. Org. Chem. 1955, 2632-2638 (modifikováno)
K roztoku 3'-O-DMTr-dT a DMAP ve 20 ml absolutního pyridinu se za chlazení ledem přikape Ac2O. Po 3 hodinách reakční doby je reakce úplná (kontrola chromatograficky, rozpouštědlo CH2Cl2/MeOH 24:1). Produkt se vysráží 400 ml ledové vody, bílá sraženina se odsaje, promyje ledovou vodou a suší se.
Výtěžek: 1,02 g 3'-O-DMTr-5'-O-Ac-dT (88 %)
K odštěpení 4,4'-dimethoxytritylové skupiny se 7 při teplotě místnosti míchá v 10 ml 80% kyseliny octové. Přidáním 100 ml ledové vody se reakce po 3 hodinách ukončí; při tom 4,4'dimethoxytritanol vypadne jako bílá sraženina. Odsaje se a vodný filtrát se odstředí. Olejovitý zbytek se vyjme do malého množství CH2C12 a při -15 °C se vysráží ve 200 ml n-hexanu.
Výtěžek: 455 mg 5'-O-acetylthymidinu (94 %).
D) Příprava a thymidilyl-(3'-3')thymidinu 10
Násada:
1,0 mmol esteramidu kyseliny 5'-O-DMTr-thymidin-3'-O-(N,N-diisopropylamino-p-kyanoethoxy-)-fosfo rite 6 (705,8 mg)
0,9 mmol 5'-O-acetylthymidinu 8 (253 mg)
2,6 mmol tetrazolu (182 mg)
9,0 mmol J2 (1,14 g)
-13CZ 285408 B6
Syntéza dimerového bloku 10 se může provést metodou popsanou Kósterem (H. Koster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557 (1984)) k výrobě 3'-5'-nukleosiddimerů. Směs 5'-O-acetylthymidinu a tetrazolu se rozpustí v 30 ml absolutního CH3CN a pod argonem se dá k esteramidu kyseliny fosforité. Přidá se 9 mmol J2 v 30 ml směsi acetonitril/pyridin/voda (24:5:1) á po dalších 15 minutách se přebytečný jod redukuje 5 ml 40% roztoku H2SO3. Roztok se pak zahustí, zbytek se vyjme do CH2C12, 2x se promyje nasyceným roztokem NaHCO3 a rozpouštědlo se oddestiluje. Surový produkt se může čistit na sloupcové chromatografii (sloupcový materiál: silikagel 60H, eluační prostředek: ethylacetát/dichlormethan 50:50).
Výtěžek: 665 mg (75 %).
K odštěpení acetylové a β-kyanoethylové skupiny se na dimer 1 hodinu působí 5 ml koncentrovaného NH3 při teplotě místnosti; 4,4'-dimethoxytritylová skupina se může odstranit 80% kyselinou octovou.
Příklad 3
Příprava thymidilyl-thymidinu s 5'-5-fosfodiesterovou vazbou 14
Následující schéma ukazuje přípravu 14
DAe DMTrO
-14CZ 285408 B6
Jednotlivé reakční kroky k syntéze mezistupňů se provádějí metodami odpovídajícími metodám popsaným v příkladu 2.
Struktura obou dimerových bloků se může prokázat FAB-hmotovou spektrometrií a spektroskopií ΙΗ-jademé resonance.
Příklad 4
Uchycení 3'-0-dimethoxytrityl-desoxyribonukleosid-5'-0-sukcinátu na nosném materiálu CPG 10-1400
Funkcionalizace CPG-nosiče 3-aminopropylovými řetězci se provádí podle předpisu Atkinsona a Smitha (T. Atkinson, M. Smith v Oligonucleotide Syntézis, M. J. Gait (ed), 35-49 (1984)).
A) Příprava 3'-0-DMTr-desoxyribonukleosid-5'-0-sukcinátu 15
Násada:
1,0 mmol 3'-O-DMTr-dN 3
0,8 mmol anhydridu kyseliny jantarové (80 mg)
0,5 mmol dimethylaminopyridinu (61 mg)
Reakce anhydridu kyseliny jantarové s 5'-OH skupinou desoxyribonukleosidu se provádí přes noc při teplotě místnosti vždy v 5 ml absolutního pyridinu s DMAP jako katalysátorem. Po dokončení reakce se roztok zahustí a pyridin se odstraní 3násobnou azeotropní destilací s toluenem. Zbytek se vyjme do dichlormethanu, promyje se ledově studeným roztokem kyseliny citrónové (10%) a H2O a organické fáze se odstředí ve vakuu. Surový produkt se rozpustí v cca 3 ml toluenu a vysráží se v 200 ml hexanu.
Výtěžek: 79-84 %
B) Příprava 3'-0-DMTr-desoxyribonukleosid-5'-0-sukcinyl-p-nitrofenylesteru 16 a zachycení na nosiči (viz následné schéma)
-15CZ 285408 B6
| Θ—0- | ||
| i DMTrO | ||
| Násada: | 0,8 mmol | 3'-O-DMTr-dN-5'-O-sukcinátu 15 |
| 0,8 mmol | p-nitrofenolu (112 mg) | |
| 2,0 mmol | dicyklohexylkarbodiimidu (412 mg) | |
| 3g | funkcionalizovaného CPG 10-1400 |
Chráněný sukcinylovaný desoxyribonukleosid se dá k roztoku p-nitrofenolu v 5 ml absolutního dioxanu a 0,2 ml pyridinu a potom se přidá DCC1 jako kondensační prostředek. Po krátké době io vypadává dicyklohexylmočovina a po 3 hodinách ukazuje chromatografie na tenké vrstvě (CH2Cl2/MeOH 9:1) úplné zreagování. Sraženina se pod argonem odsaje a filtrát se přímo dá k suspenzi funkcionalizovaného nosného materiálu v 15 ml absolutního DMF. Přidá se 0,8 ml triethylaminu a násada se třepe přes noc. Zatížený nosič se pak odsaje, promyje methanolem a etherem a v exsikátoru se suší.
Zatížení nosiče se stanoví spektrometricky. Působením 10 ml 0,1 N roztoku kyseliny ptoluensulfonové v acetonitrilu na vzorek nosiče (ca. 2 mg) se 4,4'-dimethoxytritylkation odštěpí a měřením absorpce roztoku při 498 nm se podle vzorce
-16CZ 285408 B6
ODm/ml x 10 ml x 14,3 (konst.) mg nosiče nechá vypočítat zatížení nosiče v pmol/g.
Výsledky: 3'-DMTr-dT- nosič: 23 pmol/g
3'-DMTr-dGlbu-nosič: 21 pmol/g 3'-DMTr-dAbz-nosič: 21 prnol/g 3'-DMTr-dCbz-nosič: 15 pmol/g
K blokování nezreagovaných aminoskupin se zatížený nosič 1 hodinu při teplotě místnosti třepe s roztokem 1 ml anhydridu kyseliny octové a 50 mg dimethylaminopyridinu v 15 ml absolutního pyridinu, potom se odsaje, promyje methanolem a etherem a suší se.
Příklad 5
a) Syntézaoligonukleotidů sterminální 3-3'-a5'-5'-vazbou
Syntézy se provádějí v DNA -syntetizátoru firmy Applied Biosystems, Forster City, USA, Modell 381 A, za použití 0,2 pmol standardního programu pro kondensační kroky. Syntezní cykl je ukázán dříve (str. 11). Jako nosný materiál slouží CPG 10-1400 popsaný v příkladu 4. Kondensace se provádějí s obvyklými estery kyseliny nukleosid-3-fosforité; pouze v posledním reakčním cyklu se nasadí v příkladu 1 popsané esteramidy kyseliny 3'-0-DMTr-nukleosid-5'~ O-(N,N-diisopropylamino-(3-kyano-ethoxy-)fosforité. Po odštěpení oligonukleotidu z nosiče konc. NH3 a odstranění všech fosfátových a bazických ochranných skupin zahříváním amoniakálního roztoku na 60 °C přes noc se vzorek odsolí vysrážením v ethanolu a cílový řetězec se elektroforesou na polyakrylamidovém gelu čistí od kratších fragmentů.
Pro pokusy se syntetizoval eicosathymidylat s pouze 3'-5'-vazbami jakož i s terminálními 3-3'a 5'—5'— vazbami. Mimo to se volily řetězce z SV40 - genomu. Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
dT20;
dT20(3'-3', 5'—5');
SV40TS17: 17-mer, řetězec ve smyslu kódu z SV40-genom na polohách 5159-5176;
5-AGT TTT GCA AAG ATG GA-3'
SV40TAS17: 17-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV40TS17;
5-TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'
SV40TA17 (3-3' ,5'-5'): 17-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV40TS17 s 3'—3'— popřípadě 5'5'-vazbou na koncích;
3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5'
SV40TS35: 35-mer, řetězec ve smyslu kódu z SV40-genomu na polohách 5142-5176;
5-AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGA AG-3'
SV40AS35: 35-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV40TS35;
5'-TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'
-17CZ 285408 B6
SV40TAS35(3'-3',5'-5'): 35-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV40TS35 s 3-3'- popřípadě
5'—5'— vazbou na koncích;
3'-T(5'-5')CT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA
AAGC(3'-3')T-5'
b) Syntéza oligonukleotidů s terminální 3'-3'-vazbou
Jako nosný materiál slouží CPG 10-1400 popsaný v příkladu 4. Kondensace se provede s obvyklými estery kyseliny nukIeosid-3'-fosforité.
Po odštěpení oligonukleotidů z nosiče konc. NH3 a odstranění všech fosfátových a basických ochranných skupin zahříváním amoniakálního roztoku na 60 °C přes noc se vzorek odsolí vysrážením v ethanolu a cílový řetězec se elektroforesou na polyakrylamidovém gelu čistí od krátkých fragmentů.
SV40TAS17(3'-3'): 17-mer, řetězec proti smyslu kódu k SV40TS17 s 3-3'- vazbou na konci 3-TCC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5'
c) Syntéza oligonukleotidů s terminální 5'-vazbou a 2-terminálními thiofosfátovými zbytky
Jako nosný materiál slouží komerční CPG-materiál s 5'-O-dimethoxytritylthymidinem vázaným přes 3'-hydroxyskupinu. Kondensace se provede s obvyklými estery kyseliny nukleosid-3'fosforité; pouze v posledním reakčním cyklu se nasadí esteramidy kyseliny 3'-O-DMTrnukleosid-5'-0-(N,N-diisopropylamino-|3-kyano-ethoxy)-fosforité popsané v příkladu 1.
U prvých dvou reakčních cyklů se místo obvyklé oxidace jodem provede oxidace elementární sírou (W. Stec et al. J.A.C.S. 106, str. 6077, 1984).
Po odštěpení oligonukleotidů od nosiče konc. NH3 a odstranění všech fosfátových a basických ochranných skupin zahříváním amoniakálního roztoku na 60 °C přes noc se vzorek odsolí vysrážením v ethanolu a cílový řetězec se čistí od kratších fragmentů elektroforesou na polyakrylamidovém gelu.
Syntetizuje se následující oligonukleotid:
SV40TAS 17(5-5'): 17-mer, řetězec proti smyslu kódu kSV40TS17 s 5'—5'— vazbou na 5'konci a dvěma thiofosfatintemukleotidovými vazbami na 3'- konci 3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG(PS) C(Ps)T-3'
Příklad 6
Analýza struktury a řetězce oligonukleotidů s terminální 3'-3'- a 5'—5'— vazbou
Analysa řetězce oligonukleotidů se provádí metodou Maxama a Gilberta (A. M. Maxam a W. Gilbert, Metods in Enzymology 65, 499-560 (1980)). Vždy 100 pmol vzorku se v přítomnosti (γ-32Ρ)-ΑΤΡ/Τ4— polynukleotidkinázy na 5'-OH-skupině radioaktivně značí a potom se provedou následující bazicky specifické reakce:
(A+G) - reakce: protonace bází kyselinou mravenčí
G - reakce: reakce s dimethylsulfátem (T+C) - reakce: hydrazinolýza
C - reakce: reakce s hydrazinem v přítomnosti 5 M NaCl
-18CZ 285408 B6
Působením 1 M piperidinu při 95 °C se oligonukleotidové řetězce štěpí na modifikovaných místech; zlomky se mohou elektroforezovou na polyakrylamidovém gelu oddělit (20 % akrylamidu, 7 M močoviny) a autoradiografií detekovat. Obr. 1 ukazuje autoradiogram analysy řetězce SV40TS17, SV40TAS17 a SV40TAS 17(3-3',5-5') (popis oligonukleotidů viz příklad 5). Poněvadž jsou řetězce na 5'-OH skupině značené, může se sled bází u pouze 3'-5'-vazeb odečítat ve směru 3'-5'-směru. V důsledku 3'—3'— konce má však oligonukleotid SV40TAS17(3'-3',5'-5') radioaktivně značenou 5'-OH skupinu na své koncové části; směr odečítání řetězce se tím otáčí (obr. 1). To je také důkazem pro 5'-5'-fosfodiesterovou vazbu na 5'- koncové části řetězce s volnou 3'-OH skupinou, která se enzymem polynukleotidkinázy nemůže fosforylovat.
Příklad 7
Zkouška stability oligonukleotidu s 3-3' a 5-5' konci v testu krevního séra
A) Kinasace eicosathymidylatu s 3'—3'— a 5'-5'- konci
Literatura: T. Mizuno, Μ. Y. Chou a M. Inouya, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1966—1970 (1984)
Násada: 1 μΐ oligonukleotid (0,01 OD26o) μΐ 10 x kináza - pufr μΐ T4—polynukleotidkinasa μΐ y-32P-dATP (spec, aktivita: 6000 Ci/mmol) μΐ H2O
Násada se 30 min inkubuje při 37 °C, potom se přidáním 90 μΐ H2O ukončí a frakcionuje se přes sloupec ®Sephadex G 50. Produkční frakce se spojí a lyofilizují se.
B) Test krevního séra
Literatura: S. M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772 (1986)
Násada: 0,01 OD260 radioaktivně fosforylovaného oligonukleotidu pro kontrolní vzorek, 0,01 OD260 T20 pro zkoušku 0,01 OD26oT20 s 3-3'- a 5'—5'— koncovými vazbami μΐ čerstvého lidského sera
Sérum se dá ke vzorku a krátce se ručně třepe. Potom se ihned pro 0-hodnotu odpipetují 3 μΐ a dají se do 3 μΐ pufru s formamidem, aby se přerušila aktivita enzymu. Potom se vzorek inkubuje při 37 °C.
Pro kinetinu se po určitých časových úsecích odeberou 3 μΐ a přeruší se jak popsáno shora.
Kontrolní vzorek: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min.
Zkouška: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min, 90 min.
Vzorky se dají na 20% polyakiylamidová gel, dělí se elektroforesou na gelu a potom se autorad iografuj i.
Autoradiogram štěpení s čerstvým lidským sérem zleva (viz. obr. 2):
-19CZ 285408 B6
Kontrolní vzorek: 0-hodnota, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min.
Zkouška: 0-hodnota, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min, 90 min.
Již po 5 minutách se ukazuje, že začalo odbourávání přírodního oligonukleotidu. Štěpení se zvyšuje s přibývajícím časem. Modifikovaný oligonukleotid zůstává i po 90 minutách inkubace prakticky nezměněn. Slabé pásy, které jsou vidět při všech hodnotách kinetiky, resultují z aktivity endonukleáz, které jsou přítomné v séru. Toto štěpení je důležité pro terapeutické použití těchto oligonukleotidů, poněvadž zaručuje pomalé odbourávání účinné substance a nemůže tím dojít k akumulaci těchto substancí v těle.
Příklad 8
Zkouška chování oligonukleotidů sterminální 3'—3'- a 5'-5'- vazbou proti fosfodiesteráze 15 z hadího jedu
A) Kinazace eikosathymidylatu s 3'-3'- a 5'—5'— konci
Jak popsáno v příkladu 7
B) Hydrolysa eikosathymidylatu s 3'-3'- a 5'-5'- konci pomocí fosfodiesterázy z hadího jedu
Literatura: A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi a M. Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)
Násada: 5 μΐ RNA- nosiče μΐ SQ - pufru μΐ SVpdE(l,5 u/μΐ)
Radioaktivně fosforylovaný vzorek (standart: T20, zkouška: T20 sterminální 3-3'- a 5-5' vazbou) se lyofilizuje, k tomu se dá RNA - nosič a SQ - pufr. Od této směsi se pro 0-hodnotu odpipetuje 5 μΐ, ke zbytku roztoku se přidá enzym a při 37 °C se inkubuje. Pro kinetiku standartu se odebere po 5 min, po 15 min a po 30 min po 5 μΐ, pro kinetiku eikosathymidylatu s 3-3' a 5'5'-konci se po 5 min, 30 min, 45 min, 60 min a 90 min odebere po 5 μΙ. K desaktivaci enzymu se vzorky přímo po odběru zahřívají na vodní lázni 2 min na 95 °C. Vzorky se lyofilizují a nanesou se na analytický 20% polyakrylamidový gel. Po gelelektrolytickém dělení se autoradiografuje.
Autoradiogram SVpdE - štěpení (viz obr. 3) zleva: T2o (standart), T2o s terminálními 3'-3'- a 5'-5'-vazbami, kinetika zkoušky: po 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, mix z 0 min/15 min, mix z 0 min/30 min, kinetika standartu: po 5 min, 15 min, 30 min, 45 min.
Vazba 5-5' se, jak již popsáno, ihned štěpí. Že další štěpení ve srovnání se standartem pokračuje ještě jen velmi pomalu, je značný strukturní průkaz. Po štěpení 5'—5'— fosfordiesterové vazby vznikne molekula, která na místě štěpení nese 5'-hydroxylovou funkci. Na druhé koncové části je molekula 5'-fosforylovaná. Obě koncové části jsou pro fosfodiesterázu z hadího jedu nenapadnutelné. Pomalé, ale velmi značné další odbourávání je pravděpodobně, podle výrobce popsaných přísad (J. G. Izant a H. Weintraub, Cell 36, 1007-1015(1984)), možné odvozovat od jednořetězcově specifické endonukleázy, které PM2 DNA mění v otevřené formy. Krásně je možné odečíst délku řetězce. Je však možné odečíst pouze 19 pásů, poněvadž při první hodnotě kinetiky, po 5 min, je 5'-5'-fosfodiesterová vazba již odštěpena.
-20CZ 285408 B6
Příklad 9
Zkoušky hybridizačního chování oligonukleotidů opatřených terminálními 3-3'- a 5-5'- konci
Ke zkouškám hybridisačního chování se zaznamenávají křivky tavení vždy ekvimolámího množství (5,23 nmol) SV40TS17 a SV40TAS17(3'-3',5'-5') (popis oligonukleotidů viz příklad 5), rozpustí se v 1 ml 10 nM Na-kakodylátu/100 mM NaCl-pufru, pH 7,0, zahřeje se na 70 °C a průběh renaturace se zjišťuje při pomalém ochlazování (1 stupeň/min) měřením absorpce roztoku. K záznamu křivky standartu se použijí stejná množství SV40TAS17. Analogicky se v pufru mísí vždy 4,75 nmol SV40TS35 a SV40TAS35 popřípadě SV40TS35 a SV40TAS35(3'3',5'-5'), zahřeje se na 90 °C a absorpce se měří při ochlazování. Byly zjištěny křivky tavení, které poskytují následující hodnoty Tm
SV40TS17 . SV40TAS17
SV40TS17 . SV40TAS17(3'-3',5'-5’)
SV40TS35 . SV40TAS35
SV40TS35 . SV40TAS35(3'-3',5'-5')
54.1 °C
53,3 °C
65,5 °C
64.2 °C
Teploty tavení se tedy abiologickými vazbami snižují jen o 0,6 °C u 17meru popřípadě o 1,3 °C u 35meru.
Příklad 10
Inhibice biosyntézy SV40 T-antigenu oligonukleotidy s terminální 3'-3'-a 5-5'-vazbou
A) Buněčná kultura
Buňky COSI se vEaglově prostředí v Dulbeccově modifikaci (DMEM) kultivují s 10% fetálního telecího séra. Misky pro tkáňové kultury se inkubují při 37 °C a 7,5 °C CO2.
B) Radioaktivní značení a rozrušení buněk
Asi 4 x 104 buněk se jako monolayer dá do misek pro tkáňové kultury. Buňky se třikrát promyjí DMEM bez methioninu a potom se značí 100 pCi 35-S-methioninu. Pro zkoušky modulace proti smyslu kódu se buňky současně 30 min při 37 °C inkubují s oligonukleotidem SV40TAS17(3'3',5'-5') a radioaktivním methioninem. Potom se buňky dvakrát promyjí DMEM obsahujícím 10% fetálního telecího séra a neznačený methionin a v tomto prostředí se nechají dalších 30 min. K rozrušení se na buňky působí ledově studeným fosfátem pufřovaným fyziologickým roztokem NaCl (PBS), od misek se odškrábnou a 2 min se při 400 g odstřeďují. Usazenina buněk se pak 45 min na ledě lysuje 0,4 ml rozrušovacího pufru (0,5 % nonidetu P40, 100 mM tris-HCl, pH 9,0, 0,1 M NaCl) pro 3 x 106 buněk. K zamezení proteolysy se k rozrušovacímu pufru přidá 1 % trasylolu a fenylmethylsulfonylfluorid až do konečné koncentrace 0,25 mg/ml. Lysát se pak 30 min při 4 °C v ultraodstředivce (105 000 g) odstřeďuje do čirá. Podíl 10 μΐ se odebere a měří se obsah proteinu metodou Lowryho. K imunoprecipitaci se nasadí stejná množství celkového proteinu.
C) Imunoprecipitace
Jak pro imunoprecipitaci SV 40 T-antigenu, tak také mutant T-antigenu lokalizovaných v cytoplasmě se použije monoklonální protilátka PAblO8. Protilátka se chromatografii na proteinu Asefarose čistí od přebytku hybridomu. Buněčný extrakt se předběžně přes noc při 4 °C sráží 100 μΐ 10% suspenze teplem inaktivovaných a formaldehydem fixovaných bakterií kmene
-21CZ 285408 B6
Staphylococcus aureus (Cowan 1). Bakterie se pak odstředí, zbytek se alespoň 2 hodiny při 4 °C inkubuje s monoklonální protilátkou a přidáním S. aureus se tvoří vysocespecifícké imunokomplexy. Tento postup se 3 x opakuje, aby se zajistila úplná precipitace.
Potom se imunoprecipitáty promývají: třikrát 50 mM tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 % trasylolu; dvakrát 50 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 % nonidetu P40 a jednou 50 mM NH4HCO3. Potom se 45 min při 4 °C eluuje 200 μΐ elučního pufru (50 mM NH4HCO3, 1 % SDS, 1 % β-merkaptoethanolu), lyofylizuje se, 10 minutovým varem se rozpustí ve 20 μΐ pufru (65 mM tris-HCl, pH 6,8, 5&[3-merkaptoethanolu, 1 % glycerinu, 0,01 % bromfenolové modře) a uloží se na 3% polyakrylamiový gel (10% SDS). Proteiny se rozdělí diskontinuelní elektroforesou na gelu; pásy se mohou lokalizovat fluorografií na rentgenovém filmu (Kodak X-AR).
S oligonukleotidy připravenými podle vynálezu tak, že prodlouží začátek translace pro Tantigen, bylo při použití extrabuněčné koncentrace 30 μ-molámí registrována 70% inhibice virového růstu. To je protikladem k účinnosti odpovídajících řetězců, které nebyly stavěny podle vynálezu, tj. řetězců bez 3'—3'— a 5'-5'-vazeb. Zde při použití stejné koncentrace nebyla zjištěna žádná inhibice.
Obr. 4 ukazuje zřejmou inhibici T-Ag-biosyntézy při ošetření buněk 30 μΜ SV40TAS17(3'3',5-5').
Příklad 11
Srovnání sérové stability oligonukleotidů, které jsou modifikované pouze na 3'- konci popřípadě pouze na 5'- konci invertovanými fosfodiesterovými vazbami
Oligonukleotidy se nukleázou odbourávají od své 3'- koncové části (J. P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fishback, B. Froehler, Nucleid Acids Res. 19, 747-750 (1991). Mělo by se proto zkoušet, zda sama terminální 3'-3'-fosfodiesterová vazba stačí ke stabilizaci oligonukleotidu v krevním séru. Poněvadž 32p značený fosfátový zbytek, zejména při delším působení sérem na vzorek, se fosfatázami odštěpuje, bylo k detekci oligonukleotidů použito fluoresceinu.
Syntetizovány byly následující řetězce z genomu Xenopus levis:
Xelev 1: 3'-A(5'-5')GC CTC AAA C*AT GTG TGA CG-3'
Xalev 2: 5'-AGC CTC AAA C*AT TGT TGA C(3'-3')G-5'
Syntézy se provádějí jak popsáno v příkladu 5, přičemž se pro 10. kondensaci nasadí esteramid kyseliny cytidin-fosforité C*, který umožňuje dodatečnou kovalentní vazbu s fluoresceinem. Vestavba fluoresceinu se provádí podle návodu firmy Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology Auto Primer™ Syntézis Kit Instructions (XY-023-00-01). Modifikované oligonukleotidy se čistí elektroforesou na polyakrylamidovém gelu.
Sérový test: 10 pmol oligonukleotidu
140 μΐ čerstvého lidského séra
Vzorky se inkubují při 37 °C. Po 15 min, 30 min, 45 min, 45 min, 60 min, 8 hodinách a 72 hodinách se odebere vždy 20 μΐ, 2 x se extrahuje směsí fenol/chloroform/isoamylalkohol 25:24:1 a oligonukleotidy se srazí ethanolem. Produkty štěpení se dělí a detekují na 16% polyakrylamidovém gelu v automatickém sekvenátoru A.L.F. (Pharmacia, Freiburg). Jak ukazuje obr. 5, vykazuje pouze řetězec opatřený na 5'-konci invertovanou intemukleotidovou vazbou již
-22CZ 285408 B6 po 15 min působení séra produkty odbourání a po 60 min, je již téměř úplně odbourán.
Oligonukleotid „chráněný“ na 3'-konci 3'-3'-vazbou je sám proti tomu po 72 hodinách teprve částečně odbourán.
Příklad 12
Inhibice exprese genů v in vitro-expresním systému
Aby se kvantifikovala exprese genů INV-oligonukleotidy, byl zkoušen účinek odpovídajících oligonukleotidů s řetězcem proti smyslu kódu na expresi p53 v systému in vitro, aby p53 obsahoval mRNA (E. Reihsaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).
Byly syntetizované řetězce proti smyslu kódu
NH2(CH2)6pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT(3'-3')T a jako srovnávací vzorek odpovídající řetězec ve smyslu kódu
NH2(CH2)6pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3'-3')A
Oligonukleotid s řetězcem proti smyslu kóduje řízen proti počátku translace onkoproteinu p53 Zkoušeny byly exprese proteinu
1. bez přidání oligonukleotidů
2. při přidání 30 μΜ řetězce proti smyslu kódu
3. při přidání 1 μΜ řetězce proti smyslu kódu
4. při přidání 10 μΜ řetězce proti smyslu kódu
Ke kvantifikaci bylo stanoveno černé zbarvení proteinových pásů densitometricky (E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).
Obr. 6 ukazuje, že přídavek 10 μΜ oligonukleotidů s řetězcem proti smyslu kódu k systému exprese působí cca 70% inhibici. Při snížení koncentrace na 1 μΜ není více možné zjistit téměř žádnou inhibici, rovněž při přídavku řetězce ve smyslu kódu, který neváže na mRNA.
-23CZ 285408 B6
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Analogy oligonukleotidů sterminálními 3-3'-, popřípadě 5'-5'-intemukleotidovými vazbami obecného vzorce I kdeR1 značí vodík nebo zbytek vzorce IIIGiDOHR2 značí vodík nebo zbytek vzorce IV αν) přičemž však alespoň jeden ze zbytků R1 nebo R2 představuje zbytek vzorce III nebo IV,B představuje bázi, vybranou ze skupiny zahrnující adenin, cytosin, guanin nebo nepřírodní báze purin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, N4-ethanocytosin popřípadě jejich prekurzorové formyY značí zbytek z řady O-Si(R)2, OCH2, C(O)NR nebo OCH2-C(O), kde R představuje alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, fenylovou skupinu, fenylovou skupinu, substituovanou jednou až-24CZ 285408 B6 třikrát alkylovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy, alkoxyskupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy a/nebo atomem halogenu, cykloalkylovou skupinu s 5 nebo 6 uhlíkovými atomy nebo skupinuIZ - P = v ,Ον/ a W' nezávisle na sobě značí kyslík nebo síru,Z a Z' nezávisle na sobě značí O; S“; alkoxyskupinu s 1 až 18 atomy uhlíku; alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku; skupinu NHR3 s R3 znamenajícím alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, nebo alkoxyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém zbytku; skupinu NR3R4, kde R3 má shora uvedený význam a R4 značí alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, nebo kde R3 a R4 spolu s nosným atomem dusíku značí 5 až 6 členný heterocyklický kruh, který může navíc obsahovat další heteroatom z řady O, S, N a n znamená celé číslo 5 až 60, jakož i jejich fyziologicky snášenlivé sole a tyto sloučeniny, substituované skupinami, podporujícími intrabuněčnou absorpci, skupinami, které slouží jako značící skupiny in vitro nebo in vivo, chemiluminiscenčními skupinami a/nebo skupinami, které při hybridizaci oligonukleotidů na biologické DNA nebo RNA napadají tyto DNA- nebo RNA-molekuly za vazby nebo štěpení.
- 2. Analogy oligonukleotidů podle nároku 1, vzorce I, kde R2 představuje zbytek vzorce IV a R1 značí vodík; R1 popřípadě R2 představují zbytek vzorců III popřípadě IV; nebo R2 značí vodík a R1 znamená zbytek vzorce III, přičemž buď W nebo Z v posledním případě neznamenají kyslík.
- 3. Analogy oligonukleotidů podle nároků 1 nebo 2, vzorce I, kde W představuje kyslík, nebo Z a W oba znamenají kyslík.
- 4. Analogy oligonukleotidů podle nároků 1 až 3, vzorce I, kde R2 představuje zbytek vzorce IV a R1 značí vodík.
- 5. Analogy oligonukleotidů podle nároků 1 až 4, vzorce I, kde Z a Z' nezávisle na sobě značí výhodně alkoxyskupinu s 1 až 8 uhlíkovými atomy, obzvláště 1 až 3 uhlíkovými atomy, zejména methoxyskupinu; alkylovou skupinu s 1 až 8 uhlíkovými atomy, obzvláště alkylovou skupinu s 1 až 3 uhlíkovými atomy, zejména methylovou skupinu; R3 výhodně značí alkylovou skupinu s 1 až 8 uhlíkovými atomy, zejména alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy, nebo také methoxyethylovou skupinu; R4 značí výhodně alkylovou skupinu s 1 až 8 uhlíkovými atomy, zejména alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy nebo R3 a R4 spolu výhodně tvoří morfolinovou skupinu a n značí výhodně celé číslo 10 až 40, obzvláště 15 až 25.
- 6. Analogy oligonukleotidů podle nároků 1 až 5, vzorce I, substituované skupinami, podporujícími intrabuněčnou absorpci, zvolenými ze skupiny alkylových zbytků saž 18 uhlíkovými atomy, cholesterylu, kyselin žlučových a peptidů, vázajících se na receptory, které hrají roli při receptory zprostředkované endocytose; skupinami, které slouží jako značící skupiny in vitro nebo in vivo ze skupiny obsahující akridinylovou skupinu, dansylovou skupinu nebo fluoresceinylovou skupinu; nebo chemiluminiscenčními skupinami ze skupiny obsahující akridiniumesterové skupiny; a/nebo skupinami, které při hybridizaci oligonukleotidů na-25CZ 285408 B6 biologické DNA nebo RNA napadají tyto DNA- nebo RNA-molekuly za vazby nebo štěpení, ze skupiny obsahující akridin, psoraly a chlorethylaminoarylové konjugáty.
- 7. Způsob výroby analogů oligonukleotidů vzorce I, podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že sea) odpovídající nukleotidová jednotka s 3'- popřípadě 5'-terminálními skupinami fosforu(III) nebo fosforu(V) nebo její aktivovaný derivát nechá reagovat s další odpovídající nukleotidovou jednotkou s 3'-, popřípadě 5'-terminální volnou hydroxyskupinou, nebo seb) odpovídající oligonukleotid zkonstruuje z fragmentů stejným způsobem, v oligonukleotidech získaných podle (a) nebo (b) se popřípadě jedna nebo několika ochranných skupin zavedených dočasně k ochraně ostatních funkcí odštěpí a takto získané oligonukleotidy vzorce I se popřípadě převedou na svoje fyziologicky snášenlivé soli.
- 8. Analogy oligonukleotidů vzorce I, podle nároků 1 až 6 k použití pro hybridizačně chemický, na adici na nukleové kyseliny s dvojitým nebo jednoduchým řetězcem spočívající postup regulace nebo potlačování biologických funkcí nukleových kyselin, jakož i k selektivnímu potlačování exprese funkcí virového genomu a k profylaxi a terapii virových funkcí, k potlačování nádorové funkce a k terapii rakovinných onemocnění.
- 9. Farmaceutické prostředky potlačující funkci nukleových kyselin, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahují jeden nebo několik analogů oligonukleotidů podle nároku 1 až 6, popřípadě spolu s fyziologicky snášenlivými pomocnými a/nebo nosnými látkami, zejména pro intravenosní nebo topickou aplikaci.6 výkresů-26CZ 285408 Β6 ° * » > 0 > fltl>U τ3’-27CZ 285408 B6-28CZ 285408 B6Obr.3-29CZ 285408 B6Obr. 4-30CZ 285408 B6
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4021019 | 1990-07-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS201491A3 CS201491A3 (en) | 1992-01-15 |
| CZ285408B6 true CZ285408B6 (cs) | 1999-08-11 |
Family
ID=6409497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS912014A CZ285408B6 (cs) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | Analogy oligonukleotidů s terminálními 3`-3` -popřípadě 5`-5`-internukleotidními vazbami, způs ob jejich výroby a použití |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5750669A (cs) |
| EP (1) | EP0464638B1 (cs) |
| JP (1) | JP3186795B2 (cs) |
| KR (1) | KR100200400B1 (cs) |
| AT (1) | ATE151076T1 (cs) |
| AU (1) | AU647143B2 (cs) |
| CA (1) | CA2045891C (cs) |
| CZ (1) | CZ285408B6 (cs) |
| DE (1) | DE59108644D1 (cs) |
| DK (1) | DK0464638T3 (cs) |
| ES (1) | ES2099718T3 (cs) |
| FI (1) | FI104177B1 (cs) |
| GR (1) | GR3023432T3 (cs) |
| HU (1) | HU215147B (cs) |
| IE (1) | IE912309A1 (cs) |
| IL (1) | IL98672A (cs) |
| NO (1) | NO303018B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ238769A (cs) |
| PT (1) | PT98169B (cs) |
| SK (1) | SK279544B6 (cs) |
| TW (1) | TW206232B (cs) |
| ZA (1) | ZA915056B (cs) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5223618A (en) * | 1990-08-13 | 1993-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
| EP0593901B2 (de) * | 1992-09-24 | 2008-04-09 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Oligoribonucleotid- und Ribozym-Analoga mit terminalen 3'-3'-bzw.5'-5'-Verknüpfungen |
| HU9501974D0 (en) * | 1993-03-31 | 1995-09-28 | Sterling Winthrop Inc | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
| US6015886A (en) * | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
| US6605708B1 (en) * | 1993-07-28 | 2003-08-12 | Hybridon, Inc. | Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom |
| US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
| US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| US20080119427A1 (en) * | 1996-06-06 | 2008-05-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation |
| US9096636B2 (en) * | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US7309692B1 (en) * | 1996-07-08 | 2007-12-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1 |
| US6977244B2 (en) | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
| CN1060177C (zh) * | 1997-06-28 | 2001-01-03 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 3′－单磷酸化寡核苷酸 |
| US7285288B1 (en) | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
| US7704962B1 (en) | 1997-10-03 | 2010-04-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Small oligonucleotides with anti-tumor activity |
| US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
| US20030180789A1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-09-25 | Dale Roderic M.K. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
| DE19935756A1 (de) * | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
| DE19935303A1 (de) | 1999-07-28 | 2001-02-08 | Aventis Pharma Gmbh | Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5 |
| US6271360B1 (en) | 1999-08-27 | 2001-08-07 | Valigen (Us), Inc. | Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors |
| EP1702983A3 (en) | 2000-04-13 | 2007-01-10 | Medical University of South Carolina | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, DNAzymes and antisense oligonucleotides and methods of use thereof |
| JP2004503560A (ja) * | 2000-06-13 | 2004-02-05 | プロリゴ・エルエルシー | 固相オリゴ合成の普遍固形支持体とその製造及び使用の方法 |
| AU2001294750C1 (en) * | 2000-09-26 | 2008-09-18 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes |
| GB0114007D0 (en) * | 2001-06-08 | 2001-08-01 | Isis Innovation | Oilgonucleotides |
| US7070933B2 (en) * | 2001-09-28 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Inversion probes |
| US20040043950A1 (en) * | 2002-01-03 | 2004-03-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | WT1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer |
| WO2003066649A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Biomira Inc. | Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides |
| AU2003291755A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use |
| CA2504720C (en) | 2002-11-05 | 2013-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| CA2679750A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-23 | Nexus Dx, Inc. | Methods for detecting nucleic acids in a sample |
| EP2781523A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-24 | Miltenyi Biotec GmbH | Lipophilic oligonucleotide analogs |
| KR101323476B1 (ko) * | 2013-06-12 | 2013-10-31 | 조선미 | 건물용 층간소음 방지재와 이를 이용한 층간소음 방지구조 및 그 시공 방법 |
| LU92821B1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-20 | Mologen Ag | Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides |
| GB2542425A (en) | 2015-09-21 | 2017-03-22 | Mologen Ag | Means for the treatment of HIV |
| EP3825400B1 (en) * | 2016-04-08 | 2024-12-25 | Translate Bio, Inc. | Multimeric coding nucleic acid and uses thereof |
| JP2020522510A (ja) | 2017-06-02 | 2020-07-30 | ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． | オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法 |
| CA3094598A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Tsinghua University | Methods of sequencing and producing nucleic acid sequences |
| SG11202009877XA (en) * | 2018-04-12 | 2020-11-27 | Wave Life Sciences Ltd | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
| US12391942B2 (en) | 2018-05-11 | 2025-08-19 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4123610A (en) * | 1977-03-09 | 1978-10-31 | The United States Government | Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith |
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
| DE3332068A1 (de) * | 1983-09-06 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von nukleosidalkyl-, aralkyl- und arylphosphoniten und -phosphonaten |
| US4795700A (en) * | 1985-01-25 | 1989-01-03 | California Institute Of Technology | Nucleic acid probes and methods of using same |
| US5276019A (en) * | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
| JPH03503894A (ja) * | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド ｎ‐アルキルホスホラミデート |
| WO1990012022A1 (en) * | 1989-03-31 | 1990-10-18 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections |
-
1991
- 1991-06-26 DE DE59108644T patent/DE59108644D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 DK DK91110570.8T patent/DK0464638T3/da active
- 1991-06-26 AT AT91110570T patent/ATE151076T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-26 EP EP91110570A patent/EP0464638B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 ES ES91110570T patent/ES2099718T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-28 FI FI913169A patent/FI104177B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 NZ NZ238769A patent/NZ238769A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 CA CA002045891A patent/CA2045891C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-30 IL IL9867291A patent/IL98672A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 IE IE230991A patent/IE912309A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 HU HU215/91A patent/HU215147B/hu unknown
- 1991-07-01 KR KR1019910011064A patent/KR100200400B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 AU AU79475/91A patent/AU647143B2/en not_active Expired
- 1991-07-01 CZ CS912014A patent/CZ285408B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 ZA ZA915056A patent/ZA915056B/xx unknown
- 1991-07-01 PT PT98169A patent/PT98169B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 SK SK2014-91A patent/SK279544B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 NO NO912585A patent/NO303018B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-07-02 JP JP18820291A patent/JP3186795B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-27 TW TW080105851A patent/TW206232B/zh not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-01 US US08/282,503 patent/US5750669A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-15 GR GR970401081T patent/GR3023432T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ285408B6 (cs) | Analogy oligonukleotidů s terminálními 3`-3` -popřípadě 5`-5`-internukleotidními vazbami, způs ob jejich výroby a použití | |
| US7321029B2 (en) | 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use | |
| AU709924B2 (en) | Cross-linking oligonucleotides | |
| JP3535519B2 (ja) | Ｎ−２置換プリン類 | |
| JP3170241B2 (ja) | ヌクレオチド試薬 | |
| EP1113020B1 (en) | Nucleosides and oligonucleotides containing boron clusters | |
| EP1206574A2 (en) | Guanidinium functionalized oligomers and methods | |
| JP2002520420A (ja) | 部位特異的キラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド | |
| JPH09505306A (ja) | 非ホスホネートヌクレオシド間結合と混合している不確定キラリティーのホスホネートヌクレオシド間結合を有する合成オリゴマー | |
| Lesiak et al. | 2', 5'-Oligoadenylate: antisense chimeras. Synthesis and properties | |
| EP0688784A2 (de) | Neue 3'-Modifizierte Oligonucleotid-Derivate | |
| US6312953B1 (en) | Bifunctional Crosslinking oligonucleotides adapted for linking to a target sequence of duplex DNA | |
| Fettes et al. | Synthesis and nucleic-acid-binding properties of sulfamide-and 3′-N-sulfamate-modified DNA | |
| RU2088588C1 (ru) | Олигонуклеотиды и способ их получения | |
| Olejniczak et al. | Synthesis, physicochemical and biochemical studies of anti-IRS-1 oligonucleotides containing carborane and/or metallacarborane modification | |
| JP2003513883A (ja) | ホスホロアミダイト組成物を用いるオリゴマー合成法 | |
| Pav et al. | Activation of Murine RNase L by Isopolar 2 ‘-Phosphonate Analogues of 2 ‘, 5 ‘Oligoadenylates | |
| JPH07507563A (ja) | ヘテロ原子によるオリゴヌクレオシド連結 | |
| JP2025163629A (ja) | クリックケミストリーによる制御する新規ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20110701 |