TW206232B - - Google Patents

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經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 206332 A6 ______；_ B6_ 五、發明説明（1 ) 反義寡核苷酸（Ant〖sense 0丨丨sonucleotides)被定 義作為核酸片段，其序列與傳信RNA之密碼或有義 序列互補或與D N A之编瑪鍵（codogenic strand)互補 。此類型之寡核苷酸在活饑外或細胞培養条统中逐漸地 被用於抑制基因表現。已络寬範圍的觀察使用此種物質 於内科治療上，例如：作為抗病毒蕖物。在生物學上， 反義RNA序列被使用作為原核生物中基因表琨之天然 發生調節剤己知己經有些時候（T· Mizuno, ，M.-Y. Chou and Μ . Inouyi，Ρ r ο c . Natl. Acad. Sci. USA S_L. 1966 -1 970 ( 1984))而且也是稟核生物基因表現之天然發生 調節劑（S.M. Heywood， Nucleic Acids Res. 1_1_，6 7 71 -6772 (1986))。它們藉由與適當傳倍RNA雜交•而 發生轉譯抑制作用。目前己經在許多實驗證明此種反義 RNA序列也可在插入細菌時，阻止基因表現（A. Hirashina, S. Sawaki, Y. Inokuchi and H. Inouye, PHAS USA 8 3 . 7726-7730 (1986))或插人真核細胞時阻止基因表現（J. G . Izant and H. Weintraub, Cell 3 6. 1007-1015 (1984)),並顯現抗病毒 （L.-J. Chang and C.K. Stoltzfus, J. Virology 6_L, 921-924 (1987))及抗腫 瘤作用（J.T. Holt, T.V. Gopal, A.D. Moutton and A.W. Nienhuis, PHAS USA 4794-4798 (1986)。合 成寡核苷酸之益處與供此種觀察之生物反義R ΝΑ比較 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 206232 A6 ____B_6_ 五、發明説明（2 ) •具有較大安定性並且較容《可獲得性。後者鼸於合成 技術•其在最近已經大大地改善而且使得相當短的寡* 物（例如：12-30鵪鍮基對者），目前相當容易獼得（Ε. Sonveaux , Bioorganic Cheaistry T 4. 274-325 (1986)； 01 igodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene E x p r e r s s i ο n , J . S . C o h e n ,鏞著，M a c ί 1 1 a n 出畈， 19 89;第7頁以後）。其己顏現甚至此種短寡聚物也是 表現之有效讕S_e 而且，此種寡核苷酸也可鞴由連接到DNA雙股， 形成三股蠼嫵産生作用。可是，為了反義寡核苷酸及形 成三股组合之寡核苷醎被用於生»糸统，必須符合下列 需求(01 igodeoxynucleotides, Antisense inhibitors of gene expression. J.S. Cohen fll # · Macaillan 出® , 1989,參鬭第1頁以下）： 1. 一方面它Λ必須易溶於水，但是，另一方必須容易通 钃親鼸性繽颼膜， 2. 在细鉋内必須對降解作用安定，換句括玫，對核醴鼸 必須安定， 3. 於生理覼度下，它們必須與鑛醣内核酸形成安定雜交臞， 4. 此雜交作用必須具蠹揮性；由産生繕嫌配對之寡核苷 酸的解離瀛度的差異，必須足麹大到其仍然可能持別 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -装- 訂- 線- 本紙張尺度逍用中國困家櫺準(CNS)甲4規格(210x297公¢) 206232 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（3 ) 将後者洗出。 在 1978, Zaczni I{及 Stephensοn ( P . C . Z ae c n i k and M. Stephenson. PNAS USA L5_. 280-284 & 285-288 (1978))第一次證明未經修改寡核苷醵能》抑觸Rous肉 艚病毒β可是，此寡核苷醴是以很离的濃度使用，而且 此實驗為了使核釀_失活，大部分是在事先加熱基質中 進行。逭些测量的必然性由外來核醴在受驗者之愈淸及 纗鼬中迅速釀索降解解釋之。 因此，早期以構迪上修饑寡核苷酸為目的遒行研究 ,使得它們較能符合上述需求，尤其鲥鑛Κ内峰解有較 好的保護者。遽些研究特別集中在磷酸二_核苷酸閭鍵 接的修餘，因為遽是在最後分析時，受所有核醴鼸攻擊 的位置。構造上經修改核苷酸間鍵接顋則上可分成 (a)以磷作為中心應子之核苷鍵接 逋些依序可為： 離子性/對*性 離子性/非對掌性 中性/對掌性 (b>中性/非對掌性無礴核苷鍵接 三羁酸釀及二覉酸_鍵接為構造上經修鑰者，但 是仍然是離子性核苷閜鍵癢者。經三覉酸釀修_寡核苷 釀（01ig〇dβο Xynuc1e〇tides, Antisense inhibitors of (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 線. 本紙尺度逡用中B β家揉準（CNS)甲4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 206232 A 6 _B_6_ 五、發明説明（4) gene expression, J.S. Cohen 编著，Macnillan 出版 ,1989, 97頁以下）目前證明在細胞培養中，雖然此抑 制作用顯示未結合至持異序列但是，對基因表現有最好 的抑制作用，因為甚至由那些只由一傾核酸單位組成之 經硫代磷酸酯修飾寡核苷酸例如：寡胞嘧啶核苷酸之硫 代雄酸酯類似物，也證明具抑制作用。經硫代磷酸酯修 飾之寡核苷酸的用途，一直受其對掌性的限制。 可是，因為η鹼基對寡核苷酸的製備，産生2n-l 舾非對映異檐物，只有含硫代磷酸酯鍵接之黴小比例産 物具有良好雑交性質。 在具有二硫代磷酸_核苷間鍵接之寡核苷酸蠹避免 對掌性問題（A. Grandas, Irfilliam S. Marshall, John Nielsen and Martin H . Caruthers, Tetrahedron Lett. 2 0 . 543-546 (1989), G.M. Porritt, C.B. Reese, Tetrahedron Lett. 3 0. 4713-4716 (1989))。可是， 到現在，此種化合物只能藉由具高損率之後雜及多階段 合成獲得。造就是為什麽到現在此雜交行為尚沒有寬範 圍研究，尤其在細胞培餐中尚未進行研究。 另一種化學上經修飾寡核苷酸是那些具非雔子性者 ，換句話說卽中性，核苷間鍵接者。此類型經修飾構造 包括具有磷酸三酯或甲基磷酸酯核苷間鍵接之寡核苷酸 (01 igodeoxynucleotides, Antisense inhibitors of (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ 線· 太疳iAffl ΨΗ3Η定捸miCNS)中4摁柊（210x297公修） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消费合作杜印製 五、發明説明（5) gene expression, J.S. Cohen 篇著，Macaillan 出睡 ,1989 , 79頁以下）。通常兩種類的化合物其可難子化覉__殘基是被一未懵霣苒基取代。此類型鍵接的導入.使得遒箜寡核苷 酸同条物對核黢醻具抗性β但是它fl具有在水合基質中 低溶解度之缺點。 具有中性/射掌性核苷两鍵接之寡核苷酸到現在只 能藉由将核苷閜鼸接之覉順子被另一中心應子取代獲得 .〇矽氧烷鍵接類似《酸醮繾接。具有矽《烷核苷閭鍵接 之寡核昔酸（K.K. Ogilvie· J.F. Cornier, Tetrahedron Lett. 2 6. 41 59 (1985 ), H. Seliger, G. Feger, Nucl. Hucl. fi_ ( 1 82), 483-484 ( 1987 )〉已經被合成而且對核 酸酶安定。具磺酸S,乙鐮醛或羧醒胺核苷閜鍵接之寡核苷酸 被掲示在 M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 2JL, 2385 -2388 (199). J.R. Tittensor, J. Cher·. Soc. C, 1971, p2656及 J. Coul. 1 If . Tetrahedron Lett. 2JL. P745。不同修改覉酸二曲核苷m踺接，鞴由使用改變组 蘼之_殲基，也已經産生抗核酸鼸寡苷酸同条物。此藉 由将其中琢餘基以α —配糖連接，合成寡核苷_同条物 (01 igodeoxynucleotides. Antisense inhibitors of gene expression, J.S. Cohen jfi 着，Macmillan Press , (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 太蚯张R飧1Λ ffl Ψ a SB宅捸灌iCNSi 規仫（210x297公烽） 2〇6232 A 6 B6 五、發明説明（6 ) 1989, 119頁以下）。可是，此類塱寡核苷酸同条物製 備上難以獾得，因為它們必須由糖及II基起始。而且， 在一些情況下它們顯示出鬵於雜交方位不正常行為。 本發明傈颺於化學式I或I之赛^核苷酸 W, —- —一 ...

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 式中 R1是氫或化學式1之一基者

-線. 經濟部中务標準局貝工消費合作社印製 #是氫或化學式IV之一基者

大κ 燴 ϋί 用 Ψ a ® V4規格（210x297公货） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（7 ) 但是至少R1或R2基中一基是化學式I或IV之一基者； B是一鹹基，例如••天然鐮基讅如：膝螵昤，胸膝嘧啶 ,胞哺啶，馬嚟昤或非天然鹹基諸如：嚅昤，2,6-二 胺基嚅昤，7 -去氡雜腺嚅昤，7 -去気雜鳥蠼昤或N4,N4-乙烯胞醺啶或其前藥物形式； W及W’分別為《或硫； Z及Z ’分別為0; S; Ct -0« -烷氣基，較佳h -C8 -烷氣 基，特定較佳Ci — C3 —统氣基，尤其甲氣基；Ci — Cb — 院基，較佳Ci — Ce —院基，待定較佳Ci— C3 —按基，尤 其甲基；HHR3 ,其中R3 =較佳為Ci-C·-烷基，待定較佳 Cl -Ce-院基，尤其是Cl — p —院基，或Cl — 〇4_焼氧基 -Ci—Ce —烷基，較佳甲«乙基 ；1<113114其中113如上面 所定義者，R4較佳是h -Οβ -烷基，持定較佳Ci -C8 -烷基 ，尤其Ct-U —烷基，或其中R3及R4舆其*懵它《之氰 原子一起，形成一可額外含選自包括0, S, N之另一雜 原子的5 — 6_元雜琛例如：噶啉。 Y 是.灌自包括 〇-Si(R)2 , 0CH2, C(0)NR.或 0-CH2-C(0) 之基，其中R是Ci—Ce —院基，芳基或C5 —或Ce_琢 烷基；且 η是5〜60之整歟，較佳20〜40 ,待定較佳15〜25之整 數，及其生理上可耐受·。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線· 太Κ浼iS用Ψ困Η «:捸rniCNS) V4掛格（210x297公修） 2〇6232 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（8) 就此而論，芳基意義例如：苯基，被G-Ce —烷基 ,G-C6 —烷氣基及/或鹵素取代（1-3次）之苯基。 化學式I之寡核苷酸較佳。 更好的是化學式I之寡核苷酸其中R2是化學式I V 之一基且R1是氫者；R1及R2分別是化學式I及IV之一基 者；或R2是氫且R1是化學式H之一基，其中W或Z在後面 倩況不是氣者。 又持別提及可製造化學式I之募核苷酸其中W是氧 或Z及W兩者是氣者。 化學式I之很持定較佳寡核苷酸是那些其中R2是化 學式IV之一基且是氫者。 而且，提及可能裂造化學式I及I之寡核苷酸，其 額外被利於細胞内吸吸之基取代，其在活體外或活醴内 作為報告基（reporter groups)者，及/或在寡核苷酸 與生物DNA或RNA雜交時，攻整此DNA或RNA 分子之基，與鍵形成或斷裂之基。 利於分子内吸收之基的實例是親脂性基諸如：烷基 ，例如：具高達18個碩原子者或膽固醇基或共軛髏，其 利用天然載體条统例如：膽汁酸或適當受體（例如：受 疆調節胞呑作用）之肽。報告基之實例是螢光基（例如 吖啶基，5 -二甲胺萘磺醛基，螢光素基）或化學發光基 例如：吖錠酯基）。 -10 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 線. 火皈谌R Λ达明Φ « M «ismiCNS)帘4相.格（210x297公货） 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 a〇6S3a A6 _B6_ 五、發明説明（9 ) 接至核酸及/或核酸裂阙之寡核苷酸共艉讎包含吖 陡（N. Thuong 等，Tetrahedron Lett. 29, p 5905， 1988)，補费賸素（psoralen)(U. Pieles 等，Nucleic Acid Res. Vol. 17，p285, 1 989 )或氰乙胺芳基共輥臞 (01igodeoxynuc 1 eotides , Antisense inhibitors of gene expression, J.S. Cohen篇箸，Maciillan 出版· 1989, 173以下）。 逋些寡核苷酸之待性構造修餘是改變於兩鍵末端之 核苷酸間鍵接，邸3’-3’或5’-5’鍵接取代生杨3’-5’鍵 接。令人驚訝地是我們己經發現，此最小限度之構造修 改，足以使此種化合物安定，以對抗核酸鼸降解。 如下文所描述者，此唯一 K微構造修嫌，将導致雜 交行為幾乎輿生物寡核苷酸之雑交行為相同。此也使得 逋些化合物大致上上可利用作為在细膽培餐中繽胞表現 之抑制繭。 迄今尚未在文獻中指出於矚鍵末纗上具有3’-3’及 5’-5’核苷間鍵接之寡核苷酸同条物的製備及其使用作 為反義寡核苷酸。二核苷碡酸酯之同条物其包含3’-3’ 或5’-5’鍵接者，己經有很多年是以主要産物_得（A. Myles, W. Hutzenlaub, G. Reitz 及 V. Pfeiderer, Che*. B e r . LQ_8_, 2857 -287 1 ( 1 975 ) ； H . Rokos , A. Myles, W. Hutzenlaub及 V. Pfeiderer, Che·· Ber. -11 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 線< 2〇6232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（β LQ_5_. 2872-2877 (1975); J. Toiaasz, Nucl. Hucl. 2_· ( 1). 51-61 (1983)； M. Neiner, N. Theriault, A. Schifman 及 K.K. Ogilvie, Vlth International Round Table, Nucleosides, Nucleotides and their biological Applications, La Grande Motte编箸，J.L. Imbach, 9 4 - 9 6 ( 1 9 8 4 )或適酋縮合作用之副産物（R . L e t s i n g e r , Κ·Κ· 0 g i 1 v i e , J . A m e r . Chem. Soc. 8 9 · 4801-4802 ( 1967))並且已經研究過。可是，此類型之二聚物在能 夠與細胞核酸安定雜交之原則上，熔點太低了。已經合 成只於一末端具有5’-5’鍵接之寡核苷核，在基因探針 中，於報告基導入一連接點 （S. Agrawal, C . Christodoulou, M.J. Gait, Nucleic Acids Res 14 . 6227-6245 (1986))。可是，其雜交行為迄今尚未被研 究。已經製備在分子中間具有單一 3'-3’或5’-5’鍵接之 自體互補寡核苷酸，供生物物理研究U.H. van de Sande, N.B. Rainsing, M.W. Germann, W. Elhorst, B.W. Kalisch, E.V. Kitzing, R.T. Pon, R.C. Clegg, T.M. Jovin, Science 2 4 1. 551-557 (1988) )〇 具有例置末端3’-3’及5’- 5’鍵接之寡核苷酸的製備 是以和在溶液中合成生物寡核苷酸相同方式施行之或較 佳，以固相，若適當，則用自動合成儀幫助合成之。 -12 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 線< 太《•祺Κ Λ* 用伞国国V4播格（210乂297公分） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 206232 A6 _B6_ 五、發明説明（11) 所以本發明也關於化學式I之寡核苷酸的製備，其 包括 (a)令具有3’-或5’-末端亞磷（Μ )或磷（V)基之核 苷酸單元或其活化衍生物與具自由3’-或5’-端羥基 之另一核苷酸單元反應或 (b )以相同方式由片段合成寡核苷酸， 若適當則將一或多値保護基消除，暫時導入依（a)或 (b)獲得之寡核苷酸，以保護其他官能基，及若適當 ,則將以此方式獲得之化學式I之寡核苷酸轉變成生理 上可耐受鹽。 用於固相合成之起始組份是一載醱樹脂，經由5 ’-0 Η 基連接至第一核苷單醴。用於製備此組扮的載髏樹脂是 藉由文獻已知方法 （T. Atkinson, M S π ί t h in Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait (缠箸），35-49 (1934))製備之，較佳矽膠或經控制細孔玻璃，其與 胺基起作用者。其與在核鹼基及 3’- 0H基被保護並且其 己事先轉變成5’-(對-硝苯基丁二酸）之核苷衍生物反應 。用於此鹼基之較佳保護基是醯基，例如：苯甲醯基， 異丁醛基或苯氣乙醛基。此3’位置較佳是被二甲氧三 苯甲基保護基保護，此保護基可依 M.D. Matteucc ί , M.-H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 21 (1980) p 3243 -3246所描述之方法導人。進一步藉由文獻上己 -13 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 装- 訂* 線· 206232 A 6 B6 2)明説 明 發 、五 第 數 倒 達 高 鏈 酸 苷 核 3 寡苷 行核 進用 ， 使 法佳 方較 之 ， 知成 3 苷 核 或 酯 酸 磷 亞 基 胺 合酯 之酸 份膝 組 Η 鏈 位 , 佳 3 較 在 0 保酯 用酸 使膝 次Η-再苷 〇 核 基或 OHil 酸 5 0 ^¾ 基基 P31K 甲 | 苯 5 三苷 氣核 甲之 二 上 藉基 具示 型解 類 _ 此以 〇 » 份備 组製 鐽的 後鏈 最酸 為 作 ，寡 者之 護接 保鍵 基間 甲酸 苯苷 三 核 氧端 甲末 二 置 用倒 苷 核 文 下 Ί 寡 於-5之 鍵 核 用時 同酯 酸。 磷 § 5 酸 亞ff備 ^ ^ ^ 寡 Ϊ 之酸 接 具 5 端或 末3' 在-備 製 3 具 及 接 鍵 (請先閲讀背面之注意事項再蜞窝本頁) 裝. 訂_ 線- 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 太冷Jl用+ »國宏i«miCNS)v4摁格（210x297公發） 206232 10 經请部中央標準局员工消费合作社印製 A 6 B 6

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線- 夂 W. K 埯 iS m Ψ a 03 它 i:S 進（CNS) lM ttl.格（210 乂 297 公货） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準扃员工消費合作社.印製 五、發明説明（ 结構及序列分析供藉由合成具3’-3’或5’-5’末端之 寡核苷酸的最初末蟵標定施行之。此藉由放射性檁定， 較佳使用S’-r-mp-ATP/多核苷酸激鼸進行標定。此放 射性標定發生在自由態5'-0H基上.邸於輿只具生物 3’-5’鍵接之寡核苷酸比較，位於此核苷酸鐽之相反末 端上。其次再籍由文獻上已知之方法，較佳_由如Maxaii 及Gilbert所描述之齡基待異性逢機裂解（A.M. Maxai 及 W. Gilbert, Methods in Enzy臟ology 6 5 . 4 9 9-560 (1980))施行之。因為此放射性櫥定是位於此分子之w 相反”末嫌，所以此序列之解黷現在也發生在輿具生物 3’-5’鍵接之寡核苷酸比較之相反方向上。此試驗之詳 细描述亲於實施例6。 化學式I及Π之寡核苷酸被用於化學雜交方法，其 以接到雙一或睪肢核酸為基磯，供讕節或抑制核酸之生 物功能，及供選擇性抑制病毒基因组功能之表現並且供 預防及治療病毒疾病，供抑制致鼸癱基因功能及供治療 痛症。 根鐮本發明合成之化學式I或I之寡核苷酸之行為 及其溶於血清中，可被拯為是活讎内安定性之澜量。一 般試驗描述在實施例7 ;對應活讎外試驗，在實施例8 中用蛇毒磷酸二醣酶之溶掖。根本發明之寡核苷酸比 3’-5’寡核苷酸之降解慢得多。 -16 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 206232 A 6 B6 五、發明説明（I5) 實施例11S明具末纗倒置3’-3’鍵接之寡核苷酸的 血清安定性。 依實施例9所描述之棋型實驗證明雜交行為，其中 若干SV40-特異性序列，己g根據本發明裂得，在各情 況下具3'-3’及5’-5’末纗者，證明與SV40 DHA之逋當 相對股雜交，其熔黏只撖乎其微地低於不是根據本發明 合成之對應序列，即不具3’-3’及5’-5’端之序列雑交所 澜得之熔 根據本發明提供之具末纗3’-3’及5’-5’鍵接之寡核 苷酸作為基因表現之抑制劑的活性，像由病毒SV40之生 長的抑制作用》明之。 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝- 訂_ 線. 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 -17 - 太《.ί&κ 燎淡 m + 拟格（210x297公修） A 6 B6 206232 五、發明説明（1¾ ? 先 閲 讀 背 .V-Π-二田氬三荃田薑-去氬炫镰iKgS’-fH.H-二里丙簋 -θ -镶7.甚）眩薹西鑑_醮4：>会成 由經基保謹之核苷起始的反匾流程描述如下： OMTiO-η 〇 ρ ΗΟ-η 〇 0 3Μ1Χ3 ^ 2nBr2 C > ~ Dt^T 織甲‘ r 2m-d 3a-d a : B=胸膝«啶 DMTr = 4, 4 ’-二甲氣基三苯甲基 b : B=HS -苯甲醒腺_昤 c : B=M4-苯甲B胞喃啶 d : B=N2-異丁醒鳥嚅昤 (<)3 ’ .5 雙- DMTr-去翥核糖核苷2之製備 . 混合物： 6毫莫耳dT, dAbz，dC ^或dG^u 14.4毫莫耳4,4’-二甲翥三苯甲基氛（DMTr-Cl) 14.0毫莫耳绝對三乙胺 將去氧核耱核苷1溶於50«升绝對吡啶並且於Ot： 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 之 注

OH 1a-d 添加三乙肢及二甲氣基三苯甲基«。然後令此混合物於 室溫攪拌24小時，随後藉薄靥色層分析（移動相：二镢 甲烷/甲酵9 : 1)檢澜反應。此反應藉添加甲酵使反 應中止，溶劑汽提除掉，並将殘餘物溶於二氰甲烷。有 機相用1M NH4HCO3溶液及水洗幾次，置《酸«(Ha2S〇4) 乾燥後，於旖轉濃缩機囊缠。3',5’-雙三苯甲基化産物 -18 - 太蚯法β 用屮团田定iitmfCNSVM規格（210x297公货） 206232 A 6 B6 經濟部屮央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（17) 2可自遇Λ三苯甲酵純化及藉管柱色層分析（管柱材料 :矽06ΟΗ,溶雄_ :蘧增甲酵含量之二氰甲烷溶液， 其中雙三苯甲基化去《核耱核苷是於卜1.5%甲酵被溶離 出來）由DMTr-dN分颼。 産1 :理諭值約73 -85%。 (B)5,-二甲氣基三苯甲基之待異性消除 ?久-夂 參考文獻：M.D. Matteucci 及 M.H. Caruthers , Tetrahedron Lett. 21. 3243-3246 (1980) 混合物：3¾荑耳3·,5’-0-雙-二甲氣三苯甲基去氧核 糖核苷2 15毫其耳溴化鋅（ZnBr2 ) 200毫奠耳绝對硝基甲烷 於0 1C ·将3 ’，5 ’ - 0 -雙-二甲氣三苯甲基去《核糖 核苷2在100毫升硝基甲烷中之溶掖添加至在另外1〇〇毫 升硝基甲烷中之澳化鋅憑浮液中。就經保護去氧膝曛昤 核苷而言，此反慝於冷卻下持鑛進行，以避免脱曛昤作 用。但是，此消去反醮只於60分後·用此核苷完成，此 消除反«可藉薄層色歷分析建立。躭胸脒晡啶核苷及去 «鳥嚅昤核苷而言•此反應同樣於室狙6〇分鏞後完成· 而雙-二甲氣三苯甲基去氣胞嘧啶核苷之5’-脱三苯甲基 化作用則只有不完全地反應發生。在此情況下•此反匾 於3小時後停止，以避免3’-二甲氧三苯甲基也被消除。 -19 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 206232 A 6 B6 五、發明説明（18) 此 反 應 藉 由 添 加200毫升1M醸酸銨 (N1U Ac) 溶 m 使反 應 中 止 ： 産 物 3用 200 *升二氯甲烷萃 取 « 有機 相 再 用銪 和 氛 化 m 溶 液 及 水洗 之，置Ha, S(U乾 嫌 後 ，溶 _ 藉 由於 真 空 蒸 » 去 除 之 〇 大 部 份 三 苯甲 醪可由使粗産物 在 約 500 毫 升 正己 烷 中 » 於 -1 5 *C沈》去除之。然後藉由在矽謬6 0 Η 管柱上 色 靥 分 析 » 用 m 壜甲 酵含量之二氰甲 烷 溶 液作 為 溶 離爾 t 進 行 纯 化 作 用 〇 3, -二甲«三苯甲基- 去 氣核 糖 核 苷之 Rf 值 與 以 下 列 方 式（ 移動相：二《甲 烷 / 甲酵 24 • 1 ) 獲 得 之 對 應 5 · -三苯甲基化單驩之Rf不同： 3 • __ 二甲氣三 :笨甲基去氣核苷 5, -二甲 «三苯甲基去氧核苷 (3'-1 DMTr-dM) (5，· -DMTr-dH) dT 0.28 0 .21 dA 0.55 0 .29 dC 0.53 0 .41 dG 0.32 0 .14 産 Μ ： 理 諭 值 的48 1-65¾ 〇 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 装· 訂· 線- 經濟部-¾央標準局员工消費合作社印製 C )/·-0-二甲«三苯甲基-去氧核耱核苷5’- (Ν,Ν-二異丙 (s C\' ^基氱乙基）胺基亞磷酸醱4之裂備 參考文獻：H. K‘0ster· Nucleic Acids Res· 12 . 4 5 3 9 -4557 (1984) -20 - 太《·?!« ΛΐΛ rn •kaerfeiitiftiCNSViMia格（210x297公修） 206232 A 6 B6 五、發明説明（19) 混合物：1毫莫耳 3 ’-0-二甲氧三苯甲基去氧核糖 核苷3 1.5毫某耳 氛-N , N-二異丙胺基-/3 -懾乙氣 基膦 4毫契耳 二異丙胺 以類似Koste「等人<23)所描述之方法進行亞礎酸 化反應，以製備5’- 0-二甲氣三苯甲基-去氣核耱核苷3’-胺基亞磷酸酯。於氫氣下，二異丙胺跟随在磷酸化試劑 之後添加至在绝對二氛甲烷中之經保護核苷之溶液中。 30分後，藉由添加30毫升乙酸乙酯使反應中止，此溶液 用飽和H a C 1溶液萃取3次，有機相置H a2 S 04乾燥，溶劑 藉真空蒸餾去除之。粗産物藉管柱色層分析純化之（管 柱材料：矽膠60H,溶離劑：石油醚/二氛甲烷/三乙 胺 45 : 45 : 10) 〇 4a之産量：理論值約93%。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_ 線· 經濟邡中央標準局员工消费合作社印製 -21 - 太《.银K疳ΐΛ ffl中國B定熄m(CNS) Ψ4坦格（210乂297公册） 206232 A 6 B 6 五、發明説明（2 Q 奮瀹拥P : mpy雄酗二醮鏞堆夕μι»睫眭接苷甚-鼸鼸醵眭毪苷之經備供裂備二聚物嵌段之反應路徑示於下面： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

7經濟部屮央標準局貝工消费合作杜印M 〇

TTX3H g 1〇 -22 - 夂认仏r泞Lfi m 4ms aa它嫂迆（CNSVMfcO.格（210 乂 297公资）

206232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 五、發明説明（2 1) A) 5’-0 -二甲氣三苯甲基胸腺嘧啶核苷5之製備 混合物 20毫莫耳 胸腺嘧啶核苷（4.84克） 24毫莫耳 4 , 4 ’-二甲氧三苯甲基氨（8 . 2克） 1毫莫耳 二甲胺基吡啶（122毫克） 28¾契耳 絶對三乙胺（3.8毫升） 化合物5之製備是由R.A. Jones之方法（G.S. Ti, B.L. Gaffney 及 R.A. Jones, J . A m e r . C h e m . Soc. LOA, 1316- 1 3 19 (1982))進行之。胸腺嘧啶核苷《由毎 次與50毫升绝對吡啶共蒸發3次，使乾燥並溶於100毫升 吡啶，於冰冷卻時，添加4,4’-二甲氣三苯甲基氛（4,4’-DMTr-Cl)及二甲胺基rtfc啶（DMAP)作為催化剤。此反 應藉薄層色分析監測（移動相：二氛甲烷/甲醇9: 1) ;可能於4小時後，藉添加100毫升水使反應停止。此溶 液用乙醚萃取3次，有機相乾燥後，於旋轉*縮機内醆 縮，殘餘物在苯中再結晶純化之。 産量：9.63克二甲氧三苯甲基去氧胸腺嘧啶核苷（89¾) B) 5’-0 -二甲氣三苯甲基胸腺嘧啶核苷3’-0- (Ν,Ν-二異 丙基- /?-氛乙基）胺基亞磷酸酯6之製備 依3二甲氧三苯甲基5’-胺基亞礤酸酯4之合成 (實施例1, C)所描述之方法，進行化合物6之製備 及純化。 C) 5'-0 -乙醯基胸腺嘧啶核苷8之製備 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝< 訂- -線- -23 - 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（22) 混合物： 2.0毫典耳 3 ’-0-二甲氣三苯甲基去镇胸 腺喃啶核苷3a (3 ’ -0-DMTr-dT) (1 . 1克） 0.1毫莫耳 二甲胺基吡啶（DMAP) (12. 2毫克） 4毫升 醣酸酐 參考文獻：A.M. Michel son 及 A.R. Todd, J. Org. Che·. 1 955 . 2632-2638 (經修改方法） 於冰冷卻下，將醑酸酐滴加至含3’-0-DMTr-dT&DMAP 在20毫升绝對吡啶之溶掖中。反應3小時後，轉化完全 (TLC核對；移動相：二氰甲烷/甲酵 24: 1)。生 成物7在400毫升冰水中沈澱出來，用抽氣將白色沈澱物 濾出，用冰水洗後，乾嫌。 産It : 1.02克3’- 0-二甲氣三苯甲基-5’- 0-乙醯基-去翥 胸膝喃啶核苷（3'-0-DMTr-5'-0-Ac-dT)(88X)。 為了消除4,4’-二甲«三苯甲基，令化合物7於室 溫，在10毫升80¾強度之醋酸中攪拌。3小時後，藉由 添加100«升冰水使反*中止；此使得4,4’-二甲氧基三 苯甲酵以白色沈黷分鬭。用抽氣過濾除掉，水合濾液在 旋轉囊繡機上囊缠。將油狀殘餘物溶於少量二氰甲烷並 且於-151C在200毫升正己烷中使沈黷出來。 産量：4 5 5毫克5 ’ - 0 -乙醒基胸膝嘧«核苷（9 4 % ) D)胸脒喃啶核苷基-(3’-3·)胸腺嘧啶核苷10之製備 -2 4 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂_ 線. 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（23) 混合物： 1.0毫其耳 5二甲氣三苯甲基3-0-(N, Η-二異丙基-/8 乙基）胺基 亞磷酸酯6 ( 705 . 8毫克） 0.9毫其耳 5 ’-0-乙醯基胸腰喃啶核苷8 (253毫克） 2. 6毫其耳 四唑（182毫克） 9 . 0毫其耳 磧（1 . 14克） 可能藉由供ΙΪ備3夂5’-核苷二聚物之Kiister所描述 之方法（H. Kbster, Nucleic Acids Res. JJL· 4 5 3 9 -4557 ( 1 984))合成二聚物B段。將5’-0-乙醯基胸脒喃 啶核苷及四唑之混合物溶於30毫升绝對氰甲烷，於氪氣 下，添加至按基亞羁酸酯。此混合物魇拌《夜，然後添 加9毫奠耳碘在30毫升氡甲烷/吡啶/水（24:5:1) 之溶液，再遇15分鐘後，《量礴藉由添加5毫升40*強 度亞硫酸溶液使遍原。然後将此溶液濃缠，殘餘物溶於 二氰甲烷並且用飽和硪酸氫納溶液洗2次，溶劑再藉蒸 «去除。粗産物可能藉管柱色靥分析（管柱材料：矽醪 60H ;溶離_ :乙酸乙僮/二氨甲烷50 : 50 ) «化之。 産量：665毫克（75 « ) 為了消除乙醯基及氰乙基，二聚物於室溫用5 毫升濃«水處理1小時；可能用80¾強度的醋酸去除4· 4’-二甲氣基三苯甲基。 -25 - (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) '裝. 訂- 線. 太紙张K飧诎闲中國团提格（210x297公你·） 206232 66 ΑΒ 五、發明説明（2)4 奮掄俐3 : 真5’. 5’-鎏醵二醮《格：> Μ瞌晡揉苷甚-鼸明醣iff榇苷14«備化合物14之流程示於下面。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央櫺準局貝工消#合作杜印製

14 -26 - 太认汴尺冷儁闳屮闽闽:捣淮（CNS)平4姒格（210x297公贷） 裝· •可_ 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（ 合成中間體之値別反應步驟是以實施例2所描述之 方法施行之。可能藉由F A B質譜及Μ核磁共振光譜證 明此2個二聚物嵌段的構造。 奮掄俐4 : 具η-二甲氣三荣甲某去筮核搪核苷5’-π-τ二酴酯 之CPG10-4 00敝驩物暫的附加。 CPG載劑籍由 Atkinson及 Smith之方法（Τ. Atkinson, M. Smith in Oligonucleotide Synthesis, M . J . G a i t (编箸），3 5 - 4 9 ( 1 9 8 4 ))使與 3 -胺丙基鐽 起作用。 A)3'-0-二甲氣三苯甲基-去氣核糖核苷5'-0- 丁二酸酯 15之製備 混合物： 1.0毫奠耳 3’-0 -二甲氣三苯甲基去氣核 糖核苷3 0.8毫莫耳 丁二酸酐（80毫克） 0.5毫荚耳 二甲胺基吡啶（61毫克） 丁二酸酐與去氧核糖核苷之5’- 0H基的反應在各情 況下是在5毫升絶對毗啶中，用DMAP作為催化劑， 於室溫進行隔夜。轉化完全之後，溶液濃縮並且藉由與 甲苯共沸蒸餾3次去除毗啶。將殘餘物溶於二氛甲烷 ,有機相用1 0 %強度之冰冷檸檬酸溶液及水洗之，並且 於真空濃縮。粗産物溶於約3毫升甲苯並且在200毫升 -27 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 206232 A 6 B6 五、發明説明（26) 正己烷中使沈澱。 産 Jt : 79-84¾。 B)3’-0-二甲氣三苯甲基去翥核糖核苷5’-(丁二酸對-硝 基苯酯）16及載W附加之製備（參閲下面流程）。

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 線- 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 潺合物： 0.8毫其耳-3’-0-二甲氣三苯甲基-去氣 核耱核苷5’- 0-丁二酸酯15 0.8毫英耳 對-硝基酚（112毫克） 2.0毫某耳 二環己基硪化二亞胺（412毫 克） -2 8 - 太《•张 K 坨 ίΛ ΙΑ Ψ » M ««miCNSI 姐格（210x297公焙） 206232 A 6 B6 五、發明説明（27) 經濟部中央標準局β工消费合作社印製 3克 起作用CPG 10 -1400 将 迓 保 護 丁二醯化 去氣 核耱核苷 添 加 至 對 一 m 基酚 在 5毫升绝對二啤烷及0 .2毫 升吡啶之 溶 掖 中 » 随 後 添加 D C C L 作 為 缠合劑。 短時 間後，二 琢 己 基 m 沈 黷 出來 » 3 小 時 後 TLC ( CH2 C 12 / Μ eOH 9 ： 1) 顯 示 兀 金 轉 化。 於 氬 氣下 抽氣将沈澱濾 掉， 濾掖立刻 添 加 15 毫 升 绝 對二 甲 替 甲 m 胺 ( D M F ) 中之 官能化載 Η 物 質 之 懸 浮 液。 添 加 〇. 8毫升三乙胺， 混合 物振燙遇 夜 0 然 後 用 抽 氣将 附 加 載 鼸 濾 出 ,用甲酵 及乙 醚洗後， 在 乾 嫌 器 乾 燥 。藉 光 譜 學 m 定 載 鼸附加。 一載 讎樣品（ 約 2 毫 克 ) 用 10毫 克 0 . 1N對 -甲苯磺酸之臃甲烷溶液處理， 以去除4 ,4 » 一 — 甲 氣 三 苯 基 m _子，載黼之附加可藉由於498奈 米 澍定 溶 掖 之 吸 光 9 使用下列 方程 式以黴莫 耳 / 克 計 算 之 吸 光值/10«毫升X 10*升X 14. 3 (常 數 ) 毫克 載臞 结 果 • 3 ' -DMTr-dt -載讎： 23微莫耳/克 3， -DMTr-dG i、u -載讎： 21微Μ耳/克 3 ' -DMTr-dA bz 載《 : 2 1微篥耳/克 3， -DMTr-dC bz _ 載鼸： 1 5撇莫耳/克 為 了 将 未 處理胺基 封纗 ，将經附 加 載 讎 與 1 毫 升醋 酸 m 及 50 毫 克 二甲胺基 毗啶 在15毫升 絶 對 吡 啶 之 溶 液， 於 室 溫 振 通 1 小時，然 後用 抽氣濾出 f 用 甲 酵 及 乙 醚洗 後乾燥。 -29 - 九紙张R浼ίΛ用中SB HI «iiSm(CNS) HM扭格（210x297公爺） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 206232 A 6 B6 經濟部中央標準扃貝工消费合作社印製 五、發明説明（28) 謇瀹拥R : 冀主纗3’- 31)¾ U，雄班之篡玆苷»的会成 此合成是在由美國纟？？1丨63 Biosysteu，Forster City供應之381A型D ΝΑ合成儀中.所有缩合步骤都使 用0.2微其耳檬_計劃施行之。此合成循環示於上面。 所使用之載_物質是描述在實施例4之CPG 10-1400 。 此縮合作用憤用之核苷3’-亞»酸酸旎行之；只在最後 反慝循琛是使用在實施例1所描述之3’-0-二甲氣三苯 甲基-核苷5 ’ - ( Η , Η -二異丙基-泠-供乙基）胺基亞磷酸 酯。寡核苷酸自載麵用潰氨水消除後，藉由在《水中於 60t加熱此溶液過夜，去除所有磷酸醣及_基保護基， 此櫬品藉由在乙酵中沈濉脱·橛的序列自較短片段藉 聚丙稀醯按》騵霣泳液化之。《我們研究而言·吾等合 成一只有3·-5,鍵接及一具末纗3’-3’及5’-5’鏞接之二 十磺胸膝《啶核苷酸物。我們也自(SV4QS遲JB選揮序列 。合成下列寡_苷酸： ..... d T 2〇 *dTsso (3，- 3、5，- 5 ·); SV40TS17: 17聚物，於5159-5176位，自SV40基因组之有 意義序列； 5 ' -AGC TTT GCA AAG ATG GA-3 ' SV40TAS17: 17 聚物，對 SV40TS17 反義序列； -30 - (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 装- 太板铒 R 飧 1Λ ffl Ψ M a 格（210x297公资） 經濟部+央標準局貝工消費合作社印製 206232 A6 _B6_ 五、發明説明（29) 5 ' -TCC ATC TTT GCA AAG CT-3' SV40TAS17(3、3’，5’-5·): 17 聚物.對 SV40TS17 反義 序列：於末纗具3’-3’及5’ -5’鍵接； 3 f-Τ (5 *-5 · )CC ATC TTT GCA AAG C(3，-3，） Τ-5， SV40TS35 : 35聚物，得自SV40基因组，於5 142-5 176位 之有意義序列； 5'-AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGA AG-3' SV40TAS35: 35聚物，對 SV40TS35反義序列； 5，-TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG CT-3 * SV40TAS35(3'-3’，5’-5’）： 35» 物，對 SV40TS35反義序 列••於末蟥具3’-3’及5’-5’ 鍵接 31-T (5'-5')CT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAGC (3·-3，）T-5， h)真支纗技苷鷉的会成 所使用之載黼物霣是在實施例4所描述CPG 10-1400 ，此编合作用是用慣用核苷3’-亞篇酸酯施行之。用濃 孩水自載黼消除寡核苷酸後，此溶液藉由在氩水中於60C -31 - (請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁) 裝- 訂· 線· 太紙铒Λ沧用Ψ國W定捸迆（CNS) 頫格（210x297公你） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明夺0 ) 加熱過夜，去除所有磷酸酯及驗基保護基，此樣品藉由 在乙醇中沈澱脱鹽，標的序列藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳 自較短片段純化之。合成下列寡核苷酸： SV40TAS17(3'-3'): 17聚物，對SV40TS17之反義序 列，於末端具3 ' - 3 ’鍵接； 3'-TCC ATC TTT GCA AAG C (3'-3')T-5' c)翁支锶5 ’-5'键培泠？支端硫代SS酸酯雜甚夕宴核苷敢 的合成 所使用之載醴物質為商場上可取得CPG物質，其包 含經3’-羥基鍵接之5’- 0-二甲氣三苯甲基胸睇嘧啶核苷。 此縮合作用以慣用之核苷3’-亞磷酸酯施行之；只有在 最後的反應循環是使用在實施例1所描述之3’- 0- DMTr·-核苷5’（Ν,Ν -二異丙基-/3 -氰乙基）胺基亞磷酸酯。 在前二傾反應循環中，用碘之愼用氣化反應，用元 素硫氣化取代之（參考文獻：W. Stec等人，J.A.C.S. 106,P6077, 1984)。用濃氛水自載體消去募核苷酸並且 藉由此溶液在氨水中.於601C加熱過夜，去除所有礤酸 酯及齡基保護基，此樣品藉由在乙醇中沈澱脱鹽，標的 序列》聚丙稀醯胺凝膠電泳，自較短片段純化之。 合成下列寡核苷酸： SV40TAS17(5-5’）： 17 聚物，對 SV40TS17 反義序列，於 5,端有5’-5’鍵接且於3’端有2二艢 -32 - (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝· 訂_ 線. 火紙银R沧iA用申团1«定燻m(CNS)肀4摁焓（210x297公分） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（3) 硫代磷酸酯核苷酸間鍵接 , 3'-T (5'-5')CC ATC TTT GCA A AG ( Ρs)C ( Ρs)Τ-3 ' / ^ 奮施例: 具末端n’；？（5’-5M鍵接乏寞核苷酴>搛诰好庠列的 分析 此寡核苷酸籍Maxaffl及Gilbert之方法（參閲M. Maxam 及 W. Gilbert, Methods in Enzymoloy 6 5. 4 9 9 -560 (1980)定序。在各情況下，100微徽某耳樣品在（r -32 -P)-ATP/T4多核苷酸激酶之存在下，在5’-0H基上放射性 標定，隨後進行下列驗基待異性反應： (A + G)反應：_基藉甲酸質子化 G反應：與硫酸二甲酯反鼷 (T+C)反應：肼解作用（hydrazinolysis) C反應：在5M NaCl存在下，與胼反應 寡核苷酸鏈Μ由1M用六氮吡啶於951C處理，於經修 改部位使斷裂；可能藉由聚丙烯Μ胺凝膠電泳（20%丙 烯醯胺，7Μ脲）劃分片段並且藉放射性自顯影偵測之。 圈 1 顯示 SV40TS17, SV40TAS17 及 SV40TAS17 (3，-3’， 5 ’-5')(參閲實施例5寡核苷酸之a描述）之序列的放 射性自顯影照相。因為此鍵於5 ’-0H基標定，當只有3’ -5’鍵接時，鹼基序列可以3’-5’方向讀出。可是，因為 3’-3’末端的結果，寡核苷酸5740了4517(3’-3’，5'-5’） -3 3 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明62) 於其3’纗具有放射性欏定5’-0H基；使得該序列（圈1) 讓数之方向相反。逭也趲明具自由態3’-0H基之鑣的5’-端上5’-5’磷酸二酯鍵接，不能藉酵素多核苷酸激酶使 磷酸化。 謇嫌俐7 : 以rfn清试齙恩有3’- 5末鏞夕富铉苷醵眘宙袢的 掄顛 a)具3’-3’及5'-5’末蟵之二十磺胸腺《啶核苷酸的致活 參考文獻：T. Mizuno, M.-Y. Chou.及 M. Inouye, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8_L. 1 9 6 6 -1970 (1984)混合物：1微升寡核苷酸（0.01 ODae* ) 1微升10 x澂醻緩衝液 1徽升T4多核苷酸激酶 1黴升r - 32 p - d A T P (待異活性：6 0 0 0 C ί /毫其耳） .6微升水 混合物於3 7 t：培養3 0分鐮，然後藉由添加9 0徽升水 使反應中止並且藉由在* S e p h a d e X G 5 0管柱分劃。将 生成物部份混合並且冷凍乾燥。> B)血淸試驗 參考文獻：S.M. Heywood, Nucleic Acids Res. ϋ_· 677 1 -6772 ( 1 986 ) -34 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 大《?& K 沧 ffl Ψ 因团 V4t0焓（210x297公分） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 五、發明説明（3 3) 混合物：0.01 0D2SO供參考之放射性雔酸化寡核苷酸 0.010026(>1'2〇,為具3’-3'及5’-5’鍵接末 端之實驗0.01 0D 2Μ T 20 50徹升新鮮人類血清 此血淸加至每一樣品並且藉手短暫振盪之。然後立 刻藉吸管吸出3微升作為Ο值並且添加至3徹升加有甲 醯胺缓衝液，以便中止酵素活性。然後於37 °C培養此樣 品。為了動力學研究，於指定時間間隔後取出3黴升並 且依上述方法^止酵素活性Q 1對照組： I p分，8分.11分，15分，30分 I實驗組： \5分，8分，11分，15分，30分，90分 此樣品裝填至20%聚丙烯醯胺凝膠上並且藉凝膠電 泳分離，然後放射性自顯影。 具新鮮人類血清之裂Η的放射性自顯影照相由左至 右（參閲圖2 )： 對照組： 0值，5分，8分，11分，15分，30分 實驗組： 0值，5分，8分，11分，15分，30分，90分 此證明天然寡核苷酸之降解於只有5分鐘後開始。 -35 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装- 訂· 線· 經濟部中央標準局员工消t合作杜印製 206232 A6 _B6_ 五、發明説明（3 4) «時間增加，而增加斷裂。甚至於培養90分鏞後，經修 正寡核苷酸事實上未改變。於所有動力值（kinetic values)看起來弱帚者，偽由血清中存在核酸内切鼸之 活性産生的。此斷裂對道些寡核苷酸之治療用途是重要 的並且是合宜的，因為其保證活性物霣之慢降解作用， 因此在身鼸内没有逭些物質累積發生。 奮渝俐ft : 旦玄鐮3'-2’》5|-5’《堆：>寞铉苷酴轚帕塞磯酴二酷醱 行為的研宑 A) 具3’-3’及5’-5'末蟵之二十磺胸臃《啶核苷酸，依實 施例7)所描述之方法致活 B) 具3’-3’及5’-5’末端之二十硪胸臃晡啶核苷酸使用蛇 毒磷酸二酯鼸水解 參考文獻：A. Hirashi^a, S._Savaki, Y. Inokuchi and M. Inouye, PNAS USA 8 3. 7726-7730 (1986) 混合物：5撇升R N A載fll 50撇升SQ缓衡劑 1徽升SVpdE (1 . 5單位/黴升） 放射性磷酸化樣品（對照组：T20,實驗組，具末 端3 ’ - 3 ’及5 ’ - 5 ’鍵接之T 2〇 )經冷凍乾燥，並於此添加 RNA載鼸及SQ® «液。在各情況下，自此混合物以 -36 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂· -線· 太紙？& R疳1Λ用Ψ团团宅熄m(CNS丫帘4姐格（210X297公册） 經濟部中央標準局员工消t合作社印製 206232 A6 ____B6 _ 五、發明説明（3导 吸管取出5微升作為0值•此溶液之钃餘部份輿_素温 合並且於3 7 t：培餐之。5分後，1 5分後及3 0分後各取出 5»升«品·作為對照動力，具3·-3·及5’_5'末靖之二 十硪胸脉嘧啶核苷酸之動力學研究，於5分· 30分· 45 分，60分及90分後各取5徽升櫬品败察之。為了使酵素 失活，此樣品於取出後立刻在95t水浴中加熱2分鐘。 此樣品經冷凍乾嫌並且裝《至分析2〇妬聚丙嫌醒胺#腰 上。_凝謬《泳分割之後，進行放射性自顯彩。 SVpdE斷片之放射性自顯彩照相（參閲_3): 由左两始：ΤΜ (對照组），具末绱3，-3,及5'-5’鍵接 之T2〇，實驗组之動力學試驗：5分.15分· 30分，45分 ,60分，90分後· 0分/15分混合，〇分/30分恭合，對 照動力學試驗：5分，15分，30分，45分後。 如已描述者5,- 5’鍵接立刻斷裂。淸楚的構造指示 舆對照组比較«後斷裂只有很慢地發生。5’_5’雄酸二 酯鍵接的斷裂，導致一分子其於斷裂位黏有_羥基。 此分子於其他末續被5’-雄酸化。於兩末纗受蛇骞雄醸 二鼸酶之攻擊是不可能的。此侵但是很明確之後來降解 可能鑤因於轚遒商所描述之簞胶持異性核酸内切’的存 在（J.G. Izant 及 H. Weintraub, Cell 16_，1007-1015 (1984))而且其将超蠼旋化PM2 DNA轉變成两放形式。其 容易讀出此序列之長度》可是，只有19個帯可讀出，因 -37 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 線· 太饫银；？ ΛΐΛ if!中困03宅itS(CNS)V4撖格（210乂297公龙·） 31：·»ί. ______ ... —*·—"*·** 206232 A 6 B6 五、發明説明（3 6) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 為 5， -5 » · 磷酸二 酯 鍵接已經於 5 分 鐘 後 之 第 —- 傾 動 力值 裂 開 〇 奮 W 例 9 . 具 末 端 ,V -3 f ^ t 一 R ’主纗：> 萁 核 苷 酸 雜 行 為 的 研究 為 了 研究雜 交 行為，記錄 熔 點 0 在 各 情 況 下 1 將等 克 分 子 量 (5 . 23奈莫耳）SV40TS17及 SV40TAS17 (3 '-3 ' 5， -5 -) (參閲實施例5寡核苷酸之描述 )溶於1毫升 1 OmM 二 甲 神 酸 鈉/IOObM氮化納缓衝液， P Η 7 . 0 » 並 且 熱至 7〇 r » 並 且在慢 冷 卻（1度/ 分 ) 下 ， 藉 由 测 置 溶 液之 吸 光 ί 決 定愎性 作 用（renatur at i 〇 η )之 進 展 C 由 使 用相 同 量 之 SV40TS17及 SV40TAS17記錄對照圖 0 在 各 情 況下 9 4 . 7 5 奈 ΙΪ 耳 SV40TS35 及 SV40TAS35 或 SV40TS35 及 SV40TAS35 ( 3 '- 3 ' ,5，-5，）在 緩 衝 液 中 類 似 混 合 並 且熱 至90 t t 測量冷 卻 時之吸光。 所 得 之 熔 點 作 圖 > 得 下列 Till 值 SV 40TS 1 7 * SV40TAS17 54 . 1 V SV40TS17 • SV40TAS17 (3 ' -3 * » 5 ' -5 ') 53 . 3 X： SV40TS35 • SV40TAS35 65 . 5 SV40TS35 * SV40TAS35 (3 ' -3 ’ » 5； -5 ') 64 . 2 X： 對 17聚物而言 ，非生物鍵 接 引 起 的 熔 化 溫 度 減 低只 有0.6°而35聚物則只有1.3亡。 -3 8 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部屮央標準局员工消費合作社印製 206232 A6 _B6_ 五、發明説明（37) 啻渝例1 0 亘支鱷3'-3’.5'-5’鐮培：>寞铉苷醵斟5 740了抗鹿夕牛 会成的油制作ffi A) 细胞培養 C0S1細胞培養在具10%胎生血淸之Dulbecco氏經修 改Eagle培餐基（DM EM)中。此组織培養皿於3 7弋及7.5% C〇2培餐之。 B) 放射性禳定及細胞裂解 約4X104細胞以單靥培餐在組鐵培餐皿中。會合 細胞曆用無甲硫胺酸DMEM洗3次，随後用100 MCi 3SS-甲硫胺酸欏定。為了反義調節實驗，此细胞與寡核苷酸 5\/40丁5017(3’-3’，5’-5’）及放射活性甲硫按酸，同時於 37C培養30分鐘。鏽後細胞用含10%胎牛血澝及未標定 甲硫胺酸之DMEM洗2次，並且讓其在此培養基中再 靜置30分鐘。為了使细胞碎裂，用冰冷磷酸鹽缓衡食鹽 水（PBS)處理之，自培養皿刮出並且於400g離心2 分鐮。细胞丸再用0.4毫升裂解缓衢液（0.5X Honidet P40, 100·Μ tris-HCl, pH 9.0, 0.1 M HaCl)每 3X106 細胞，在冰上溶胞45分鐘。為了防止蛋白質分解，將IX Trasylol及苯磺醒氟，以終*度0.25毫克/毫升添加至 裂解缓衝液中。溶解産物再於超離心機（105,000g), 於4TD離心30分鐘，直至澄淸。取出1〇撤升並且ULowry -39 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ 太K 浼 iA 用 Ψ Μ M «liSmiCNS) Ψ4規格（210x297公:Jin 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 206232 A6 _B6_ 五、發明説明（38) 方法澜置蛋白質含量。等量總蛋白霣用於免疫沈澱。 C)免疫沈澱作用 單株抗臞PAbl08用於局限在细胞霣之SV40野生型T 抗原及突變T抗原兩者之免疫沈澱。由雜種瘤上層清液 藉由在蛋白質A-Sepharose色曆分析純化抗鼸。細胞萃 取物用100微升金黄色葡萄球菌菌株（Cowan 1)之熱失活 及甲醛固定細豳的10%強度懸浮液，於4 t使沈醱過夜 。細®再鞴離心去除，上層液用單株抗鼸，於41C至少 培餐2小時，离度持異性免疫複合物《由添加金黄色蕕 萄球菌形成。此程序重禊高達3次，以確保完全沈澱。 免疫沈澱物再以下法洗滌：用50·Μ Tris-HCl, pH 8.0, 500 ·Μ LiCl, 1 ·Μ DTT, 1 ·Μ EDTA, U Trasylol 洗 3次；用50 ·Μ Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M HaCl, 5臟Μ EDTA, IX Honidet P40洗 2 次及用 50 ·Μ NfUHCOa 洗一 次。它們再用200微升溶雄缓衢液150 ΝΗ4 HC%y IX SDS, IX /8-殲基乙酵）於溶離45分鐮，冷凍乾燥 後，藉由在20撖升樣品缓衝液（65 nM Tris-HCl, pH 6.8,5!1!/3-黷基乙酵，1：1!甘油，〇.〇1!1!溴酚藍）沸1〇分 鐘溶解之並且裝《至3%聚丙烯醯胺«謬（10% SDS> 上。蛋白質藉間斷凝騵霣泳分劃；可能藉螢光術使該帶 局限在X-光軟片（Kodak X-AU)上。 記錄用根據本發明製備之寡核苷敢有70%病毒生長 -40 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 線· 太κ 疳 i» 用 Ψ 困 H 格（210乂297公货） 206232 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（3译 抑劑作用者，以此方式，當使用30微克分子的細胞外濃 度時，它們跨越T抗原之轉譯起始。此與不是根據本發 明合成之對應序列，即無3 ’-3’及5’-5’鍵接之序列的活 性相反。此情況當使用相同瀑度時，没有可偵測之抑制 作用。 圖 4 展示於細胞用 30w M SV40TAS17(3'-3’，5’-5') 處理時，TAg生合成之明顯抑制作用。 啻旃例1 1 於_好一末端薛3 ’ .V或5 ’ 5 ’倒晋磋酴二酯镪培條孜窵 炫苷酴 > 虫亩袢的檢湖丨 寡核苷酸藉核酸酶首先由其3’-末端使降解（J.P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J . Fischbach, B . Forehler, Nucleic Acids Res. 11., 747-750 (1991))。下列研 究之目的是用以證明若只一 3’3’-末端磷酸二酯鍵接是 足以使寡核苷酸安定化，以對抗在血清中之迅速降解。 因為32 P -標定磷酸酯殘基藉由磷酸酶在血清中延長處理 去除之，一螢光素檫記用於偵測。 合成得自非洲爪蛙（X e η 〇 p u s 1 e v i s )之下列寡核 苷酸序列，供研究其安定性： Xelev 1： 3,-A(5'5')GC CTC AAA C*AT GTG TGA CG 3' Xelev 2: 5, AGC CTC AAA CiAT GTQ TGA C(3'3')G 5' 依實施例5所描述之方法進行寡核苷酸之合成，惟 在第10個耦合反應中，一經鹸基修改之胞嘧啶核苷一胺 基亞礤酸酯c*用於容許螢光素標記之隨後共價連接。螢 -41- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 装- ,ΤΓ_ 線- 206232 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A 6 B6 五、發明説明（40) 光素之導入己經根據商場供慝商之原報告（Pharmacia TM . LKB Biotechnology, Auto Priier Synthesis Kit Instructions (XYA-023-00-01))完成之。經修改寡核 苷酸是藉聚丙烯醯胺鍰膠霣泳純化之。 血澝分析： 10微撖其耳寡核苷酸 140撖升人類血淸 櫬品於371培餐。15, 30, 45及60分，8小時及72 小時後，分別取出20撤升，用苯酚/«仿/異成酵（25 :24:1, v ： v ： v)萃取2次，最後用酒精使寡核苷酸 沈澱。斷裂産物在16%聚丙烯釅胺績謬上藉自動化定序 儀 *A.L.F. (Pharmacia, Freiburg)分離。由 _13可看 出的是於5’-纗剛好有一倒置磷酸二醣鍵接之Xelev 1之 安定性反而比於血澝處理15分後己經斷裂之産物顯現之 安定性低，60分後寡核苷酸幾乎完金降解。相反地，於 末端只有一 3'3’_磷酸二酯鍵接之寡核苷酸Xelev 2,甚 至於72小時處理後，仍只有部份降解。 實施例12 甚囡穷斑宑一话_外_薄条统中之抑制作用 為了定量蛋白質生合成在無細胞条统中被經修改寡 核苷醆之抑制作用，我們研究其對p53 «RHA之轉_的衝 (E. Reihsaus, M. Kohler, S. Kreiss, M. Oren, M. Montenarh, Oncogene 5, 137-144 (1990)) 〇 -42 - 太张 K iii ffl Ψ 困 M «i*rn(CNSΊ V 4描.格（210 X 297公册） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 206232 A 6 B6 五、發明説明气1 ) 已經合成針對p53-iRHA之轉嫌起始Ξ之下列反義寡 核酸： 5",H2H(CH2 ) 6 p TAA TCA GTC GTT GTT CCA CAC CTT (3'3')T 使用下列有義序列作為對照： δ^Ηζ N(CH2 ) 6 P AAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT (3'3f)A P53之蛋白質生合成已經研究 1. 無添加任何募核苷酸 2. 添加30ϋΜ有義寡核苷酸後（對照） 3. 添加1 Η反義寡核苷酸後 4. 添加1〇Μ Μ反義寡核苷酸後 f定¥是藉由在蛋白質凝謬上經染色蛋白質薄之光密 度澜定建成目的。圏14顯示添加10^/H反義寡核苷酸後 至活釀外蛋白》生合成条統，將導致70%抑制作用，而 於添加只有lw Μ寡核苷酸時，則幾乎沒有抑制作用可 被偵測得出來。添加不能結合至p53 *RNA之有義寡核苷 酸，甚至於髙至30uM之*度下，也不會導致P53生成之 抑制作用。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 線- 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 -43 - 太ttitK 燴 iiilfl ΦΒΒΤϋ：熄m(CNSl¥4扭格（210x297公分）

Claims (1)

1. 六、 公擊¥ 修ι£ ,1,丨日 補充| AT B7 C7 D7 申請專利範圍 專利申請案第80105851號 ROC Patent Appln. No.80105851 修jE之申請_利範圍中文本-附件㈠ Amended Claims in Chinese - Enel. I (民-82年1月曰送呈) (Submitted on January l| ,1993) l式（I)之寡核苷睃 r1 ~ — - 0、. B

   (I) (請先閱磧背面之注意事項再填寫本頁 M 0

   .¾.. 式中 R3·是氫或式（M )基團

   〇 - p « w (川） •打· 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 是氫或式（IV)基園

   但是至少R1或R2基中之一基是式（m或（IV)基圔； -44 - .線· 本紙張尺度適用中國鐲家樣準(CNS>T4規格(210X297公») 206232 A7 B7 C7 D7___ 六、申請專利範圊 (請先閱讀背面之注意事項再琪寫本頁) B是一選自胸腺嘧啶，N = -苯甲醯腺晡昤，N4-苯甲醢胞嘧啶， H2-異丁醯鳥晡呤· W及W’為氧； Z及Z ’為0H ; 旦 η是10-40之整數*及其生理上可耐受之鹽類。 2. 根據申請專利範圍第1項之式（I)之寡核f酸，其中R2是式 (")基_，旦R1是氫者。 3. 根據申請專利範圃第1項或2項之式（I)之 寡核苷酸，其額外被利於细胞内吸收之基取代，該基 在活醴外或活體内作為報告基（reporter groups), 及/或在寡核苷酸與生物DNA或R ΝΑ雜交時，攻 蠄此DNA或RNA分子，有鍵形成或斷裂之基者。 4. 一锺製備根據専利範園第1或2項之式（U之寡核 苷酸的方法，其包括 a) 令具3’-或5·-末嫌亞磷（I)或雔（V)基之核苷 酸單元或其活化衍生物與具自由態3〜或5’-末绱羥 基之另一核苷酸單元反應或 b) 以相同方式由片段合成寡核苷酸，若適當則消去一 • ， 經澌部屮央櫺準局貝工消费合作社印製 或多値哲時導入依（a)或（b>獲得之寡核苷酸 的保護基，以保護其他官能基，及若適當，則將以 此方式播得之式（I)之寡核苷酸轉變成其生理上 可射受之鹽。 -45 - 本紙張尺度適用中國國家樣毕（CNS) 規格（210x297公釐） A7 20623® c? ____D7_ 六、申請專利範面 5. 根據申謓專利範圍第 1 或2項之式（I )之 寡核苷酸•其係供用於化學雜交方法•其Μ連接至雙股或 單股苷酸為基礎，供調節或抑制核酸之生物功能，及供埋[擇 性抑制病毒基因組功能之表現及供預防及治療病毒疾病•供 抑制致腫瘤基因功能及供冶療癌症。 6. —種用於調節或抑制核酸之生物功能、及供選擇性抑制病毒 基因組功能之表現及供預防與治療病毒疾病、供抑制腫瘤基 因功能及供治療癌症之藥學組成物，其包含一或多棰根據申 請專利範圍第1或2項之化合物•若適當則與生理上可耐受 之輔助劑及/或賦形劑一起，較佳供解脈内或局部投解。 (請先聞讀背面之注意事項再滇鸾本百) 經浒部+央標準局®:工消費合作社印製 -46 - 本紙張疋度逋用中國國家搮準（CNS)規格(210x297公釐）