CS240463B1

CS240463B1 - Trojsodná sol' 4-(N-etyl-N-f0nylamíno)-8-(4-meíyll-2-sulíobenzén-l- -azo-2-(l-hydroxy-3,6-bÍ8Sulfonaft-l-yl)antíno ]-1,3,5-triazín- -2-ylhydroxyetylcelulózy a sposob jej přípravy

Info

Publication number: CS240463B1
Application number: CS843540A
Authority: CS
Inventors: Danica Mislovicova; Peter Biely
Original assignee: Danica Mislovicova; Peter Biely
Priority date: 1984-05-14
Filing date: 1984-05-14
Publication date: 1986-02-13
Also published as: CS354084A1

Description

Vynález sa týká trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonaf t-l-yl) amine] -1,3,5-triazín-2-yl-hydroxyetylcelulózy a sposobu jej přípravy.

Stanovenie aktivity glukanáz s endo-sposobom ataku polyméjnych substrátov sa v posledných rokocli značné zjednodušuje používáním tzv. chromogénnych substrátov, t, j. polysacharidov s kovalentne.. naviaza-. ným Farbivcm. V případe celuláz (endo-1,4-(3-glukanáz) sa používá niekoíko typov chromogénnych substrátov. Firma Calbiochem vvrába substrát, ktorý představuje vo vodě nerozpustná, čiastočne amorfnú celulózu s kovalentne naviazaným modrým farbivom. E. Kuniak a J. Zemek připravili preparát založený na báze sodnéj soli 2-[3-(l-amíno-2-sulf oantrachinón-4-yl-amíno) f enylsulfonyl] etyl — mikrokryštalickej celulózy upravený vo formě tabletiek (čs. AO 219 575).

Podobné M. Linko a M. Leisola připravili mikrokryštalikcú celulózu s tým istým naviazaným farbivom ako substrát vhodný predovšetkým pre stanovenie aktivity celuláz, ktoré atakujú krystalické oblasti celulózy [M. Linko, M. Leisola: Anal. Biochem. 70, 592 (1976)]. Dalším chromogénnym substrátom na stanovenie aktivity je vodonerozpustná O-(2,4,6-trinitrofenyl) celulóza, ktorej příprava ale vyžaduje poměrně drahé a toxické chemikálie a samotný substrát sa vyznačuje nestálosťou [J. S. Huang, J. Tang.: Anal. Biochem. 73, 369 (1976}]. Farebný substrát na báze hydroxyetylcelulózy bol připravený sieťovaním hydroxyetylcelulózy epichlórhydrínom a potom reakciou s dvojsodnou solou l-amíno-2-sulfo-4- [ 3- (2-sulf átoetylsulf onylanilíno) ] antrachinónu (čs. AO 192 202).

Vo všetkých vyššie uvedených prípadoch ide o substráty nerozpustné vo vodě, pričom princípom stanovenia aktivity celuláz ich prostredníctvom je spektrofotometrické meranie množstva farbiva uvolněného do roztoku vo formě rozpustných fragmentov polysacharidu s kovalentne naviazaným farbivom. Nevýhodou nerozpustných substrátov sú ťažkosíi s ich dávkováním (tabletováním sa tieto ťažkosti odstránia) akd i heterogenita inkubačných zmesi s enzýmom, keďže nerozpustný substrát nedovoluje bez miešania rovnoměrné vytváranie enzým-substrátového komplexu v celom objeme zmesi. Nerozpustné substráty nie sú tiež vhodné na sledovanie aktivity enzýmov viazaných na nerozpustné struktury, či už nosiče alebo buňkové, organely. Z tohto hladiska je preto výhodnejšie použit další typ chromogénnych substrátov, ktoré sú rozpustné vo vodě a predovšetkým v tlmivých roztokoch, v ktorých sa stanovenie enzýmovej aktivity uskutočňuje. Sú to chromogénne deriváty modifikovanej celulózy, ktorá je vo vodorozpustnej formě.

Na tieto účely je vhodná karboxymetylcelulóza alebo hydroxyetylcelulóza. Nevýhodou doteraz připravených chromogénnych substrátov na uvedenej báze je, že karboxymetylcelulóza sa musí upravit čiastočnou enzymatickou depolymerizáciou, aby sa zvýšila jej rozpustnost [Β. V. Mc Cleary: Carbohydr. Res. 86, 97 (1980)] a vodorozpustná hydroxyetylcelulóza po naviazaní dvojsodnej soli l-amíno-2-sulfo-4-[3-(2-sulfátoetylsulfonylanilíno) ] antrachinónu sa stává nerozpustnou v tlmivých roztokoch, v ktorých sa uskutočňuje stanovenie enzýmovej aktivity.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje tento vynález. Podstatou vynálezu je vodorozpustný chromogénny substrát trojsodná sol' á-fN-etyl-Ndenylamínoj-e-já-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno ] -l,3,5-triazín-2-yl-hydroxyetylcelulózy. Ďalej podstatou vynálezu je sposob přípravy tohto substrátu, ktorý sa vyznačuje tým, že vodorozpustná hydroxyeiylcelulóza reaguje vo vodnom roztoku s obsahom 1 až 3 % hmot. hydroxidu sodného alebo hydroxidu draselného za přítomnosti solí ako octan sodný, síran sodný a chlorid sodný pri teplote 20 až 50 °C počas 1 až 2 h s trojsodnou sofou 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl]amíno]-l,3,5-triazínu pri hmotnostných pomeroch hydroxyetylcelulóza : trojsodná soí 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4 -metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno ] -1,3,5-triazínu:

: hydroxid sodný alebo hydroxid draselný = 1 : 0,2 až 0,8 : 0,4 až 1,2; načo sa zafarbená hydroxyetylcelulóza vyzráža 3 objemami roztoku obsahujúceho 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 objemu acetónu a nenaviazané farbivo a farebné nízkomolekulárne frakcie hydroxyetylcelulózy sa odstránia vymýváním s roztokom obsahujúcim 1 objem 0,6 až 1 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a 3 objemy roztoku obsahujúceho 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 obpemu acetónu až do bezfarebného filtrátu.

Výhodou navrhovaného nového substrátu a spůsobu jeho přípravy je, že sa získá jednoduchým sposobom farebný substrát rozpustný v tlmivých roztokoch, v ktorých sa uskutočňuje stanovenie enzýmovej aktivity. Ďalšou výhodou je, že tento substrát je zrážaný a vymývaný za přítomnosti octanu sodného, t. j. za podmienok zhodných s podmienkami zrážania enzymaticky nerozštiepených farebných makromolekúl pri stanovení aktivity endo-l,4-/3-glukanáz. Výhodou je tiež to, že základné suroviny sú dostupné.

Příklad 1 g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v 30 mililitroch dest. vody, potom sa přidá 0,3 gramov trojsodnej soli 2-chlór-4r(N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno]-1,3,5-triazínu (Ostazinová červeň bril. H—3B) rozpustenej v 5 ml dest. vody. Po dókladnom premiešaní sa přidá 5 ml 6 % hmot. vodného roztoku chloridu sodného· a 10 ml 15 % hmot. vodného rozteku hydrou xidu draselného. Mieša sa 2 h pri teplote 20 ^CC. Po zneutralizovaní reakčnej zmesi 3 mol. 1^_1 kyselinou chlorovodíkovou na pH 7 sa zafarbený produkt vyzráža s roztokom 93 ml 96 °/o obj. etylalkoholu a 93 ml acetónu.

Vzniknutá zrazenina sa filtruje na nuči a premýva roztokom obsahujúcim 1 dřel 0,6 pere. hmot. vodného roztoku octanu sodného, 1,5 dielu 96 % obj. etylalkoholu a 1,5 dielu acetónu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zrazenina premyje roztokom 96 % obj. etylalkoholu a vody 3 : 1. Ešte vlhká zrazenina sa rozpustí v 50 ml vody a lyofilizuje. Získá sa 1 g farebnej hydroxyetylcelulózy s obsahom 2,5 % hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-fenylamíno )-6-[4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno]-1,3,5-triazín-2-yl. Příklad 2.

g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v 200 mililitroch dest. vody.pri teplote 40 °C. Potom sa přidá 8 g trojsodnej soli 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl)amíno]-1,3,5-triazínu rozpustenej v 50 ml dest. vody a ďalej 50 ml 6 % hmot. vhodného roztoku octanu sodného a nakoniec 100 ml 4 % hmot. vodného· roztoku hydroxidu sodného. Mieša sa 1 h pri teplote 40 °C. Reakčná zmes sa zneutralizuje s 3 mol. I^-1 kyselinou octovou , na pH 7 a vyzráža za intenzívneho miešania s 860 ml 96 % obj. etylalkoholu a 430 ml acetónu.

Zrazenina sa přefiltruje na nuči a premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 1 % hmot. vodného roztoku octanu sodného, 2 diely 98 % obj. etylalkoholu a 1 diel acetónu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zrazenina premýva roztokom 96 % obj. etylalkoholu a vody 3:1a ešte vlhká sa rozpustí v 400 ml vody a lyofilizuje. Získá sa 10 g farebnej hydroxyetylcelulózy s obsahom 13 % hmot. trojsodnej soli (4-N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno] -1,3,5-triazín-2-yl-.

Příklad 3

Postupuje sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že sa použije miesto octanu sodného 5 % hmot. vodný roztok síranu sodného a 6,5 g trojsodnej soli 2-chlór-4-(N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno]-1,3,5-triazínu. Reakcia prebieha pri teplote 50 °C po dobu 1 h. Získá sa 10 g farebnej hydroxyetylcelúlózy s obsahom 20 pere. hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno ] -l,3,5-triazín-2-yl-.

Příklad 4 g hydroxyetylcelúlózy sa rozpustí v 1 200 ml dest. vody počas 24 h. Potom sa přidá postupné 24 g trojsodnej soli 2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf abenzén-l-azo-2- {l-hydroixy-3,6-bissulf onaft-l-yl)amíno]-1,3,5-triazínu rozpustenej v 300 ml dest. vody, potom 50 ml 30 % hmot. vodného roztok u octanu sodného a nakoniec 600 ml 4 % hmot. vodného roztoku hydroxidu sodného. Teplota sa zvýši na 50 stupňov Celsia a reakčná zmes sa mieša pri tejto teplote 1 h. Po ukončení sa zneutralizuje s 5 mol.1¹ kyselinou octovou na pH 7 a zráža s 4 600 ml 96 % obj. etylalkoholu a 2 300 ml acetonu. Vyzrážaná zafarbená hydroxyetylcelulóza sa premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. roztoku octanu sodnéhd, 2 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel acetonu do· slabého sfarbenia filtrátu. Zrazenina sa ešte vo vlhkom stave rozpustí v 1 500 ml 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a prezráža zmesou rozpúšťadiel obsahujúcou 3 000 mililitrov 96 % obj. etylalkoholu a 1 500 ml acetonu. Zrazenina sa přefiltruje cez nuč a premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného, 2 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel acetonu do· bezfarebného filtrátu a nakoniec s roztokom 96 % obj. etylalkoholu a vody 3 : 1. Vlhká zrazenina sa rozpustí v 1 500 ml vody a lyofilizuje. Získá sa 55 g farebnej hydroxyetylcelúlózy s obsahom 15 pere. hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-f eny lamino)-6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissul.f onaf t-l-yl )amíno]-l,3,5-triazín-2-yl-.

Vynález má použitie v biochemii pře detekciu a kvantitativné stanovenie aktivity endo-l,4-/3-glukanáz ako zložiek celulázových enzýmových systémov.

Claims

PREDMET

1. Trojsodná so! 4-{N-etyl-N-fenylamíno )-6- [ 4-metyl-2-sulf ohenzén-l-azOi-2- {1-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno]-1,3,5-triazín-2-yl-hydroxyetyicelulózy.

2. Sposob přípravy zlúčeniny pod!'a bodu 1 vyznačujúci sa tým, že vodorozpustná bydro.íyetylcelulóza reaguje vo vodnom roztoku s obsahom 1 až 3 % hmot. hydroxidu sodného· alebo hydroxidu draselného za přítomnosti solí ako octan sodný, síran sodný a chlorid sodný pri teplote 20 °C až 50 stupňov Celsia počas 1 až 2 h s trojsodnou sofou 2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno )-6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl) amíno]-1,3,5-triazínu

VYNALEZU pri hmotnostných pomeroch hydroxyetylcelulóza : trojsodná sof 2-chlór-4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulf obenzén-lazo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-lyl) amíno·]-1,3,5-triazínu : hydroxid sodný alebo hydroxid draselný = 1 : 0,2 až 0,8 : 0,4 až 1,2; načo sa zafarbená hydroxyetylcelulóza vyzráža zmesou rozpúšťadiel obsahuiúcou 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 objemu acetonu a zrazenina sa premýva roztokom obsahujúcim 1 objem 0,6 až 1 °/o hmot. vadného roztoku octanu sodného, 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 objemu acetonu až do bezfarebného filtrátu.