CS251457B3 - Sposob přípravy deriváíov ceíalosp^rínov - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKÁSOCIALISTICKÁR E ? U S L I K A(13) POPIS VYNALEZU K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU 251457 (11) (B3) (61) Autorské osvedčenie je závisléna autorskom osvědčení č. 231 458 (51) Int. Cl.4 C 12 P 35/06 (22) .Přihlášené 17 10 83(21) (PV 7599-83) (40) Zverejnené 13 11 86 ttŘAD PRO VYNÁLEZY A OBJEVY (45) Vydané 15 08 83 (75)

Autor vynálezu KREMPOVÁ ALŽBĚTA ing., WELWARD LADISLAV ing. CSc., MICHÁLKOVÁ EVA ing. CSc., DUDEK MARCEL ing., BANSKÁ BYSTRICA,MARTVOŇ AUGUSTIN doc. ing. CSc., KOŠALKO RUDOLF ing. CSc.,BRATISLAVA, CHROMÍK JINDŘICH ing. CSc., PRAHA,

FRIMM RICHARD doc. ing. CSc., BRATISLAVA (54) Sposob přípravy deriváíov ceíalosp^rmw 1

Vynález „Sposob využitia imobilizovanýchbuniek pri přípravě derivátov cefalosporínovbuniék pri přípravě derivátov cefalosporí-nov“ sa týká sposobu enzýmovej přípravyderivátov cefalosporínov (CFSJ štruktúrne-ho vzcrca TI (viď rovnica č. 1), ktoré súmedziproduktami 'pri príprave kyseliny 7- 2 -aminccefalosporánovej (7-ACK) z látokštruktúrneho vzorca T pomocou imobilizo-vaných buniek mikroorganizmov obsahujú-cich D-aminoacid deaminujúcu-O2-reduktá-zu (D-aminoacidoxidázu, DAAO). rovnica č. 1 ' Cri - í ( Ό - / '

HciN

ÍQ

kde x = — O—CO—CH3

x = —OH

x = —H

R=—COOH cefalosporín C (CFS-C) dezacetylcefalosporín C (DCFS-C)dezacetoxycefalosporín C (DACFS-C)

Enýzm D-aminoacidoxiďáza produkovanýbuňkami Trigonopsis variabilis CCY 15—1—2Je možné imobilizovať viacerými sposobmi,pričom sa zvyšuje jeho stabilita a nekofko-násobne sa predlžuje použitelnost pri sú-časnom zjednodušení technologie a možnomvyužití nových technologických postupov.

Kyselinu 7-aminocefalosporánovú je mož-né připravit dvoma postupmi. Oba využívajú 251457 251457 ako substrát fermentačnou cestou získanécefalcsporíny. Chemická konverzia je viac-stupňový proces, náročný na čistotu použí-vaných surovin a přísné dodržiavanie tech-nologických operácií pri nízkých teplotách,pričom sa pracuje s toxickými látkami. Spo-sob chemickej přípravy popisuje japonskýpatent č. 7 307 117, patent NSR č. 1 445 615ai., líšiace sa od seba sposobom blokovaniakarboxylovej a amínoskupiny a čs. AO193 181. V porovnaní s chemickým sposobomje enzýmová konverzia výhodnejšia z hfadis-ka menšej technologickej náročnosti, nie jepožadovaný substrát vysokej čistoty a znižujesa počet technologických operácií v proce-se. Enzýmavá konverzia je nenáročná nasuroviny. Jedná sa o jedno alebo dvojstup-ňový proces, pričom v dvojstupňovej reakciivznikajú z látok štruktúrneho vzorca I lát-ky štruktúrneho vzorca II, ktoré sú dostup-ným substrátom pre acylázy různých mikro-organizmov pri tvorbě 7-ACK. Japonský pa-tent č. 74 044 895 uvádza možnost priamejenzýmovej konverzie cefalosporínov na 7--ACK vo fermentačnej pode působením Fu-sarium solárii, japonský patent č. 55 35 119//1980 opisuje rovnaký produkčný kmeň. Pa-tent NSR 2 723 463 sa zaoberá priamou kon-verziou CFS na 7-ACK působením enzýmovz krneňov Aspergillus a Alternaria rovnakoako US patent č. 3 239 393 a japonský pa-tent 53-94 093/1978, ktoré ako producentovuvádzajú kmene Brevibacterium, Achromo-bacter a Flavobacterium. Výhodnějším sposobom enzýmovej přípra-vy 7-ACK sa zatiaT javí dvojstupňový proces,v ktorom účinkom enzýmu DAAO na cefalo-spcríny štruktúrneho vzorca I dochádza kuoxidačnej deaminácii bočného reťazca v po-lohe 7 na cefémovom jadre za vzniku látokštruktúrneho vzorca II. Japonský patent54 154 592/1979 popisuje použitie buniek Tri-gonopsis variabilis zaistením glutaraldehy-dcm, pričom dochádza ku zvýšeniu stabilityenzýmu a je možné použit biologický mate-riál viackrát. Japonský patent č. 5 535 118//1980 popisuje rovnakého kmeňa na konver-ziu s účinnosťou 95 %. ČS AO č. 221 003 po-pisuje spůsob použitia aktivovaných buniekTrigcnopsis variabilis s účinnosťou 80—85percent. Aktivácia sa robí organickými roz-púšťadJami a detergentami. Brodelius v ča-sopise Applied Biochem. Biotechnology 6/4//1981 sír. 293—308 opisuje použitie buniekTrigonopsis variabilis zabudovaných do algi-nátového gélu pri produkcii α-ketokyselín zD-aminokyselín. V případe použitia buniekna konverziu vo filtráte z fermentačnej pů-dy, připadne v eluáte, je doporučovaný pre-bvtok enzýmu podfa japonského patentu č.507 158. AO 231 458 opisuje metody imobili-zácie buniek mikroorganizmov za použitiapolyfunkčných činidiel.

Vynález „Spůsob využitia imobilizovanýchbuniek pri príprave derivátov cefalosporí-nov“ využívá imobilizované buňky kmeňaTrigonopsis variabilis CCY 15—1—2 připra- vené modifikovaným postupom podfa čs. AOč. 231 458. Imobilizovaný biokatalyzátor ka-talyzuje vznik derivátov cefalosporínovštruktúrneho vzorca II z látok štruktúrnehovzorca I. Látky štruktúrneho vzorca II súmedziprcduktami pri príprave kyseliny 7-a-mínocefalosporánovej. Substrátom enzýmovejkonverzie je vodný roztok sodnej soli cefa-losporínu C alebo deproteinizovaný filtrátfermentačnej půdy alebo eluáty z II. purifi-kačného stupňa z purifikácie CFS-ov o kon-centrácii 3—5 % hmotnostných. Koncentrá-cia imobilizovaného biokatalyzátora pri re-akcii je 10--15 % hmotnostných a koncen-trácia inhibítorov vedlajších reakcii je 0,1až 0,5 %. Reakcia prebieha 2—8 hodin priteplote 32—36 °C za intenzívneho miešaniaa vzdušnenia.

Biomasa produkčného kmeňa kvasinkyTrigonopsis variabilis CCY 15—1—2 sa při-pravuje dvojstupňovou kultiváciou, pričomkaždý stupeň trvá 72 h pri 28 °C za vzduš-nenia 1 : 1 (objem živnej půdy : objem vzdu-chu za minutu). Do inokulačnej pody zlože-nia 2 % kukuřičného extraktu a 2 % glukó-zy sa ako stimulátor tvorby enzýmu přidává0,3 % D-valínu. pH půdy před sterilizáciousa upraví na 5,0. Pre druhý stupeň fermen-tácie sa 8—10 % inokula očkuje fermentač-ná půda zloženia: glukóza 3 %, peptón 1 °/o,kvasničný extrakt 1 °/o, KFLPCU 0,1 °/o, MgSO.j0,09 %, ktorá ako stimulátor obsahuje 0,25percent D-metionínu. Biomasa z fermentač-nej půdy sa získává centrífugáciou pri otáč-kách 4 000 mino1 počas 30 min za chladeniaBuňky po 3-násobnom premytí 0,lM fosfáto-vým tlmivým roztokom pH 7,5 sa deponujúpri —25 °C. Takto ošetřené buňky si zacho-vává jú enzýmovú aktivitu 10—12 mesiacov.

Zosietené buňky Trigonopsis variabilis sapripravujú působením polyaldehydických či-nidiel na bunkovú suspenziu o koncentrá-cii 1 % polyaldehydu (glutaraldehydu J nabunkovú suspenziu so sušinou 10 %. Za stá-lého miešania sa nechá působit 3—5 hodinpri laboratórnej teplote, potom sa centrifu-gáciou odseparuje biomasa, premyje sa vo-dou a deponuje pri —15 °C.

Agregáty buniek s enzýmovou aktivitou sapripravujú z premytej biomasy působenímzmesi 1% polyaldehydu (glutaraldehydu)a 2 % polyfunkčného činidla s obsahom a-miuo- alebo iminoskupiny, například poly-etylénimín, tetrametyiéndiamín, 3,3-diamino-dipropylamín ai. Táto zmes sa připraví 24hodin před použitím a intenzívně sa miešabez přístupu vzduchu. Po přidaní agregač-nej zmesi k bunečnej biomase sa táto zho-mogenlzuje a vymrazuje sa 6—10 hodin pri—25 °C.

Po rozmražení sa vzniknuté agregáty od-separujú filtráciou alebo centrífugáciou,premyjú a deponujú pri +4 °C vo fosfátovomtlmivom roztoku pH 7,5.

Pri imobilizácii buniek na pevný nosič sapoužívajú porézně aluminosilikátové mate- 231457

S riály, minerálně nosiče na báze kremeliny,porézneho skla, keramické materiály, hlin-ky, makroretikulárne živice ai. materiály svysokou adsorpčnou schopnosťou. Naviaza-nie buniek sa robí buď adsorpciou za rastu,kedy sa do kultivačného média přidá 10 %nosiča alebo naviazaním odseparovanej apremytej biomasy po ukončení fermentácie.V oboch prípadoch sa nosič s naviazanoubiomasou premyje 5-krát vodou a pósobe-ním horeuvedenej zmesi polyfukčných čini-diel sa připraví enzýmovo aktívny mobili-zovaný materiál. Na 5 g nosiča s adsorbova-nou biomasou sa přidává 30 ml zmesi poly-funkčných činidiel, vymrazí sa 4—6 hodinpri —25 °C, premyje sa a deponuje pri 4-4°Cv tlmivom roztoku pH 7,5. Enzýmavá akti-vita u všetkých spomenutých sposobov imo-bilizácie sa zachovává počas 10—12 mesia-cov od přípravy.

Pri enzýmovej konverzii sa vychádza zroztokov solí CFS-ov, deproteinizovanéhofiltrátu fermentačnej půdy alebo z eluátovz purifikácie CFS-ov, pričom optimálnakoncentrácia CFS-ov je 10 000—12 000 μξ//ml, optimum pH sa pohybuje od 7,9 do 8,1a teploty od 33 do 35 °C. V případe, že je vbuňkách přítomná aj kataláza, je možné juinaktivovať, pretože v opačnom případe vzni-kajú produkty štruktúrneho vzorca II, kdeR = —COCOOH, ktoré sú pre ďalšie enzýmo-vé spracovanie nevhodné. Na inhibíciu ka-talázy sa používajú anorganické azidy (azidsodný 0,1—0,5%), kyselina askorbová, pe-roxid vodíka, zlúčeniny bóru (metaboritana perborát sodný) ai. Reakcia vyžaduje ae-robně podmienky, optimálna aerácia je 1 li-ter vzduchu na jeden liter reakčnej zmesiza minútu. Doba reakcie je dva až šesť ho-hín. Orientačně sledovanie priebehu reakciesa robí metodou tenkovrstvovej chromato-grafie na silikagélových platniach s UV254indikátorom, kvantitativné stanovenie sa ro-bí vysokotlakovou chromatografiou.

Enzýmovou konverziou vzniknuté látkyštruktúrneho vzorca II, kde R = —COOH mož-možno použit' ako substrát pre enzýmovúpřípravu 7-ACK. Příklad 1

Biomasa T. variabilis s aktívnou DAAO,získaná dvojstupňovou kultiváciou na podes obsahom metionínu (0,2%), bola odsepa-rovaná. centrifugáciou pri otáčkách 4 000 . . min-1 počas 30 minut, premytá vodou adeponovaná pri —25 °C. Po rozmražení bolabiomasa nariedená tak, aby sušina výsled-né j suspenzie bola přibližné 10 %. Bolo při-dané 1 % glutardialdehydu a zmes bola mie-šaná 5 hodin pri laboratórnej teplote.Zosietené buňky boli odseparované centrifu-gáciou, premyté a rozsuspendované do tlmi-vého roztoku pH 7,5 tak, aby sušina bola10 %, Na enzýmovú konverziu bola použitátakto připravená suspenzia zosietených bu-niek v množstve 0,5 ml na 10 ml reakčnej 6 zmesi obsahujúcej ako substrát sodnú sol'CFS-C, v koncentrácii 12 000 /zg/ml a azidsodný 1 mg/ml. Reakcia prebiehala 2 hodi-ny při 34 °C za intenzívneho vzdušnenia natrepacom stroji. Hodnota pH bola udržiava-ná v rozmedzí 7,9-8,0. Stupeň konverzie bol88 %. Příklad 2

Postup přípravy biomasy aj podmienky en-zýmovej konverzie sú zhodné s príkladom 1,len na inhibicíu katalázy boli namiesto azi-du sodného použité perboritan sodnýNaBCkHzOa. 3IHO alebo perborát sodnýNaBOi. 3 H2O.

Stupeň konverzie bol 78 %. Příklad 3

Postup je zhodný s príkladom 1, pri enzý-movej konverzii boli namiesto sqdnej soliCFS-C použité eluáty z purifikácie CFS-ovs koncentráciou 12 000 ^zg/ml CFS-C. Stupeňkonverzie bol 71 %. Příklad 4

Biomasa produkčného kmeňa bola získa-ná postupem, opísaným v příklade 1. 24 ho-din před použitím bola připravená reakčnáagregačná zmes, obsahujúca 1 % glutaral-dehydu a 2 % polyetylénimínu v destilova-nej vodě a táto bola intenzívně miešaná prilaboratórnej teplote bez přístupu vzduchu.Agregáty s enzýmovou aktivitou boli pripra/vené přidáním tejto zmesi k biomase (tátotvořila 25 % reakčnej zmesi), ktorá bola podokladnom zhomogenizovaní vymrazená pri—25 CC minimálně 8 hodin. Pósobením čini-diel vznikli z biomasy granulkovité alebovločkovité agregáty, z ktorých po rozmraže-ní boli premývaním vodou odstránené zvyš-ky reakčnej zmesi, agregáty boli odseparo-vané centrifugáciou alebo odsátím a depo-nované v tlmivom roztoku pH 7,5 pri + 4 °C.Na enzýmovú konverziu sa navazovalo 0,5 gagregátov na 10 ml reakčnej zmesi, obsahu-júcej 10 000 — 12 000 |Ug/ml sodnej soli CFS--C. Podmienky reakcií sú zhodné s podmien-kami, uvedenými v příklade č. 1.

Stupeň konverzie sa pohyboval v rozmed-zí od 75 do 83 %. Příklad 5

Postup je zhodný s príkladom č. 4, len nakonverziu boli použité eluáty z purifikácieCFS-C s koncentráciou 12 000 ^g/ml CFS-C.Stupeň konverzie sa pohyboval v rozmedzíod 70 do 75 %. Příklad 6

Postup je zhodný s príkladom č. 4, ale na-miesto polyetylénimínu bol pri príprave ag-

Claims (1)

1. regátov použitý tetrametyléndiamín. Stupeňkonverzie bol 73 %. Příklad 7 Postup ako v příklade č. 4, ale namiestopolyetylénimínu bol použitý diaminodipro-pylamín v rovnakej koncentrácii. Stupeňkonverzie bol 75 %. Příklad 8 Biomasa připravená postupom, opísanýmv příklade 1, bola zriedená na sušinu 10 %.15 ml biomasy bolo inkubovaných s 5 g alu-míno silikátového nosiča s priemerom zrn 0,5 mm 3 hodiny. Nosič bol premytý vodou,bolo přidaných 30 ml roztoku 1 % glutaral-dehydu vo vodě a po 4 hodinovom vymrazo-vaní pri —25 °C bol nosič premytý vodou.Na konverziu bolo použitých 5 g na 50 mlzmesi. Podmienky reakcie bolí rovnaké akov příklade č. 1. Stupeň konverzie bol 60 %. Příklad 9 Biomasa bola kultivovaná v přítomnostiminerálneho nosiča, přidaného do půdy předsterilizáciou v množstve 5 % na objem pody.Po ukončení fermentácie bol nosič s buňka-mi premytý a další postup bol zhodný s prí-kladom č. 8. Stupeň konverzie bol 56 %. PREDMET VYNÁLEZU Spósob přípravy derivátov cefalosporínov obecného vzorca II i.....Á. | X' CQQH V1) kde X=z_ OCOCH.3, —OH, —H R ——COOH vyznačujúci sa tým, že sa k vodnému rozto-ku sodnej soli cefalosporínu C o koncentrá-cii 3—5 % hmotnostných alebo k eluátu zpurifikácie cefalosporínov o koncentrácii 3až 5 % hmotnostných pridávajú imobilizo-vané buňky kvasinky Trigonopsis variabilis CCY 15—1—2 imobilizované modifikovanýmipostupmi podía čs. AO č. 231 458, pričomkoncentrácia katalyzátora pri reakcii je 10až 15 % hmotnostných a koncentrácia inhi-bítorov vedfajších reakcii 0,1—0,5 % hmot-nostných a reakcia prebieha 2—8 hodin priteplote 32—36 °C za intenzívneho miešaniaa vzdušnenia a získané cefalosporínové de-riváty štruktúrneho vzorca II sa izolujú. Saverografia, n. p., závod 7, Most Cena 2,40 KCs