CS251457B3 - Sposob přípravy deriváíov ceíalosp^rínov - Google Patents

Description

Vynález „Sposob využitia imobílizovaných buniek pri přípravě deriváíov cefalosporínov buniek pri přípravě deriváíov cefalosporínov“ sa týká spSsobu enzýmovej přípravy derivátov cefalosporínov (CFS) šíruktúrnebo vzcrca II (viď rovnica č. 1), ktoré sú medziproduktami 'pri přípravě kyseliny 72

-aminccefalosporánovej (7-ACK J z látok štruktúrneho vzorca Ί pomocou imobilizovaných buniek mikroorganizmov obsahujúcich D-aminoacid deaminujúcu-Oa-reduktázu (D-aminoacidoxidázu, DAAO).

rovnica č. 1 ' Cri - í ( HΌ Z '

H_ciN íQ

kde x = — O—CO—CH3 x = —OH x = —H

R=—COOH cefalosporín C (CFS-C) dezacetylcefalosporín C (DCFS-C) dezacetoxycefalosporín C (DACFS-C)

Enýzm D-aminoacidoxiďáza produkovaný buňkami Trigonopsis variabilis CCY 15—1—2 Je možné imobilizovať viacerými sposobmi, pričom sa zvyšuje jeho stabilita a nekofkonásobne sa predlžuje použitelnost pri súčasnom zjednodušení technologie a možnom využiti nových technologických postupov.

Kyselinu 7-aminocefalosporánovů je možné připravit dvoma postupmi. Oba využívajú ako substrát fermentačnou cestou získané cefalcsporíny. Chemická konverzia je viacstupňový proces, náročný na čistotu používaných surovin a přísné dodržiavanie technologických operácii pri nízkých teplotách, pričom sa pracuje s toxickými látkami. Sposob chemickej přípravy popisuje japonský patent č. 7 307 117, patent NSR č. 1 445 615 ai., líšiace sa od seba sposobom blokovania karboxylovej a amínoskupiny a čs. AO 193 181. V porovnaní s chemickým sposobom je enzýmová konverzia výhodnejšia z hladiska menšej technologickej náročnosti, nie je požadovaný substrát vysokej čistoty a znižuje sa počet technologických operácii v procese. Enzýmavá konverzia je nenáročná na suroviny. Jedná sa o jedno alebo dvojstupňový proces, pričom v dvojstupňové]' reakcii vznikajú z látok štruktúrneho vzorca I látky štruktúrneho vzorca II, ktoré sú dostupným substrátom pre acylázy různých mikroorganizmov pri tvorbě 7-ACK. Japonský patent č. 74 044 895 uvádza možnost priamej enzýmovej konverzie cefalosporínov na 7-ACK vo fermentačnej pode působením Fusarium sedáni, japonský patent č. 55 35 119/ /1980 opisuje rovnaký produkčný kmeň. Patent NSR 2 723 463 sa zaoberá priamou konverziou CFS na 7-ACK působením enzýmov z knieňov Aspergillus a Alternaria rovnako ako US patent č. 3 239 393 a japonský patent 53-94 093/1978, ktoré ako producentov uvádzajú kmene Brevibacterium, Achromobacter a Flavobacterium.

Výhodnějším spůsobom enzýmovej přípravy 7-ACK sa zatial' javí dvojstupňový proces, v ktorom účinkom enzýmu DAAO na cefalosperíny štruktúrneho vzorca I dochádza ku oxidačně] deaminácii bočného reťazca v polohe 7 na cefémovom jadre za vzniku látok štruktúrneho vzorca II. Japonský patent 54 154 592/1979 popisuje použitie buniek Trigonopsis variabilis zaistením glutaraldehydom, pričom dochádza ku zvýšeniu stability enzýmu a je možné použit biologický materiál viackrát. Japonský patent č. 5 535 118/ /1980 popisuje rovnakého kmeňa na konverziu s účinnosťou 95 %. ČS AO č. 221 003 popisuje sposob použitia aktivovaných buniek Trigcnopsis variabilis s účinnosťou 80—85 percent. Aktivácia sa robí organickými rozpúšťadJami a detergentami. Brodelius v časopise Applied Biochem. Biotechnology 6/4/ /1981 str. 293—308 opisuje použitie buniek Trigonopsis variabilis zabudovaných do alginátového gelu pri produkcii α-ketokyselín z D-aminokyseiín. V případe použitia buniek na konverziu vo filtráte z fermentačnej půdy, připadne v eluáte, je doporučovaný prebvtok enzýmu podfa japonského patentu č. 507 158. AO 231 458 opisuje metody imobilizácie buniek mikroorganizmov za použitia polyfunkčných činidiel.

Vynález „Sposob využitia imobilizovaných buniek pri přípravě derivátov cefalosporínov“ využívá imobilizované buňky kmeňa Trigonopsis variabilis CCY 15—1—2 připravené modifikovaným postupom pódia čs. AO č. 231 458. Imobilizovaný biokatalyzátor katalyzuje vznik derivátov cefalosporínov štruktúrneho vzorca II z látok štruktúrneho vzorca I. Látky štruktúrneho vzorca II sú medzipreduktami pri přípravě kyseliny 7-amínocefalosporánovej. Substrátom enzýmovej konverzie je vodný roztok sodnej soli cefalosporínu C alebo deproteinizovaný filtrát fermentačnej půdy alebo eluáty z II. purifikačného stupňa z purifikácie CFS-ov o koncentrácii 3—5 % hmotnostných. Koncentrácia imobilizovaného biokatalyzátora pri reakcii je 10--15 % hmotnostných a koncentrácia inhibítorov vedfajších reakcii je 0,1 až 0,5 %. Reakcia prebieha 2—8 hodin pri teplote 32—36 °C za intenzívneho miešania a vzdušnenia.

Biomasa produkčného kmeňa kvasinky Trigonopsis variabilis CCY 15—1—2 sa připravuje dvojstupňovou kultiváciou, pričom každý stupeň trvá 72 h pri 28 °C za vzdušnenia 1 : 1 (objem živnej půdy : objem vzduchu za minutu). Do inokulačnej pódy zloženia 2 % kukuřičného extraktu a 2 % glukózy sa ako stimulátor tvorby enzýmu přidává 0,3 % D-valínu. pH půdy před sterilizáciou sa upraví na 5,0. Pre druhý stupeň fermentácie sa 8—10 % inokula f?čkujc fermentačná půda zloženia: glukóza 3 %, peptón 1 °/o, kvasničný extrakt 1 °/o, KELPCU 0,1 °/o, MgSO.j 0,09 %, ktorá ako stimulátor obsahuje 0,25 percent D-metionínu. Biomasa z fermentačnej půdy sa získává centrífugáciou pri otáčkách 4 000 min“¹ počas 30 min za chladenia Buňky po 3-násobnom premytí 0,lM fosfátovým tlmivým roztokom pH 7,5 sa deponujú pri —25 °C. Takto ošetřené buňky si zachovává jú enzýmovú aktivitu 10—12 mesiacov.

Zosietené buňky Trigonopsis variabilis sa pripravujú působením polyaldehydických činióiel na bunkovů suspenziu o koncentrácii 1 % polyaldehydu (glutaraldehydu) na bunkovů suspenziu so sušinou 10 %. Za stálého miešania sa nechá působit 3—5 hodin pri laboratórnej teplote, potom sa centrifugáciou odseparuje biomasa, premyje sa vodou a deponuje pri —15 °C.

Agregáty buniek s enzýmovou aktivitou sa pripravujú z premytej biomasy působením zmesi 1% polyaldehydu (glutaraldehydu) a 2 % polyfunkčného činidla s obsahom amíuo- alebo iminosknpiny, například polyetylénimín, tetrametyléndiamm, 3,3-diaminodipropylamín ai. Táto zmes sa připraví 24 hodin před použitím a intenzívně sa mieša bez přístupu vzduchu. Po přidaní agregačnej zmesi k bunečnej biomase sa táto zhomogenizuje a vymrazuje sa 6—10 hodin pri —25 °C.

Po rozmražení sa vzniknuté agregáty odseparujú filtráciou alebo centrífugáciou, premyjú a deponujú pri +4 °C vo fosfátovom tlmivom roztoku pH 7,5.

Pri imobilizácii buniek na pevný nosič sa používajú porézně aluminosilikátové mate231457 riály, minerálně nosiče na báze kremeliny, porézneho skla, keramické materiály, hlinky, makroretikulárne živice ai. materiály s vysokou adsorpčnou schopnosťou. Naviazanie buniek sa robí buď adsorpciou za rastu, kedy sa do kultivačného média přidá 10 % nosiča alebo navíazaním -odseparovanej a premytej biomasy po ukončení fermentácie. V oboch prípadoch sa nosič s naviazanou biomasou premyje 5-krát vodou a pósobením horeuvedenej zmesi polyfukčných činidiel sa připraví enzýmovo aktívny mobilizovaný materiál. Na 5 g nosiča s adsorbovanou biomasou sa přidává 30 ml zmesi polyfunkčných činidiel, vymrazí sa 4—6 hodin pri —25 °C, premyje sa a deponuje pri 4-4°C v tlmivom roztoku pH 7,5. Enzýmavá aktivita u všetkých spomenutých sposobov imobilizácie sa zachovává počas 10—12 mesiacov od přípravy.

Pri enzýmovej konverzií sa vychádza z roztokov solí CFS-ov, deproteinizovaného filtrátu fermentačnej půdy alebo z eluátov z purifikácie CFS-ov, pričom optimálna koncentrácia CFS-ov je 10 000—12 000 μξ/ /ml, optimum pH sa pohybuje od 7,9 do 8,1 a teploty od 33 do 35 °C. V případe, že je v buňkách přítomná aj kataláza, je možné ju inaktivovať, pretože v opačnom případe vznikajú produkty štruktúrneho vzorca II, kde R = —COCOOH, ktoré sú pre ďalšie enzýmové spracovanie nevhodné. Na inhibíciu katalázy sa používajú anorganické azidy (azid sodný 0,1—0,5%), kyselina askorbová, peroxid vodíka, zlúčeniny bóru (metaboritan a perborát sodný) ai. Reakcia vyžaduje aerobně podmienky, optimálna aerácia je 1 liter vzduchu na jeden liter reakčnej zmesi za minútu.. Doba reakcie je dva až šesť hohín. Orientačně sledovanie priebehu reakcie sa robí metodou tenkovrstvovej chromatografie na silikagélových platniach s UV254 indikátorom, kvantitativné stanovenie sa robí vysokotlakovou chromatografiou.

Enzýmovou konverziou vzniknuté látky štruktúrneho vzorca II, kde R = —COOH možmožno použit' ako substrát pre enzýmovú přípravu 7-ACK.

Příklad 1

Biomasa T. variabilis s aktívnou DAAO, získaná dvojstupňovou kultiváciou na pode s obsahom metionínu (0,2%), bola odseparovaná centrifugáciou pri otáčkách 4 000 .

. min^-1 počas 30 minút, premytá vodou a deponovaná pri —25 °C. Po rozmražení bola biomasa nariedená tak, aby sušina výsledné j suspenzie bola přibližné 10 %. Bolo přidané 1 % glutardialdehydu a zmes bola miešaná 5 hodin pri íaboratórnej teplote. Zosietené buňky boli odseparované centrifugáciou, premyté a rozsuspendované do tlmivého rozteku pH 7,5 tak, aby sušina bola 10 %, Na enzýmovú konverziu bola použitá takto připravená suspenzia zosietených buniek v množstve 0,5 ml na 10 ml reakčnej zmesi obsahujúcej ako substrát sodnú sol' CFS-C, v koncentrácii 12 000 μ§/τηϊ a azid sodný 1 mg/ml. Reakcia prebiehala 2 hodiny při 34 °C za intenzívneho vzdušnenia na trepacom stroji. Hodnota pH bola udržiavaná v rozmedzí 7,9-8,0. Stupeň konverzie bol 88 %.

Příklad 2

Postup přípravy biomasy aj podmienky enzýmovej konverzie sú zhodné s príkladom 1, len na inhibíciu katalázy boli namiesto azidu sodného použité perboritan sodný NaBCkHzOa. 3IHO alebo perborát sodný NaBCH. 3 H2O.

Stupeň konverzie bol 78 %.

Příklad 3

Postup je zhodný s príkladom 1, pri enzýmovej konverzií boli namiesto sqdnej soli CFS-C použité eluáty z purifikácie CFS-ov s koncentráciou 12 000 ^zg/ml CFS-C. Stupeň konverzie bol 71 %.

Příklad 4

Biomasa produkčného kmeňa bola získaná postupom, opísaným v příklade 1. 24 hodin před použitím bola připravená reakčná agregačná zmes, obsahujúca 1 % glutaraldehydu a 2 % polyetylénimínu v destilovanej vodě a táto bola intenzívně miešaná pri Íaboratórnej teplote bez přístupu vzduchu. Agregáty s enzýmovou aktivitou boli pripra/ vené přidáním tejto zmesi k biomase (táto tvořila 25 % reakčnej zmesi), ktorá bola po dokladnom zhomogenizovaní vymrazená pri —25 ^CC minimálně 8 hodin. Pósobením činidiel vznikli z biomasy granulkovité alebo vločkovité agregáty, z ktorých po rozmražení boli premývaním vodou odstraněné zvyšky reakčnej zmesi, agregáty boli odseparované centrifugáciou alebo odsátím a deponované v tlmivom roztoku pH 7,5 pri + 4 °C. Na enzýmovú konverziu sa navazovalo 0,5 g agregátov na 10 ml reakčnej zmesi, obsahujúcej 10 000 — 12 000 |Ug/ml sodnej soli CFS-C. Podmienky reakcií sú zhodné s podmienkami, uvedenými v příklade č. 1.

Stupeň konverzie sa pohyboval v rozmedzí od 75 do 83 %.

Příklad 5

Postup je zhodný s príkladom č. 4, len na konverziu boli použité eluáty z purifikácie CFS-C s koncentráciou 12 000 jUg/ml CFS-C. Stupeň konverzie sa pohyboval v rozmedzí od 70 do 75 %.

Příklad 6

Postup je zhodný s príkladom č. 4, ale namiesto polyetylénimínu bol pri príprave ag251457 regátov použitý tetrametyléndiamín. Stupeň konverzie bol 73 %.

Příklad 7

Postup ako v příklade č. 4, ale namiesto polyetylénimínu bol použitý diaminodipropylamín v rovnakej koncentrácii. Stupeň konverzie bol 75 %.

Příklad 8

Biomasa připravená postupom, opísaným v příklade 1, bola zriedená na sušinu 10 %. 15 ml biomasy bolo inkubovaných s 5 g alumíno silikátového nosiča s priemerom zrn

0,5 mm 3 hodiny. Nosič bol premytý vodou, bolo přidaných 30 ml roztoku 1 % glutaraldehydu vo vodě a po 4 hodinovom vymrazovaní pri —25 °C bol nosič premytý vodou. Na konverziu bolo použitých 5 g na 50 ml zmesi. Podmienky reakcie bolí rovnaké ako v příklade č. 1. Stupeň konverzie bol 60 %.

Příklad 9

Biomasa bola kultivovaná v přítomnosti minerálneho nosiča, přidaného do půdy před sterilizáciou v množstve 5 % na objem pody. Po ukončení fermentácie bol nosič s buňkami premytý a další postup bol zhodný s príkladom č. 8. Stupeň konverzie bol 56 %.

PREDMET VYNÁLEZU

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Sposob přípravy derivátov cefalosporínov obecného vzorca II

   R ' (CM?)? -CO-HN

   i.....Á.

   COOH

   V¹) kde

   X=z_ OCOCH.3, —OH, —H

   R ——COOH vyznačujúci sa tým, že sa k vodnému roztoku sodnej soli cefalosporínu C o koncentrácii 3—5 % hmotnostných alebo k eluátu z purifikácie cefalosporínov o koncentrácii 3 až 5 % hmotnostných pridávajú imobilizované buňky kvasinky Trigonopsis variabilis

   CCY 15—1—2 imobilizované modifikovanými postupmi podfa čs. AO č. 231 458, pričom koncentrácia katalyzátora pri reakcii je 10 až 15 % hmotnostných a koncentrácia inhibítorov vedfajších reakcii 0,1—0,5 % hmotnostných a reakcia prebieha 2—8 hodin pri teplote 32—36 °C za intenzívneho miešania a vzdušnenia a získané cefalosporínové deriváty štruktúrneho vzorca II sa izolujú.

   Severograíla, n. p., závod 7, Most

   Cena 2,40 KCs