CS255356B1 - Sposob přípravy krvného zvieracieho savčieho,gama globulinu pre i.v. pedante - Google Patents

Description

Vyná'ez sa týká spósobu přípravy krvného zvieracieho savčieho gamaglobulínu pre

i. v. podanie, z normálnej alebo hyperimunnej plazmy připadne z normálného alebo retroplacentárneho připadne hyperimunného séra, ktorý je určený pre terapeutické účely.

Súčasná situácia priemyselnej produkcie masa, mlieka a kožušín změnila životné podmienky chovných zvierat od narodenia až po dosiahnutie jatočnej hmotnosti. Nesprávná výživa zvieracích samic a nie vždy dostatočná starostlivost o novonarodené mláďata ovplyvňujú životnost a imunologická odolnost voči bakteriologickým alebo virologickým infekciam.

Mechanizmus imunitnej obranyschopnosti sa mimo iného opiera o systém nespecifických obranných mechanizmov, medzi ktoré možeme zahrnúť systém komplementu, ako aj systém špecifickej imunity, kde možeme zařadit' imunoglobulínový systém.

Přenos imunoglobulínov vo vztahu samica — mláďa a saturácia krvného séra mláďata imunoglobulínami po narodení je predovšetkým závislá od včasného podania kolostra v dostatočnom množstve. Podl'a Klaussa a spol. (Klauss G. G. B., Bennet A., Jones

E. V.: Immunology 16, 293, 1969) dochádza aj pri optimálnej kolostrálnej výživě ku vý2 skytu imunodeficientného stavu u 20 % teliat. Zistenia našich autorov publikované v 1983 uvádzajú však rozdielné údaje. Normálny obsah imunoglobulínov málo podlá Kudlača a spol. (Kudlač E., Schulz J., Vedral V., Vollhardt V.: Veterinární medicína 28, 7, 401, 1983J iba 24 % a pódia Paulika a spol. (Paulik Š., Slanina li., Bomba A., Poláček M.: Veterinární medicína 28, 11, 669,

1983) iba 30 % novonarodených teliat.

Jednou z hlavných příčin úhynu teliat bol prevážne pozitivny bakteriologický nález a nízký obsah imunoglobulínov u uhynulých kusov (I-Ioryna B., Draganov D.: Veterinární medicína 25, 9, 537, 1980; Horyna B., Lavička M., Kabelík V., Krpata V.: Veterinární medicína 25, 9, 545, 1980).

Hladina imunoglobulínov naviac kolíše v závislosti na čase od podania kolostra u teliat (Vajda V., Slanina L·.: Veterinární medicína 25, 9, 527^ 1980) a žriebat (Komárek J., Hamáčková J.: Veterinářství 34, 5, 209,

1984) pričom bol pozorovaný aj sezónny pokles imunoglobulínov v krvi v období február — máj a vzostup v období máj — október.

Využívanie doterajších poznatkov sa začalo realizovat tým sposobom, že imunologická odolnost zvieracích savčích mláďat sa zvyšuje v období výskytu znížených hla255356 din imunoglobulínov podáváním homológnych imunoglobulínov prevažne i. m. cestou.

Pri podávání homológneho gamaglobulínového preparátu i. m. cestou si musíme uvedomiť, že preparáty tohoto typu majú zpravidla vysokú antikomplementárnu aktivitu, ktorá může ovplyvňovať nešpecifickú imunitu blokováním komplementového systému, v důsledku čoho může byť ohrozený terapeutický efekt tých imunoglobulínov, ktoré ku svojej činnosti potrebujú komplement.

Táto skutočnosť by dokázala vysvětlit popisovaný kladný terapeutický účinok hovádzieho i. m. gamaglobulínu ako ho popisuje Tlučhoř a Komárek (Tlučhoř V., Komárek J.: Veterinářství 33, 5, 221, 1983) a nie celkom terapeuticky přesvědčivý účinok gamaglobulínového i. m. preparátu od toho istého výrobců ako ho popisuje Jílek a spol. (Jílek F., Dobšinský O., Novotný B.: Veterinářství 33, 5, 218, 1983), ktorí použili dvojnásobná dávku ako Tlučhoř a Komárek.

Až doposia! sa realizuje příprava zvieracích savčích gamaglobulínov pre terapeutické účely prevažne podl'a kritérií pre intramuskulárne podanie t. j. kladie sa důraz na výťažnosť, elektroforetickú čistotu a na obsah látok so schopnosťou vyvolat pyretickú reakciu. Preparáty tohoto typu majú dlhú dobu vstrebatelnosti a zpravidla vykazujú antikomplementárnu a hypetenzívnu aktivitu.

Na precipitáciu gamaglobulínu zo zmesi zvieracích plazmatických alebo sérových bielkovín může byť použitý síran amonný a hydroxid hlinitý (Schultze Η. E., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 28, 9, 1954; Schultze Η. E., Schonenberger M., Matheka H. D.: Behringwerke Mitt. 26, 21, 1952), rivanol (Hořejší J., Smetana R.: Acta Med. Scand. 155, 65, 1956), síran sodný (Amiraian K., Leikhim E. J.: J. Immunol. 87, 301, 1961), chlorid hlinitý (Lewln J.: Therapie 9, 523, 1954), DEAE celulóza (Sober H. A., Peterson E. A.: Fed. Proč. 17, 1 116, 1958; Peterson E. A., Sober H. A.: J. Am. Chem. Soc. 78, 756, 1956; Fahey J. L., Herbett A. P.: J. Biol. Chem. 234, 2 645, 1959; Stanworth D. H.: Nátuře 188, 156, 1960), kyselina kaprylová (Steinbuch M., Audran R.: Rev. Franc. D‘etud. Clin. Biol. 14, 1054, 1969), ionty Zn^{+ +} a Al^{+ + +} (Rejnek J., Svařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 22, 1 489, 1957; Rejnek J., Škvařil F.: Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 23, 773, 1958; Krauze R., Naimski K., Zakrewski K.: Acta Biochim. Pol. 8, 209, 1961), polymetaf osfát (Nitschman H. S., Rickli R., Kistler P.: Vox Sang. 5, 232, 1969), éter (Pennell R. B. v Putnám

F. W.) ed (The Plasma Proteine vol I Academie Press New York 1960, str. 3) a etanol (Cohn (E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D.

M., Barnes B. A., Brown R. K., Derounaux G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lever W. F., Liu

C. H., Mittelman D., Mouton R. F., Schmid

K., Uroma E.: J. Am. Chem. Soc. 72, 465, 1950; Deutsch H. F., Gostling G. L., Alberty R. A., Williams J. W.: J. Biol. Chem. 164, 109, 1946; Oncley J. L., Melin M., Rickert D.

A., Cameron J. W., Gross P. M.: J. Am. Chem. Soc. 71, 541, 1949; Nitschman H. S., Kistler P., Lergier W.: Helv. Chim. Acta 37, 866, 1954; Kistler P., Nitschman H. S.: Vox Sang. 7, 414, 1962; Taylor H. L., Bloom F. C., McCall K. B., Hydman L. A., Anderson H. D.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1 356, 1956).

Preparáty gamaglobulínu z homolognej savčej krvnej plazmy alebo séra připravené podlá doterajších kritérií pre i. m. podanie majú zpravidla hypotenzívny a antikomplementárny účinok čo je pre kvality intravenóznych preparátov nepřípustné. Podanie preparátu týchto kvalit intravenózne může v důsledku náhlého poklesu krvného tlaku zviera ohrozit a v důsledku antikomplementárnej aktivity oslabit jeho nešpecifickú obranu.

Napriek tomu, že hypotenzívny účinok pri intramuskulárnom podaní nemá taký priebeh ako pri intravenóznom podaní, možno ho označit spolu s vysokým antikomplementárnym účinkom za vlastnosti nežiaduce pre preparáty savčieho gamaglobulínu, ktoré sú určené pre terapeutické účely či už pre intramuskulárne alebo pre intravenózne podanie.

Na odstraňovanie antikomplementárnej aktivity gamaglobulínu, ktorý bol připravený zo zmesi savčích p’azmatických alebo sérových bielkovín pri zachovaní homológnosti může byť použitá úprava hodnoty pH na 4,0 pri 24 hodinovej inkubácii pri 37 stupňoch Celzia (Barandun S., Kistler P., Jeunet F., Isliker H.: Vox Sang. 7, 157, 1962).

Pokles antikomplementárnej aktivity gamaglobulínu bol zaznamenaný po přidaní aktívneho uhlia (Steinbuch M., Audran R., Amouch P., Blatrix C.: Vox Sang. 13, 103, 1967), po přidaní trikalciumfosfátu (Steinbuch M., Audran R., Amouch P., Blatrix C.: Rev. med Tours, suppl. No 3, 1968) a po přidaní albuminu (Auerswald W., Kiesewetter E.: Wien. med. Wschr. 115, 690, 1965).

Znižovanie antikomplementárnej aktivity gamaglobulínového roztoku pomocou proteolytického štiepenia bolo realizované pepsínom (Schultze Η. E., Schwick G.: Dtsch. med. Wschr. 87, 1 643, 1962) a plazmínom (Sgouris J. T.: Vox Sang. 13, 71, 1967; Barandun S., Castel F., Makula M. F., Morell

A., Pian R., Škvařil F.: 28, 157, 1975).

Antikomplementárnu aktivitu gamaglobulínovej molekuly je možné znížiť jej chemickou redukciou beta merkaptoetanolom (Wiedermann G., Miescher P. A., Franklin E. C.: Proč. Soc. exp. Biol. Med. 113, 609, 1963), modifikáciou beta propiolaktonom (Stephan W.: Z. kliň. Chem. 7, 262, 1969; Stephan W.: Vox Sang. 28, 422, 1975), redukciou s dithioerythritolom (Isenman D.

25535S

E., Dorrington K. J., Painter R. H.: J. Immun. 114, 1 726, 1975], sulfonáciou (Masuho Y., Tomibe K., Matsuzawa K., Ohtsu A.: Vox Sang. 32, 175, 1977), amidáciou (Schidtberger R.: US Patent No 4 118 379 — 1978), redukciou s dithiothreitolom a alkyláciou s jodacetamídom (Fernandes P. M., Lundblad J. L.: Vox Sang. 39, 101, 1980) a redukciou s dithiothreitolom v kombinácii s dithioerythritolom s následnou alkyláciou pomocou jodacetamidu alebo metyljodidu, akrylonitrilu, benzylbromidu připadne etylénoxidu (Schroeder D. D,, Tankersley D. I,., Lundblad J. L.: Vox Sang. 40, 373 1931).

Antikomplementárna aktivita savčlebo gainaglobuínu súvisí jednak so vznikom polymerov gamaglobulíuu, ktoré můžu vznikat v procese technologické] izolácie a jednak vzniká v procese lyofilizácie v důsledku interakcie nízkomolekulárnych látok s molekulami gamaglobulínu. Ponžitie deští lovanej apyrogennej vody pri separácii nízkomolekulárnych látok z gamaglobulínu jednak spůsobuje precipitáciu najma vyš ších polymerov gamaglobulínu a jednak odstránenie nízkomolekulárnych látok v důsledku čoho pri lyotilizácii nemůže důjs!' ku ich interakcii s molekulami gamaglobulínu, číže nedochádza ani ku vzniku antikoniplementárnej aktivity. Použitie vodného roztoku chloridu sodného, v koncsntrácii do 30 g na liter, zaručuje polymérom varna globulínu v roztoku potřebná stabilitu a dochádza len ku separácii nízkomolekulárnych látok, ktoré spůsobujú vznik antikomplementárnej aktivity v procese Izolácie.

Antikomplementárna aktivita bola testovaná na základe úbytku aktivity komplementu. Úbytok známej hodnoty aktivity komplementu po přidaní známého množstva roztoku lyofilizovaného gamaglobulínového preparátu bol stanovený metodou podlá Kabata a Mayera (Kabat E. A., Mayer Μ. M.: Experimentální imunochemie ČSAV, Praha 1965 str. 180).

Efekt dešti¹ ovanej apyrogénnej vody pri odstráňovaní antikomplementárnej aktivity je možné dokumentovat u 5 experimentálnych šarží gamaglobulínu, ktorý bol izolovaný z frakcie III podlá Cohna a Oncleya. Pokial' bola použitá samotná destilovaná voda, bolo dosiahnuté zníženie antikomplementárnej aktivity gamaglobulínu po lyofilizácii o 80 až 95 °/o. Použitie vodného roztoku chloridu sodného, za použitia toho istého gamaglobulínového materiálu, v koncentrácii do 30 g na liter spůsobio zníženie antikomplementárnej aktivity gamaglobulínu po lyofilizácii iba o 30% až 45%. Po kial niesu v roztoku gamaglobulínu přítomné jeho vyššie polyméry, sú výsledky testován ia antikomplementárnej aktivity v lyofilizovanom gamaglobulínovom preparáte, z ktorého bolí odstráňované nízkomolekulárne látky za použitia destilovanej apyrogénnej vody alebo za použitia vodného roztoku chloridu sodného do 30 gramov na liter prakticky rovnaké.

Hypotenzívny účinok bol testovaný na základe poklesu krvného tlaku králika priamou krvnou metodou podlá ČSL 3 (ČSL 3, svazok I, vydanie III, Avicenum Praha 1970 str. 149) s tým, že králíkovi o hmotnosti 2 až 3 kg sa aplikujú 2 ml gama globulínového roztoku na kg hmotnosti. Obsah gama globulínu v aplikovanom roztoku je 50 gramov na 1 000 ml roztoku. U preparátov připravených podlá navrhovaného postupu sa hypotenzívna aktivita nevyskytovala v tak výraznej intenzitě, čo je možné dokumentovat údajom, že z 5 připravených experimentálnych šarží podlá předloženého vynálezu bol stanovený pokles systolického tlaku maximálně o 4 až 8 % v porovnaní s tým istým materiálom v tej istej dávke bez separácie nízkomolekulárnych zlúčenín, kde bol stanovený pokles systolického prvného tlaku od 20 do 30 %.

Podstatou vynálezu je odstranenie balastných negamaglobulínových příměsí, ktoré majú vzhladom ku gamaglobulíuu nižšiu molekulárnu hmotnost. Za hraničně hodnohy možno považovat údaje okolo 50 000 molekulárnej hmotnosti.

Odstranenie balastných negaraaglobu'lnových příměsí je možné previest:

A. Gélovou filtráciou

B. Dialýzou

C. Ultrafiltráciou

D. Diafiltráciou

A. V súčasnosti existuje celá rada komerčných materiálov pre gélovou filtráciu na báze dextranových gélov, pod označením Sephadex, polyakry amidových gélov, pod označením Biogel, hydroxyalkylmetakrylátových gélov, pod označením Spheron, polystyrénových gélov, pod označením Styragel, polyvinylacetátových gélov, pod označením Merskogel,. poréznych silikátov, pod označením Porasi', a poréznych sídel pod označením Bioglas, ktoré majú odstupňované velkosti pórov v gélových časticiach a umožňujú gélovou filtráciu v poměrně širokých rozmedziacli molekulárnych hmotností.

B. Dialýza sa v poslednom desa^ťročí znovu začína uplatňovat najma pri výrobě liečiv ako technologická metoda separácie tých zmesí prírodných alebo syntetických látok, ktorých molekuly majú podstatné rozdielnú hmotnost.

V súčasnosti existuje celá rada komerčných membrán pre dialýzu či už v podobě rovinnéj membrány a'ebo v podobě potrubia o menlivom priemere a menlivej velkosti pórov na báze regenerovanej celulózy alebo jej derivátov, připadne na báze kolódia a taktiež na báze vinylových polymérov.

C. Separácia nízkomolekulárnych zlúčenín do molekulové) hmotnosti 50 000 sa mo255356 že uskutočniť aj pomocou ultrafiltrácie, ktorú možno realizovat v podobě dutých nití pričom gamaglobulínový roztok přetéká pod tlakom do 800 kP vo vnútri niťovej membrány a cez póry v stene niťovej membrány prestupujú nízkomolekulárne látky v vod nom roztoku do zbernej nádoby.

Ultrafiltráciu je možno realizovat aj v podobě kazetového systému kde v rovinnom usporiadaní je alebo vyměnitelná membrána alebo doska z umelej hmoty s definovanými vetkosťami pórov. Gamaglobulínový roztok pod tlakom do 800 kP preteká například nad membránou a cez póry v stene rovinnej membrány alebo došky z ume lej hmoty prestupujú relativné nízkomolekulárne látky vo vodnom roztoku do zbernej nádoby.

D. Odstráňovanie relativné nízkomolekulárnych zlúčenín do molekulárnej hmotnosti 50 000 je možno uskutočniť aj pomocou diafiltrácie, čo jě kombinácia dialýzy a ultrafiltrácie. Diafiltráciu je možné realizovat jednak v podobě dutých nití pričom gamaglobulínový roztok preteká pod tlakom do 200 kP vo vnútri niťovej membrány a cez póry v stene niťovej membrány prestupujú reálne nízkomolekulárne látky do z vonkajšiej strany pretekajúceho roztoku, ktorý relativné nízkomolekulárne látky odplavuje od niťovej membrány do odpadu.

Diafiltráciu je možné realizovat aj v podobě kazetového systému kde v rovinnom usporiadaní je alebo vyměnitelná membrána připadne doska z umelej hmoty s definovanou vefkosťou pórov. Gamaglobulínový roztok pod mierným tlakom do 200 kP preteká například nad membránou a cez póry v stene rovinnej membrány alebo poréznej došky prestupujú reálne velmi pomalým prietokom relativné nízkomolekulárne látky do pod membránou pretekajúceho roztoku, ktorý odplavuje relativné nízkomolekulárne látky do odpadu.

Východzlou surovinou može byť pasta frakcie II izolovaná metodou podlá Cohna a Oncleya z normálnej alebo hyperimunnej savčej plazmy připadne z normálneho alebo retroplacentárneho připadne hyperimunného séra savcov. Taktiež však možu byt použité bielkovinné gamaglobulínové materiály izolované pomocou iných metod.

Bielkovinný materiál sa rozpúšťa v takom množstve destilovanej apyrogénnej vody o teplote 0 °C až +6 °C, aby sa hodnota koncentrácie bielkovín nachádzala v rozmedzí 10 až 180 gramov na liter, s optimom 60 až 100 gramov na liter. Rozpúšťanie sa urýchluje miešaním. Po rozpuštění sa gamaglobulínový roztok vyčíri například filtráciou.

V technologických pomeroch sú vyššie u vedené optimálně podmienky zachované vtedy ak rozpúšťame 1 kg gamaglobulínovej pasty v 2 000 ml destilovanej apyrogénnej vody o teplote 0 °C až +6 °C. Hodnota pH takto připraveného gamaglobulínového roztoku bývá zpravidla v rozmedzí pH 4,0 až 8,0 a koncentrácia bielkovín v rozmedzí 60 až 100 gramov na liter. Takto připravený roztok gamaglobulínu sa vyčíri například filtráciou a nízkomolekulárne zlúčeniny do 50 000 molekulárnej hmotnosti sa odstránia například gélovou filtráciou, dialýzou, ultrafiltráciou alebo diafiltráciou pomocou elúcie alebo narieďovania s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s vodným roztokom chloridu sodného o koncentrácii maximálně do 30 gramov na liter, s optimom 3,0 až 9,0 gramov na liter, o teplote 0 °C až +6 °C s hodnotou pH v rozmedzí 4,0 až 8,0. Gamaglobulínový roztok sa po oddělení nízkomolekulárnych látok sterilizuje, například filtráciou alebo pomocou iných metod, a potom sa zakoncentrováva například lyofilizáciou a’ebo pomocou membrán, vakuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metodami a v případe potřeby sa podrobí ďalšiemu spracovaniu na konečný produkt.

Vynález je dalej objasněný na príkladoch prevedenia, ktorými jeho rozsah nieje ani obmedzený ani vyčerpaný.

Příklady prevedenia

Příklad 1

Východziou surovinou móže byť pista frakcie II izolovaná metodou podlá Cohna a Oncleya z normálnej alebo hyperimunnej savčej plazmy připadne z normálneho alebo retroplacentárneho připadne hyperimunného séra savcov s antibakteriálnou, antitoxickou alebo antivirovou protilátkovou aktivitou. Bielkovinný gamaglobulínový materiál sa rozpúšťa v takom množstve destilovannej apyrogénnej vody o teplote 0 °C až +6 °C aby hodnota koncentrácie bielkovín sa nachádzala v rozmedzí 10 až 180 gramov na liter, s optimom 60 až 100 gramov na liter. Rozpúšťanie sa urýchluje miešaním. Po rozpuštění sa gamaglobulínový roztok vyčíri například filtráciou.

V technologických pomeroch sú vyššie uvedené podmienky optima zpravidla zachované vtedy ak rozpúšťame 1 kg gamaglobulínovej pasty v 2 000 ml destilovanej apyrogénnej vody o teplote 0 ^CC až +6 °C. Hodnota pH gamaglobulínového roztoku bývá zpravidla v rozmedzí 4,0 až 8,0 a koncentrácia bielkovín v rozmedzí 60 až 100 gramov na liter. Takto připravený roztok purifikovaného savčieho gamaglobulínu sa vyčíri například filtráciou a nízkomolekulárne zlúčeniny sa zo savčieho gamaglobulínového roztoku odstránia:

A. Gélovou filtráciou

B. Dialýzou

C. Ultrafiltráciou

D. Diafiltráciou

A. Odstránenie nízkomolekulárnych zlúčenín sa prevádza elučnou gélovou chromato grafiou s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilované] apyrogénnej vodě o koncentráeii do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6°C pri pH 4,0 až 8,0 s vylučovacou medzou gélu vyjádřenou moleku’árnou hmotnosťou do 50 000 pričom je potřebné uvedené materiály používat v optlmálnom zrnění zaručujúcom prietok v technologických podmienkách.

Ko kolóny naplnenej s nepučeným gélo vým materiálom necháme nasávat gamaglobulínový roztok takou rýchlosťou, aby prietok spodnou plochou kolóny sa pohyboval medzi 0,01 ml až 3,0 ml za minutu na plochu 1 cm². Množstvo savčielio gamaglobulínového roztoku naseděného na kolonu nemá překročit 25 až 30 % objemu gélovej Časti kolóny. Účinnost delenia je možné sledovat podta stupňa oddelenia etylalkoholu, chloroformu a ninhydrin pozitívnych látok z gamaglobulínového roztoku. Pokial' by nedošlo ku dokonalému oddeleniu je po trebné zmenšit objem vkládaného gamaglobulínového roztoku na kolonu a spoma iť prietok. Po separácii nízkomolekulárnych zlúčenín zo savčieho zvieracieho gamaglobulínového roztoku sa tento ďalej spracováva.

B. Sterilný roztok puntíkovaného gamaglobulínu sa opatrné přesaje do sterilného dialyzačného potrubia, ktoré sa před zaha jením presavania v spodnej časti uzatvorí uzlom a po přesátí sa vrchná část uzatvorí uzlom so smyčkou za ktorá sa naplněné po trubie zavěsí na háčik, ktorý je tak umiestnený, aby roztok gamaglobulínu v dia yzacnom potrubí bol v stálom styku s pretekajácou destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilované] apyrogénnej vodě o koncentráeii do 30 gramov na liter pri teplote 0 C až +6 °C pri pH 4,0 až 8,0 pričom vefkosf pó rov v dialyzačnej membráně by mala byt tak vetká, aby umožnila separáciu nízkomo lekulárnych látok vyjádřená moleku árnou hmotnosťou do 50 000.

Koniec dialýzy je indikovaný negativnou reakciou na etanol, chloroform a na ninhydrin pozitivně látky v pretekajácej dialyzačnej tekutině ako aj negativnou reakciou na etanol a chloroform v gamaglobulínovom roztoku. Po skončení dialýzy sa dialyzačne potrubie zvesí z háčika, opatrné sa vyberie a po rozstrihnutí sa gamaglobulínový roztok preleje do zbernej nádoby a ďalej sa spracováva.

C. Odstraňovanie re^!atívne nízkomolektilárnych zláčenín do molekulárnej hmotnosti 50 000 je možné uskutočniť pomocou ultrafiltrácie, pričom relativné nízkomolekulárne látky v podobě roztoku odtekajá do zbernej nádoby. Ultrafiltráciu je možné realizovat jednak v podobě dutých nití alebo v podobě kazetového systému, kde sa používajá došky alebo membrány s definovanými vefkosťami pórov.

Vzhfadom na to, že roztok gamaglobulínu sa pri ultrafiltrácii zakoncentrováva prevedieme opatovné nariedenie s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě v koncentráeii do 30 gramov na liter a toto zakoncentrovávanie například na polovičný objem a narieďovanie na póvodný objem prevádzame dovtedy pokiaf je reakcia gamaglobulínového roztoku na přítomnost chloroformu a etanolu pozitivna.

Sterilizácia ultrafiitračného zariadenia sa prevádza alebo parou alebo chemickou cestou například prepláchnutím aparatáry vodným roztokom formalínu o koncentrácii do 50 g na liter a následným vymytím formalínu destilovanou vodou.

D. Odstráňovanie relativné nízkomolekulárnych látok do molekulárnej hmotnosti 50 000 je možné uskutočniť pomocou diafiltrácie pričom reatívne nízkomolekulárne látky prestupujá do roztoku apyrogénnej vody alebo do roztoku chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 °C pri pH 4,0 až 8,0, ktoré relativné nízkomolekulárne látky odplavujá do odpadu. Diafiltráciu je možné realizovat jednak v podobě dutých nití alebo v podobě kazetového systému kde sa používajá došky alebo membrány s definovanými vefkosťami pórov.

Vzhfadom na to, že roztok gamaglobulínu sa pri diafiltrácii zakoncentrováva, prevedieme opatovné nariedenie s destilovanou apyrogénnou vodou alebo s roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentráeii do 30 gramov na liter a toto zakoncentrovávanie například na polovičný objem a narieďovanie na póvodný objem prevádzame dovtedy, pokiat je reakcia gamaglobulínového roztoku na přítomnost chloroformu a etanolu pozitivna. Savčí gamaglobulínový roztok sa preleje do zbernej nádoby a ďalej sa spracováva.

Sterilizácia diafiltračného zariadenia sa prevádza alebo parou alebo chemickou cestou naprík ad prepláchnutím aparatury vodným roztokom formalínu o koncentráeii do 50 gramov na liter a následným vymytím formalínu sterilnou destilovanou vodou.

Dokaž chloroformu sa prevádza Fujiwarovou reakciou (Fujiwara: Sitzber. Naturw. Ges. Rostock 6, 33 1916] či už v póvodnom usporiadaní, alebo v novších aplikáciach podlá Seta a Schultzeho (Seto T., Schultze M. O.: Anal. Chem. 28, 1 625, 1956), Hildebrechta (Hildebrecht C. D.: Anal. Chem. 29, 1037, 1957), Friedmana a Coopera (Friedman P. J., Cooper J. R.: Anal. Chem. 30, 1 674, 1958).

Ninhydrin pozitivně látky stanovujeme spósobom podl'a Ruhemana (Ruhemann S.: J. Chem. Soc. 97, 1438, 1910). Stanovenie etanolu sa prevádza Agulhonovou reakcion (Agulhon H.: Bull. soc. chim. France[4], 9, 881,’ 1911) či už v původnom usporiadauí, alebo v novějších aplikáciach podfa Kellctta (Kellett E. G.: Analyst 62, 728 1937), alebo Webba (Webb D. A.: Sci. Proč. Roy Dublin Soc. 21, 281, 1936).

Gamaglobulínový roztok po oddělení nízkomolekulárnych látok sa sterilizuje například fftráciou alebo inými metodami, a potom sa zakoncentrováva například lyofilizáciou alebo pomocou membrán, vákuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metodami, a v případe potřeby sa podrobí ďalšiemu spracovaniu.

Příklad 2

Východziou surovinou móže byť biolkovinná pasta alebo bielkovinný roztok savčieho gamaglobulínu izolovaný aj pomocou iných metod. Bielkovinná pasta alebo bie kovinný roztok savčieho zvieracieho gamaglobulínu sa spracováva v ďalšom postupe podobné ako v příklade 1 s tým rozdielom, že kritérium odstránenia nízkomolekulárnych zlúčenín z roztoku gamaglobulínu ne súvisí s prítomnosťou etanolu alebo chloroformu, ale s prítomnosťou precipitačnej látky, ktorá bola na precipitáciu gamaglobulínu alebo jeho imobilizovanie použitá. Kritérium ninhydrin pozitívnych látok je zachované pri akejkofvek metóde, pričom proces oddelovania sa opakuje dovtedy pokial' nieje reakcia v negamaglobulínovom podiele negativna.

Claims (4)

1. Spňsob přípravy krvného zvieracieho savčieho gamaglobulínu pre i. v. podanie vyznačujúci sa tým, že sa bielkovinný materiál obsahujúci purifikovaný savčí gamaglobulín suspenduje za aseptických pod mienok v takom množstve apyrogénnej destilovanej vody o teplote 0°C až -j-6 C, aby hodnota koncentrácie bielkovín sa nachů dzala v rozmedzí 10 až 180 gramov na li ter, gamaglobulínový roztok sa vyčíri například filtráciou a oddelia sa nizkomolckulárne látký, vyjádřené molekulovou hmotnosťou do 50 000, potom sa gamaglobulínový roztok sterilizuje například filtráciou a následné sa zakoncentrováva například lyofilizáciou alebo pomocou membrán, vá kuovou destiláciou, vymrazením a v případe potřeby sa podrobí ďalšiemu spracovaniu na konečný produkt.

2. Spůsob přípravy podfa bodu 1 vyznačujúci sa tým, že oddelenie relativné nízko

VYNALEZU molekulárnych látok do molekulárně) hmot nosti 50 000 sa prevádza elúciou alebo nariedením s destilovanou vodou alebo roztokom chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vodě o koncentrácii do S0 g na liter, pri teplote 0 °C až -j-6 °C pri pH 4,0 až 8,0.

3. Sposob přípravy podfa bodu 1 vyznačujúci sa tým, že oddelovanie nízkomolekulárnych látok sa prevedie pomocou gélovej fi trácie, dialýzy, ultrafiltrácie a diafiltrácie.

4. Spůsob přípravy podfa bodu 1 vyznačujúci sa tým, že ako materiál z ktorého sa frakcia obsahujúca gamaglobulín izoluje sa použije savčia zvieracia normálna alebo hyperimunná plazma připadne normálně, retroplacentárné alebo hyperimunné sérum s definovanou antibakteriálnou, antitoxickou alebo antivirovou protilátkovou aktivitou.