JPH04502324A - 純粋なｉ因子蛋白質および該蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 純粋なＩ因子蛋白質および該蛋白質の製造方法本発明は、特に感染性ウィルスの ないＢ因子およびＣ３因このような製剤は、■因子欠損並びに自己免疫疾患の治 療において使用できる。本発明は又、血漿から回収される純粋なＩ因子蛋白質を 製造する方法にも関する。

補体系は、２０個以上の血漿蛋白質から成る酵素カスケード系である。この系は 、微生物感染に対する防御において重要である。これは、部分的には古典経路を 介して抗原抗体複合体により、部分的には副経路を介して細菌膜および可溶性物 質により活性化されている。両方の場合において、活性は基質として中央成分Ｃ ３を有する幾つかの活性酵素複合体、Ｃ３カバターゼの形成を導く。Ｃ３蛋白質 は、小さな断片Ｃ３ａおよびより大きな断片Ｃ３ｂに切断される。Ｃ３ｂは、副 路Ｃ３カンバターゼの一部を形成する。従って、補体系の副路の増幅原理が導入 される。副路のＣ３カンバターゼは、Ｂ６因子を含み、この因子は補体因子、Ｂ 因子からの分解産物である。

系は、活性化酵素複合体を抑制する幾つかの蛋白質により調節される。因子１（ Ｃ３ｂ不活性化物質又はＫＡＦ）は、そのような調節物質の蛋白質である。と言 うのは、それは、中間体断片１Ｃ３ｂに更にはＣ３ｃおよびＣ３ｄにＣ３ｂ断片 を酵素的に分解するからである。

■因子欠損は、Ｃ３ｂがより小さな分解産物に分解できないことを必要とする。

これは、別のＣ３カンバターゼの連続的でかつ制御できない形成をもたらし、副 経路からの一連の蛋白質の減少または放出を伴う。従って、例えば頻度が増大し た脳を髄膜炎および肺炎が、■因子欠損患者において報告されている（Ｓ、　Ｃ ，Ｏ−ス等、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９８４）　６３（５）、　２４３参照）。

血漿から精製した■因子製剤の静脈内注入による治療が記載されている（Ｊ、　 Ｂ、　Ｚｉｅｇｌｅｒ等、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、＜１９７５）５５゜６ ６８参照）。この治療は、■因子欠損患者において大部分の血漿蛋白質濃度をは ゾ正常化するのに有効であることが見出された。しかし、製剤はウィルス不活性 でなかった。

血漿注入による治療は、有効であることが見出された。例えば、Ｄ、　Ｊ、バＬ ／７ト等、Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒｉ（１９８４）、１０４（１）、７６、　Ｖ。

ワーフ等、Ａｌｌｅｒｇｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　（１９８０）　８ （４）、　４２２並びにＶ、ワーフ等、Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　（１９８１）　Ｈ４）、　２２８参照。しかし、この治療法は幾つかの重大な 欠点を有する：■因子欠損患者は、血漿中子量のＣ３カンバターゼを有する。血 漿を介して投与されたＣ３は、従って上述のように直ちにＣ３ａとＣ３ｂに分解 する。アナフィラキシンであるＣ３ａは血漿注入と関連したアナフィラキシ−の 反応を引きおこし得る（Ｖ、バーン等Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒ、（１９８４）　１０ ５（４）、６７３参照）。更に、同様に、血漿を投与した、Ｂ因子に関連して生 成Ｃ３ｂは、副路に対し刺激作用を有する。投与された血漿中の補体成分Ｃ１よ びＢ因子の存在は、副路のＩ因子調節の有効性を弱める。最後に、プラズマ感染 によるウィルス性汚染の危険を軽減することは不可能である。

■因子およびＨ因子の一時的減少レベルが、全身的狼痕紅斑（ＳＬＥ）を患う患 者に見出される。カネコ（Ｅ　Ｐ　０２２２６１１）には以下の内容が示されて いる。すなわち、ヒ）ＳＬＥ、ＩＪウマチ様関節炎および糸球体腎炎の疾患に以 だ自己免疫疾患を患うマウスに、Ｈ因子および／又は■因子の投与は、タンパク 尿（これは自己免疫疾患の病理学的状態を示す）の改善又は予防に有効である。

しかし、カネコはウィルス不活性化工程にも特定のＢ因子放出工程のいずれに対 してもＩ因子製剤を提起していない。ヒト血漿又は血液血漿から製造される製剤 又は画分の治療用の使用における本質的問題は、この血液又は血液血漿が感染ウ ィルスを含有している可能性のあることである。このような感染ウィルスの例は 、肝炎Ｂウィルス、非Ａ１非Ｂ肝炎ウイルスである。輸血感染ウィルスは、一般 にヒト血液又は血液血漿から製造される使用から一般に公知である。このような 製剤の例は、凝集■因子、凝集■因子、凝集Ｘ■因子、免疫性グロブリンおよび アンチトロンビン■である。

ヒト血液又は血液血漿から製造されるものを含有する治療製剤又は溶液から感染 ウィルスを除去するための種々のプロセスは公知である。このような公知のプロ セスは、治療用蛋白質を含有する水性溶液を６０℃で１０時間加熱することを含 んでなり、これによりこれらの血漿蛋白質を含有する製剤を使用する場合、感染 ウィルスの転位に対し安全性を与える。

水性溶液中で治療的に活性な蛋白質に対し変性又は他の損害を避けるため、熱処 理中安定化剤を添加することが必要である。

従って、脂肪酸又はアミノ酸の塩は、ヒトアルブミン／又は蛋白質コンセントレ ートを含有する溶液を６０℃での熱処理において、安定剤として添加される（ｇ ｅｌｌｉｓ等、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、（１９４８）、　２７．２３９参照）。ヒトＴ）Ｌｔブミン又は 蛋白質の処理に対するこのプロセスの使用は、該プロセスが１９４８年に導入さ れて以来、これらの調製品を用いる場合、感染ウィルスが媒介されてきていない ことを伴っている。このプロセスは、治療用血漿蛋白質アルブミンの著しい損失 を伴っていないか極くわずかの損失を伴っているのみである。

プラスミノーゲン含有溶液は、６０°で１０分間の熱処理中、アミノ酸リシンで 安定化され得る（Ｂａｕｗｇａｒｔｅｎ等、米国特許３２２７６２６　（１９６ ６）参照）。このプロセスは、該特許に従い肝炎ウィルスを破壊する。

凝固Ｘ■因子を有する溶液は、アミノ酸、単糖類又は糖アルコールの存在下６０ ℃で１０時間加熱される（ツクヒラ、特公昭５１−１３４８７８　（１９７６） ）。ｘｍ因子活性の約５０％損失が、このプロセスに関して報告されている。

更に、プロテアーゼ阻害剤抗−トロンビン■を含有する溶液は、６０°で１０時 間の加熱前、クエン酸の塩で殺菌できる（ｆｌｏｌｌｅｍａｎ等、Ｔｈｒｏｍ、 　４　Ｈａｅｍｏ　（１９７７）、　３８．２０１）　。治療後蛋白質抗トロン ビンの損失は、このプロセスにおいて約３０％に達する。

最後に、ドイツ公開公報２９１６７１１　（１９８０）は、汚染フィブリノーゲ ン含量を減少しながら、６０℃で１０時間■因子の熱処理プロセスを開示してい る。用いた安定化剤は、高濃度のアミノ酸と組合せたサツカリド又は糖アルコー ルである。存在するアミノ酸は、■因子溶液のフィブリノーゲンの沈殿をもたら す。このプロセスにおいて、■因子溶液は、熱処理中、例えば５０％ｗ　／　ｗ サツカリドおよび２Ｍグリシンと混合される。

ウィルス不活性化１因子製剤の調製法は、文献に記載されていない。しかし、本 発明は感染ウィルスの媒介に対し安定である。本質的に感染ウィルスとＢ因子が ないＩ因子の溶液の製造方法を提供するものであり、この方法はＩ因子（所望に より血漿から回収）を含有する溶液を５５〜６５℃で０．５〜１００時間、好ま しくは６０℃で４〜２４時間、１種以上のＩ因子に対する安定化剤の存在下で加 熱することによるパスツール殺菌法に委ねることを含んでなる。熱処理は、より 好ましくは約６０℃で５〜１５時間行われる。本発明は、活性ウィルスと補体因 子、Ｂ因子の媒介に対して実際的に保護されている■因子の調製を一工程で可能 にする。

もしも本発明を例えば例１で記載した如きＰＥＧ沈殿によりＣ３活性を除去する 分画工程と結合させると、■因子欠乏の治療において血漿以上に２つの極めて重 要な利点を有する沈殿が得られるであろう。と言うのは、実際ウィルスも無く更 に前記の如くアアフィラキシー反応をひき越こし得るＣ３およびＢ因子活性が実 際存在しないからである。生成物はまた、自己免疫疾患の治療に対しカネコ（Ｅ Ｐ　０２２２６１１１）　ニよって記載されてたＩ因子製剤よりも秀れている。

と言うのは、これらはウィルス伝染の免疫に関し安全でないからである。従って 、本発明は血漿注入による普通の治療の間、■因子欠乏患者の治療において相当 の改善をもたらすことができる。サツカリドおよび／又は糖アルコールおよび／ 又は安定剤としてアミノ酸と共にＩ因子を含有する溶液を５５〜６５℃で０．５ 〜１００時間熱処理するプロセスは、■因子を含む分画又は沈殿物について行わ れ得る。

■因子を含む溶液をサツカリドおよび／又は糖アルコールおよび／又はアミノ酸 と混合する。１因子の安定化は、サツカリド、糖アルコール又はアミノ酸の添加 増大をもたらし；従って、１種以上のこれらのタイプの安定化剤の飽和まで添加 を行うことができる。同様に、Ｂ因子の安定化は、サツカリドおよび／又は糖ア ルコールの添加量の増加と共に増加する。しかし、これらの安定化剤の濃度範囲 が存在するであろう、ここではＢ因子は熱処理された溶液中に存在せずそしてＩ 因子の高収率が６０℃で１０時間の熱処理後に得られる。

５５％（Ｗ／Ｗ）サツカリドによる安定化が６０℃で１０時間の熱処理後２１％ の緊度でＢ因子発生が起こることは注目すべきである。一方、３０％（Ｗ／Ｗ） サツカリドの使用は、６０℃で４時間以内にＢ因子の全変性をもたらす。同様の 明確な効果はＩ因子に対しては認められない（法例１、パートＢおよび例３）、 安定化剤としてのアミノ酸の使用は、Ｂ因子の安定化を示さず、一方６０℃で１ ０時間の熱処理後にＩ因子の高収率を得ることができる。この事実は、Ｂ因子活 性の無い■因子製剤の製造を可能にする。

熱処理後、■因子を含む溶液からサツカリド、糖アルコール又はアミノ酸の除去 は、イオン交換又は透析により行うことができる。安定化剤の除去後、溶液は、 例えば限外濾過により同時濃度まで濃縮し、引続き所望により沈殿物を凍結乾燥 しそれが再構成される場合使用するまで安定性を改善する。

■因子は、（オーデンス大学（デンマーク）インスティチュート　オン　メディ カル　マイクロバイオロジーにより産生された）　■因子に対し単−特異性家免 抗一血清一抗体を用いロケット免疫電気泳動により測定できる。サンプル径は１ ０Ｉである。標準は、凍結乾燥ヒト血漿である（ＫＡＢＩ）。

Ｂ因子は、家兎抗血清Ｂ因子抗体を用い放射免疫拡散により判定できる（ベージ ング、抗Ｃ３活性化物質）。サンプル径は１０ｍである。標準は、同様に凍結乾 燥ヒト血漿である（ＫＡＢＩ）。

Ｃ３に対する抗体は、商業的には入手できないので、Ｃ３の存在を次の間接法に よって排除することができる。■、ブラントスラング等、５ｅａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ １ｎ、　［：ａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、（１９８４）４４Ｓｕｐｐｌ、　１６８．５ ７参照二Ｃ３分解産物Ｃ３ｃに対する抗体はＣ３並びにＣ３ｃと反応するが、Ｃ ３ｄとは反応しない。

Ｃ３とＣ３ｃ活性の合計はＣ３ｃに対する家免抗−血清−抗体（ダカバッツ）を 用いロケット免疫電気泳動により測定できる。両方の分析に於て、標準は凍結乾 燥ヒト血漿である（ＫＡＢＩ）。もしもこれらの電気泳動の一方が、負の応答（ ロケットなし）を与えるなら、このことはサンプル中にＣ３が存在しないことを 意味する。

サッカロースの濃度は、Ｐｈ、Ｎｏｒｄ、６３　Ｖｏｌ、　Ｉｌ、５５８頁に記 載された方法を変形した方法に従いヨウ素滴定により測定できる。本発明のプロ セスは、次の実施例により示される。

実施例１ ノｆ−ト　Ａ 新鮮な凍結血漿を解かし次いでＰＥＧ　（１８，５％）を添加する。沈殿物を遠 心分離する。ｐＨを４．８に調整すると、大部分の蛋白質は沈殿する。沈殿物を 遠心分離し次いで当初の血漿容量の８６％まで水中に再溶解する。この溶液は次 のものを含有する。

■因子：　０．６　Ｕ／ｍｌ Ｂ因子：　０．３　Ｕ／ｍ１ Ｃ３：ＯＵ／ｍｌ パートＢ 標準物質は、■因子０．４Ｕ／ｍｌおよびＢ因子０．１６Ｕ／ｍｌ（パートＡで 記載した方法により製造）を含有する水性溶液である。溶液中、ｐＨを７．０に 調整し、次いで５ｇの溶液を８個のバイアルの各々に投入した。バイアルを３７ ℃の水溶中に６分間保持する。０〜５５％（ｗ／ｗ）のサツカリドを各バイアル に添加する（下記表参照）。サッカロースの溶解後、ｐ＋＋を再たび７．０に調 節する。次いで、バイアルをシールし、６０℃で１０時間熱処理する。■因子お よびＢ因子を、熱処理および非熱処理の処方サンプルについてロケット免疫電気 泳動および放射免疫電気泳動によりそれぞれ測定する。

パートＢで記載した如く、３０％（Ｗ／Ｗ）サッカロースで処方した水性熱処理 溶液が出発物質である。ｐＨを７．８に調節する。溶液を、電導度２．ＯｍＳお よびｐｆ１７．８を有するホスフェート緩衝液中で平衡化した０ＥＡＥセフアロ スＦＦＣフアルマシアノイオン交換ゲルを充填したカラムに適用する。これを１ ．５カラム溶量の平衡緩衝液でフラッシュ、引き続き電導度４、　ＯｍＳおよび ｐＨ７，８を有するホスフェート緩衝液を用いて溶離する。溶出液を集める。■ 因子活性（ロケット免疫電気泳動）およびサッカロース濃度（アイオノメトリッ ク適定）の双方がイオン交換に対する出発サンプルおよび溶出液について測定さ れる。

■因子およびサッカロースの回復は、それぞれ６４％および１．１％である。

溶出液を限外濾過により濃縮し次いで凍結乾燥する。

例２ 出発物質は、０．６　Ｕ　Ｉ因子／ｍｌおよび０．３０因子Ｂ　／　ｍ　］を有 する水性溶液である（実施例１、パートＡ参照）。溶液中、ｐＨを７．０に調節 し、次いで５ｇの濃液を駅員して１３個のバイアルの各々に投入する。０〜５０ ％（Ｗ／Ｗ）のソルビトール又は０．５〜１．０Ｍのりシン又は０．５〜２．０ Ｍのグリシンをバイアルに添加する。（次表参照）。安定剤を溶解後、ｐＨを７ ．０に調節する。次いでバイアルをシールし、６０℃で１０時間熱処理する。■ 因子およびＢ因子を、熱処理および非熱処理サンプル中、ロケット免疫電気泳動 および放射免疫拡散によりそれぞれ測定する。

処方溶液活性　Ｉ因子活性　Ｂ因子活性中の安定剤の量　の回復　％　の回復　 ％５％（Ｗ／Ｗ）ソルビトール　２１０ １０％（ｖｒ／ｗ）ソルビトール　５９０１５％（ｗ／ｗ）ソルビトール　７５ ０２０％＜ｗ／ｗ＞　ソルビトール　８５０３０％（ｗ／ｗ）ソルビトール　９ ３３４０％（ｗ／ｗ）ソルビトール　９６５０．５Ｍリシン　１０００ ０．５Ｍグリシン　００ １．０Ｍグリシン　９０ 例３ 出発物質は、例１のバー）Ａで記載した如く製造される０、６３ＵＩ因子／ｍＬ ｊｊよび０．３０　Ｂ因子／ｍｌを含有する水性溶液である。溶液中、ｐＨを７ ．０に調節し、３０％（Ｗ／Ｗ＞サッカロースを添加する。処方溶液を各バイア ル中に０．５ｍｌ添加されるように分配する。バイアルをシールし、６０℃に保 持する。異なる時間に（次の表参照）、バイアルを６０℃の保存しながら一２０ ℃に移す。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年６月π日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．本質的に感染ウィルス、因子Ｂおよび因子Ｃ３のない純粋なＩ因子蛋白質。
2. ２．血漿から誘導される請求の範囲第１項記載の純粋なＩ因子蛋白質。
3. ３．請求の範囲第１項又は第２項に明定される如き純粋なＩ因子を含有する注入 可能製剤。
4. ４．本質的に感染ウィルスおよびＢ因子のないＩ因子の溶液の製造方法であって 、Ｉ因子含有溶液を、５５〜６５℃で０．５〜１００時間Ｉ因子のための１種も しくはそれ以上の安定化剤の存在下、加熱することによりパスツール殺菌法に委 ねることを特徴とする、前記製法。
5. ５．Ｉ因子を含有する溶液を血漿から回収する、請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．約６０℃で、４〜２４時間、好ましくは５〜１５時間加熱処理を行うことを 特徴とする、請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．安定化剤が、サッカリド、糖アルコールもしくはアミノ酸又はこれらの組合 わせである、請求の範囲第４項から第６項までのいずれか１項に記載の方法。