CS256897B1

CS256897B1 - Series thymic factor's analogue-type peptides

Info

Publication number: CS256897B1
Application number: CS849887A
Authority: CS
Inventors: Evzen Kasafirek; Martin Cerny; Petr Kocis; Jiri Krepelka; Josef Rovensky
Original assignee: Evzen Kasafirek; Martin Cerny; Petr Kocis; Jiri Krepelka; Josef Rovensky
Priority date: 1984-12-17
Filing date: 1984-12-17
Publication date: 1988-04-15
Also published as: FI855041L; FI855041A0; US4711952A; JPS61191696A; FI855041A7; EP0232435A3; CA1259449A; CS988784A1; EP0232435A2

Description

Vynález se týká peptidů typu analogů sérového thymického faktoru obecného vzorce I

A - Gly - Gly - Ser - Asn -B-C-NH-R (I), kde A je pGlu, Gin, anebo zbytek peptidů Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-, pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-, Ala-Lys-Ser-Gln-,

В je Gly, Phe, Ala nebo nula,

C je totéž co B,

R je atom vodíku nebo alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo 2-fenylethyl.

Hormony thymu získané bud izolací extrakcí thymu anebo synthetické, jsou therapeuticky využívány u imunodeficientních pacientů (thymotherapie) ke zvýšení jejich imunologické reaktivity. Prakticky se to týká systémového onemocnění lupus erythemathodes, myastenia gravis, dětského astmatu, ale i nádorového onemocnění.

S překvapením bylo zjištěno, že látky podle vynálezu se vyznačují tím, že stimulují a diferencují vývoj T-lymfocytů, zvláště jejich zrání. Jejich aktivita in vitro E-rosetovým testem je vyšší než u přírodních hormonů thymu, kupř. sérového thymického faktoru, ale i thymosinu V, viz tab. I.

Dosavadní vývoj v hledání nových specifických analogů sérového thymického faktoru se soustředoval na látky modifikované v N-terminální části řetězce anebo přímo v aminokyselinové sekvenci uvnitř řetězce a zcela opomíjel prodloužení C-terminálního peptidického řetězce.

S překvapením bylo zjištěno, že látky podle vynálezu s C-terminálním. prodlouženým aminokyselinovým anebo peptidickým zbytkem, zvláště pak zakončených amidovým nebo alkylamidovým zbytkem, se vyznačují zvýšenou imunomodulační aktivitou.

Dosud prováděné záměny u N-terminální části sekvence sérového thymického faktoru prokázaly nevýznamnost pyroglutámového zbytku v pozici 1. (int. J. Pept. Protein Res. 14, 41 /1979/, Mol. Immunol. 17„ 1 213 /1980/, Int. J. Pept. Protein Res. 21, 135 /1983/, Int.

J. Immunopharmac. 6, 141 /1984/), stejně tak jeho substituci glutaminem. Nyní bylo zjištěno, že u analogů prodloužených u C-konce peptidického řetězce aminokyselinovým anebo peptidickým řetězcem a zakončených amidickou anebo alkylamidickou skupinou, zaujímá N-terminální pozice sérového peptidického hormonu klíčové postavení. Tak je-li u souboru C-prodloužených hormonů N-terminální pozice zakončena zbytkem glutaminu, dochází к imunosupresi; tato aktivita je dokonce zsílena u kratších peptidů. Naproti tomu, je-li pozice 1 zcela eliminována (tzv. des-pyroglutamylpeptidy) a C-konec zakončen nesubstituovanou amidickou skupinou, dochází к potenciaci imunostimulační aktivity; při substituci C-koncové amidické skupiny, tj. hormony s alkylamidovou skupinou, dochází к imunosupresi. Tyto vztahy mezi agonistickými a antagonistickými aktivitami názorně a přesvědčivě dokumentuje tabulka 1.

Peptidy s imunomodulačním účinkem obecného vzorce I lze připravit obecnými, všeobecně známými metodami používanými v synthese peptidů, například synthesou v roztoku anebo na pevné fázi a to fragmentovou kondenzací či postupnou výstavbou, případně synthesou katalyzovanou enzymy.

Podobně použití chránících skupin a kondenzačních činidel zahrnuje současný stav obecně známých skupin a synthetických metod.

Podle vynálezu lze peptidy s imunomodulačním účinkem obecného vzorce I například připravovat tak, Že se

a) sloučenina obecného vzorce II

Gly - Gly - Ser - Asn - В - C - NH - R (TI) , ve kterém В, C a R značí totéž co ve vzorci I, kondenzuje s kyselinou pyroglutámovou, nebo tak# že se

b) sloučenina obecného vzorce .11 kondenzuje se sloučeninou obecného vzorce III

X - А(Y) (III)_t ve kterém X a Y značí chránicí skupiny pro alfa- nebo omega-aminoskupiny a A totéž co ve vzorci I, v meziprodukt obecného vzprce IV

X - A(Y) - Gly - Gly - Ser - Asn - В - C - NH - R (IV), kde X a Y značí totéž co ve vzorci III а А, В, C a R značí totéž co ve vzorci I# z něhož se postupně nebo současně odstraní chránicí skupiny X a Y.

Je samozřejmé, že к přípravě peptidů obecného vzorce I podle vynálezu lze použít i jiných vhodných výchozích fragmentů nebo metod obecně známých v tomto oboru.

Způsob výroby podle vynálezu je blíže popsán v následujících příkladech provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Poznámky к experimentální části: Teploty tání byly stanoveny na Koflerově bloku a nebyly korigovány. Vzorky к analýze byly sušeny ve vakuu při 70 Pa nad kysličníkem fosforečným při teplotě místnosti (látky s teplotou tání (t.t.) nižší než 115 °C) anebo při 105 °C (látky s teplotou tání nad 115 °C). Optické rotace byly změřeny na polarimetru Perkin-Elmer 141. Obsah vody byl měřen na přístroji Aquatest II Photovolta.

Tabulka 1 vA

Thymické hormony Rozdíl počtu znovuvzniklých roset (%) pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn9,20 (sérový thymický faktor)

Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn—1,64

AI a-Lys-Ser-Gln-GJ.y-Gly-Ser-Asn3,18 pGlu-Ala-I.ys-Ser-Gln-G] y-Gly-Ser-Asn-Phe-Nř^7,54

Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-Phe-NI^16,09

Gln-Ala-ňys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-Phe-Nl^-1,52 pClu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-Gly-NH.,6,31

Alú-Lys-Ser-G.l n - Gly-Gly-Ser-Asn-Gly-NH^12,75

Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-Phe-NIL, -22,90 pGlu-G.l.y-Gly-Ser“A£n-Phe-’NII₂2,89 pGlu-Gly-G.ly-Ser “Arin-Cly~NR₂6,35

Ala-Lys-Scr-Cln-GJ y-Gly-Ser-Asn-Phe-NII-EtPh-6,0 pGlu-Gly-Gly-Asn-Phe-NH-EtPh-13,0

Thymosin frakce V3,80 * metodou viz. Clin. exp. Immunol. 47, 183 (1982) pGlu = kyselina pyroglutámová; alanin;

Lys = lysin; Ser = serin; Gin « glutamin; Gly = qlycin;

Asn -· asparagin; Phe = fenylalaroin; -NH-EtPh = 2-fenylethylamidová skupina; -NH₂ = amidová skupina.

Chromatografie byla provedena na tenké vrstvě silikagelu (klese 1-gel G, Merck) v následujících systémech:

Soustava S^:

1-butanol-kyselina octová-voda (4:1:1)

Soustava S₂ :

1- butanol-kyselina octová-pyridin-voda (15:3:10:6)

Soustava

2- propanol-voda (2:1)

Detekce volných aminokyselin a peptidů byla provedena ninhydrinem.

Detekce chráněných peptidů byla provedena chlorační technikou s 2-tolidinem.

Odpaření roztoků bylo provedeno výhradně ve vakuu na rotačním vakuovém odpařováku.

Příklad 1

Methylester benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaminu

К roztoku benzyloxykarbonylasparaginu (13,3 g; 50 mmolů), N-ethylpiperidinu (7,0 ml) a pyridinu (5,0 ml) v dichlormethanu (100 ml), ochlazenému na -20 °C byl přidán za stálého míchání pivaloylchlorid (6,3 ml); roztok byl míchán a chlazen (0 °C) 8 minut. Potom byl během 2 až 3 minut přidán к reakčnímu roztoku roztok methylesteru fenylalaninu v dichlormethanu (100 ml), uvolněného z odpovídajícího hydrochloridu methylesteru fenylalaninu (10,7 g; 50 mmolů) přídavkem N-ethylpiperidinu (7,0 ml). Reakční směs byla dále míchána 2 hod při teplotě místnosti, vyloučená krystalická látka byla odfiltrována a postupně roztírána s 1M kyselinou chlorovodíkovou, vodou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Krystalizací z methanolu bylo získáno 14,5 g (68%) produktu o t.t. 196 až 197 °C. Vzorek к analýze byl krystalován z dimethylformamidu a 2-propanolu; t.t. byla nezměněna; R_f = 0,71/Sp 0,75/S₂;

-2,0 ° (c = 0,2; dimethylformamid)

Pro C₂₂H₂₅N₃O₆ (427,5) vypočteno: 61,82 % C, 5,90 % H, 9,83 » N, nalezeno: 61,68 % C, 5,96 % II, 9,65 % N.

Hydrobromid methylesteru asparaginy1-fenylalaninu

К roztoku methylesteru benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaninu (4,3 g; 10 mmolů) v ledové kyselině octové (7,0 ml) byl přidán 38% rozt.ok bromovodíku v kyselině octové (10 ml) a směs byla odstavena za občasného míchání 1 hodinu při teplotě místnosti. Potom byl produkt vysrážen přídavkem etheru, odfiltrován, promyt etherem a vysušen v exsikátoru nad hydroxidem sodným a kysličníkem fosforečným. Bylo získáno 3,6 g (97 %) produktu. Látka byla elektroforeticky a chromatograficky homogenní: R^ = 0,37/S^, 0,70/S₂·

Methylester benzylóxykarbonylseryl-asparaginyl-fenylalaninu


	25-6.8:9.7

К roztoku benzyloxykarbonylserinu (8,4 g; 35 mmolů), N-ethylpiperidinu (4,9 ml) a pyridinu (3,5 ml) v dichlormethanu (100 ml), ochlazenému na -20 °C byl za stálého míchání přidán pivaloylchlorid (4,4 ml). Roztok byl míchán a chlazen (0 °C) 8 minut. Po této době byl během 2 až 3 minut přidán roztok methylesteru asparaginyl-fenylalaninu v dichlormethanu (100 ml), uvolněného z hydrobromidu methylesteru asparaginyl-fenýlalaninu (13,1 g; 35 mmol) přídavkem N-ethylpiperidinu (4,9 ml). Reakční směs byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti a odpařena. Nekrystalický odparek byl rozpuštěn v octanu ethylnatém a postupně promýván 1M kyselinou chlorovodíkovou, vodou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, vysušen bezvodým síranem sodným, odpařen a odparek byl krystalován z methanolu. Bylo tiskáno 9,1 g (51 %) produktu o t.t. 180 až 183 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně, t.t. 184 až 186 °C;

R_f = 0,71/S₁, 0	,82/S₂	; Μ² _ΰ° -ia.	,8	° (c = 0₍	,2; methanol)
Pro C₂₅H_3Q	^N14°8	(514,5)
vypočteno:	58,36	% C, 5,88	%	H, 10,89	% N,
nalezeno :	58,36	% C, 5,83	%	H, 11,26	% N.

Amid benzyloxykarbonylseryl-asparaginyl-fenylalaninu

К ochlazenému roztoku methylesteru Ьепгу1охукагЬопу15егу1-а8рагад1пу1-^епу1а1апхпй (5,2 g; 10 mmol) v 98 % methanolu (130 ml) byl přidán kapalný amoniak (cca 33 g) a reakční · směs byla odstavena 70 hodin při teplotě místnosti. Vyloučený krystalický produkt byl odfiltrován a promyt methanolem. Bylo získáno 3,9 g (78 %) produktu o t.t. 218 aŽ 221 °C. Vzorek к analýze byl krystalován ze směsi dimethylformamid-methanol (1:1) přídavkem etheru, ť.ť.

222 až 224 °C; -15,9 ° (c = 0,2; dimethylformamid); R_f = 0,64/S^ 0,71/S₂·

Pro C₂₄H_2gN₅O₇ (499,5) vypočteno: 57,70 % C, 5,86 % H, 14,02 % N, nalezeno ; 57,03 % C, 5,96 % H, 13,90 % N.

)

Amid seryl-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku amidu benzyloxykarbonylseryl-asparaginyl-fenylalaminu (5,0 g; 10 mmol) a kyseliny octové (0,1 ml) v 70% methanolu (400 ml) byla přidána Pd-čerň (cca 50 mg); hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku 3 hodiny při teplotě místnosti. Po odfiltrování Pd-černi byl roztok odpařen a pevný odparek byl krystalován z 95 % methanolu přídavkem etheru. Bylo získáno 3,6 g (96 %) produktu o t.t. 169 až 172 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně, t.t. byla nezměněna; R_f = 0,24/S^, 0,57/S₂; QjJ ²⁰ -19,3 ° (c = 0,2; methanol)

Pro C₁₆H₂₃N₅O₅.1/2H₂O (374,4) vypočteno: 51,,32 % C, 6,47 % H, 18,70 % N, nalezeno : 51,67 % C, 6,35 % H, 18,49 % N.

Methylester benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycinu

К suspenzi hydrochloridu methylesteru glycyl-glycinu (1,9 g;(10 mmol) ve směsi dimethylformamid-dichlormethan (1:2) (30 ml) byl přidán N-ethylpiperidin (1,4 ml) a směs byla míchána hodiny při teplotě místnosti. Potom byl přidán pentachlorfenylester benzyloxykarbonylglutaminu (5,3 g; 10 mmolů) a reakční směs byla míchána další 4 hodiny při teplotě místnosti. Po dalších 8 hodinách stání při teplotě místnosti byl vyloučený krystalický produkt odfiltrován a krystalován z methanolu přídavkem dichlormethanu. Bylo získáno 2,5 g (61 %) produktu o t.t. 129 áž 134 °C. Vzorek к analýze byl krystalován z methanolu, t.t. 132 až 134 °C; R_f = 0,57/Sp O,78/S₂; ²⁰ -8,5 ° (c = 0,2; 50% kyselina octová).

Pro _ЙН_2ЛО₇.1 /2Н₂О (417,4) vypočteno: 51,79 % С, 6,05 % Н, 13,43 % N, nalezeno : 51,74 % С, 5,96 % Н, 13,32 % N.

Hydrazid benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycinu

К roztoku methylesteru benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycinu (8,3 g; 20 nunol) v methanolu (100 ml) byl přidán 100¾ hydrazin hydrát (4,7 ml). Po 48 hodin stání při teplotě místnosti byl vyloučený krystalický produkt odfiltrován, promyt methanolem a krystalován z 80 % ethanolu. Bylo získáno 6,1 g (74 %) produktu o t.t. 169 až 171 °C. Vzorek k analýze byl krystalován obdobně, t.t. 167 až 170 °C; R_f = 0,30/Sp 0,70/S₂; £Ó4J -9,05 ° (c - 0,2;

methanol)

Pro C₁₇H₂₄N₆O₆ (408,4) vypočteno: 49,99 % C, 5,94 % H, 20,58 % N, nalezeno·: 50,15 % C, 6,06 % H, 21,16 % N.

Amid benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku hydrazidu benzyloxykarbonylglutaminyl-glycylglycinu (4,1 g; 10 nunol) a koncentrované kyseliny chlorovodíkové (4,0 ml) v dimethylformamidu (50 ml), ochlazenému na -20 °C byl přidán 3,6M roztok dusitanu sodného (2,8 ml). Roztok byl míchán a chlazen (-20 °C) 10 minut. Po této době bylo pH reakčního roztoku upraveno přídavkem N-ethylpiperidinu na hodnotu 6,9 a byl přidán roztok amidu seryl-asparaginylfenylalaninu (3,7 g; 10 mmolů) v dimethylformamidu (50 ml); po 12hodinovém stání při teplotě 0 °C byl roztok odpařen a pevný odparek byl postupně roztírán s 1M kyselinou chlorovodíkovou, vodou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a krystalován z butanolu přídavkem octanu ethylnatého. Bylo získáno

5,6 g (74 %) produktu o t.t. 225 až 227 °C. Vzorek k analýze byl krystalován obdobně, t.t. 226 až 229 °C; R^ = 0,30/Sp 0,58/S₂;pj -12,1 ° (c- 0,2; dimethylformamid). Aminokyse- linová analýza: Glu (1,00), Gly (2,02), Ser (0,76), Asp (0,94), Phe (0,92).

Pro ^C33^H43^N9°h · ^H2° í⁷⁵⁹*®) vypočteno: 52,16 % C, 5,98 % H, 16,59 % N, nalezeno : 51,85 % C, 5,79 % H, 16,33 % N.

Amid glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku amidu benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (2,2 g; 3 mmol) a kyseliny octové (0,1 ml) ve směsi dimethylformamid-methanol (112) (100 ml) byla přidána Pd-čerň (cca 25 mg). Hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku 6 hodin při teplotě místnosti. Po odfiltrování Pd-Černi byl roztok odpařen a pevný odparek byl krystalován z 95 % methanolu přídavkem etheru. Bylo získáno 1,7 g (86%) produktu o t.t. 202 až 204 °C. Vzorek k analýze byl krystalován obdobným způsobem, t.t. 209 až 212 °C; = 0,05/Sj,

0,42/S₂; W 2° -21,9 ⁰ (c = 0,2; 50 % methanol) .

Pro C₂₅H₃₇N₉<3₉.3H₂O (661,7) * vypočteno: 45,37 % C, 6,56 % H, 19,05 % N, 8,17 % H₂O nalezeno : 46,91 % C, 6,04 % H, 18,33 % N, 9,32 % H₂O.

Hydrochlorid methylesteru alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu

К roztoku methylesteru terč. butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu (3,4 g; 6 mmol) v ledové kyselině octové (12 ml) byl přidán 1M roztok chlorovodíku v kyselině octové (12 ml). Reakční směs byla ponechána 1 hodinu při teplotě místnosti, potom byl produkt vysrážen etherem, odfiltrován a sušen v exsikátoru nad hydrosidem sodným a kysličníkem fosforečným. Bylo získáno 2,7 g (93 %) produktu; R_f « 0,35/S^, 0,62/S₂·

Methylester pyroglutamyl-alanyl-N-omega~benzyloxykarbonyllysyl-ser.í nu

Roztok kyseliny pyroglutámové (0,9 g; 7 mmol), N-hydroxybenztriazol. (0,95 g) a N,N'-dicyklohexylkarbodiimidu (1,6 g) v dimethylformamidu .(50 ml) byl míchán a chlazen (-10 °C) 10 minut. Potom к reakčnímu roztoku byl přidán předchlazený roztok (-10 °C) methylesteru alanylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu v dimethylformamidu. (50 ml) uvolněného z odpovídajícího hydrochloridu methylesteru alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu (3,4 g; 7 mmol) přídavkem N-ethylpiperidinu (1,0 ml). Reakční směs byla míchána 2 hodiny při 0 °C a odstavena 8 hodin při teplotě místnosti. Poté byla vyloučená Ν,Ν'-dicyklohexylmočovina odfiltrována, roztok byl odpařen, nekrystalický odparek byl rozpuštěn v octanu ethylnatém a postupně promýván 1% roztokem kyseliny citrónové, vodou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, vysušen bezvodým síranem sodným, odpařen a krystalován z 2-propanolu. Bylo získáno 2,4 g (59 %) produktu o t.t. 120 až 122 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně, t.t. 135 až 137 °C. R_f = 0,53/5_χ, 0,83/S₂; [á] ²⁰ -24,4 ° (c = 0,2; dimethylformaniid). Aminokyselinová analýza: Glu (0,85), Lys (1,00), Ala (1,06), Ser (0,82).

Pro C₂₆ ^H37^N5°9·^H2° (581,7) · vypočteno: 53,68 % C, 6,77 % K, 12,04 % N, nalezeno : 53,96 % C, 6,47 % H, 11,34 % N.

Hydrazid pyroglutamy1-alany1-N-omega-benzyloxykarbonyl-lysyl-serinu

К roztoku methylesteru pyroglutamyl-alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu (2,9 g;

mmol) ve směsi dimethy 1 formamid-methanol (1:1) (40 ml.) byl přidán 100% hydrazin hydrát (3,0 ml). Po 8hodinovém stání při teplotě místnosti byl vyloučený krystalický produkt odfiltrován a promyt methanolem. Bylo získáno 2,3 g к analýze byl krystalován z 80% methanolu fZjn⁰ ~⁴⁸-⁹ ° ^{(c =} °-² % methanol).

t.t.

°C. Vzorek

218 °C; R_f = 0_ř54/S_x, 0,73/S₂;

(79 %) produktu o t.t. 212 až 214 217 až

Pro C₂₅H₃₇N_?O₈.H₂0 (581,6) vypočteno: 51,62 % C, 6,77 % H, 16,86 % N, 3,10 % nalezeno : 52,01 % C, 6,55 % H, 16,54 % N, 3,22 % H₂O.

Amid pyroglutamyl-alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku hydrazidu pyroglutamyl-alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu (0,95 g;

1,63 mmol) a koncentrované kyseliny chlorovodíkové (0,6 ml) v dimethylformamidu (20 ml), ochlazenému na -20 °C byl přidán 3,6M roztok dusitanu sodného (0,5 ml). Roztok byl míchán a chlazen (-20 °C) 10 minut. Po Opravení pH roztoku přídavkem N-ethylpiperidinu na hodnotu

6,9 byl přidán roztok amidu glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (0,92 g; 1,51 mmolů) v dimethylformamidu (40 ml). Po 12hodinovém stání při teplotě 0 °C byl roztok odpařen a nekrystalický odparek byl rozmíchán s nasyceným roztokem chloridu sodného (2,0 ml), po 1 hodině stání při 0 °C byl krystalický produkt odfiltrován, promyt a krystalován z butanolu (nasyceného vodou při 20 °C) přídavkem octanu ethylnatého a rekrystalován z 80% methanolu přídavkem octanu ethylnatého. Bylo získáno 0,58 g (33%) produktu o t.t. 248 až 252 °C. Vzorek к ajpalýze byl krystalován obdobně, t.t. 259 až 261 °C; R^ = 0,08/S^, 0,42/S₂;

48,2 ° (c = 0,1; 50% kyselina octová). Aminokyselinová analýza: Glu (1,90), Ala (1,18), Lys (1,06), Ser (1,79), Gly (1,95), Asp (1,05), Phe (1,00).

Pro C₅₀H₇₀N₁₄O₁₇.2H₂O (1 175,3) vypočteno: 51,10 % C, 6,35 % H, 36,68 % N, nalezeno : 51,13 % C, 6,26 % H, 16,20 % N.

Amid pyroglutamy1-alanyl-lysy1-seryl-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-feny1alaninu

К roztoku amidu pyroglutamyl-alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl-glutarninyl-g cyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (300 mg; 0,26 mmolu) v 10% kyselině octové (100 . byla přidána Pd-čerň (cca 20 mg). Hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku 3 hodin} při teplotě místnosti. Po odfiltrování Pd-černi byl roztok odpařen, odparek byl rozpuštěn v 0,2M kyselině octové (5,0 ml) a čištěn gelovou filtrací na Sephadexu G 15, na koloně i (1,8 x 90 cm); homogenní frakce byly zahuštěny a lyofilizovány. Bylo získáno 200 mg (64 %) produktu. Látka byla chromatograficky homogenní; R^ = 0,02/S^, 0,25/S₂; &/J -67,9 ° (c = = 0,1; 0,lM kyselina octová). Aminokyselinová analýza: Glu (1,94), Ala (1,18), Lys (1,10), Ser (1,78), Gly (2,03), Asp (1,04), Phe (1,00).

Pro ^c ₄₂IÍ₆₄N₁₇O_{1 5}.2AcOH. 4H₂O (1 197,3) vypočteno: 46,47 % C, 6,74 % H, 17,24 % N, 6,34 % H₂0, , nalezeno : 46,75 % C, 6,25 % H, 16,82 % N, 8,84 % Η_?0

Příklad 2

Amid pyroglutamyl-glycyl-glycyl-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku amidu benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (4,0 g; 5,26 mmolů) v 10% kyselině octové (100 ml) byla přidána Pd-čerň (cca 25 mg). Hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin. Po odfiltrování Pd-černi byl roztok odpařen, odparek byl rozpuštěn v 0,2M kyselině octové (5 ml) a látka Čištěna gelovou filtrací na Sephadexu G 15; homogenní frakce byly spojeny, zahuštěny a lyofilizovány. Bylo získáno 2,5 g (77 %) produktu o t.t. 218 až 221 °C; M -35,7 ° (c - 0,1;

1M kyselina octová). Látka byla chromatograficky homogenní (ninhydrin negativní): R_f = 0,15/S^, 0,56/S₂· Aminokyselinová analýza: Glu (1,00), Gly (2,00), Ser (0,87), Asp (1,04), Phe (0,97).

Pro C₂₄H₃₃NgO₉.l a 1/2H₂O (616,6) vypočteno: 48,69%C, 5,90 % H, 18,18 % N, , nalezeno : 49,20 % C, 5,86 % H, 17,64 % N.

Příklad 3

Terč.butyloxykarbonylalany1-N-omega-benzyloxykarbony1-lysyl-serin

К roztoku methylesteru terč.butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu (2,0 g;.3,6 mmolu) v methanolu (20 ml) byl přidán roztok 1M hydroxidu sodného (5,4 ml). Reakční směs byla míchána 30 minut při teplotě místnosti, potom bylo pH roztoku upraveno na hodnotu 7, z roztoku byl oddestilován methanol, pH vodného odparku bylo upraveno 1M kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 3 a produkt byl postupně vytřepán octanem ethylnatým (3krát 100 ml). Spojené organické výtřepky byly vysušeny bezvodým síranem sodným, odpařeny a odparek byl krystalován z octanu ethylnatého přídavkem petroletheru. Bylo získáno 1,7 g (88 %) produktu o t.t. 132 až 134 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně, t.t. byla nezměněna. = 0,75/S^, 0,75/S₂; fýbj -23,2 ° (c = 0,2; methanol).

Pro C₂₅H₃₈N₄O₉ (538,6) vypočteno: 55,74 % C, 7,13 % H, 10,40 % N, nalezeno : 56,13 % C, 7,46 % H, 10,40 % N.

Amid terč. butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzy]oxykarbonyl-Iysyl-seryl-glutaminyl-glycyl-glycil-seryl-asparaginyl-fenylalaninu

Roztok terč. butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzy.loxykarbonylJ ysyl-serinu (0,8 g;

1,49 mmolů), N-hydroxybenztriazolu (0,2 g) a N,N'~dicyklohexylkarbodiimidu (0,3 g) v dimethylformamidu (30 ml) byl míchán a chlazen (-10 °C) 10 minut. Potom byl přidán předchlazený roztok (-10 °C) amidu glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginy]-fenylalaninu (1,0 g;

1,51 mmolu) v dimethylformamidu (50 ml).

Reakční směs byla míchána 2 hodiny při 0 °C a potom odstavena 8 hodin při teplotě místnosti. Po odfiltrování Ν,Ν'-dicyklohexylmočoviny byl roztok odpařen a nekrystalický odparek rozmíchán s nasyceným roztokem chloridu sodného (3,0 ml). Po 1 hodině stání při 0 °C byl krystalický produkt odfiltrován, promyt a krystalován z butanolu (nasyceného vodou při 20 °C) přídavkem octanu ethylnatého. Bylo získáno 0,4 g (23 %) produktu o t.ť. 225 až 227 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně^ t.t. byla nezměněna. R_f = 0,25/S^ 0,76/S₂; β/J ²⁰ -39,2 ° (c = 0,l; 50% kyselina octová).

Aminokyselinová analýza: Ala (1,03), Lys (0,98), Ser (1,77), Glu (0,94), Gly (2,03.), Asp (1,00), Phe (1,03).

Pro ^c50^H73^Ni3^o ₁₇.H₂O (1 146,2) vypočteno: 52,39 % C, 6,59 % H, 15,88 % N, nalezeno : 51,99 % C, 6,55 % H, 15,59 % N.

Amid alany1-1ysyl-séry1-glutaminy1-glycyl-glycyl-sety1-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku amidu terč. butyloxykarbonylalanvl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl-glutaminyl-glycyr-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (0,4 g; 0,35 mmolů) v 10% kyselině octové (100 ml) byla přidána Pd-čern (cca 20 mg). Hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku 2 hodiny při teplotě místnosti. Po odfiltrování Pd-černi byl roztok odpařen, odparek vysušen v exsikátoru 5 hodin nad hydrosidem sodným a kysličníkem fosforečným a rozpuštěn v kyselině trifluoroctové (1,8 ml). Roztok byl míchán .1 hodinu při teplotě místnosti, produkt byl vysrážen etherem, zfiltrován, promyt, sušen v exsikátoru nad hydrosidem sodným a kysličníkem fosforečným 2 hodiny a rozpuštěn v 50% methanolu; konverzí na Zerolitu FF v acetátovém cyklu (nejprve vsádkově a potom na koloně 1,8 x 25 cm) byl produkt převeden v odpovídající acetát. Spojené methanolické eluáty byly odpařeny, odparek byl rozpuštěn v 0,2M kyselině octové a dále čištěn gelovou filtrací na Sephadexu G 15 jak uvedeno v příkladě 1. Bylo získáno 0,2 g (57 %) homogenního produktu. R_f - 0,02/Sj, 0,45/S₂; (/J ²⁰ -40,4 ° (c = 0,1; 0,1M kyselina octová. Aminokyselinová analýza: Ala (1,09), Lys (1,03), Ser (1,65), Glu (1,00), Gly (1,97), Asp (1,02), Phe (0,98).

Pro C_3?H₅₉N₁₃O₁₃.2AcOH (1 014,1) vypočteno: 48,56 % C, 6,66% H, 17,96 % N, nalezeno : 49,07 % C, 6,42 % H, 37,51 % N.

Příklad 4

Trifluoroacetát amidu alanyl-N~omega-benzyloxykarbonyl-lysyl-seryl-glutaminyl-glycy1-glycy1-séry1-asparaginyl-fenylalaninu

Roztok amidu terč.butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl~glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (1,0; 0,87 mmolů) a anisolu (0,3 ml) v kyselině trifluoroctové (2,7 ml) byl míchán 30 minut při teplotě místnosti. Produkt byl vysrážen přídavkem etheru, odfiltrován, promyt a sušen v exsikátoru nad hydroxidem sodným a kysličníkem fosforečným. Bylo získáno 0,9 g (89 %) produktu. = 0,21/S^, 0,65/S₂·

Amid benz-yloxy karbo nylglut.aminyl~a lany l-N-omega-benzyloxy kar bony llysyl-séry 1-glutaminyl-glycyl-glycyl-séryl-asparaginyl-fenylalaninu

Roztok benzyloxykarbonylglutaminu (250 mg; 0,89 mmolů), N-hydroxybenztriazolu (120 mg) a N,N-dicyklohexylkarbodiimidu (200 mg) v dimethylformamidu (30 ml) byl míchán a chlazen (-10 °C) 10 minut. Po této době byl přidán předchlazený (-10 °C) roztok amidu allányl-N-oniega-benzyloxykarbopyllysyl-seryl-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu v dimethylformamidu (30 ml), uvolněného z odpovídajícího trifluoroacetátu přídavkem N-éťhylpiperidinu (0,15 ml). Reakční směs byla míchána 2 hodiny při 0 °C a potom odstavena 8 hodin při teplotě místnosti.

Po zahuštění (cca na půl objemu) a následujícím ochlazení (1 hodinu při 0 °C) byla vyloučená N,N”-dicyklohexyImočovina odfiltrována a roztok byl odpařen. Pevný odparek byl rozmíchán s vodu (3 ml). Potom byl krystalický produkt odfiltrován a krystalován z kyseliny octové přídavkem octanu ethylnatého. Bylo získáno 200 mg (18 %) produktu o t.t. 251 až 254 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně, t.t. byla nezměněna. R_f = 0,02/Sp 0,03/S₂;

οθ ° (c - 0,1; 25% kyselina octová). Aminokyselinová analýza: Glu (1,84), Ala (0,95), Lys (1,11), Ser (1,73), Gly (2,04), Asp (1,00), Phe (1,09).

Pro C_5gH₇₉N₁₅O₁₉.2H₂O (1 326,4) vypočteno: 52,88 % C, 6,27 % H, 15,99 % N, nalezeno : 52,88 % C, 6,32 % H, 15,32 % N.

Amid glutaminyl-alanyl-lysyl-séry1-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-feny1alaninu .

К roztoku amidu benzyloxykarbonylglutaminyl-alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu (100 mg; 0,08 mmolů) v 10% kyselině octové (100 ml) byla přidána 1M kyselina chlorovodíková (0,4 ml) a Pd-čerň, (cca 30 mg). Hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku 3 hodiny při teplotě místnosti. Po odfiltrování Pd-černi byl filtrát odpařen, a odparek byl rozpuštěn ve vodě (5 ml) a roztok znovu odpařen (2krát opakováno). Pevný odparek byl rozpuštěn v 0,2M kyselině octové a čištěn gelovou filtrací stejným způsobem jak uvedeno v příkladě 1. Bylo získáno 70 mg (75 %) produktu. Rf = 0,00/S₁, 0,25/S₂; [j/J²θ -47,8 ° (c = 0,1; 0,1M kyselina octová). Aminokyselinová analýza: Glu (1,92), Ala (1,00), Lys (0,99), Ser (1,77), Gly (2,04), Asp (1,01), Phe (0,97).

Pro C₄₂H₆₇N₁₅0₁₅.2HC1.4H₂0 (1 167,1) vypočteno: 43,22 % C, 6,66 % H, 18,00 % N, nalezeno : 43,73 % C, 6,20 % H, 16,78 % N.

Příklad 5

2-fenylethylamid benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven obdobným způsobem jako odpovídající methylester metodou směsného anhydridu jak uvedeno v příkladě 1 ve výtěžku 70 %. Vzorek к analýze byl krystalován z kyseliny octové a etheru; t.t. 239 až 143 °C.

Pro C_2gH₃₂N₄O₅.1/2ACOH (546,6) · vypočteno: 65,92 % C, 6,27 % H, 10,25 % N, nalezeno : 65,92 % C, 6,50 % H, 10,28 % N.

Hydrazid benzyloxykarbonylglycy1-glycyl-serinu

Roztok benzyloxykarbonylglycyl-glycinu (13,31; 50 mmolů), N-hydroxysukcinimi.du (5,75 g) a N,N'-dicyklohexylkarbodiimidu (11,3 g) v dimethylformamidu (180 ml) byl míchán a chlazen (-10 °C) 1 hodinu. Po této době byl přidán к reakčnímu roztoku předchlazený roztok (-10 °C) methylesteru šeřinu v dimethylformamidu (50 ml) uvolněného N-ethylpiperidinem (6,85 ml) z odpovídajícího hydrochloridu (7,8 g; 50 mmolů). Reakční směs byla míchána 3 hodiny při 0 °C a potom odstavena 8 hodin při teplotě místnosti. Vyloučená N,N'-dicyklohexylmočovina byla odfiltrována а к filtrátu byl přidán 100% hydrazinhydrát (15 ml). Po 3 dnech stání reakční suspenze při teplotě místnosti byl vyloučený hydrazid odfiltrován, promyt ethanolem a krystalován ze zředěného ethanolu. Bylo získáno 15,2 g (83 %) produktu o t.t. 172 až 175 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobně; t.t. byla nezměněna.

Pro C₁₅H₂₁N₅O₆ (367,4) vypočteno: 49,04 % C, 5,76 % H, 19,07 % N, nalezeno : 49,07 % C, 5,91 % H, 18,52 % N.

Hydrobromid 2-fenylethylamidu asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku fenylethylamidu benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaninu (5,2 g; 10 mmolů) v kyselině octové (40 ml) byl přidán 38% roztok bromovodíku v kyselině octové (10 ml). Po 1-hodinovém stání při teplotě místnosti byl hydrobromid vysrážen'etherem, odfiltrován a důkladně promyt etherem; produkt byl sušen 12 hodin nad hydroxidem sodným a kysličníkem fosforečným. R_f = 0,48/S^, 0,53/S₂«

2-Fenylethylamid benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-séry1-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku hydrazidu benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-serinu (3,7 g; 10 mmolů) a koncentrované kyseliny chlorovodíkové (4 ml) v dimethylformamidu (80 ml) ochlazenému na -30 °C byl přidán roztok dusitanu sodného (690 mg) ve vodě (2,8 ml). Po lOminutovém míchání a chlazení (-25 °C) reakčního roztoku bylo pH upraveno N-ethylpiperidinem na 6,9 a takto zneutralizovaný roztok byl přidán к předchlazenému roztoku (-30 °C) fenylethylamidu asparaginyl-fenylalaninu v dimethylformamidu (50 ml) uvolněného z odpovídajícího hydrobromidu (10 mmolů) N-ethylpiperidinem (cca 1,6 ml). Po 12hodinovém stání při +3 °C byl reakční roztok odpařen, produkt vysrážen přídavkem vody, odfiltrován, postupně roztírán 1M kyselinou chlorovodíkovou, vodou, 5% hydrogenuhličitanem sodným, vodou a krystalován z kyseliny octové a etheru. Bylo získáno 2,45 g (43 %) produktu o t.t. 225 až 229 °C.

Hydrobromid 2-fenylethylamidu glycyl-glycyl-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven v kvantitativním výtěžku z odpovídajícího benzyloxykarbonyl-derivátu působením bromovodíku v kyselině octové; t.t. 227 až 230 °C; R_f - 0,52/S^; 0,71/S₂·

Pro C₂₈H_3?N₇O₇2HBr.1/2ACOH (775,5) vypočteno: 44,89 % C, 5,42 % H, 12,86 % N, nalezeno : 44,92 % C, 5,33 % H, 12,64 % N.

2-fenylethylamid glycyl-glycyl-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

Base byla uvolněna z odpovídajícího hydrobromidu rozpuštěného v dimethylformamidu 10% vodným amoniakem a izolována přídavkem vody. Krystalizaci z dimethylformamidu a etheru byl získán produkt ve výtěžku 51 % a t.t. 223 až 226 °C; R^ = 0,61/S^, 0,74/S₂·

2-fenylethylamid benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku benzyloxykarbonylglutaminu (0,42 g; 1,5 mmolů) a N-ethylpiperidinu (0,21 ml) v dimethylformamidu (2,5 ml) ochlazenému na -10 °C, byl přidán chlormravenčan ethylnatý (0,14 ml). Po 20minutovém míchání a chlazení (-5 °C) byl přidán předchlazený roztok fenylethylamidu glycyl-glycyl-sery1-asparaginyl-fenylalaninu (0,88 g) v dimethylformamidu (15 ml) a reakční roztok byl míchán 2 hodiny při 0 °C a potom odstaven 8 hodin při teplotě místnosti. Druhý den byl roztok odpařen, produkt vysrážen vodou a postupně roztírán 1M kyselinou chlorovodíkovou, vodou, 5% hydrogenuhličitanem sodným, vodou a krystalován z dimethylformamidu a etheru. Bylo získáno 0,9 g (72 %) produktu o t.t. 192 až 195 °C. *

Hydrobromid 2-fenylethylamidu glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven v kvantitativním výtěžku z odpovídajícího benzyloxykarbonyl-derivátu působením bromovodíku v kyselině octové. R_f = 0,21/Sp 0,53/S₂·

2-fenylethylamid terč.butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl-glutaminy1-glycyl-glycy1-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

К roztoku terc.butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu (0,148 mg; 0,25 mmolů), N-hydroxysukcinimidu (0,03 g) a Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu (0,06 g) v dimethylformamidu (6 ml) ochlazenému na -10 °C byl po 1-hodinovém míchání a chlazení (-10 °C) přidán roztok 2-fenylethylamidu glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu v dimethylformamidu (10 ml), uvolněného z odpovídajícího hydrobromidu (0,25 mmolu) přídavkem N-ethylpiperidinu; další postup je shodný jako u odpovídajícího amidu uvedeného v příkladu 3. bylo získáno 162 mg (53 %) produktu. R_f = 0,63/S^, 0,76/S₂·

Aminokyselinová analýza: Ala (1,00), Lys (1,00), Ser (1,63), Glu (1,2), Gly (2,53), Asn (1,3), Phe (1,3). ,

Hydrochlorid 2-fenylethylamidu alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-seryl-glutaminyl-glycyl-glycy1-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího terč, butoxykarbonyl-derivátu působením 2,5M kyselinou chlorovodíkovou v kyselině octové obdobným postupem uvedeným v příkladě 1. Bylo získáno 100 mg (95 %) produktu. Aminokyselinová analýzy: Ala (1,00), Lys (0,93), Ser (1,62), Glu (1,03), Gly (2,54), Asp (1,29), Phe (1,26).

2-fenylethylamid alany1-lysy1-sery1-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu.

Katalytickou hydrogenolýzou z příslušného benzyloxykarbonyl-derivátu obdobným postupem jak uvedeno v příkladě 1 byl získán diacetát ve výtěžku 78 %. Aminokyselinová analýza: Ala (1,00, Lys (0,97), Ser (1,55), Glu (1,02), Gly (2,18), Asp (1,14), Phe (1,16).

Příklad 6

2-fenylethylamid glutaminy1-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaninu

Byl získán z odpovídajícího hydrobromidu uvedeného v příkladě 5; pH roztoku hydrobromidu v dimethylformamidu bylo upraveno na hodnotu 7,1 přídavkem N-ethyl-piperidinu a produkt vysrážen vodou. R_f = 0,18/S^, 0,51/S₂. .

Příklad 7 !

2-fenylethylamid pyroglutamy1-glycyl-glycy1-sery1-asparagipyl-fenylalaninu

Byl připraven z kyseliny: pyroglutámové a z příslušného fenylethylamidu glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalaminu karbidiimidovou methodou postupem uvedeným v příkladě 5 ve výtěžku 72 % a t.t. 209 až 211 °C. R_f = 0,25/Sp 0,67/S₂·

Příklad 8

Amid benzyloxykatbonylfenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího methylesteru amonolýzou uvedenou v příkladě 1 v kvantitativním výtěžku a t.t. 230 až 232 °C.

Hydrobromid amidu fenylalanyl-fenylalaninu

Byl získán z odpovídajícího benzyloxykarbonyl-derivátu působením bromovodíku v kyselině octové postupem uvedeným v příkladě 1. R^ = 0,56/Sj.

Amid benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z benzyloxykarbonylasparaginu a amidu fenylalanyl-fenylalaninu uvolněného z odpovídajícího hydrobromidu uvolněného na ionexu Zerolit FF v methanolu ve výtěžku 74 %. Analytický vzorek byl krystalován z kyseliny octové přídavkem etheru; t.t. byla 265 až 267 °C.

Pro C₃₀H₃₃N₅O₆.1/2H₂O (568,6) vypočteno: 63,37 % C, 6,03 % H, 12,32 % N, nalezeno : 63,87 % C, 6,17 % H, 12,21 % Ni

Hydrobromid amidu asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonyl-derivátu v kvantitativním výtěžku. R_f = 0,37/Sp 0,72/S₂.

Amid benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-séry1-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z hydrazidu benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-serinu a amidu asparaginyl-fe- ¹nylalanyl-fenyl-alaninu, uvolněného z příslušného hydrobromidu na ionexu Zerolit FF v methanolu, azidovou metodou, uvedenou v příkladě 5 ve výtěžku 50 %. Analytický vzorek byl krystalován z kyseliny octové přídavkem etheru, t.t. 232 až 234 °C.

Pro C₃₇H₄₄N₈O₁₀.1/2AcOH<(790,8) vypočteno: 57,71 % C, 5,86 % H, 14,17 % N, nalezeno : 57,81 % C, 5,91 % H, 14,39 % N.

Hydrobromid amidu glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylčlerivátu v kvantitativním výtěžku působením bromovodíku v kyselině octové. R^ « 0,60/Sp 0,69/S₂·

Amid benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z benzyloxykarbonylglutaminu a amidu glycyl-glycy1-seryl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu obdobným způsobem, jak uvedeno v příkladě 5 u fenylethylamidového derivátu ve výtěžku 96 %. Analytický vzorek byl krystalován z kyseliny octové přídavkem etheru, t.t. 196 až 199 °C.

Pro C₄₂H₅₂N₁₀O₁₂.AcOH.l/2H₂O (958,0) vypočteno: 55,16 % C, 6,00 % H, 14,62% N, nalezeno : 55,01 % C, 5,93 % H, 14,57 % N.

Amid glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparagiri^-fenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu působením bromovodíku v kyselině octové a získaný hydrobromid byl uvolněn na ionexu Zerolit FF. Produkt byl přesrážen z dimethylformamidu přídavkem etheru. = 0,08/S^, 0,31/S₂·

Příklad 9

Amid pyroglutamyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginylfenylalanyl-fenylalaninu

Byl připraven z kyseliny pyroglutámové a amidu glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-fenylalanyl-fenylalaninu obdobným postupem, jak uvedeno v příkladě 7 ve výtěžku 83 %. Krystal.izací z dimethylformamidu a etheru byl získán produkt o t.t. 250 až 253 °C. R^ = 0,22/S^, 0,51/S₂·

Příklad 10 šťavelan 4,4'’-dimethoxybenzhydrylamidu glycinu

К roztoku 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu benzyloxykarbonylglycinu (27,9 g; 64 mmoly) a kyseliny octové (0,1 ml) v methanolu (100 ml) byla přidána Pd-čerň (cca 60 mg); hydrogenolýza byla provedena za normálního tlaku při teplotě místnosti po dobu 5 hodin. Po odfiltrování Pd-černi, byl filtrát zahuětěn cca na 1/4 původního objemu, smísen s roztokem kyseliny šřavelové (5,8 g) v methanolu (50 ml) a produkt byl krystalován přídavkem etheru, po 30 minutách byl odfiltrován a překrysta.lován stejným způsobem. Bylo získáno 22,2 g (87 %) produktu o t.t. 171 až 173 °C. Vzorek к analýze byl krystalován obdobným způsobem, t.t. 179 až 182 °C. R_f = 0,86/S₁, 0,72/Sg.

Pro C₁₉H₂₂N₂O_?.l/2 HgO (399,4) vypočteno: 57,13 % C, 5,82 % H, 7,02 % N, nalezeno : 57,32 % C, 5,74 % H, 6,64 % N.

4-nitrobenzylester benzyloxykarbonylseryl-asparaginu

К roztoku benzyloxykarbonylserinu (12,0 g; 50 mmolů) a N-ethylpiperidinu (7,0 ml) v dimethylformámidu (100 ml), ochlazenému na -20 °C byl za stálého míchání přidán chlormravenčan ethylnatý (5,0 ml). Po lOminutovém míchání a chlazení (-10 °C) byl reakční roztok ochlazen na -20 °C a přidán roztok 4-nitrobenzylesteru asparaginu v dimethylformamidu (100 ml) uvolněného z odpovídajícího hydrochloridu (15,2 g; 50 mmolů) přídavkem N-ethylpiperidinu (7,0 ml) a zpracována jak uvedeno v příkladu 1. Krystalizaci z octanu ethylnatého bylo získáno 18,8 g (77 %) produktu o t.t. 174 až 177 °C. Vzorek к analýze byl krystalován z dimethylformamidu přídavkem petroletheru, t.t. 179 až 180 °C. R_f « 0,73/S^^, 0,76/Sg.

(c ^e 0,2; dimethylformamid).

Pro C₂₂H₂₄N₄O₉ (488,5) vypočteno: 54,09 % C, 4,96 % H, 11,47 % N, nalezeno : 53,49 % C, 5,13 % H, 11,54 % N.

Hydrazid benzyloxykarbonylseryl-asparaginu

Byl připraven z odpovídajícího 4-nitrobenzylesteru postupem uvedeným v příkladě 1 ve výtěžku 95 %. Vzorek, к analýze byl krystalován z 80% methanolu. t.t. 218 až 220 °C.

Pro C₁₅H₂₁N₅O₆ (367,4) vypočteno: 49,03 % C, 5,77 % H, 19,07 % N, ' nalezeno : 48,59 % C, 5,81 % H, 18,77 % N.

4,4*-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylseryl-asparaginyl-glycinu

Byl připraven z hydrazidu benzyloxykarbonylseryl-asparaginu a 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu glycinu uvolněného z odpovídajícího Sřavelanu N-ethylpiperidinem postupem uvedeným v příkladě 1 ve výtěžku 64 %. Analytický vzorek byl krystalován ze směsi dimethylformamid-methanol 1:1 přídavkem etheru, t.t. 160 až 162 °C. R^ = 0,68/Sp 0,80/Sg.

Pro C₃₂H₃₇N₅O₉ (635,7) vypočteno: 60,45 % C, 5,88 % H, 11,02 % N, nalezeno: 60,18 % C, 6,00 % H, 10,59 % N.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid seryl-asparaginyl-glycinu

Byl připraven katalytickou hydrogenolýzou odpovídajícího benzyloxykarbonyl-derivátu ve výtěžku 99 %. Vzorek к analýze byl krystalován z 2-propanolu přídavkem octanu ethylnatého t.t. 137 až 138 °C. R_f = 0,31/S^ 0,72/S₂· ^{Pro C}24Í31^N5°7’^3H2° <⁵⁵⁵'⁶>

vypočteno; 51,88 % C, 6,73 % H, 12,61 % N, nalezeno : 51,39 % C, 5,87 % H, 13,29 % N.

4,4‘*-dimethoxybenzhydrylamid N-alfa-benzyloxykarbonyl-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-glycinu

Byl připraven z hydrazidu benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycinu a 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu seryl-asparaginyl-glycinu postupem uvedeným v příkladě 1 ve výtěžku 54 %. Vzorek к analýze byl krystalován z dimethylformamidu přídavkem octanu ethylantého, t.t. 200 až 202 °C. R_f - 0,38/Sp 0,85/S₂. Aminokyselinová analýza: Glu (1,03), Gly (3,00), Ser (0,86), Asp (1,00)

Pro C₄₁H₅₁N_gO₁₃.H₂O (895,9) .

vypočteno: 54,97 % C, 5,96 % H, 14,07 % N, nalezeno : 54,50 % C, 5,82 % H, 13,87 % N.

Hydrochlorid 4,4 '-dimethoxybenzhyd.rylamid glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-glycinu

Katalytickou hydrogenolýzou odpovídajícího chráněného derivátu v roztoku 10% kyseliny octové а 2M kyseliny chlorovodíkové postupem uvedeným v příkladě 1 byl připraven produkt ve výtěžku 97 %. Látka chromatograficky homogenní: R_f = 0,10/Sj, 0,63/S₂, 0,36/S^.

Amid pyroglutamyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-glycinu

Byl připraven z odpovídajícího 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu 1-hodinovým zahříváním s kyselinou trifluoroctovou a anisolem pod zpětným chladičem ve výtěžku 66 %. R^ - 0,01/S^, 0,03/S₂. И -27,5 ° (с = 0,1; 0,1М kyselina octová)Aminokyselinová analýza: Glu (1,03), Gly (2,80), Ser (0,88), Asp (1,00). ·

Příklad 11

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylasparaginyl-alaninu

Byl připraven z benzyloxykarbonylasparaginu a z 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu alaninu obdobným postupem jako byl připraven methylester benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaninu uvedeným v příkladě 1 ve výtěžku 87 %. Vzorek к analýze byl krystalován z dimethylformamidu a etheru; t.t. 235 až 236 °C.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid asparaginyl-alaninu

Byl připraven katalytickou hydrogenolýzou z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu obdobným způsobem jak uvedeno v příkladě 1. Vzorek к analýze byl krystalován z methanolu a etheru; t.t. 155 až 157 °C.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu

Byl připraven z hydryzidu benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-serinu a 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu asparaginyl-alaninu azidovou metodou, uvedenou v příkladu 5, ve výtěžku 61 %.

R_f « 0,40/S₁, 0,77/S₂.

I

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu katalytickou hydrogenolýzou obdobným způsobem, jako je uvedeno v příkladu 1, ve výtěžku 95 %. Analytický vzorek byl krystalován z dimethylformamidu a etheru. R_f = 0,04/Sj; 0,070/S₂·

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu

Byl připraven z benzyloxykarbonylglutaminu a 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu metodou směsného anhydridu, jak uvedeno v příkladě 1, ve výtěžku 70 %. R_f = 0,23/Sp 0,80/S₂. . '

Amid glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu

Do roztoku 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu v kyselině trifluoroctové byl zaváděn plynný bromovodík po dobu 30 minut při teplotě 0 °C. Příslušný hydrobromid byl vysrážen etherem a vysušen v exsikátoru nad hydroxidem sodným a kysličníkem fosforečným. Base byla uvolněna N-ethylpiperidinem z methanolického roztoku hydrobromidu a vysrážena dichlormethanem. Produkt byl získán ve výtěžku 70 %. R_f = 0,00/Sp 0,ll/S₂.

Příklad 12

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonyl-derivátu katalytickou hydrogenolýzou obdobným způsobem jak uvedeno v příkladě 1, ve výtěžku 80 %. = 0,00/S^, 0,38/S₂·

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid terč. butyloxykarbonyl-alanyl-N-omega-benzyloxykarbonyl-lysyl-seryl-glutaminyl^glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu ·

Byl připraven z terč. butyloxykarbonylalanyl-N-omega-benzyloxykarbonyllysyl-serinu a 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu karbodiimidovou metodou, obdobným způsobem jak uvedeno v příkladě 5., ve výtěžku 85 %. Rf = 0,21/Sj, 0,81/S₂. ,

Amid alanyl-lysyl-seryl-glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alaninu.2 CF^COOH

Byl připraven z odpovídajícího terč.butyloxykarbonyl-derivátu acidolytickým štěpením varem s kyselinou trifluoroctovou a anisolem, obdobným způsobem jak uvedeno v příkladě 10., ve výtěžku 65 %. T.t. 178 až 181 °C (rozklad), slíná od 140 °C; R_f = 0,00/S^ 0,02/S_2<Příklad 13

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylalanyl-alaninu

К roztoku amidu benzyloxykarbonylalanyl-alaninu (4,8 g; 16 mmol) v bezvodé kyselině octové (80 ml) byl přidán 4,4'-dimethoxybenzhydrol (4,0 g; 16 mmol). Po rozpuštění byla přidána konc. kyselina sírová (0,1 ml) a po třech dnech stání při teplotě místnosti byl reakční roztok vlit do vody (620 ml). Vyloučená sraženina byla po 2 hodinách zfiltrována a čištěna roztíráním s 5% hydrogen-uhliČitanem sodným a vodou. Krystalizací z octanu ethylnatého a petroletheru bylo získáno 7,1 g (86 %) produktu. Vzorek k analýze byl krystalován z octanu ethylnatého, t.t. 208 až 210 °C.

Pro С₂₉Н_зЛО₆ (519,6) vypočteno: 67,04 % C, 6,40 % H, 8,08 % N, nalezeno : 67,06 % C, 6,48 % H, 7,97 % N.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid alanyl-alaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu katalytickou hydrogenolýzou obdobným postupem jak uvedeno v příkladě 1., ve výtěžku 97 %. Vzorek к analýze byl krystalován z 2-propanolu. R_f = 0,23/S^, 0,69/S_2<

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylasparaginy1-alanyl-alaninu

Byl připraven obdobným způsobem jako methylester benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaninu metodou směsného anhydridu, jak uvedeno v příkladě 1., ve výtěžku 91 %. Vzorek к analýze byl krystalován z dimethylformamidu a octanu ethylnatého, t.t. 242 až 245 °C.

Pro ^C33^H39^N5°8 ⁽⁶³³'⁷⁾ vypočteno: 62,55 % C, 6,20 % H, 11,05 % N, nalezeno : 62,18 % C, 6,29 % H, 10,56 % N.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid asparaginyl-alanyl-alaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu katalytickou hydrogenolýzou obdobným postupem jak uvedeno v příkladě 1., ve výtěžku 90 %. Vzorek к analýze byl krystalován z methanolu a etheru, t.t. 210 až 212 °C.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alanyl-alaninu

Byl připraven z hydrazidu benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-serinu a 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu asparaginyl-alanyl-alaninu azidovou metodou, jak uvedeno v příkladě 5. R_f = « 0,32/S_lf 0,76/S₂.

4,4'-Dimethoxybenzhydrylamid glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alanyl-alaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu katalytickou hydrogenolýzou obdobným postupem jak uvedeno v příkladě 1„ ve výtěžku 90 %. R^ = 0,00/S^, 0,39/S₂·

4,4 '-Dimethoxybenzhydrylamid benzyloxykarbonylglutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginy1-alanyl-alaninu

Byl připraven z benzyloxykarbonylglutaminu a příslušného 4,4'-dimethoxybenzhydrylamidu glycyl-glycyl-seryl-asparaginyl-alanyl-alaninu anhydridovou metodou jak uvedeno v příkladě 5., ve výtěžku 60 %. R_f = 0,37/S^, 0,77/S₂·

Amid glutaminyl-glycyl-glycyl-seryl-asparaginy1-alanyl-alaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu acidolytickým štěpením bromovodíkem v kyselině trifluoroctové a uvolněním base N-ethylpiperidinem, jak uvedeno v příkladě 11. T.t. 181 až 185 °C (rozklad), slíná od 145 °C. R_f = 0,00/S^ 0,04/S₂·

Příklad 14

Ethylamid benzyloxykarbonylasparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven anhydridovou metodou obdobným způsobem jako odpovídající 2-fenylethylamid uvedený v příkladě 5. ve výtěžku 89 % a t.t. 246 až 248 °C. fáj -34,9 ° (c = 0,2; methanol).

Ethylamid asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu katalytickou hydrogenolýzou na Pd-černi v methanolu ve výtěžku 99 %. Vzorek к analýze byl krystalován z methanolu a etheru; t.t. 196 až 199 °C; R_f = 0,15(S_1# 0,62/S₂·

Pro C₁₅H₂₂N₄O₃ (306,4) vypočteno: 58,81 % C, 7,24 % H, 18,29 % N; nalezeno : 58,97 % C, 7,22 % H, 18,51 % N.

Ethylamid benzyloxykarbonylglycyl-glycy1-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven azidovou metodou z odpovídajícího hydrazidu benzyloxykarbonylglycyl-glycyl-serinu a ethylamidu asparaginyl-fenylalaninu obdobným způsobem jako odpovídající 2-fenylethyl-derivát ve výtěžku 82 % a t.t. 235 až 237 °C. R_f = 0,32/8^, 0,78/S₂·

Ethylamid glycyl-glycyl-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu katalytickou hydrogenolýzou na Pd-černi v dimethylformamidu jak uvedeno v příkladě l.ve výtěžku 99 % a t.t. 199 až 200 °C. R_f - 0,05/Sf, 0,025/S₂.

Ethylamid benzyloxykarbonyIglutaminy1-glycyl-glycy1-sery1-asparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven anhydridovou met/odou obdobným způsobem jako odpovídající 2-fenylethyl-derivát z příslušného benzyloxykarbonylglutaminu a odpovídajícího C-koncového ethylaminu ve výtěžku 77 %. Vzorek к analýze byl krystalován z dimethylformamidu a etheru; t.t. 269 až 271 °C R_f = 0,20/Sf, 0,69/S₂.

•

Pro C₃₅H₄₇N₉O_1;L1/2H₂O (778,8) vypočteno: 53,60 % C, 6,09 % H, 16,26 % N, nalezeno : 53,97 % C, 6,21 % H, 16,19 % N.

Ethylamid glutaminyl-glycyl-seryl-asparaginylfenylalaninu

Byl připraven katalytickou hydrogenolýzou z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu ve směsi dimethylformamid-methanol (9:1) obdobným způsobem jako příslušný ethylamid uvedený v příkladě 1. R_f « 0,04/Sf, 0,30/S₂·

Ethylamid pyroglutamy1-glycyl-glycy1-sery1-aeparaginyl-fenylalaninu

Byl připraven hydrogenolýzou na Pd-černi z odpovídajícího benzyloxykarbonylderivátu v 10% kyselině octové při zvýšené teplotě (40 °C). Byl získán produkt o t.t. 219 aŽ 221 °C; R_f « 0,10/Sf, 0,49/S₂.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Peptidy typu analogů sérového thymického faktoru’obecného vzorce I

A - Gly - Gly - Ser - Asn - В - C - NH - R (I), kde A je pGlu, Gin, anebo zbytek peptidu Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-, pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-, Ala-Lys-Ser-Gln-,

В je Gly, Phe, Ala nebo nula,

C je totéž co B,

R je atom vodíku nebo alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo 2-fenylethyl.